Name: 고분자 마이크로 스피어 및 광섬유 번들을 사용하여 인간의 타액 단백질 분석을위한 다중 형광 마이크로 어레이 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 배우세요 형광 마이크로스피어와 광섬유 번들을 활용한 다중 단백질 분석 기법으로 인간 타액에서 여러 단백질을 동시에 검출하는 방법입니다. 이 기술은 기존 ELISA보다 높은 효율성과 민감도를 제공하여 임상 진단 응용 가능성을 보여줍니다.

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이 작품은 국립 보건원 (부여 08UDE017788-05)에 의해 지원되었다. EBP는 과학 기술에 대한 스페인 재단 (FECYT)에서 지원을 인정합니다. 저자는 원고의 중요한 읽기 Shonda T. 게일로드와 Pratyusha Mogalisetti 감사합니다.

<img alt="그림 1" width="600px" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50726/50726fig1.jpg" /> 그림 1. . 침 프로파일에 광섬유 미세 항체 어레이를 적용하는 작업 흐름 (1) 마이크로 스피어가 내부적이 형광 염료를 사용하여 인코딩되며, (2) 상기 인코딩 된 미소 구체는 외부 단백질 특이 모노클로 날 항체로 수정되고, (3), 다중화 미소 구체를 혼합, (5) 타액 단백질은 샌드위치 면역 측정법을 통해 미소 구에 의해 캡쳐되고, (6) 형광 현미경을 이용하여 정량화하고, (4) 임의로 광섬유 다발의 기단부에 에칭 마이크로 웰에 침착. 1. 마이크로 스피어 인코딩 <ol><li> 호박 유리 병에 나트륨 유로퓸 (III) thenoyltrifluoroacetonate 삼수화물 (EU-TTA, MW = 869.54 g / 몰)을 달아 테트라 하이드로 퓨란 (THF)에 200 밀리미터 주식 솔루션을 준비합니다. 피펫으로 부드럽게 혼합, 시각적으로 확인염료가 완전히 용해된다. </li><li> 호박 유리 병에 쿠마린 30 (C30, MW = 347.41 g / 몰)을 달아 THF에서 12 밀리미터 주식 솔루션을 준비합니다. 피펫으로 부드럽게 혼합, 시각적으로 염료가 완전히 용해되어 있는지 확인합니다. </li><li> 표 1에 기재된 최종 농도에 도달하는 스톡 용액 및 THF를 사용하여 각 미세 분류를위한 작업 용액 700 μl를 준비한다. </li><li> 마이크로 스피어 (10 % W / V)도 소용돌이로 교반에 의해 중단하고 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 60 ㎕의 현탁액을 전송되어 있는지 확인합니다. </li><li> 미세 현탁액에 600 ㎕의 PBS를 추가하고 20 배를 피펫으로 혼합한다. 3 분 동안 10,000 rpm으로 튜브를 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 미세 세척이 프로세스 또 다른 배를 반복합니다. </li><li> THF 단계 1.5와 유사한 절차를 이용하여 미세 펠렛의 3 배를 씻으십시오. </li><li> 3 분 동안 10,000 rpm으로 미세 / THF 현탁액을 원심 분리기, 뜨는을 제거하고 600 μL에 펠렛을 다시 일시 중지작업 용액은 표 1에 나열된. 새로운 1.5 밀리리터 microcentrifuge 관에 혼합물을 전송. </li><li> 파라 필름으로 microcentrifuge 관을 밀봉하고 통에 놓습니다. 3,000 rpm으로 흔들어 24 시간 동안 배양, 알루미늄 호일로 덮여 상자를 사용하여 설치를 덮어 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 펠릿을 형성하는 3 분 동안 10,000 rpm으로 미세 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 단계 1.5에 설명 된 상등액 염료 용액을 제거, 0.01 % 트윈 -20을 함유하는 다른 6X 600 ㎕의 PBS로 한 다음 미세 600 μL 메탄올로 씻어 6X. </li><li> 사용할 때까지, 빛으로부터 보호하는 4 ° C에서 0.01 % 트윈 20을 포함하는 600 ㎕의 PBS에 인코딩 미소를 저장합니다. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 마이크로 스피어 유형 이름 : </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </강한&gt; </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 유럽​​ 연합 (EU) - TTA (MM) </td><td> (100) </td><td> (100) </td><td> 10 </td><td> (100) </td><td> 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> C30 (MM) </td><td></td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> 표 1. 같은 유럽 TTA와 C30의 농도는 솔루션을 작동합니다. 2. 단백질 캡처 마이크로 스피어의 제조 <ol><li> [- (N-모르 폴리 노) 에탄 설 폰산 (MES) 0.1 M, 염화나트륨 0.9 %, SDS 0.01 %, 산도 5.7 2] PBS / SDS 버퍼 (나트륨 인산염 0.01 M, 염화나트륨 0.154 M, SDS 0.01 %, pH가 MES는 버퍼 준비 7.4) 실온에서 미리. </li><li> 안전 잠금 1.5 ML microcentrifuge 관에 (~ 2 밀리그램의 미소를 포함) 200 ㎕의 인코딩 된 미세 현탁액을 추가합니다. 이 단계 2.6에서 배양시 누유를 방지하기 microcentrifuge 관이 유형을 사용하는 것이 중요하다. </li> &lt;리&gt; 단계 1.5에 설명 된대로 배를 버퍼 600 μL의 MES와 미소를 씻으십시오. 마이크로 스피어 펠릿에 700 μL의 MES를 추가하고 피펫으로 잘 섞는다. </li><li> 준비 0.105 g / ml의 1 - 에​​틸 -3 - [3 - 디메틸 아미노 프로필] 카 보디이 미드 하이드로 클로라이드 (EDC, MW = 191.7 g / mol) 및 0.163 g / ㎖ 술포-N-히드 록 (설포-NHS, MW = 217.13 g / mol)의 별도의 튜브에있는 MES 버퍼 솔루션을 제공합니다. </li><li> 갓 마이크로 스피어 현탁액에 드롭으로 EDC 솔루션 드롭을 준비 150 μl를 추가합니다. EDC 따라서 그것은 고정화 효율을 보장하기 위해 갓 만든 솔루션을 사용하는 것이 필수적입니다, 매우 빠르게 가수 분해한다. 즉시 EDC의 추가 후, 미세에 150 ㎕의 설포-NHS의 솔루션을 추가 피펫으로 잘 섞어 현탁액이 균질 확인합니다. </li><li> 튜브 캡을 파라 필름으로 밀봉 통에 놓습니다. 4 시간 동안 1,500 rpm으로 흔들어 알루미늄 호일로 덮여 상자를 사용하여 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 마이크로 스피어 펜던트 핀을 원심 분리기펠렛을 형성하고, 상층 액을 제거하기 위해 3 분 동안 10,000 rpm에서 이온. 단계 1.5에 설명 된대로 500 ㎕의 PBS / SDS 버퍼 배에 미소를 씻으십시오. </li><li> 펠릿에 200 ㎕의 PBS / SDS 버퍼를 추가 물론 미세 혼합 60 μg 캡처 항체를 포함하는 300 ㎕의 PBS / SDS 버퍼에 솔루션을 전송합니다. 먼저 미세 펠렛을 일시 중단 한 후 항체 용액에 미세 현탁액을 추가하는 것이 중요합니다. </li><li> , 셰이커에 4 시간 동안 1,500 rpm으로 흔들어 항체 마이크로 혼합물을 품어 알루미늄 호일로 덮여 상자를 사용하여 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 펠렛을 형성하고, 상층 액을 제거하기 위해 3 분 동안 10,000 rpm으로 미세 현탁액을 원심 분리기. 500 μL의 StartingBlock (TBS) 단계 1.5에 설명 된대로, 버퍼의 3 배를 차단과 미세을 씻으십시오. </li><li> 버퍼를 차단 TBS 1 ㎖에 미소를 혼합 상자 코브를 사용하여 빛으로부터 보호, 쉐이커에 1 시간 동안 1,500 rpm에서 미소를 품다알루미늄 호일 빨간색. </li><li> 펠렛을 형성하고, 상층 액을 제거하기 위해 3 분 동안 7,000 rpm으로 미세 현탁액을 원심 분리기. 단계 1.5에 설명 된대로 500 μL의 TBS가, 차단 버퍼와 펠렛 배를 씻으십시오. </li><li> 펠렛을 형성하고, 상층 액을 제거하기 위해 3 분 동안 7,000 rpm에서 마이크로 스피어 솔루션을 원심 분리기. 차단 버퍼 500 μL의 TBS를 추가하고 피펫으로 혼합한다. </li><li> 빛으로부터 보호, 사용할 때까지 4 ° C에서 수정 된 미세 현탁액을 저장합니다. </li><li> 해당 항체를 사용하여 마이크로의 다른 유형을 만들기 위해이 절차를 반복합니다. </li></ol> 3. 광섬유 마이크로 어레이 조립 <ol><li> 새로운 멸균 microcentrifuge 관에 단백질 캡처 미소의 각 유형의 50 μl를 섞는다. 원심 분리기 주식 마이크로는 3 분 동안 7,000 rpm에서 풀, 나머지 볼륨이 약 100 μL가되도록 뜨는을 제거합니다. </li><li> 손으로 컷 광섬유 길이 약 5cm에 번들순차적 필름 랩핑 30, 15, 15, 6, 3, 1, 0.5, 및 0.05 μm의 크기의 다이아몬드를 사용한 연마 장치에 양단 닦아. 모든 입자를 제거하기 위해 2 분 동안 탈 이온수 연마 번들을 초음파 처리. </li><li> 0.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 작은 자석 교반 막대를 넣고, 단백질이없는 PBS 400 μL 버퍼와 공기 방울을 제거하기 위해 30 분 동안 자기 교반 판에 자극을 추가합니다. </li><li> 150 초 10,16 대해 0.025 N HCl 용액으로 연마 섬유 다발의 일단을 에칭. 즉시 물속에 1 분 동안 탈 이온수에서 에칭 단부 초음파 처리. 압축 공기와 섬유 다발 말린다. </li><li> 광섬유 홀더에 섬유 다발을 마운트하고 1 시간 동안 기포없이, 단백질이없는 PBS 버퍼에 에칭 단부 블록. </li><li> 광섬유 다발의 에칭 끝의 저장 미세 현탁액 예금 1 μL 나누어지는. 알루미늄 호일 상자 빛에서 설정을 보호하고, 15 분 동안 기다립니다. 현탁액의 부피 것증발에 의해 감소​​하고 에칭 된 마이크로 웰에 미소 강제. 이로드 단계를 한 번 더 반복합니다. </li><li> 마이크로 웰에 갇혀되지 미소를 제거하기 위해 시료 용액으로 포화 면봉을 사용합니다. 단백질 마이크로 어레이는 이제 사용할 수 있습니다. 타액 분석을 위해 4.1 단계로 바로 이동합니다. </li></ol> 4. 마이크로 스피어 마이크로 어레이를 사용하여 침 샘플 분석 <ol><li> 200 ㎕의 샘플 용액 (버퍼를 차단. 타액 상층의 수집 프로토콜은 이전에 10 게시 된 StartingBlock T20 (PBS)의 같은 부피로 희석하여 100 ㎕의 타액 상층 액)를 추가합니다. 0.5 ㎖ 멸균 microcentrifuge 관에. 용액에 섬유에로드 된 단백질 마이크로 어레이를 담그고 2 시간 동안 600 rpm으로 진탕 배양, 알루미늄 호일로 덮여 상자를 사용하여 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 10 % 트윈 20 19.6 ㎖의 PBS, 미시간에 200 ㎕의 10 % BSA 용액 200 μl를 추가하여 20 ㎖ 세척 버퍼를 준비합니다X도 부드럽게 흔들어. </li><li> 200 μL 세척 버퍼를 포함하는 새로운 멸균 microcentrifuge 관에 단백질 마이크로 어레이를 담그고 2 분 동안 600 rpm으로 흔들. 이 세척의 배를 반복합니다. </li><li> 항-VEGF, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9의 5 ㎍ / ㎖의를 포함하는 검출 항체 칵테일의 100 ㎕의 용액에 마이크로 어레이를 품어, StartingBlock T20에서 IL-1β 바이오틴 검출 항체 (PBS) 버퍼를 차단 600 rpm에서 진탕 기에서 실온에서 30 분 동안, 알루미늄 호일로 덮여 상자를 사용하여 빛으로부터 보호한다. </li><li> 4.3 단계에 설명 된대로 세척 버퍼와 마이크로 어레이의 3 배를 씻으십시오. </li><li> 10 분 동안 진탕 600 rpm에서 PBS에서 20 ㎍ / ㎖의 스트렙 타비 딘 R-피코 에리 트린의 어원 (SAPE) 솔루션을 200 μL의 마이크로 어레이를 품어 알루미늄 호일로 덮여 상자를 사용하여 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 4.3 단계에 설명 된대로 세척 버퍼와 마이크로 어레이의 5 배를 씻으십시오. </li><li> 섬유 거리 (즉, 말의 말단부를 청소미세부터) 무수 에탄올로 포화 면봉과 함께 제공. </li><li> 압축 공기와 함께 광섬유의 양단 말린다. 섬유의 말단부를 통해 epifluorescent 현미경 이미지 섬유를 장착합니다. </li><li> 같은 유럽 TTA, C30, 및 SAPE 형광 방출 강도에 해당하는 마이크로 스피어 이미지를 획득. Eu를-TTA, C30 및 SAPE의 형광 이미징을위한 광학 필터 설치 및 노출 시간은 표 2에 도시된다. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 채널 </td><td> 유럽 ​​연합 (EU) - TTA </td><td> C30 </td><td> SAPE </td></tr><tr><td> 자극하는 사람 </td><td> 365/10x </td><td> 350/50x </td><td> 546/10x </td></tr><tr><td> 빔 스플리터 </td><td> 525DCLP </td><td> 400DCLP </td><td> 560LP </td></tr><tr><td> 이미 터 </td><td> 620/60m </td><td> 460/50m </td><td> 580/30m </td></tr><tr><td> 노출 시간 </td><td> 1 초</td><td> 0.3 초 </td><td> 1 초 </td></tr></tbody></table> 표 2. 마이크로 어레이의 세 가지 형광 이미지의 매개 변수.

<ol><li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+gene-expression+patterns+with+a+complementary-DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray.</a> Science. 270, 467-470 (1995).</li>
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	 <a target="_blank" href="http://www.rndsystems.com/Products/MAB002">http://www.rndsystems.com/Products/MAB002</a> (2013).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

연구팀은 다음 단계에 특별한주의를 지불해야한다 : 더 나은 해독 정확성을 위해, 그것은 미세 균일하게 모든 배양에 현탁 확인하고 미소 인코딩 절차에서 단계를 세척 할 필요가있다. 또, 부호화 된 미소 구체 전체 실험을하는 동안 광으로부터 보호 할 필요가있다. 적절한 인코딩 및 저장 절차에 따라, 우리는 전체 디코딩 정확도는 99 % 이상이었다 것으로 나타났습니다. 인코딩 된 마이크로 스피어 C. 동결을 피하고 빛으로부터 보호하는 4 ℃에서 보관해야합니다. 적절한 보관 조건에서 인코딩 된 마이크로 스피어가 6 개월 이상 안정적이다. 극도의주의가 미소 구체의 손실을 감소시키기 위해 인코딩 및 수정 단계에서 요구된다. 상층 액을 제거 할 때 예를 들어, 미세 펠렛을 방해하지 않습니다. 또한, 버퍼에 트윈 -20 및 SDS를 포함하여 더 미세 구 펠렛 필수적이다. 일부 oF 일반적인 해결 절차는 다음과 같다 : (1) (단...

마크 Schena 1990 년대 중반에서 동료에 의해보고되는 최초의 마이크로 어레이 때문에,이 강력한 도구는 생물학 연구 1의 많은 분야에서 활용되고 있습니다. 동시에 혈액과 같은 체액 진단, 여러 단백질을 검출 할 수있는 항체 마이크로 어레이는, 임상 진단 및 바이오 마커 검사 2-10에서 중요한 응용 프로그램이 있습니다. 타액, 혈액과 같은 분석 물질의 많은 것을 포함하는, 타액 수집 안전한 비 침습적이므로 혈액 바람직한 대안으로 간주되었으며, 최소한 숙련 된 의료인 11-13에 의해 수행 될 수있다. 현재, 타액으로 다중화 단백질 분석은 표적 피 분석 물 (14)의 낮은 농도와 상이한 바이오 마커 (15)의 넓은 농도 범위를 포함하여 여러 가지 중요한 요인에 의해 제한된다. . 여기서, 우리는 육 단백질의 분석을 설명 : 인간 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터페론 감마 - 유도 단백질 10 (IP-10), 인터루킨 -8 (IL-8), 표피 성장 인자 (EGF), 매트릭스 metallopeptidase 9 (MMP-9) 및 인터루킨 -1 베타 (IL-1β) . 방법의 성능은 초기 분석 재조합 단백질을 구성하고 차단 완충액의 표준 용액을 사용하여 확인 하였다. 다른 만성 호흡기 질환의 환자뿐만 아니라 건강한 대조군에서 수집 된 실제 타액 샘플도 만족스러운 성능을 시험 하였다. 이 프로토콜은 다른 단백질 분석 및 기타 마이크로 스피어 기반의 분석에 적용 할 수 있어야합니다. 그것과 비교하여 넓은 동적 범위, 최소한의 비특이적 상호 작용을 감소 샘플 소모 및 저렴한 비용으로 여러 단백질의 낮은 농도의 빠르고 정확하고 재현성 동시 분석을 가능으로이 플랫폼은 분석 화학 분야에 상당한 이점을 제공한다 유사한 효소 결합 면역 분석 (ELISA).

<table><tbody><tr><td>Eu-TTA 염료</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42319-0010</td><td></td></tr><tr><td>THF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34865-100ML</td><td></td></tr><tr><td>호박색 유리 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-339-23B</td><td></td></tr><tr><td>Coumarin 30 염료</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>546127-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Microspheres</td><td>Bangslabs</td><td>PC05N/6698</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x 농축액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tw-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>BupH MES 완충 식염수</td><td>Thermo Scientific</td><td>28390</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05030-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 솔루션</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td>Safe-lock microcentrifuge tube</td><td>VWR labshop</td><td>53511-997</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Human VEGF capture antibody</td><td>R& D Systems</td><td>MAB293</td><td></td></tr><tr><td>Human IP-10 capture 항체</td><td>R& D Systems</td><td>MAB266</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-8 포획 항체</td><td>R& D Systems</td><td>MAB208</td><td></td></tr><tr><td>인간 EGF 캡처 항체</td><td>R& D Systems</td><td>MAB636</td><td></td></tr><tr><td>Human MMP-9 capture 항체</td><td>R& D Systems</td><td>MAB936</td><td></td></tr><tr><td>인간 IL-1&beta; 포획 항체</td><td>R& D Systems</td><td>MAB601</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgG1 동형 대조군 항체</td><td>R& D Systems</td><td>MAB002</td><td></td></tr><tr><td>StartingBlock(TBS) 완충액</td><td>Thermo Scientific</td><td>37542</td><td></td></tr><tr><td>HCl 표준 용액 1.0 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318949-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>무단백질(PBS) 완충액</td><td>Thermo Scientific</td><td>37572</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 VEGF 165</td><td>R& D 시스템</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IP-10</td><td>R& D 시스템</td><td>266-IP</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-8</td><td>R& D Systems</td><td>208-IL</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 EGF</td><td>R& D 시스템</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 MMP-9</td><td>R& D 시스템</td><td>911-MP</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-1&베타;</td><td>R& D Systems</td><td>201-LB</td><td></td></tr><tr><td>StartingBlock T20 (PBS) 버퍼</td><td>Thermo Scientific</td><td>37539</td><td></td></tr><tr><td>Blocker BSA in PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>37525</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated VEGF 검출 항체</td><td>R& D Systems</td><td>BAF293</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated IP-10 검출 항체</td><td>R& D Systems</td><td>BAF266</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 IL-8 검출 항체</td><td>R& D Systems</td><td>BAF208</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 EGF 검출 항체</td><td>R& D Systems</td><td>BAF236</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 MMP-9 검출 항체</td><td>R& D Systems</td><td>BAF911</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 IL-1&beta; 검출 항체</td><td>R& D Systems</td><td>BAF201</td><td></td></tr><tr><td>스트렙타비딘, R-피코에리트린</td><td>Invitrogen</td><td>S-21388</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(200프루프)</td><td>시그마-알드리치</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

고분자 마이크로 스피어 및 광섬유 번들을 사용하여 인간의 타액 단백질 분석을위한 다중 형광 마이크로 어레이

Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles

여기서, 우리는 동시에 광섬유 마이크로 스피어 계 항체 배열을 사용하여 침 육 단백질을 측정하기위한 프로토콜을 기술한다. 채용 면역 어레이 기술은 형광 현미경의 사용으로 미세 기반 서스펜션 어레이 제조의 이점을 결합한다. 비디오 프로토콜에서 설명한 바와 같이, 시판되는 4.5 ㎛의 중합체 미세 물리적 미소 구체 안에 갇혀이 형광 염료의 농도에 의해 분화 된 일곱 가지 유형으로 인코딩되었다. 표면에 카르복실기를 함유하는 미소 구체는 부호화 EDC / NHS 커플 링 화학을 통해 캡쳐 항체 모노클로 개질되었다. 단백질 마이크로 어레이를 조립하기 위해, 인코딩과 기능화 미소 구체의 다른 유형들을 혼합하고, 임의로 화학적 광섬유 다발의 기단부에 에칭 된 4.5 ㎛의 마이크로 웰, 증착. 광섬유 다발 반송로 양 및 m을 묘화에 사용 된icrospheres. 일단 조립, 마이크로 어레이는 병원에서 수집 된 타액 상등액에서 단백질을 캡처하는 데 사용 하였다. 검출은 스트렙 타비 딘 - 컨쥬 형광 프로브, R-피코 에리 트린을 가진 다른 분석을 위해 비 오티 닐화 된 검출 항체의 혼합물을 사용하여 샌드위치 면역 분석법을 기반으로했다. 마이크로 어레이 마이크로 스피어 등록 및 분석 신호 하나를 세 가지 채널, 두 형광 현미경에 의해 촬영되었다. 형광 현미경은 디코딩 및 MATLAB에서 제 알고리즘을 이용하여 분석 하였다.

광섬유 다발의 작은 단면을 나타내는 세 개의 채널로부터 형광 이미지는도 2A-C에 나타내었다. (토론 섹션에서보다 상세히 설명 됨)이 이미지는 MATLAB 작성 알고리즘을 이용하여 분석 하였다. 분석은 마이크로 스피어 디코딩을 EU의 TTA 부호화 화상 (도 2a)로부터의 정보 및 C30 부호화 화상 (도 2B) 모두를 채용하고, 신호 콘텐츠 (도 2c)의 다른 구체의 형광 강도를 계산 하였다. 상관 된 단백질로부터 얻은 표준 교정 곡선, 타액 샘플에서 단백질의 농도를 계산 하였다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50726/50726fig2.jpg" /> 그림 2. (A)-TTA E...

우리는 다중 미세 기반 항체 배열을 사용하여 타액 단백질 프로파일위한 절차를 설명한다. 단일 클론 항체는 공유 보디이 미드 화학을 사용하여 형광 염료로 인코딩 된 4.5 μm의 폴리머 마이크로 스피어에 연결되어 있었다. 변형 된 미소 구체는 형광 샌드위치 면역 분석을 사용하여 침의 단백질 수준을 측정하기 위해 광섬유 마이크로 웰에서 증착되었다.

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array ...

본 절차의 전체적인 목적은 마이크로스피어 기반의 형광 어레이를 사용하여 인간 타액 시료 내의 여러 단백질을 분석하는 것입니다. 먼저, 두 종류의 형광 염료를 서로 다른 양으로 조합하여 마이크로스피어를 부호화합니다. 그 후, 부호화된 마이크로스피어에 각기 다른 단백질에 대한 포획 항체를 결합시킵니다.그 다음, 조립된 마이크로어레이의 샌드위치 면역 분석법을 이용하여 섬유 광다발 위에 다중 단백질 마이크로어레이를 구성하고, 테스트 타액 샘플 내의 여러 단백질을 분석합니다. 최종적으로, 형광 현미경 분석을 통해 타액 샘플 내 서로 다른 단백질의 신호 반응을 측정할 수 있습니다. ELISA와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 복잡한 생체 유체 내의 여러 단백질을 동시에 분석할 수 있다는 점입니다.이 방법은 인간 타액 분석에 대한 통찰을 제공할 수 있지만, 혈청, 소변 및 객담과 같은 다른 생체 유체에도 적용할 수 있습니다. 갈색 유리 바이알에 opium TTA를 정밀하게 측정하여 넣고, tetra hydro Furin을 사용하여 200 millimolar 스톡 용액을 준비합니다. 피펫팅으로 부드럽게 혼합하고 염료가 완전히 용해되었는지 육안으로 확인합니다.마찬가지로, 피펫팅으로 부드럽게 혼합하여 12 millimolar의 Coumarin 30 스톡 용액을 준비합니다. 육안으로 D가 완전히 용해되었는지 확인한 후, 마이크로스피어 현탁액을 볼텍스 처리하고 60 microliters를 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 마이크로스피어를 세척하기 위해 600 microliters의 PBS를 넣고 피펫팅으로 20회 혼합한 후, 10, 000 RPM에서 3분 동안 원심분리합니다.테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran) 용액으로 3회 세척한 후, 상층액을 제거하고 펠릿을 600 µL의 작동 용액에 재현탁시킨 다음, 혼합물을 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 마이크로 원심분리 튜브를 파라필름으로 밀봉하여 쉐이커 위에 놓습니다. 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호하십시오.안전 잠금 장치가 있는 1.5 milliliter 미세 원심 분리 튜브에 코딩된 마이크로스피어 현탁액 200 microliters를 넣습니다. 갓 준비한 EDC 용액 150 microliters를 한 방울씩 첨가합니다. 즉시 sulfa NHS 용액 150 microliters를 넣습니다. 피펫팅으로 잘 섞어 현탁액이 균질한지 확인합니다.튜브의 캡을 닫고 파라필름으로 밀봉한 후 쉐이커에 놓습니다. 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호하십시오. P-B-S-S-D-S 버퍼로 3회 세척한 후, 펠렛을 200 µL의 P-B-S-S-D-S 버퍼 혼합액에 현탁합니다.그런 다음, 60 µg의 포획 항체가 포함된 300 µL의 PBSSDS 완충액으로 용액을 옮깁니다. 각 유형의 단백질 포획 마이크로스피어 50 µL를 새로운 오토클레이브 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 혼합합니다. 스톡 마이크로스피어 풀을 7,000 RPM에서 3분간 원심분리한 후, 상청액을 100 µL만 남기고 모두 제거합니다.이제 광섬유 번들을 약 5 cm 길이로 직접 자른 후, 다이아몬드 래핑 필름을 사용하여 양 끝단을 순차적으로 연마합니다. 그다음 연마된 번들을 탈이온수에서 2분 동안 초음파 처리합니다. 입자를 제거하기 위해 0.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 작은 마그네틱 스터링 바를 넣습니다.단백질이 없는 PBS 버퍼 400 µL를 첨가하고 마그네틱 교반기 위에서 30분 동안 교반합니다. 기포를 제거하기 위해 연마된 광섬유 번들의 한쪽 끝을 0.025 N 염화수소 용액에 150초 동안 식각합니다. 식각된 N을 즉시 탈이온수에 담그고 1분 동안 초음파 처리합니다.그 다음, 압축 공기로 섬유 다발을 건조시킨 후 섬유 홀더에 장착하고, 식각된 끝부분을 기포와 단백질이 없는 PBS 완충액에 1시간 동안 담가둡니다. 보관된 마이크로스피어 현탁액 1 µL를 섬유 광다발의 식각된 끝부분에 분주합니다. 알루미늄 호일로 감싼 상자를 사용하여 장치를 빛으로부터 보호합니다. 15분이 지나면 증발로 인해 현탁액의 부피가 감소하며 마이크로스피어가 식각된 마이크로웰 내부로 강제로 진입하게 됩니다.시료 용액으로 적신 면봉을 사용하여 마이크로 웰에 포획되지 않은 마이크로스피어를 제거합니다. 단백질 마이크로어레이를 사용할 준비를 하려면, 0.5 mL 오토클레이브 마이크로 원심분리 튜브에 200 µL의 시료 용액을 넣습니다. 파이버에 로드된 단백질 마이크로어레이를 용액에 담근 후 쉐이커 위에 놓습니다.알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호합니다. 다음으로, 200 µL의 세척 완충액이 들어 있는 새로운 오토클레이브용 마이크로 원심분리 튜브에 단백질 마이크로어레이를 담그고 600 RPM으로 2분 동안 흔들어 줍니다. 이제 비오틴화된 검출 항체와 PBS 블로킹 완충액이 포함된 100 µL의 검출 항체 칵테일 용액에서 마이크로어레이를 30분 동안 배양합니다.실온의 암소에서 절대 에탄올을 적신 면봉으로 파이버 번들의 원위단을 세척합니다. 그런 다음 압축 공기로 파이버의 양끝을 건조시키고 파이버를 에피 형광 현미경에 장착한 후 파이버의 원위단을 통해 이미지를 촬영하여, opium TTAC 30 및 SAP 형광 방출 강도에 해당하는 마이크로스피어 이미지를 획득합니다. 7가지 마이크로스피어 유형의 인코딩 이미지가 여기에 표시되어 있습니다.UTTA 인코딩 이미지에서 두 가지 강도 수준이 관찰되며, 이는 서로 다른 양의 UTTA 염료로 인코딩된 마이크로스피어를 나타냅니다. C 30 인코딩 이미지에서도 유사한 결과가 관찰됩니다. MATLAB 이미지 분석을 통해 시그널 이미지 내 서로 다른 마이크로스피어의 형광 강도를 계산할 수 있습니다. 디코딩 결과는 그림 2D 7에 나타나 있습니다.서로 다른 마이크로스피어들이 성공적으로 디코딩되었습니다. 어세이 버퍼와 함께 배양했을 때 마이크로스피어들은 아무런 반응을 보이지 않았습니다. 인간 타액 샘플과 함께 배양했을 때는 유의미한 형광 반응이 관찰되었습니다.더 나은 비교를 위해, 이 두 그림의 대비(contrast)를 동일한 수준으로 조정하였습니다. 이 방법을 숙달하면 인간 타액 샘플 내의 서로 다른 단백질에 대해 재현 가능한 분석이 가능합니다. 동일한 샘플에 대해 세 차례 독립적으로 검출한 결과가 제시되어 있습니다.이 영상을 시청하신 후에는 마이크로스피어 기반의 다중 단백질 마이크로어레이를 준비하고 이를 복잡한 생체 시료 분석에 활용하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 본 절차를 따라 다른 복잡한 생체 시료 내의 다양한 단백질 바이오마커 또한 분석할 수 있습니다.

multiplexed-fluorescent-microarray-for-human-salivary-protein

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

우리는 oligonucleotide 결합 형광 구슬을 사용하여 샘​​플 내에 미생물의 검출을위한 다양한 방법을 설명합니다. 샘플 내의 모든 생물에서 Amplicon는 프로브 결합 구슬의 패널에 hybridized입니다. Luminex 또는 바이오 플렉스 악기는 비드 타입과 하이브 리다이 제이션 신호를 각 비드를 쿼리하는 데 사용됩니다.

Oligonucleotide - 결합 형광등 Microspheres를 사용하여 복잡한 임상 및 환경 샘플에서 박테리아의 멀티 플렉스 감지

온 - 칩 photopolymerization 기술을 사용하여 폴리머 microarray의 형성에 대한 설명입니다. 원자 힘 현미경, 물 접촉 각도 측정, X-선 광전자 분광법 및 비행 차 이온 질량 분광법과 세포 부착 분석 시간을 사용하여 높은 처리량 표면 특성도 설명되어 있습니다.

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

Luminex Corporation의 xMAP의 microsphere 기술을 사용, 우리는 다양한 실험실 동물 종의 serosurveillance에 대한 다중 Fluorometric 면역 분석법 (MFIA)를 개발했습니다. MFIA는 항원, 조직 제어 또는 면역 글로불린이 covalently 색으로 구분되는 폴리스티렌 마이크로에 연결되어 정지 microarray입니다. MFIA 테스트 방법뿐만 아니라 다양한 문제 해결 항목은 해결됩니다.

멀티 플렉스 Fluorometric 면역 분석법 테스트 방법론 및 문제 해결

이 동영상은 인간 타액에서 여러 환경 병원체에 대한 항체를 동시에 검출하는 비드 기반 다중 면역분석 기술을 보여줍니다. 형광 구슬은 인간 타액 샘플의 항체를 사용하여 캡처된 다른 병원체의 항원에 결합되었습니다. 형광 리포터를 사용하여 항체를 라벨링한 후, 타액 내 다양한 병원체 특이적 항체의 존재를 평가하기 위해 유세포 분석을 사용하여 비드를 분석했습니다.

타액에서 병원체 특이적 항체를 식별하기 위한 비드 기반 다중 면역 분석

이 프로토콜은 세포 신호 전달 연구와 바이오 마커 검출 잠재적 인 응용 프로그램과 대규모의 제조, 다중화 된 두 차원의 DNA 또는 항체 배열을 설명합니다.

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액적 미세유체역학에서 다색 형광 검출은 일반적으로 부피가 크고 복잡한 에피 형광 현미경 기반 검출 시스템을 포함합니다. 여기에서는 단일 광검출기에서 수집한 다색 데이터를 시간적으로 인코딩하기 위해 광섬유 어레이를 사용하는 소형 모듈식 다색 검출 체계에 대해 설명합니다.

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