푸리에에 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 이미징 매트릭스 디 트라 놀은 이온 사이클로트론 공명 질량 분석기를 변환

이 절차는 소 수정체 내의 여러 내인성 지질을 공간적으로 국소화하는 방법입니다. 행렬 보조 레이저 탈착 이온화(matrix assisted laser DESORPTION ionization) 질량 분석 이미징 기술을 사용합니다. 먼저, 얇은 소 수정체 조직 절편을 준비하여 멀티 매트릭스(multi matrix)를 도포한 후, MALDI 질량 분석 데이터 세트를 획득합니다.

데이터셋을 처리하여 렌즈 조직 절편에서 검출된 지질의 시각적 표현으로 변환합니다. 이러한 결과들을 종합하여 소 렌즈 내 지질의 위치와 상대적 풍부도를 결정하고, 이 분포의 시각적 표현을 생성할 수 있습니다. 지질 추출 후 LCMS 분석을 수행하는 다른 방법들과 비교하여, MALDI 질량 분석 이미징은 공간적 국소화 정보를 손실하지 않고 여러 지질을 동시에 시각화할 수 있게 해줍니다. 급속 냉동된 조직 표본을 -80 °C 보관소에서 꺼냅니다.

전체 소 송아지 수정체 절편을 고정하기 위해 수정체 표면에서 낭을 제거합니다. 크라이오스탯(cryostat)의 조직 절단대에 물 한두 방울을 떨어뜨립니다. 크라이오스탯이 최적 온도에 도달하여 평형을 이룬 후, 수정체가 응고되기 전에 빠르게 물 위에 놓습니다.

조직을 적도 방향으로 20 micron 두께의 절편으로 자릅니다. 초기 조직 절편은 폐기하고, 안구 수정체 조직의 이미징을 위해 적도면에 가깝거나 적도면에 해당하는 절편만 사용합니다. ITO 코팅 유리 슬라이드의 표면을 미리 적시기 위해 1.5 microliters의 formic acid를 첨가합니다.

그 후, 조직 절편을 크라이오스탯 내부의 슬라이드로 조심스럽게 옮깁니다. 다음으로, MALDI 매트릭스를 도포하기 전에 슬라이드를 15분 동안 동결건조합니다. 수정액 펜을 사용하여 ITO 코팅 유리 슬라이드의 비전도성 표면에 세 개의 표시를 합니다.

이제 플랫베드 스캐너를 사용하여 조직 슬라이드의 광학 이미지를 촬영하고 TIFF 또는 jpeg와 같은 적절한 형식으로 저장하십시오. 먼저, 매트릭스가 슬라이드 가장자리에 코팅되지 않도록 ITO 코팅 유리 슬라이드 전면의 가장자리를 테이프로 덮으십시오. 적절한 용매에 사용할 매트릭스를 준비하십시오.

그 다음 조직 절편의 표면에 매트릭스 용액을 도포합니다. 매트릭스 코팅을 20회 반복하여 유리 슬라이드를 코팅합니다. 만약 용매가 전자식 매트릭스 분무기와 호환되지 않는 경우에는 공압식 에어브러시 분무기를 사용하여 매트릭스를 도포할 수 있습니다.

질량 보정 용액을 제조하기 위해, ES tuning mix 표준 용액을 60% Isopropanol로 1:200 비율로 희석합니다. 희석된 ES tuning mix 용액을 분당 2 µL의 속도로 FT-ICR MS(Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry) 장비의 듀얼 모드 전기분무 이온화(ESI) 이온원에 주입합니다. FT-ICR 장비를 광대역 검출 및 1024 kilobytes/second의 데이터 수집 크기를 갖는 양이온 ESI 모드로 작동시킵니다. 일반적으로 ESI 파라미터의 모세관 전기분무 전압은 3,900 V로 설정합니다.

스프레이 쉴드 전압은 3,600 V, 네뷸라이저 질소 가스 유량은 2 L/min으로 설정합니다. 건조 질소 가스 유량은 4 L/min, 온도는 200 °C로 설정합니다. 또한 스키머 1 전압을 15 V로 설정합니다.

비행 시간을 0.01초로, 충돌 아르곤 가스 유량을 0.4L/s로, 소스 이온 축적 시간을 0.1초로, 그리고 충돌 셀 이온 축적 시간을 0.2초로 설정합니다. 이제 시간 영역의 자유 유도 감쇠(free induction decay) 신호를 양호하게 유지하면서, 질량 대 전하 비 200에서 1400 사이의 질량 범위에서 분석 감도를 최대화하도록 FT-ICR 작동 파라미터를 조정합니다. 그런 다음 ESI 질량 스펙트럼을 획득하고 E es 튜닝 믹스 용액 내 표준 화합물의 기준 질량을 사용하여 기기를 교정합니다.

MALDI 작동을 위해 장비를 튜닝하려면, 각각 1 µM 농도가 되도록 혼합 taurine 및 INE 표준 용액 1 µL 분주액 여러 개를 매트릭스 용액에 녹인 후, 이 용액들을 샘플 조직 절편 중 하나에 직접 스팟팅합니다. 슬라이드를 조직 슬라이드 어댑터에 넣고, dual ESI maldi 이온 소스의 MALDI 측면에서 어댑터를 로드합니다. 다음으로, 각 질량 스캔에 대해 MALDI 신호 축적을 위한 레이저 출력 및 레이저 샷 횟수에 적절한 MALDI 작동 파라미터를 최적화하십시오.

MALDI MSI 실험을 위해 기기를 튜닝, 교정 및 최적화한 후, 이미징 소프트웨어 내에서 이미징할 조직 절편의 물리적 위치를 기록된 광학 이미지와 정렬합니다. 3점 삼각측량법을 사용하여 세 개의 수정액 표시를 정렬하십시오. 그런 다음, 데이터 획득 후 내부 질량 교정을 위해 각 질량 스펙트럼에 E ES 튜닝 믹스 용액의 참조 질량 피크가 포함되도록 ESI MALDI 동시 작동을 시작합니다.

먼저 모세관 전압을 낮추어 ESI 신호를 감쇠시켜, ESI 보정 신호가 내부 질량 보정에 충분한 수준을 유지하면서 MALDI 신호가 스펙트럼에서 우세해질 때까지 조절합니다. 다음으로, 레이저 방사선에 대한 자동 스캐닝 방법을 설정합니다. 무작위 지점 분석법을 사용하십시오.

이미징할 조직 영역을 정의하고 적절한 레이저 RA 스텝 크기를 설정하십시오. 초기 비교를 위해 내부 보정을 사용하여 MALDI 질량 분석 스펙트럼을 보정하고, 맞춤형 VBA 스크립트를 사용하여 MSMS 디아이소토프(de isotope)를 위한 피크를 선택하고 단일 동위원소 피크를 선택한 뒤, 결과로 도출된 단일 동위원소 피크 목록을 내보내십시오. 측정된 질량 대 전하비 값을 Melin nine 또는 HMDB 메타볼롬 데이터베이스에 입력하여 라이브러리 항목과 질량 매칭을 수행하십시오.

다음으로, 피크 정점(peak apex)에서 1 ppm의 질량 필터 너비를 사용하는 이미징 소프트웨어를 사용하여 전체 조직 절편에서 검출된 모든 지질 엔티티의 MALDI 이미지를 생성합니다. 데이터베이스 항목과 일치하는 모든 질량 대 전하비(mass to charge ratio) 값에 대한 이미지가 생성되면, 소 수정체와 같은 특정 조직에 대해 추후 조사할 수 있는 고유한 분포 패턴을 찾기 위해 다른 모든 피크에 대해서도 이미지를 생성합니다. 직접 해동 마운팅(direct thaw mounting)을 사용할 때 조직의 심한 찢어짐이 자주 관찰됩니다.

에탄올 또는 포름산을 사용하여 IT OAS 슬라이드를 전처리하면 조직 장착 과정 동안 조직 절편의 무결성을 유지하는 데 도움이 됩니다. 매트릭스의 선택과 용매의 선택 모두 MALDI 스펙트럼의 품질에 영향을 미치는 중요한 요인입니다. 다음 예시들은 디올(diol)에 대해 효율적인 매트릭스 용매를 사용하여 생성된 스펙트럼과 부적절한 매트릭스 용매를 사용하여 생성된 스펙트럼을 비교하여 보여줍니다.

Maldi MSI 실험을 통해 질량 분석 스펙트럼 세트를 획득하면, 검출된 각 이온에 대한 이미지를 생성할 수 있습니다. 이때 각 픽셀은 조직 절편 표면의 레이저 조사 지점을 나타냅니다. 이를 통해 조직 절편의 서로 다른 부위별 분석물의 상대적 농도를 상세히 확인할 수 있습니다.

대부분의 실험에서 데이터는 각 스펙트럼 내의 총 이온 전류를 기준으로 정규화됩니다. 이러한 정규화 과정이 없으면 분석물 매질의 상태가 더 좋거나 COC 결정화가 일어난 영역에서 분석물 신호가 더 강하게 나타날 수 있으며, 이는 데이터를 왜곡시킬 수 있습니다. 조직 준비 과정 또한 생성되는 이미지에 매우 큰 영향을 줄 수 있습니다.

시료가 너무 젖어 있으면 분석물이 조직상에서 비국소화되어 공간 정보의 상당 부분이 손실됩니다. 안구 수정체를 이용한 조직 이미징 실험의 본 시연에서는 FT-ICRMS를 통해 지질의 공간적 분포를 결정하기 위해 diol을 다중 매트릭스로 사용하였습니다. 다양한 종류의 조직 내 지질 이미징은 diol 또는 다른 매트릭스를 사용하여 유사한 방식으로 수행할 수 있습니다.