2.15: 클로닝

분자 클로닝은 원핵 또는 진핵 생물 소스의 재조합 DNA를 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 복제 차량에 삽입하는 데 사용되는 일련의 기술입니다. 복제는 유전자와 같은 관심 DNA 단편의 수많은 사본을 만드는 것을 말합니다. 이 비디오에서는 분자 복제의 다양한 단계, 절차 설정 방법 및 이 기술의 다양한 응용 분야에 대해 알아봅니다.

클로닝이 시작되기 전에 적어도 두 개의 중요한 DNA 분자가 필요합니다. 첫째, 가장 중요한 것은 삽입물이라고도 하는 클론 복제할 DNA 단편이 필요하다는 것입니다. 그것은 prokaryote, eukaryote, 멸종된 유기체에서 올 수도 있고 실험실에서 인위적으로 만들 수도 있습니다. 분자 복제를 사용하여 특정 유전자의 기능에 대해 더 많이 알 수 있습니다.

둘째, 벡터가 필요합니다. 벡터는 분자 생물학에서 특정 유전자의 더 많은 사본을 만들거나 단백질을 생산하는 도구로 사용되는 플라스미드 DNA입니다. 플라스미드는 벡터의 한 예이며 박테리아에 의해 복제되는 원형의 여분의 염색체 DNA입니다.

플라스미드는 일반적으로 다중 클로닝 부위 또는 MCS를 가지고 있으며, 이 영역에는 제한 효소라고도 하는 다양한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위가 포함되어 있습니다. 다른 삽입물은 ligation이라고 불리는 기술에 의해 플라스미드에 통합될 수 있습니다. 플라스미드 벡터는 또한 복제의 기원을 포함하고 있어 박테리아에서 복제될 수 있습니다. 또한 플라스미드는 항생제 유전자를 가지고 있습니다. 박테리아가 플라스미드를 통합하면 항생제가 포함된 배지에서 생존합니다. 이를 통해 성공적으로 변형된 박테리아를 선택할 수 있습니다.

인서트와 벡터는 숙주 세포 유기체로 복제되며, 분자 복제에 가장 일반적으로 사용되는 것은 E. coli입니다. 대장균은 빠르게 성장하고, 널리 이용 가능하며, 상업적으로 생산되는 다양한 클로닝 벡터를 보유하고 있습니다. 진핵생물은 효모와 마찬가지로 매개체의 숙주 유기체로 사용될 수도 있습니다.

일반적인 분자 클로닝 절차의 첫 번째 단계는 모든 세포 유형의 DNA 또는 mRNA에서 파생될 수 있는 원하는 삽입물을 얻는 것입니다. 그런 다음 최적의 벡터와 숙주 유기체를 삽입 유형과 궁극적으로 수행할 작업에 따라 선택합니다. 중합효소 연쇄 반응 또는 PCR 기반 방법은 삽입물을 복제하는 데 자주 사용됩니다.

그런 다음 일련의 효소 반응을 사용하여 삽입물과 분해물을 함께 결합하고 대량 복제를 위해 숙주 유기체에 도입합니다. 복제된 벡터는 박테리아에서 정제되고 제한 분해 후 겔에서 분석됩니다. 겔 정제된 단편은 나중에 삽입물이 원하는 DNA 단편인지 확인하기 위해 염기서열분석을 위해 보내집니다.

분자 복제가 어떻게 수행되는지 좀 더 자세히 살펴 보겠습니다. 시작하기 전에 벤치에서 복제를 시도하기 전에 복제 전략을 계획하고 싶을 것입니다. 예를 들어, 주어진 플라스미드 벡터는 다중 클로닝 부위를 통해 삽입물을 통합하기 위해 한정된 수의 제한 부위를 제공합니다. 삽입물에서 찾을 수 없는 제한 사이트를 선택하여 절단하지 않도록 해야 합니다. 뭉툭한 끝 조각을 돌출부가 있는 조각과 결합해야 하는 상황이 발생할 수 있습니다. 그렇다면, klenow 단편을 사용하여 무딘 말단 결찰을 설정하는 것이 원하는 벡터에 삽입물을 얻을 수 있는 유일한 옵션일 수 있습니다. 다양한 분자 클로닝 도구를 마음대로 사용할 수 있는 이해와 클로닝을 시작하기 전에 신중한 전략을 세우는 것은 엄청난 시간을 절약할 수 있습니다.

분자 클로닝을 위한 DNA 소스는 간단한 추출 기술을 통해 거의 모든 유형의 세포 또는 조직 샘플에서 분리할 수 있습니다. 일단 분리되면 PCR을 사용하여 인서트를 증폭할 수 있습니다.

일단 삽입물이 증폭되면, 삽입체와 벡터는 모두 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease)로 알려진 제한 효소에 의해 분해됩니다.

일단 소화되면, insert와 vector는 gel에서 실행되며 gel purification이라는 공정으로 정제될 수 있습니다. 벡터와 관련하여, 이 단계는 겔에서 고분자량 도말로 나타나는 경향이 있는 절단되지 않은 플라스미드에서 선형화된 플라스미드를 정제하는 데 도움이 됩니다.

겔이 분해물을 정제한 후, 삽입물은 DNA 리가제(DNA ligase)라는 효소를 통해 플라스미드에 연결되거나 결합됩니다.

일반적으로 ligation을 설정하여 insert와 vector의 비율이 3:1이 되도록 하는 것이 항상 좋은 생각이며, 이렇게 하면 적은 양의 vector만 자체 ligulate할 수 있습니다. 결찰이 얼음 위에 설치되면 14-25? C 1 시간에서 하룻밤까지.

다음으로, 플라스미드 벡터를 복제할 호스트에 플라스미드 벡터를 도입하기 위해 형질전환이 수행됩니다.

형질전환 후 박테리아를 항생제로 한천 플레이트에 도금하고 37°C에서 밤새 배양합니다. 플라시미드는 항생제 내성 유전자를 포함하고 있기 때문에 성공적인 형질전환은 항생제가 있는 한천 플레이트에서 성장할 때 박테리아 콜로니를 생성합니다. 그런 다음 변형된 플레이트에서 개별 콜로니를 골라내고, 번호가 매겨진 튜브에 담긴 액체 성장 배지에 넣고, 팽창을 위해 진탕 인큐베이터에 넣을 수 있습니다. 소량의 액체 배양액은 번호가 매겨진 한천 플레이트에 첨가되고 나머지 배양액은 플라스미드 정제로 이동합니다. 플라스미드가 최종적으로 정제될 박테리아 콜로니의 정체성을 나타내는 번호 체계는 플라스미드 정제 공정 전반에 걸쳐 유지됩니다.

그런 다음 정제된 플라스미드 샘플을 제한 효소로 절단합니다. 그런 다음 digest를 로드하고 insert의 존재 여부를 확인하기 위해 gel에서 실행하며, insert는 박테리아 콜로니가 자가 결찰 플라스미드가 아닌 인서트를 포함하는 플라스미드로 형질전환되었는지 확인합니다. 인서트 함유 플라스미드로 형질전환된 것으로 확인된 박테리아는 추가 플라스미드 정제를 위해 확장됩니다. 염기서열분석(Sequencing)은 관심 유전자가 복제되었는지 확인하기 위한 최종 검증 단계로 수행됩니다.

분자 클로닝은 거의 무제한의 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, mRNA 주형이 역전사 효소(reverse transcriptase)라고 불리는 효소에 의해 cDNA 또는 상보적 DNA를 형성하기 위해 역전사된 다음 PCR을 사용하여 cDNA를 증폭하는 경우 분자 복제를 사용하여 cDNA 라이브러리를 만들 수 있습니다. 주어진 세포 유형에 의해 발현되는 모든 유전자의 라이브러리.

분자 클로닝은 또한 하나의 박테리아 균주에서 일련의 유전자 또는 유전자 클러스터를 취하여 다른 균주에서 형질전환되는 플라스미드로 재조직하여 전체 생합성 경로를 재생성하여 복잡한 분자를 생산할 수 있도록 할 수 있습니다.

분자 클로닝을 통해 특정 온도에서 배양될 때 오류가 발생하기 쉬운 중합효소를 사용하는 특수 박테리아 균주에서 표적 플라스미드를 발현하여 돌연변이 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 돌연변이는 염기서열분석(sequencing)으로 특징지을 수 있습니다. 그런 다음 돌연변이 유전자로 변형된 박테리아를 다른 약물 또는 화학 물질로 테스트하여 어떤 박테리아 군집이 약물 내성을 갖도록 진화했는지 확인할 수 있습니다.

분자 클로닝 덕분에 리포터 유전자는 DNA 플라스미드에 통합될 수 있으며, 일반적인 리포터 유전자는 자외선에 노출될 때 녹색 형광을 방출하는 녹색 형광 단백질 또는 GFP입니다. 리포터 유전자를 알파바이러스에 삽입하여 모기의 감염과 세포의 전염성을 보여줄 수도 있습니다.

분자 복제에 대한 JoVEs 비디오를 방금 시청했습니다. 이제 분자 클로닝이 어떻게 작동하는지, 그리고 분자 생물학에서 이 기술을 어떻게 사용할 수 있는지 이해해야 합니다. 언제나 그렇듯이 시청해 주셔서 감사합니다!