Name: DmWRNexo를 특성화하기 위한 형광 기반 엑소뉴클레아제 분석, human progeroid WRN 엑소뉴클레아제의 orthologue 및 다른 뉴클레아제에 대한 응용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 배우세요 형광 기반 엑소뉴클레아제 분석법으로 WRN 엑소뉴클레아제 활성을 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 안전하고 재현성 높은 게놈 안정성 연구 도구를 제공합니다.

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이 작업에 자금을 지원해 준 협의회 간 New Dynamics of Ageing Programme[ES/G037086/1]과 Fuji FLA-3000에 접근한 Dave Sherratt 교수(옥스퍼드 대학교 생화학과)에게 감사드립니다.

<ol><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%22%5BJournal%5D)">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr. 34, 1317-1340 (2012).</li>
<li>Payne, M., Hickson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+instability+and+cancer%3A+lessons+from+analysis+of+Bloom%27s+syndrome%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Genomic instability and cancer: lessons from analysis of Bloom's syndrome).</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 553-559 (2009).</li>
<li>Yu, C. E., Oshima, J., Fu, Y. H., Wijsman, E. M., Hisama, F., Alisch, R., Matthews, S., Nakura, J., Miki, T., Ouais, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+of+the+Werner%27s+syndrome+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Positional cloning of the Werner's syndrome gene.</a> Science. 272, 258-262 (1996).</li>
<li>Huang, S., Li, B., Gray, M. D., Oshima, J., Mian, I. S., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+premature+ageing+syndrome+protein%2C+WRN%2C+is+a+3%27--%3E5%27+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The premature ageing syndrome protein, WRN, is a 3'-->5' exonuclease.</a> Nat. Genet. 20, 114-116 (1998).</li>
<li>Goto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndrome-causing+mutations+in+Werner+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Trends%22%5BJournal%5D)">Syndrome-causing mutations in Werner syndrome.</a> Biosci. Trends. 2, 147-150 (2008).</li>
<li>Perry, J. J., Yannone, S. M., Holden, L. G., Hitomi, C., Asaithamby, A., Han, S., Cooper, P. K., Chen, D. J., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+exonuclease+structure+and+molecular+mechanism+imply+an+editing+role+in+DNA+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">WRN exonuclease structure and molecular mechanism imply an editing role in DNA end processing.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 414-422 (2006).</li>
<li>Opresko, P. L., Laine, J. P., Brosh, R. M., Seidman, M. M., Bohr, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+action+of+the+helicase+and+3%27+to+5%27+exonuclease+of+Werner+syndrome+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coordinate action of the helicase and 3' to 5' exonuclease of Werner syndrome protein.</a> J. Biol. Chem. 276, 44677-44687 (2001).</li>
<li>Plchova, H., Hartung, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+an+exonuclease+from+Arabidopsis+thaliana+reveals+similarities+to+the+DNA+exonuclease+of+the+human+Werner+syndrome+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of an exonuclease from Arabidopsis thaliana reveals similarities to the DNA exonuclease of the human Werner syndrome protein.</a> J. Biol. Chem. 278, 44128-44138 (2003).</li>
<li>Hartung, F., Plchova, H., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterisation+of+RecQ+homologues+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular characterisation of RecQ homologues in Arabidopsis thaliana.</a> Nucleic Acids Res. 28, 4275-4282 (2000).</li>
<li>Saunders, R. D., Boubriak, I., Clancy, D. J., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+Drosophila+ortholog+of+WRN+exonuclease+that+is+required+to+maintain+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a Drosophila ortholog of WRN exonuclease that is required to maintain genome integrity.</a> Aging Cell. 7, 418-425 (2008).</li>
<li>Cox, L. S., Boubriak, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Instability+in+Premature+Aging%2C+in+DNA+Damage+Repair%2C+Repair+Mechanisms+and+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Thomas%2C+A.E.%2C+Eds.+Nova+Science+Publishers%22%5BJournal%5D)">DNA Instability in Premature Aging, in DNA Damage Repair, Repair Mechanisms and Aging.</a> Thomas, A.E., Eds. Nova Science Publishers. , 1-34 (2010).</li>
<li>Cox, L. S., Clancy, D. J., Boubriak, I., Saunders, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Werner+Syndrome+in+Drosophila+melanogaster%3A+hyper-recombination+in+flies+lacking+WRN-like+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling Werner Syndrome in Drosophila melanogaster: hyper-recombination in flies lacking WRN-like exonuclease.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1119, 274-288 (2007).</li>
<li>Boubriak, I., Mason, P. A., Clancy, D. J., Dockray, J., Saunders, R. D., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DmWRNexo+is+a+3%27-5%27+exonuclease%3A+phenotypic+and+biochemical+characterization+of+mutants+of+the+Drosophila+orthologue+of+human+WRN+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">DmWRNexo is a 3'-5' exonuclease: phenotypic and biochemical characterization of mutants of the Drosophila orthologue of human WRN exonuclease.</a> Biogerontology. 10, 267-277 (2009).</li>
<li>Mason, P. A., Boubriak, I., Robbins, T., Lasala, R., Saunders, R., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+orthologue+of+progeroid+human+WRN+exonuclease%2C+DmWRNexo%2C+cleaves+replication+substrates+but+is+inhibited+by+uracil+or+abasic+sites+%3A+Analysis+of+DmWRNexo+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">The Drosophila orthologue of progeroid human WRN exonuclease, DmWRNexo, cleaves replication substrates but is inhibited by uracil or abasic sites : Analysis of DmWRNexo activity in vitro.</a> Age (Dordr). , (2012).</li>
<li>Machwe, A., Xiao, L., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Length-dependent+degradation+of+single-stranded+3%27+ends+by+the+Werner+syndrome+protein+%28WRN%29%3A+implications+for+spatial+orientation+and+coordinated+3%27+to+5%27+movement+of+its+ATPase%2Fhelicase+and+exonuclease+domains%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Length-dependent degradation of single-stranded 3' ends by the Werner syndrome protein (WRN): implications for spatial orientation and coordinated 3' to 5' movement of its ATPase/helicase and exonuclease domains.</a> BMC Mol. Biol. 7, 6 (2006).</li>
<li>Mangerich, A., Veith, S., Popp, O., Fahrer, J., Martello, R., Bohr, V. A., Burkle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+WRN+exonuclease+activity+by+isotope+dilution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of WRN exonuclease activity by isotope dilution mass spectrometry.</a> Mech. Ageing Dev. 133, 575-579 (2012).</li>
<li>Xue, Y., Ratcliff, G. C., Wang, H., Davis-Searles, P. R., Gray, M. D., Erie, D. A., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+exonuclease+domain+of+WRN+forms+a+hexamer+on+DNA+and+possesses+both+3%27-+5%27+exonuclease+and+5%27-protruding+strand+endonuclease+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A minimal exonuclease domain of WRN forms a hexamer on DNA and possesses both 3'- 5' exonuclease and 5'-protruding strand endonuclease activities.</a> Biochemistry. 41, 2901-2912 (2002).</li>
<li>Machwe, A., Ganunis, R., Bohr, V. A., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockage+of+the+3%27--%3E5%27+exonuclease+activity+of+WRN+protein+by+certain+oxidative+modifications+and+bulky+lesions+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selective blockage of the 3'-->5' exonuclease activity of WRN protein by certain oxidative modifications and bulky lesions in DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28, 2762-2770 (2000).</li>
</ol>

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정제된 단백질의 엑소뉴클레아제 활성을 측정하려면 DNA 절단 산물의 분석이 필요합니다. 엑소뉴클레아제에 의한 DNA의 순차적 절단은 아크릴아미드 겔에서 표지된 절단 산물을 분리하여 시각화할 수 있습니다. 역사적으로 이것은 방사성 표지(예: 32P 또는 35S)로 DNA 기질의 말단 표지를 포함했지만 방사성 표지 사용에 내재된 단점(비용, 안전 문제 및 시간 경과에 따른 불안정성)이 있었습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 우리는 형광 표지된 DNA 기질을 사용하는 엑소뉴클레아제 분석을 개발했으며, 초파리 멜라노가스터, DmWRNexo10의 WRN 엑소뉴클레아제 정통로그의 뉴클레아제 활성을 결정하는 데 있어 분석 시스템의 유용성을 보여줍니다. 우리 분석의 주요 이점은 형광 표지된 기질이 시간이 지남에 따라 안정적이므로 예를 들어 정제된 재조합 엑소뉴클레아제의 서로 다른 배치를 비교할 때 더 큰 재현성과 표준화를 제공한다는 것...

뉴클레아제는 세포에서 손상된 DNA를 제거하고, 홀리데이 접합(Holliday junction)과 같은 비이중 구조를 분해하며, DNA 중합효소 내에 내재되어 있거나 DNA 중합효소에 외재되어 있는 DNA 복제 중 교정 능력을 제공하는 데 중요한 역할을 합니다1. 뉴클레아제는 자유 말단에서 DNA를 순차적으로 분해하거나(엑소뉴클레아제) 더 긴 DNA 분자 내에서 내부 포스포다이에스테르 결합을 절단하여(엔도뉴클레아제) 작용할 수 있습니다. 뉴클레아제 활성의 손실은 매우 특이적인 게놈 불안정성 표현형을 초래할 수 있습니다. RecQ helicase family member BLM의 돌연변이는 자매 염색체 교환의 비율이 과도하게 높아지고 암 발병률이 전 세계적으로 높아지는 반면(Payne 및 Hickson검토 2), 관련성이 높은 WRN 단백질의 돌연변이는 조기 노화를 유발합니다3; 이 두 패밀리 구성원 사이의 가장 큰 차이점은 WRN4에 3'-5' 엑소뉴클레아제 도메인이 있다는 것입니다. 게놈 안정성 유지에 있어 WRN 엑소뉴클레아제의 중요한 역할에 대한 증거는 WS 환자5의 유전자형 분석과 인간 세포의 점 돌연변이 및 결실 연구를 통해 축적되었으며, 분리된 엑소뉴클레아제도메인 6에 대한 결정학적 연구로 뒷받침되었습니다. 그러나 WRN의 엑소뉴클레아제 활성과 중앙 헬리카제 활성7 사이의 협력 및 혼선은 각각의 기능과 게놈 안정성에 대한 상대적 기여도를 구분하기 어렵게 만듭니다. 식물 및 하부 메타 동물 동물에서, WRN 엑소뉴클레아제 활성은 헬리카제 활성이 결핍된 단일 폴리펩티드에 존재합니다8-10 (Cox 및 Boubriak11에서 검토됨). 애기장대에서 이 엑소뉴클레아제가 동족 WRN 헬리카제와 협조적으로 작용하여 척추동물 WRN9에서 관찰된 결합된 효소 활성을 효과적으로 재구성한다는 것이 생화학적으로 입증되었습니다. 우리는 우수한 유전 도구를 통해 전체 유기체 수준과 발달을 통해 엑소뉴클레아제 돌연변이의 영향을 분석할 수 있기 때문에 초파리에서 WRN 엑소뉴클레아제를 연구했습니다(추정 동족 헬리카제에 영향을 미치지 않음)10,12. 또한, 우리는 재조합 초파리 WRN 엑소뉴클레아제(DmWRNexo)를 복제, 발현 및 정제하여 효소 특성의 완전한 생화학적 분석을 가능하게 했습니다13,14.
in vitro 뉴클레아제 분석은 전통적으로 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행되었으며, 아크릴아미드 겔4,8,15에서 제품의 래더링을 찾아 분해를 평가했습니다. 민감하기는 하지만, 이러한 분석은 표지된 기질의 방사성 붕괴로 인해 매일 정량적으로 재현할 수 없습니다. 또한 방사성 시약의 취급 및 폐기는 심각한 환경 및 건강 문제를 야기합니다. Radiolabel의 소싱 또한 점점 더 문제가 되고 있습니다. 최근의 대안적인 방법은 질량 분석법16에 의해 최종 분해 생성물의 양을 평가합니다. 그러나 시간이 많이 걸리고(며칠 소요), 특수 장비가 필요하며, 판독값은 최종 산물(단일 뉴클레오티드)의 양이므로 효소 진행성과 같은 측면의 민감한 측정이나 일부 뉴클레오티드, 염기서열 또는 변형으로 인해 뉴클레아제 일시 중지 또는 중단이 발생하는지 여부를 결정하는 데 적합하지 않습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 기존의 겔 기반 분석을 형광 올리고뉴클레오티드 기질과 함께 사용하도록 조정하여 장기간에 걸쳐 재현성 있게 사용할 수 있는 안정적으로 표지된 기질을 생성하여 다양한 조건에서 뉴클레아제 활성을 직접 비교할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>Custom oligonucleotides</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>PAGE 정제를 통해 고순도 e.e.로 얻을 필요가 있습니다.</td></tr><tr><td></td><td></td><td>5'FLO</td><td>fluoresescein-5' GAACTATGGCTCTC GAGTGCTAGGACATGTCTGA CTACGTACACAAGTCACC - 3'bubble</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>5'- GGTGACTTGTACGT AGTCAGACATGTCCTAGCAC TCGAGAGCCATAGTTC-3'40</td></tr><tr><td>% 19:1 아크릴아미드 용액</td><td>Severn Biotech</td><td>20-2400-05</td><td>주의: 강력한 신경독이므로 항상</td></tr> <tr><td>장갑을 착용해야 합니다.His-Trap 컬럼 (1 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>기타 모든 시약</td>은 <td>평판이 좋은 공급 업체</td><td></td><td>분자 생물학 등급이 필요합니다 (DNase-free); 마이크로 fuge 튜브는 마찬가지로 DNase 및 RNase-free</td></tr><tr>이어야합니다 <td colspan = "4">Equipment</td></tr><tr><td>Hoefer SE400 겔 장치</td><td>Hoefer</td><td>SE400-15-1.5</td><td></td></tr><tr><td>FLA-3000 (형광체 및 형광 이미저)</td><td>Fuji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Reader V2.02</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이미지 게이지 V3.3</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dmwrnexo를 특성화하기 위한 형광 기반 엑소뉴클레아제 분석, human progeroid wrn 엑소뉴클레아제의 orthologue 및 다른 뉴클레아제에 대한 응용

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

WRN 엑소뉴클레아제는 DNA 복제 중 또는 내인성 또는 외인성 제유전자 독소에 노출된 후 발생하는 DNA 손상을 해결하는 데 관여합니다. 이는 일시적으로 정지된 복제 분기점에서 축적될 수 있는 재조합 중간체의 축적을 방지하는 역할을 할 가능성이 높으며, 이는 WRN이 결핍된 세포의 하이퍼 재조합 표현형과 일치합니다. 인간의 경우, 엑소뉴클레아제 도메인은 DNA와 단백질 상호 작용에 중요한 추가 부위와 함께 헬리카제 활성을 가진 훨씬 더 큰 단백질의 N-말단 부분으로 구성됩니다. 대조적으로, 초파리에서 WRN(DmWRNexo)의 엑소뉴클레아제 활성은 추정 헬리카제와 구별되는 유전적 위치에 의해 암호화되어 게놈 안정성 메커니즘에서 엑소뉴클레아제 활성의 역할을 생화학적(및 유전적) 해부할 수 있습니다. 여기에서는 정제된 재조합 DmWRNexo 및 말단 표지된 형광 올리고뉴클레오티드를 사용하여 WRN 엑소뉴클레아제 활성을 측정하는 형광 방법을 보여줍니다. 이 시스템은 기질 올리고뉴클레오티드가 수개월 동안 안정적으로 유지되기 때문에 방사성 분석보다 재현성이 뛰어나며, 뉴클레아제 활성의 상세 분석을 위한 더 안전하고 비교적 빠른 방법을 제공하여 뉴클레아제 극성, 진행도 및 기질 선호도를 결정할 수 있습니다.

엑소뉴클레이스(exonuclease) 활성의 in vitro 분석을 수행하려면 실제 분석 외에도 여러 가지 준비 단계가 필요합니다. 절차의 개요는 그림 1에 나와 있습니다.
형광 기반 엑소뉴클레아제 분석을 수행하기 전에, 적절한 형광 이미지 시스템을 사용하여 urea-acrylamide 젤에서 분리된 형광 표지 올리고뉴클레오타이드 기질의 검출을 최적화하는 것이 매우 중요합니다. 필터 선택은 전체 분석의 민감도에 상당한 영향을 미칠 수 있으므로 매우 중요합니다. 본 연구의 올리고뉴클레오타이드 기질은 fluorescein으로 표지되었으므로 470 nm에서 흥분하고 520 nm에서 방출되는 필터가 필요합니다. 이 필터를 사용하여 이미지 장치의 민감도와 해상도를 모두 조정함으로써 저농도의 기질(또는 생성물)에 대한 검출 능력을 높일 수 있습니다(그림 2A 및 2B). 필터 대역폭에...

엑소뉴클레아제는 게놈 안정성을 보장하는 데 중요한 역할을 합니다. WRN 엑소뉴클레아제 기능의 손실은 조기 노화를 초래합니다. in vitro에서 뉴클레아제의 기질 및 기타 요구 사항을 연구하면 in vivo에서 뉴클레아제의 역할을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에서는 뉴클레아제 활성을 측정하기 위한 빠르고 재현 가능한 형광 기반 분석을 시연합니다.

DmWRNexo를 특성화하기 위한 형광 기반 엑소뉴클레아제 분석, human progeroid WRN 엑소뉴클레아제의 orthologue 및 다른 뉴클레아제에 대한 응용

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. ...

본 실험에서는 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 측정하기 위해 견고하고 재현 가능한 형광 기반 분석법을 사용합니다. 정제된 효소를 형광 DNA 기질과 함께 배양하여 효소가 DNA를 순차적으로 분해하도록 합니다. 그 다음, 아크릴아마이드-우레아 겔에서 DNA를 전개하여 분해 산물을 크기별로 분리합니다.다음으로, 형광 이미징을 사용하여 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성의 정도를 확인하고 정량화합니다. 분석 결과는 효소의 선호 기질 반응 조건, 연속성 및 전체 활성을 결정하는 데 활용될 수 있습니다. 기존의 방사성 동위원소 기반 기술과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 DNA 기질이 장기간 안정적으로 유지되어 재현성이 뛰어나고, 비용이 절감되며, 안전성이 높아진다는 점입니다.먼저, 2 M imidazole 스톡 용액의 적절한 부피를 사용하여 박테리아 용해물을 20 mM imidazole로 조정합니다. 그런 다음 20 mM imidazole 세척액을 사용하여 부피를 최소 1 mL로 맞춥니다. 10 mL의 Milli-Q water로 1 mL HisTrap 컬럼을 세척합니다. 그 후 10 mL의 20 mM imidazole로 컬럼을 평형화합니다.다음으로, 용해물을 컬럼에 로딩합니다. 용해물이 컬럼에 로딩될 때 상당한 배압이 발생할 수 있습니다. 이는 매우 정상적인 현상입니다. 주사기에 너무 많은 힘을 가하지 않도록 주의하며 일정하고 균일한 압력을 유지하십시오.용해물이 컬럼에 진입할 때 가벼운 색상 변화가 나타나는 것이 일반적입니다. 통과액을 7 mL 용량의 멸균 biju 병에 수집하여 얼음 위에 보관하십시오. 그런 다음 10 mL의 20 mM imidazole로 컬럼을 세척하십시오.이제 40 millimolar iole 5 mL를 컬럼에 통과시킵니다. 각 마이크로 원심분리 튜브에 수집되는 1 mL 분획을 측정하기 위해 시린지의 플런저를 주의 깊게 관찰하십시오. 마찬가지로, 각 iole 농도별로 5 mL씩 순차적으로 통과시키며 매번 5개의 1 mL 분획을 수집합니다.HRP 결합 anti hiss 항체를 이용한 닷 블로팅과 프로빙으로 분획물을 분석하여 피크 분획물을 확인합니다. 모든 시약은 4°C로 유지하며, 마스터 믹스를 멸균된 DNA free 0.5 mL 마이크로 튜브에 소분합니다. 초기 기질을 시각화하기 위해 효소가 포함되지 않은 대조군을 함께 포함합니다.이제 히트 블록을 효소 활성에 적합한 온도로 설정하십시오. 정지 용액이 포함된 IDE를 준비하여 상온에서 보관하십시오. 반응에 마지막으로 첨가할 시약들을 포함하여 히트 블록 근처의 작업 공간을 정리하십시오.1~10 µL 피펫과 팁, 타이머, 크라이오 랙 또는 아이스 버킷, 그리고 정지액을 준비합니다. 첫 번째 튜브에 효소를 첨가함과 동시에 타이머를 작동시키고 튜브를 히트 블록에 넣습니다. 나머지 튜브에도 15초 간격으로 계속해서 효소를 첨가하며, 타이머가 정해진 시간에 도달할 때마다 해당 튜브를 히트 블록에 넣습니다.첫 번째 샘플에 stop solution 10 µL를 첨가하고 피펫팅하여 혼합합니다. 즉시 얼음에 놓습니다. 각 반응의 배양 시간이 정확히 동일하도록, 설정한 순서와 적절한 시간 간격에 맞춰 나머지 반응들도 중단시킵니다. 각 샘플의 절반 또는 전체를 acrylamide gel에 로딩합니다. 겔의 전개 상태를 확인하기 위해 하나 이상의 레인에 염료가 포함된 1x stop solution을 로딩합니다.전기영동 후, 스페이서와 겔 플레이트 하나를 제거합니다. 침전된 urea 흔적을 제거하기 위해 겔 플레이트를 조심스럽게 헹구고 철저히 닦아냅니다. 겔이 아래로 향하도록 하여 플레이트를 겔 홀더의 유리 공간 위에 놓고, 필요한 경우 이를 이미지 분석 장치(imager)에 넣습니다.유리판 위 겔의 좌표를 기록하십시오. 적절한 소프트웨어를 실행하고 텍스트 프로토콜에 상세히 기술된 조건에 따라 스캔 영역의 기록된 부위를 스캔하십시오. 이미지를 자르고 데이터를 압축하십시오.필요한 경우, 저장한 후 분석을 위해 파일로 내보내십시오. 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성의 in vitro 분석을 수행하려면 여러 단계의 준비 과정이 필요합니다. 형광 기반의 엑소뉴클레아제 분석을 위한 실제 분석 외에도, 형광 이미징 시스템의 검출 최적화가 매우 중요합니다.예를 들어, 플루오레세인(fluorescein)으로 표지된 올리고뉴클레오타이드 기질의 경우, 470 nanometers에서 들뜸(excitation)이 일어나고 520 nanometers에서 방출(emission)이 이루어지도록 허용하는 필터가 필요합니다. 이 필터를 사용하면 이미저의 민감도와 해상도를 모두 조정함으로써 저농도의 기질 또는 생성물을 검출하는 능력을 높일 수 있습니다. 이때, 필터 대역폭에는 어느 정도의 허용 오차가 있음에 유의하십시오.최적이지 않은 필터를 선택하더라도 기질의 부분적인 검출은 가능하지만, 민감도는 훨씬 낮아집니다. 표지된 올리고뉴클레오타이드 농도와 이미저 설정을 적절하게 조합하면 기질을 안정적으로 검출할 수 있습니다. 활성 엑소뉴클레아제와 함께 배양하면 기질이 순차적으로 분해되어 각 밴드의 분해 산물 양이 적어지므로, 이러한 최적화 과정이 중요합니다.성공적인 exonuclease 분석은 기질을 5' 말단 방향으로 순차적으로 분해하여, 젤 상에서 exonuclease 분해를 나타내는 특징적인 사다리 모양의 DNA 패턴을 형성합니다. 검출 조건이 최적화되면, 이 분석법을 통해 정성적 및 정량적으로 서로 다른 활성을 검출할 수 있습니다.예를 들어, 야생형 단백질과 비교하여 뉴클레아제 돌연변이체의 활성 유무를 결정할 수 있습니다. 또한, 뉴클레아제에 의해 분해될 수 있는 능력을 확인하기 위해 다양한 기질을 테스트할 수도 있습니다. 조사 중입니다.이 in vitro 분석법은 관심 있는 뉴클레아제의 기질 특이성과 처리 과정을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.

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