Name: 장 상피 세포의 장내 세균의 침입 체외 크게 수직 확산 챔버 모델을 사용하여 향상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 배우세요 장 상피 세포에서 장내 세균 침입을 연구하는 수직 확산 챔버(VDC) 모델을 사용하는 방법을. Caco-2 세포와 미소호기성 조건에서 Campylobacter jejuni 상호작용 및 침입을 10배에서 100배까지 증가시켜 생리학적으로 관련성 높은 감염 분석을 가능하게 합니다.

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도미닉 밀스는 블룸 즈 버리 대학 박사 과정 재학 (2,007에서 2,010 사이)에 의해 지원되었다. 저자는 VDC​​ 모델을 개발하고 그들의 도움을 Ozan Gundogdu 및 아브디 엘미 모두에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 특수 0.4 μm의 필터에 IEC 단층의 성장 <ol><li> Dulbecco의 수정 된 필수 미디어 문화 Caco-2 세포 (DMEM)의 10 % (v / v)의 송아지 태아 혈청, 100 U / ML 페니실린, 100 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신, 1 % (v / v)의에 불필요한 아미노산 보충 37 표준 조직 문화 인큐베이터 ° 5 % CO 2, 95 %의 공기 C. 씨앗 4 × 10 5 Caco-2 0.4 μm의 당 IECS 필터링 21 일 동안 양극화로 성장 매체에게 2-3 일마다 변경. </li><li> 볼트 옴 저항 측정기를 사용하여 단층의 편광 상태를 확인하는 봉사자를 측정한다. 우리의 연구에서 21 일의 봉사자는 Caco-2이 0.4 μm의 필터에서 자란 세포는 700 ~ 800 Ωcm 2입니다. </li></ol> 2. C.의 준비 속 jejuni와 Coculturing 분석 실험에 대한 세균의 중간 <ol><li> VDC의 coculturing 분석의 원하는 시작 지점 이전에 24 시간은, C의 신선한 혈액 한천 플레이트를 준비. 37 속 jejuni와 부화 ° C 변수의 분위기 배양기에서 호기성 (microaerobic) 조건 (85 % N 2, 5 % O 2, 10 % CO 2)에 따라. </li><li> 동시에, 변수의 분위기 배양기에서 호기성 (microaerobic) 조건 하에서 37 ° C에서 브루셀라 국물의 30 ML을 preinc​​ubate. </li></ol> 3. 준비 및 분석에 앞서 VDC 하프 챔버의 살균 <ol><li> 완전히 담그지 VDC 반 챔버뿐만 아니라 O-링과 살균 용액에 플러그. </li><li> 멸균 20 ML의 주사기를 사용, 반 챔버 모두에서 가스 입구를 통해 살균 용액을 세척하십시오. 그렇게하지 ​​않으면 coculturing 동안 시료의 오염을 초래할 수 있습니다. </li><li> &gt; 1 시간 동안 살균 용액에 모든 구성 요소를 둡니다. </li><li> 가스 주입구를 세척하기 위해 다른 멸균 20 ML의 주사기를 사용하여, 신선한 멸균 물을 모든 구성 요소를 씻어. </li></ol> 4. 준비하기세균 접종의 <ol><li> C. 반 접시를 수확 혈액 한천 배지에서 속 jejuni의 성장은 전 배양 브루셀라 국물 1 ㎖로 전날 준비. 이 ~ 10 10 CFU / ㎖를 산출해야한다. </li><li> 세균 콜로니 형성 단위 (CFUs)를 semiquantify 600 nm에서 세균 현탁액의 광학 밀도를 측정한다. </li><li> 전 배양 브루셀라 국물 4 ML에서 원하는 접종 수준으로 세균 현탁액을 조정합니다. </li><li> 다음 접종에 존재하는 세균 CFUs의 수를 정량화하기 위해 48 시간 동안 변수 분위기 인큐베이터에서 37 ° C에서 알을 품다 세중의에서 혈액 한천 플레이트에 적절한 희석의 도금 다음이 마지막 세균 현탁액에서 시리얼 희석을 수행합니다. </li></ol> 5. VDC 설정 <ol><li> 벤치 위에 VDC 평면의 아래쪽 챔버를 놓습니다. 아래쪽 챔버에 O-링을 맞 춥니 다. </li><li> t에서 IECS을 들고 하나의 필터를 분리그는 캐리어 및 멸균 PBS 400 μL로 3 회 세척한다. O-링이 제자리에 남아 확인하고, 아래쪽 챔버에 필터를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 상반신 챔버 제자리에 내려 놓습니다. 두 반 챔버가 조립되면, 링 클램프를 함께 사용하여 클램프. 위쪽을 향하도록 두 개의 구멍과 더불어, 벤치 위에 수평으로 VDC를 놓습니다. </li><li> 혀끝의 절반 실에 세균 접종의 4 ML을 추가합니다. </li><li> 기저 반 챔버에 세포 배양 배지 4 ML을 추가합니다. </li><li> 반 챔버 양쪽 구멍에 끝 조각을 놓습니다. </li></ol> 6. 변수 분위기 인큐베이터 내에서 가스 매니 폴드에 VDC 부착 <ol><li> 가스 매니 폴드에 근접 변수 분위기 인큐베이터에 VDC를 놓습니다. </li><li> 가스 매니 폴드에 연결된 가스 공급 레귤레이터를 엽니 다. VDC의 기저 반 챔버의 가스 입구에 매니 폴드 튜브를 연결합니다. 조지아 연결의 출구 파이프 기저 반 챔버의 끝 부분에있는 콘센트 하나에 변수 분위기 인큐베이터에서 선도. </li><li> 기저 반 챔버의 끝 부분에있는 다른 출구를 닫습니다. 이 기저 매체의 추방으로 이어질 수 있으므로, 과도한 가스 압력을 피하기 위해 매우 천천히 열을 돌보는, 가스 매니 폴드 가스 흐름을 엽니 다. </li><li> 목표는 1 거품마다 2-5 초 가스 흐름입니다. 주기적으로 실험의 과정에서 가스의 흐름을 확인하고 필요한 경우 조정합니다. </li></ol> 7. 배양 후 VDC 분해 <ol><li> 적절한 배양 기간 후에, 가스 매니 폴드에 연결된 가스 공급 레귤레이터를 닫습니다. 매니 폴드에서 VDC에 가스 흐름을 닫습니다. 가스 입구, 가스 출구 및 VDC에서 마개를 분리합니다. </li><li> 변수의 분위기 인큐베이터에서 VDC를 제거합니다. subsequen -80에서 정점과 기저 상층 액 및 저장 ° C를 제거T 분석. </li><li> 링 클램프를 제거하고 부드럽게 VDC를 분해. 반 챔버와 멸균 6 자 세포 배양 접시로 전송에서 필터를 제거합니다. 멸균 PBS 400 μL와 IECS 세 번 씻으십시오. </li><li> 상호 작용하는 세균의 총 수의 열거를 들어, 트리톤 X-100 IECS 0.1 %를 포함하는 멸균 PBS 400 μL (V / V)를 추가하고 IEC를 용해 실온에서 20 분 동안 품어. 다음 세균 CFUs 상호 작용의 수를 정량화하기 위해 48 시간 동안 변수 분위기 인큐베이터에서 37 ° C에서 알을 품다 세중의에서 혈액 한천 플레이트에 적절한 희석의 도금 이어이 세포 파쇄물에서 시리얼 희석을 수행합니다. </li><li> 침입 세균의 총 수의 열거를 들어, 5 % CO 2 95 %에서 37 표준 조직 문화 인큐베이터에서 2 시간 동안 IECS과 부화에 150 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 포함하는 DMEM 세포 배양액 ° C의 400 μl를 추가 세포 박테리아를 죽일 공기,그런 다음 위의 단계 7.4 등 따릅니다. </li></ol> 8. 배양 후 VDC 청소 실험의 다음 라운드를 위해 멸균 물 저장소와 VDC를 씻으십시오.

<ol><li>Mills, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+Campylobacter+jejuni+invasion+of+intestinal+epithelial+cells+under+low-oxygen+coculture+conditions+that+reflect+the+in+vivo+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment.</a> Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).</li>
<li>Marteyn, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Shigella+virulence+in+response+to+available+oxygen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo.</a> Nature. 465, 355-358 (2010).</li>
<li>Dorrell, N., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+century+of+Campylobacter+research%3A+recent+advances%2C+new+opportunities+and+old+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).</li>
<li>Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Campylobacter+jejuni%3A+molecular+biology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).</li>
<li>Hu, L., Kopecko, D. J. Chapter 17. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHu%2C+L+%22Campylobacter%22">Campylobacter</a>. Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. , ASM Press. 297-313 (2008).</li>
<li>Everest, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Caco-2+cells+as+a+model+for+enteric+invasion+by+Campylobacter+jejuni+and+C.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli.</a> J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).</li>
<li>Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+the+internalization+and+intracellular+survival+of+Campylobacter+jejuni+in+human+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures.</a> Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).</li>
<li>Monteville, M. R., Konkel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-facilitated+invasion+of+T84+eukaryotic+cells+by+Campylobacter+jejuni+occurs+preferentially+at+the+basolateral+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface.</a> Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).</li>
<li>Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+culture+methods+for+investigating+Campylobacter+invasion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms.</a> J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).</li>
<li>Schuller, S., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microaerobic+conditions+enhance+type+III+secretion+and+adherence+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+to+polarized+human+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells.</a> Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).</li>
<li>Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microaerophilic+conditions+permit+to+mimic+in+vitro+events+occurring+during+in+vivo+Helicobacter+pylori+infection+and+to+identify+Rho%2FRas-associated+proteins+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling.</a> J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).</li>
</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

숙주 세포와 세균 병원균의 상호 작용을 연구하는 체외 세포 배양 방법에서의 사용은 널리 많은 연구 실험실에서 근무하는 기술입니다. 이러한 세포 배양 분석은 호기성 조건에서 수행됩니다 그러나, 이러한 체외 모델에서 정확하게 호스트 병원체 상호 작용이 일어날 수있는 생체 환경을 대표하지 않을 수 있습니다. 널리 생체 감염 모델에서 사용이 호기성 C. 연구를 위해 특히 부적절한 속 jejuni는 통성 혐기성있는 다른 장내 병원균에 비해. C.에 의해 인간의 IECS 침해의 메커니즘에 관한 문헌에서 상당한 혼란이있다 속 jejuni 4,5. 우리는이 연구에서 사용되는 체외 모델은 정확하게 생체 상황을 반영하지 않기 때문에 침략의 메커니즘이 그렇게 제대로 이해하는 이유는 것이 좋습니다. 수준은 표준 세포 배양 분석을 사용하여C.의</e...

숙주 세포와 세균 병원균의 상호 작용은 체외 세포 배양 방법에 사용 광범위하게 연구되고있다. 이러한 세포 배양 분석, 숙주 세포에 세균 부착, 숙주 세포 수용체 경로와 숙주 세포의 세균 침입 신호 숙주 세포의 식별을 사용하면 모든 많은 중요한 관찰의 결과로, 세부에서 공부하고 있습니다. 그러나 이러한 세포 배양 분석은 생체 환경에서 대표되지 않을 수 있습니다 호기성 조건에서 수행됩니다. 위장 감염을 연구하는 데 체외 모델에서의 주요 제한은 높은 산소 수준을 포함 배양 조건은 일반적으로 진핵 세포의 생존을 선호한다는 것입니다. 그러나 창자 루멘의 조건이 거의 혐기성 될 것입니다. 매우 낮은 산소 환경에서의 장내 병원체는 그의 표정 변화 호기성 조건 하에서 2 독성 유전자를 표현한다. 같은 데이터는 표준 셀 문화 모델 M을 사용하여 얻은바깥 호스트 세포와 세균 상호 작용의 부정확 한 표시를 제공합니다. 캄 필로 박터 속 jejuni는 가벼운 설사에서 심한 염증성 장염에 이르기까지 다양하는 증상, 세계적으로 세균성 급성 위장염의 주요 원인이되는 에이전트입니다. C. 대부분의 단순한 위장염에 속 jejuni 감염 결과, 그러나 C. 속 jejuni는 길랑 - 바레 증후군 (GBS) 등의 말초 신경 병증에서 가장 일반적으로 발견 전염성 에이전트입니다. 영국에서는, 그것은 C.에 의한 장염의 500,000 경우가있는 것으로 추정된다 5억8천만파운드의 영국 경제에 예상 비용으로 속 jejuni 감염 매년. 개발 도상국에서, C. 속 jejuni는 어린이들에게 사망의 주요 원인이다. 의심 할 여지 캄 필로 박터 감염의 중요성과 철저한 유전체학 기반의 분석, C. 등의 연구 수십 년,에도 불구하고 속 jejuni의 병인은 아직 저조한 underst입니다OOD, 살모넬라, 대장균, 이질균, 그리고 비브리오 콜레라 등의 장내 병원체에 대비합니다. 편리한 작은 동물 모델의 부족이 3 하나의 주요 이유입니다. 또한 널리 생체 감염 모델에서 사용이 호기성 C. 공부에 더 부적절 통성 혐기성있는 다른 장내 병원균에 비해 속 jejuni. 반면 C. 속 jejuni는 침입 병원체, C.의 메커니즘으로 인식되고 장 상피 세포의 속 jejuni의 침략 (IECS)는 여전히 4,5 불분명합니다. C. 속 jejuni의 침략은 어느 미사, 미세 소관,이 둘의 조합 또는 5도에 의존 것으로 표시되었습니다. 이 지역의 혼란은 아마 대부분 체외 분석 조건 부적절한 사용으로 인한 것입니다. 다른 세포 배양 분석의 수는 C의 상호 작용을 조사하는 데 사용되었습니다 속 jejuni숙주 세포와 함께. Caco-2 6, INT 407 7 및 T84 8 셀 라인은 모든 다른 C의 접착력과 침략 기능을 연구하는 데 사용되었습니다 속 jejuni 균주. 그러나 C.에 대한 세균의 부착과 침략의 수준 IECS에 속 jejuni 다른 장내 병원균 9보다 크게 낮다. C.의 coculturing IECS에 속 jejuni는 일반적으로 IECS의 생존에 필요한 공기 중의 산소 농도에 가까운 조건에서 CO 2 배양기에서 수행됩니다. C.는 속 jejuni 유전자 발현은 대기 중 산소 조건에 비해 창자 루멘의 낮은 산소 환경에서 매우 다른 것입니다. 수직 확산 회의소 (VDC) 시스템의 사용은 다른 매체와 가스 상태 1,10,11에서 세균과 숙주 세포의 배양을 허용하는 개발되었습니다. 이 시스템은 박테리아가 취소 될 사람의 대장의 조건을 모방매우 낮은 산소 반면 조직의 데르 조건은 혈류에서 산소 공급 될 것이다. 특수 0.4 μm의 필터에서 재배 편광 IEC 단층은 개별적으로 세균 배양액은 각각 세포 배양 배지 (그림 1) 가득 차 있었다 정점과 기저 외측 구획을 만드는 VDC에 배치되었다. VDC는 변수 분위기 인큐베이터가 37 ~ 85 % N 2, 5 % O 2, 10 % CO 2를 포함 ° C, C. 최적의 조건을 나타내는에 배치되었다 속 jejuni. 정점 함을 열어 왼쪽 변수 분위기 인큐베이터 내에서 호기성 (microaerobic) 대기에 노출되고, 밀봉 기저 함을 동안은 5 % CO 2 / 압력 축적을 방지 콘센트 튜브 95 % O 2 혼합 가스의 지속적인 관리에 의해 산소와 함께 제공된 . 이러한 조건에서 Caco-2 세포의 생존 및 단층 무결성 transepithelial ELE를 모니터링하여 확인 하였다24 시간 동안 단층에 걸쳐 ctrical 저항 (티이)는 정점 구획의 낮은 산소 조건에서 정점과 기저 외측 구획의 Caco-2 세포 단층 및 물리적 분리의 생존을 증명한다. 변수 분위기 인큐베이터 (호기성 (microaerobic) 조건)과 표준 셀 문화 CO 2 배양기 (호기성 조건)에서 유지 VDC에있는 단층의 봉사자는 다른 대기 조건 1에서 세포 단층의 무결성을 나타내는 유의 한 차이를 보이지 않았다. 호기성 (microaerobic) 조건에서, 꽉 분기점이 존재하고 균등 호기성 조건 1에서 유지 세포와 유사한 occludin 염색 패턴 셀 테두리 사이에 분포 남아 있었다. C.의 상호 작용 VDC의 Caco-2와 T84 세포 속 jejuni는 세균의 상호 작용 (접착력과 침략)와 침략을 평가하여 조사 하였다. 두 개의 서로 다른 C. jejuni와 야생형 straiNS는 1 사용 하였다. C.는 jejuni와 11168H는 원래 시퀀스 변형 NCTC11168의 hypermotile 파생됩니다. 11168H 변형 병아리 식민지 모델에서 더 높은 식민지 수준을 보여 주며, 따라서 호스트 병원체 상호 작용 연구에 사용하기 적합한 균주로 간주됩니다. 81-176은 인간을 분리하고 대부분의 침략 널리 연구 실험실의 변종 중 하나입니다. C.는 속 jejuni 균주는 호기성 (microaerobic) 또는 호기성 조건 중 하나에 따라 VDC의 정점 구획에 추가되었습니다. 우리는 상호 작용과 침략을 모두 더 높은 금리 C.에 대하여 관찰 호기성 (microaerobic) 조건 1 아래 속 jejuni. 증가 C. 속 jejuni의 상호 작용은 호기성 (microaerobic) 조건 1에 따라 세균 수의 증가로 인해 아니 었습니다. 이 데이터는 VDC의 정점 구획의 낮은 산소 환경은 박테리아 호스트 상호 작용을 강화하고 나타냅니다 우리의 가설을 지원하는 C의 침략 등록 속 jejuni는 매입 채무 및 기타 채무의 증가입니다이러한 조건 완화. 이 침입 세균 병원체를 공부하는 VDC 모델의 사용의 첫 번째 보고서이었고, 더 밀접하게 생체 내 상황을 모방하는 조건 하에서 생체 감염 분석의 수행의 중요성을 강조한다. VDC 모델은 여러 세균 종에 대한 호스트 병원체 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Snapwell 인서트와 함께 사용하기 위한 특수 수직 확산 시스템</td><td>Harvard Apparatus</td><td>66-0001</td><td>매니폴드 및 6개의 Snapwell 챔버</td></tr><tr><td>캡</td><td>Harvard Apparatus</td><td>66-0020</td><td></td></tr><tr><td>O-ring</td><td>Harvard Apparatus</td><td>66-0007</td><td></td></tr><tr><td>클램프</td><td>Harvard Apparatus</td><td>66-0012</td><td></td></tr><tr><td>Snapwell 필터(기공 크기 0.4 &mu; m)</td> <td>코닝 Costar</td><td>3407</td><td></td></tr><tr><td>밀리셀 ERS-2 볼트-옴 저항 측정기</td><td>Millipore</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>WPA 광파 II 분광 광도계</td><td>Biochrom</td><td>80-3003-72</td><td></td></tr></tbody></table>

장 상피 세포의 장내 세균의 침입<em&gt; 체외</em&gt; 크게 수직 확산 챔버 모델을 사용하여 향상

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

숙주 세포와 세균 병원균의 상호 작용은 체외 세포 배양 방법에 사용 광범위하게 연구되고있다. 이러한 세포 배양 분석은 호기성 조건에서 수행됩니다 그러나, 이러한 체외 모델에서 정확하게 호스트 병원체 상호 작용이 일어날 수있는 생체 환경을 대표하지 않을 수 있습니다. 우리는 다른 매체와 가스 조건에서 세균과 숙주 세포의 배양을 허용 감염의 체외 모델을 개발했습니다. 수직 확산 회의소 (VDC)의 모델은 박테리아가 매우 낮은 산소 반면 조직의 조건이 될 사람의 대장의 조건 혈류의 산소 공급됩니다를 모방. VDC에 Snapwell 삽입에서 재배 편광 장 상피 세포 (IEC) 단일 층을 배치하면 별도의 정점과 기저 외측 구획을 만듭니다. 기저 외측 구획, 세포 배양 배지로 채워 밀봉 산소 w로 관류됩니다혀끝 함을 hilst는 국물로 가득 차 있습니다, 계속 열려있는 호기성 (microaerobic) 조건에서 배양 하였다. Caco-2와 T84 두 IECS는 세포의 생존이나 단층 무결성에 대한 명백한 해로운 영향없이 이러한 조건에서 VDC 유지 될 수 있습니다. Coculturing 실험은 서로 다른 C.으로 수행 혀끝의 구획 호기성 (microaerobic) 조건 속 jejuni 야생형 균주와 VDC 모델의 다른 IEC 라인 재현성 호기성 배양 조건에 비해 상호 작용의 수 (약 10 배) 증가와 세포 내 (약 100 배) 박테리아의 원인 1. VDC 모델에서 만든 환경이 더 가깝게 C.에 의해 발생하는 환경을 모방 그리고 인간의 창자에 속 jejuni는 더 밀접하게 생체 내 현실 모방하는 조건 하에서 생체 감염 분석의 수행의 중요성을 강조한다. 우리는 VDC​​ 모델의 사용은 상호 작용의 새로운 해석 내기 있도록 제안세균성 병원체와 숙주 세포를 싸우는.

Coculturing 실험 C.으로 수행 jejuni와 야생형 균주 및 치근단 구획 호기성 (microaerobic) 조건 VDC 모델 IECS는 시간에 호기성 배양 조건에 비해 상호 작용의 수 증가 (약 10 배)과 세포 내 (약 100 배) 박테리아를 증명하고있다 의존적으로 1. 이 관찰은 두 개의 서로 다른 C를 사용하여 재현했다 속 jejuni는 야생형 균주 (11168H 및 81-176)와 두 개의 서로 다른 IEC 라인 (Caco-2 및 T84), VDC 모델 1의 유효성을 강조. 여기에 제시된 대표적인 결과 C.의 수를 비교하다 속 jejuni는 혀끝 컴에서 호기성 (microaerobic) 조건 CO 2 배양기 (그림 2A와 B) 또는 VDC 모델에서 표준 세포 배양 분석 조건 ...

호기성 조건에서 박테리아의 부착 및 침입 조사를위한 세포 배양 분석을 수행하면의 일반적으로 대표성이다<em&gt; 생체 내</em&gt; 환경을 제공합니다. 수직 확산 챔버 모델은 인간의 병원체의 상호 작용을 연구 할 수 있습니다<em&gt; 캄 필로 박터 속 jejuni</em&gt; 더 아래에 장 상피 세포와<em&gt; 생체 내</em조건&gt;과 같은 향상된 세균 침입의 결과로.

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

다음 실험의 전반적인 목적은 수직 확산 챔버(vertical diffusion chamber, VDC) 모델을 사용하여 박테리아와 장 상피 세포 침입 간의 상호작용을 조사하는 것입니다. 이를 위해 먼저 Caco-2 장 상피 세포의 분극화된 단층이 배치된 특수 필터를 사용하여 VDC 내에 분리된 정단부(apical) 및 기저-측면(basal lateral) 구획을 생성합니다. 두 번째 단계에서는 분석 대상인 박테리아 접종물을 정단부 구획에 첨가합니다.미세 호기성 조건 및 세포 배양 하에서, 호기성 조건으로 기저측 구획에 배지를 추가한 후, 공동 배양 중 원하는 시점에서 필터를 제거하고 상호작용 또는 세포 내 박테리아의 수를 측정합니다. 결과적으로, 표준 호기성 배양 조건과 비교하여 VDC 모델을 사용하면 상호작용 및 세포 내 박테리아 수의 증가를 관찰할 수 있습니다. 표준 조직 배양 부착 및 침입 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 박테리아와 장 상피 세포의 공동 배양을 인간 장의 in vivo 조건과 더 유사한 in vitro 조건 하에서 수행할 수 있다는 점입니다.시연은 저희 실험실의 박사 과정 학생인 N Vida nas와 저희 실험실에서 박사 학위 과정 중 수직 확산 챔버 모델을 개발한 포스닥 Dominic Mills가 진행하겠습니다. 먼저 0.4 micron 필터당 4 × 10⁵개의 Caco-2 장 상피 세포를 배양액에 접종한 다음, 2~3일마다 배지를 교체하며 21일 동안 세포를 배양하여 극성을 형성시키고 단층의 극성 상태를 확인합니다. 볼트-옴 저항계를 사용하여 경상피 전기 저항을 측정하십시오.VDC 공배양 분석을 시작하기 24시간 전에, 가변 분위기 배양기 내의 미호기성 조건에서 신선한 혈액 배지 플레이트에 jejuni를 배양합니다. 동시에 Bruce broth 30 milliliters를 동일한 조건에서 사전 배양합니다. 실험 당일, VDC 하프 챔버와 O-링 및 플러그를 멸균 용액에 담급니다. 그런 다음 멸균된 20 milliliter 주사기를 사용하여 두 하프 챔버의 가스 유입구를 통해 용액을 세척합니다. 한 시간 후, 또 다른 멸균된 20 milliliter 주사기를 사용하여 가스 유입구를 헹구어 VDC 구성 요소를 신선한 멸균수로 헹굽니다.그런 다음, CJ jui 혈액 한천 배지 플레이스 배양액의 절반을 미리 배양된 barella broth 1 mL에 수확하여 mL당

enteric-bacterial-invasion-intestinal-epithelial-cells-vitro-is

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 프로토콜은 상피 세포와 세균의 동시와 언어 문화 microfluidic 공동 문화 모델을 설명합니다. 이 모델은 putative probiotic 박테리아 변종의 효과를 pathogenesis에 다른 수용성 분자 신호의 역할을 조사뿐만 아니라 화면을 사용할 수 있습니다.

Microfluidic 가용성식이 중재 신호의 상호 작용을 조사하는 상피 세포 박테리아의 공동 문화

출처: 칼라타유드 아로요, M. 외. 시험관 내 숙주-미생물 인터페이스에서 합성 박테리아 컨소시엄의 생존 가능성 평가. J. Vis. 경험 (2018).이 영상은 박테리아의 생존 가능성을 연구하기 위한 시험관 내 장 숙주-미생물 모델을 시연합니다. Caco-2와 HT29-MTX 세포의 공동 배양은 모의 소화 조건 하에 사전 처리된 박테리아와 함께 배양됩니다. 상피 장벽의 완전성을 경상피 전기 저항을 이용해 평가하며, 배양지에서 분획, 용해된 점액, 세포 용해액, 세포 잔해물을 수집하여 후속 분석을 수행합니다.

박테리아 부착 및 내부 흡수를 평가하기 위한 시험관 내 장 모델

이 비디오는 감염 전파를 연구하기 위해 태반 조직에 감염 모델을 설정하는 방법을 보여줍니다. 체외 태반 장기 배양은 통성 세포 내 기생충인 Listeria monocytogenes에 감염되어 있습니다. 박테리아는 외부 영양막아세포(EVT)에 침입하여 태반 조직에 들어간 다음 세포 간 확산을 통해 다른 세포로 증식합니다.

생체 외 장기 배양에서 박테리아 감염 모델을 확립하는 기술

점막 세균 감염에 응하여 호중구 트랜스 상피 이동은 상피 손상 및 임상 질병에 기여합니다.  시험관 내 모델은 병원체, 인간 호중구 및 트랜스웰 필터에서 자란 편광 된 인간 상피 세포 층을 결합하여이 현상을 조율하는 분자 메커니즘을 해명하는 쪽으로 조사를 용이하게하는 것으로 개발되었습니다.

시험관 내 병원균 유도 호중구 트랜스 상피 이동을 평가하는 공동 문화 분석

이 프로토콜은 극성이 역인 작은 장 장내염을 활용하여 정점 표면에 접근 할 수있는 apical-out 괴사 장염 (NEC) 인 - 접시 모델을 설명합니다. 우리는 NEC 관련 상피 파괴를 검출하기위한 면역 형광 염색 프로토콜 및 NEC-in-a-dish 프로토콜을 실시한 apical-out enteroids의 생존력을 결정하는 방법을 제공합니다.

체외 괴사성 장염의 Apical-Out Enteroid 모델

본 프로토콜은 장 투과성을 결정하기 위해 정점 엔터로이드 모델에서 루시퍼 옐로우를 활용하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 방법은 괴사 성 장염과 같은 염증성 장 질환을 모델링하는 장내 세포에서 세포 투과성을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

정점 장내구 모델에서 루시퍼 옐로우를 사용한 장 투과성 측정

대장균은 출생 무렵에 박테리아를 섭취하는 신생아에게 패혈증을 일으킵니다. 대장균이 장내에서 혈류로 이동하는 능력과 관련된 과정은 잘 이해되지 않았습니다. 이 시험관 내 모델은 대장균 균주가 장 상피 세포를 통해 이동하는 능력을 평가합니다.

신생아 대장균 균 혈증 분리물의 장 트랜스사이토시스 평가

이 프로토콜은 질병 발병에 대한 기계론적 연구에 사용할 수 있는 괴사성 장염(NEC)의 시험관 내 모델을 설명합니다. 인간 신생아 장, 내피 세포 및 중증 NEC가 있는 신생아의 장내 마이크로바이옴에서 추출한 장내 장내형 칩을 파종한 것이 특징입니다.

인간 신생아 장 장내염과 디스바이오틱 마이크로바이옴을 통합한 괴사성 장염의 미세유체 모델

본 프로토콜은 시험관 내 상피 세포주를 사용하여 Shigella 부착, 침습 및 세포 내 복제를 조사하기 위한 감염 분석을 설명합니다.

Shigella를 사용한 상피 세포 감염 분석

이 연구는 조직 줄기세포에서 유래한 장 오가노이드를 이용한 세균 감염의 시험관 내 조사 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 2차원에서 오가노이드를 배양하고 구분하는 방법, 침착성 대장균으로 감염시키는 방법, 그리고 상피 장벽 돌파, 감염 영상, 상피 RNA 반응 등 주요 측정값을 평가하는 방법을 설명합니다.

숙주-박테리아 상호작용을 연구하기 위한 침입 또는 저저막 추출물에 적용한 2차원 오가노이드 배양

침착성 대 장균 균주에서의 항생제 내성은 전통적인 겐타미신 보호 검사법을 이용한 세균 침입 평가에 도전 과제를 제기합니다. 군락 형성 단위를 열거하여 정량적으로, 그리고 감염된 세포를 면역형광 공초점 현미경으로 시각화하여 정성적으로 평가하는 개선된 방법을 기술한다.

대장균 세포 침범의 정량화 및 시각화를 위한 아미카신 보호 분석

배우세요 장 상피 세포에서 장내 세균 침입을 연구하는 수직 확산 챔버(VDC) 모델을 사용하는 방법을. Caco-2 세포와 미소호기성 조건에서 Campylobacter jejuni 상호작용 및 침입을 10배에서 100배까지 증가시켜 생리학적으로 관련성 높은 감염 분석을 가능하게 합니다.

장 상피 세포의 장내 세균의 침입

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