고분자 마이크로 스피어 및 광섬유 번들을 사용하여 인간의 타액 단백질 분석을위한 다중 형광 마이크로 어레이
October 10th, 2013
우리는 다중 미세 기반 항체 배열을 사용하여 타액 단백질 프로파일위한 절차를 설명한다. 단일 클론 항체는 공유 보디이 미드 화학을 사용하여 형광 염료로 인코딩 된 4.5 μm의 폴리머 마이크로 스피어에 연결되어 있었다. 변형 된 미소 구체는 형광 샌드위치 면역 분석을 사용하여 침의 단백질 수준을 측정하기 위해 광섬유 마이크로 웰에서 증착되었다.
이 절차의 전반적인 목표는 미세구 기반 형광 어레이를 사용하여 인간 타액 샘플의 여러 단백질을 분석하는 것입니다. 먼저, 두 가지 형광 염료의 다른 양으로 미세구를 인코딩합니다. 서로 다른 단백질에 대한 포획 항체를 인코딩된 마이크로스피어에 결합합니다.
그런 다음 시험 타액 샘플의 여러 단백질에 대해 조립된 마이크로어레이 분석실험에 끼워진 면역분석법을 사용하여 광섬유 번들에 다중화된 단백질 마이크로어레이를 조립합니다. 궁극적으로 형광 현미경 검사에 의한 분석은 타액 샘플에서 다양한 단백질의 신호 반응을 측정할 수 있습니다. Eliza와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 복잡한 생체 유체에서 여러 단백질을 동시에 분석할 수 있다는 것입니다.
이 방법은 인간의 타액 분석에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 혈청 소변 및 객담과 같은 다른 생물 독감에도 적용할 수 있습니다. 앰버 글래스(Amber Glass) 바이알에 담긴 아편 TTA의 무게를 측정하고 테트라 하이드로 퓨린(tetra hydro Furin)에 200밀리몰의 스톡 용액을 준비합니다. 피펫팅으로 부드럽게 혼합하고 염료가 완전히 용해되었는지 육안으로 확인합니다.
마찬가지로, 피펫팅으로 부드럽게 혼합된 Coumarin 30의 12밀리몰 스톡 용액을 준비합니다. 시각. D가 완전히 용해된 와류가 마이크로스피어 현탁액으로 전환되었는지 확인한 다음 60마이크로리터를 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 이동합니다. 마이크로스피어를 세척하기 위하여는, 10, 3 분 동안 000 분당 회전수에 피펫팅과 원심분리기에 의해 섞인 PBS의 600 마이크로리터를 추가하십시오.
테트라 하이드로 퓨린 용액으로 3회 세척한 후 상층액을 제거하고 600마이크로리터의 작업 용액에 입천장을 재현탁시킨 다음 혼합물을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 마이크로 원심분리기 튜브를 파라 필름으로 밀봉하고 셰이커에 놓습니다. 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호하십시오.
200마이크로리터의 인코딩된 마이크로스피어 현탁액을 안전 잠금 장치인 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다. 적하 방식으로 150 마이크로 리터, 갓 준비된 EDC 용액을 즉시 150 마이크로 리터의 설파 NHS 용액을 첨가하십시오. 피펫팅으로 잘 혼합하고 현탁액이 균질한지 확인합니다.
튜브의 뚜껑을 닫고 파라폼으로 밀봉한 다음 셰이커에 놓습니다. 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호하십시오. P-B-S-S-D-S 버퍼 reus를 3회 세척한 후 펠릿을 200마이크로리터의 P-B-S-S-D-S 버퍼 믹스에 현탁시킵니다.
그런 다음 용액을 60마이크로그램의 포획 항체가 포함된 300마이크로리터의 P-B-S-S-D-S 버퍼로 옮깁니다. 각 유형의 단백질 포획 마이크로스피어 50마이크로리터를 새로운 오토클레이브 마이크로 원심분리기 튜브에 혼합합니다. 3 분 동안 7, 000 RPM에서 스톡 마이크로 스피어 풀을 원심분리하고 100 마이크로 리터의 상층액을 제외한 모든 것을 제거합니다.
이제 약 5cm 길이의 광섬유 다발을 손으로 자르고 다이아몬드 래핑 필름을 사용하여 양쪽 끝을 순차적으로 연마합니다. 그런 다음 연마된 다발을 탈이온수에 2분 동안 초음파 처리합니다. 입자를 제거하려면 작은 자기 교반 막대를 0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.
400마이크로리터의 무단백질 PBS 완충액을 넣고 자석 교반 플레이트에서 30분 동안 저어줍니다. 기포를 제거하려면 연마된 섬유 다발의 한쪽 끝을 0.025 일반 염화수소 용액에 150초 동안 에칭합니다. 에칭된 N을 즉시 탈이온수에 1분 동안 담그고 초음파 처리합니다.
그런 다음 압축 공기로 섬유 다발을 건조시키고 섬유 다발을 섬유 홀더에 장착하고 에칭된 끝을 기포가 없는 단백질이 없는 PBS 버퍼에 막고 광섬유 다발의 에칭된 끝에 저장된 마이크로스피어 현탁액의 1마이크로리터 ALI 쿼드를 1시간 동안 증착합니다. 알루미늄 호일로 감싼 상자로 빛으로부터 설정을 보호하십시오. 15분 후, 현탁액의 부피는 증발에 의해 감소하고 마이크로스피어를 에칭된 마이크로 웰로 밀어 넣습니다.
샘플 용액으로 포화된 면봉을 사용하여 마이크로 웰에 갇히지 않은 미세구를 제거합니다. 단백질 마이크로어레이를 사용할 준비가 되도록 하려면 0.5밀리리터 오토클레이브 마이크로 원심분리기 튜브에 200마이크로리터의 샘플 용액을 추가합니다. 섬유에 적재된 단백질 마이크로어레이를 용액에 담그고 셰이커에 놓습니다.
알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호하십시오. 다음으로, 단백질 마이크로어레이를 200마이크로리터의 세척 버퍼가 들어 있는 새로운 오토클레이브 마이크로 원심분리기 튜브에 담그고 600RPM으로 2분 동안 흔듭니다. 이제 바이오틴화된 검출 항체와 A PBS 차단 버퍼를 포함하는 검출 항체 칵테일의 100마이크로리터 용액에 마이크로어레이를 30분 동안 배양합니다.
어두운 실온에서 절대 에탄올로 포화된 면봉으로 섬유 다발의 말단 끝을 청소합니다. 그런 다음 압축 공기로 섬유의 양쪽 끝을 건조시키고 섬유를 에피 형광 현미경에 장착하고 섬유의 말단 끝을 통해 이미지화하고 아편 TTAC 30 및 SAP 형광 방출 강도에 해당하는 마이크로스피어 이미지를 획득합니다. 7가지 마이크로스피어 유형의 인코딩 이미지가 여기에 나와 있습니다.
UTTA 인코딩 이미지에서 두 가지 강도 수준이 관찰되며, 이는 서로 다른 양의 UTTA 다이로 인코딩된 마이크로스피어를 나타냅니다.유사한 결과가 C 30 인코딩 이미지에서 관찰됩니다. MATLAB 이미지 분석을 통해 신호 이미지에서 다양한 마이크로스피어의 형광 강도를 계산할 수 있습니다. 디코딩 결과는 그림 2D 7에 나와 있습니다.
다양한 마이크로스피어가 성공적으로 디코딩됩니다. 마이크로스피어는 분석 버퍼로 배양할 때 반응을 보이지 않습니다. 인간 타액 샘플로 배양할 때 상당한 형광 반응이 관찰됩니다.
더 나은 비교를 위해 이 두 그림의 대비는 동일한 수준으로 조정되었습니다. 이 방법을 마스터하면 인간 타액 샘플에서 다양한 단백질을 재현 가능한 분석으로 수행할 수 있습니다. 동일한 샘플에 대한 세 가지 독립적인 검출 결과가 표시됩니다.
이 동영상을 시청한 후에는 마이크로스피어 기반 멀티플렉스 단백질 마이크로레이를 준비하고 이를 복잡한 바이오 유체 분석에 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 따릅니다. 다른 복합 바이오유체의 다른 단백질 바이오마커도 분석할 수 있습니다.
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개요
이 기사는 다중화된 마이크로스피어 기반 항체 어레이를 사용하여 타액 단백질을 프로파일링하는 절차에 대해 설명합니다. 이 방법은 인간 타액 샘플에서 여러 단백질을 동시에 분석할 수 있게 해주어 기존 분석법의 기능을 향상시킵니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생명공학
- 단백질체학
배경
- 타액은 건강과 질병에 대한 통찰력을 제공할 수 있는 다양한 단백질을 포함하고 있습니다.
- ELISA와 같은 전통적인 방법은 한 번에 한 개의 단백질을 분석하는 데 제한됩니다.
- 다중 분석법은 효율성과 데이터의 풍부함을 향상시킬 수 있습니다.
- 형광 마이크로스피어 기술은 단백질 검출을 위한 새로운 접근 방식을 제공합니다.
연구 목적
- 타액에서 여러 단백질을 동시에 분석하는 방법을 개발합니다.
- 복잡한 생체액에서 단백질 검출의 민감도와 특이성을 향상시킵니다.
- 기존의 단일 분석물 분석법에 대한 보다 효율적인 대안을 제공합니다.
사용된 방법
- 형광 염료로 마이크로스피어를 인코딩합니다.
- 포획 항체를 마이크로스피어에 공유 결합합니다.
- 광섬유 번들에 다중 단백질 마이크로어레이를 조립합니다.
- 형광 샌드위치 면역분석법을 사용하여 타액 샘플에서 단백질을 검출합니다.
주요 결과
- 이 방법은 타액 샘플에서 여러 단백질을 성공적으로 검출했습니다.
- 형광 현미경은 다른 단백질에 대한 명확한 신호 반응을 제공했습니다.
- 이 기술은 전통적인 ELISA 방법에 비해 장점을 보여주었습니다.
- 결과는 임상 진단에 잠재적 응용 가능성을 나타냅니다.
결론
- 이 다중 분석 접근법은 타액 단백질의 효율적인 분석을 가능하게 합니다.
- 이 방법은 다양한 건강 상태에 대한 더 나은 이해를 촉진할 수 있습니다.
- 미래 연구는 이 기술의 응용을 다른 생체액으로 확장할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Multiplexed protein analysis in complex biofluids like saliva addresses a critical bottleneck in biomarker discovery, where traditional single-plex assays limit throughput and increase sample consumption. This microsphere-based fiber-optic array enables simultaneous quantification of multiple salivary proteins, improving assay efficiency and supporting early-stage target validation in neurodegenerative and inflammatory disease research. By providing quantitative, reproducible readouts from limited clinical samples, the method enhances predictive confidence in lead identification and preclinical de-risking workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring multiple salivary protein biomarkers simultaneously in disease-relevant samples.
- Operational Value: Reduces sample volume requirements and assay timelines through parallel protein detection in a single workflow.
- Predictive Value: Supports biomarker panel development and functional target validation by correlating multi-analyte responses with phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative fluorescence readouts for six proteins using encoded microspheres, enabling reproducible assay performance across runs.
- Operational Value: Facilitates assay standardization via fiber-optic bundle immobilization and automated decoding algorithms, reducing user-dependent variability.
- Scalability: Supports platform reuse for other biofluids (serum, urine, sputum) as noted in the transcript, extending utility beyond saliva.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing clinically relevant salivary protein data that can inform mechanistic models.
- Mechanistic De-risking: Enables pathway-level analysis through multiplexed detection, reducing ambiguity in target engagement and biological response assessments.
- Predictive Confidence: Delivers quantitative, fluorescence-based signal responses that support go/no-go decisions in early preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through assay development to preclinical mechanistic studies, particularly for biomarker-driven programs in neurology and inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling simultaneous measurement of multiple salivary proteins linked to disease states.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized microsphere encoding, fiber-optic array assembly, and fluorescence-based quantification compatible with high-content imaging.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity per microsphere type) that allow comparison across experimental conditions and sample groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via disease-relevant salivary biomarkers that reflect systemic or local pathophysiological processes.
- Enterprise Reuse: Encodes a adaptable microsphere-based platform applicable to multiple complex biofluids, supporting cross-project standardization and reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through multiplexed, quantitative protein detection in native biofluids.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via fiber-optic immobilization and algorithmic decoding, reducing technical noise.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by maximizing data yield per sample and enabling reuse across biomarker programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering multi-analyte profiles that inform mechanistic and safety-related decision-making.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsphere encoding, antibody conjugation, and fluorescence microscopy for successful assay setup and optimization.
- Dependent on fluorescence microscopy and MATLAB-based image analysis infrastructure for signal acquisition and decoding.
- Necessitates cross-team standardization of microsphere preparation, fiber-optic handling, and assay protocols to ensure reproducibility across sites.
- Adaptation to other model systems (e.g., serum, urine) requires re-validation of encoding stability and antibody performance in differing matrices.
- Practical limitations include potential microsphere leakage from microwells and signal variability due to incomplete washing or evaporation during array assembly.
