장 상피 세포의 장내 세균의 침입

다음 실험의 전반적인 목적은 수직 확산 챔버(vertical diffusion chamber, VDC) 모델을 사용하여 박테리아와 장 상피 세포 침입 간의 상호작용을 조사하는 것입니다. 이를 위해 먼저 Caco-2 장 상피 세포의 분극화된 단층이 배치된 특수 필터를 사용하여 VDC 내에 분리된 정단부(apical) 및 기저-측면(basal lateral) 구획을 생성합니다. 두 번째 단계에서는 분석 대상인 박테리아 접종물을 정단부 구획에 첨가합니다.

미세 호기성 조건 및 세포 배양 하에서, 호기성 조건으로 기저측 구획에 배지를 추가한 후, 공동 배양 중 원하는 시점에서 필터를 제거하고 상호작용 또는 세포 내 박테리아의 수를 측정합니다. 결과적으로, 표준 호기성 배양 조건과 비교하여 VDC 모델을 사용하면 상호작용 및 세포 내 박테리아 수의 증가를 관찰할 수 있습니다. 표준 조직 배양 부착 및 침입 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 박테리아와 장 상피 세포의 공동 배양을 인간 장의 in vivo 조건과 더 유사한 in vitro 조건 하에서 수행할 수 있다는 점입니다.

시연은 저희 실험실의 박사 과정 학생인 N Vida nas와 저희 실험실에서 박사 학위 과정 중 수직 확산 챔버 모델을 개발한 포스닥 Dominic Mills가 진행하겠습니다. 먼저 0.4 micron 필터당 4 × 10⁵개의 Caco-2 장 상피 세포를 배양액에 접종한 다음, 2~3일마다 배지를 교체하며 21일 동안 세포를 배양하여 극성을 형성시키고 단층의 극성 상태를 확인합니다. 볼트-옴 저항계를 사용하여 경상피 전기 저항을 측정하십시오.

VDC 공배양 분석을 시작하기 24시간 전에, 가변 분위기 배양기 내의 미호기성 조건에서 신선한 혈액 배지 플레이트에 jejuni를 배양합니다. 동시에 Bruce broth 30 milliliters를 동일한 조건에서 사전 배양합니다. 실험 당일, VDC 하프 챔버와 O-링 및 플러그를 멸균 용액에 담급니다. 그런 다음 멸균된 20 milliliter 주사기를 사용하여 두 하프 챔버의 가스 유입구를 통해 용액을 세척합니다. 한 시간 후, 또 다른 멸균된 20 milliliter 주사기를 사용하여 가스 유입구를 헹구어 VDC 구성 요소를 신선한 멸균수로 헹굽니다.

그런 다음, CJ jui 혈액 한천 배지 플레이스 배양액의 절반을 미리 배양된 barella broth 1 mL에 수확하여 mL당 약 10¹⁰ CFU를 얻습니다. 600 nm에서 세균 현탁액의 흡광도를 측정하여 세균 집락 형성 단위(CFU)를 반정량하고, 미리 배양된 Bruce broth 총 4 mL로 세균 현탁액을 원하는 접종 수준으로 조정합니다. 이 최종 세균 현탁액으로부터 단계 희석을 수행한 후, 적절한 희석액을 혈액 한천 배지 플레이트에 3반복으로 도말하고 가스 조절 배양기에서 48시간 동안 배양합니다.

이제 VDC의 하단 챔버를 벤치 위에 평평하게 놓고 O-링을 장착합니다. 그런 다음, 장 상피 세포가 포함된 필터 하나를 캐리어에서 분리하여 400 µL의 멸균 PBS로 세 번 세척합니다. O-링이 제자리에 있는지 확인하면서 필터를 하단 챔버 위에 놓고, 상단 챔버를 그 위에 조심스럽게 내립니다.

두 개의 하프 챔버를 조립한 후, 링 클램프를 사용하여 함께 고정하고 두 개구부가 위를 향하도록 VDC를 벤치탑 위에 수평으로 놓습니다. 정단부 하프 챔버에 박테리아 접종물을 넣고, 기저 측면 하프 챔버에 4 mL의 세포 배양 배지를 추가합니다. 양쪽 하프 챔버의 개구부에 엔드 피스를 끼운 다음, VDC를 가변 분위기 배양기에 넣습니다.

가스 매니폴드 인근에서, 가스 매니폴드에 연결된 가스 공급 레귤레이터를 엽니다. 매니폴드에서 나오는 튜브를 VDC 기저 측면 하프 챔버의 가스 입구에 연결하고, 가변 분위기 인큐베이터에서 나오는 가스 배출 파이프를 기저 측면 하프 챔버 끝단 피스의 배출구 중 하나에 연결합니다. 기저 측면 하프 챔버 끝단 피스의 나머지 배출구는 폐쇄합니다.

그 다음, 과도한 가스 압력을 방지하고 적절한 공동 배양 기간 후에 2~5초당 한 개의 기포가 형성되는 가스 유량을 달성하기 위해 가스 매니폴드의 가스 흐름을 매우 천천히 엽니다. 가스 매니폴드에 연결된 가스 공급 조절기를 닫습니다. 그런 다음 매니폴드에서 VDC로 흐르는 가스를 배출하고, VDC에서 가스 유입구, 가스 유출구 및 스토퍼를 분리합니다.

다음으로, 가변 대기 배양기에서 VDC를 꺼냅니다. 그다음 정단 및 기저 측면 상청액을 제거하여 추후 분석을 위해 -80 °C에서 보관합니다. 링 클램프를 제거하고 VDC를 조심스럽게 분해합니다.

하프 챔버에서 필터를 제거하여 멸균된 6-웰 세포 배양 접시로 옮깁니다. 그런 다음 VDC를 멸균수로 세척하고, 상호작용하는 박테리아의 총 수를 측정하기 위한 다음 실험 단계까지 보관합니다. 장 상피 세포를 400 µL의 멸균 PBS로 3회 세척한 다음, Triton X 100이 포함된 400 µL의 멸균 PBS에서 실온으로 20분 동안 용해합니다. 세포 용해액을 단계별로 희석한 후, 적절한 희석액을 혈액 우무 배지에 3회 반복하여 도말합니다.

그런 다음 침입한 총 박테리아 수를 측정하기 위해 가변 분위기 배양기에서 37°C로 48시간 동안 플레이트를 배양합니다. 세포 외 박테리아를 제거하기 위해 장 상피 세포를 150 µg/mL의 Gentamycin이 포함된 세포 배양액 400 µL와 함께 표준 조직 배양기에서 2시간 동안 배양합니다. 그 후, 앞에서 시연한 것과 같이 세포 용해, 연속 희석 및 배양을 거쳐 콜로니 형성 단위(CFU)를 정량화합니다.

다음 데이터는 표준 세포 배양 분석 조건과 VDC 모델을 사용하여 3시간, 6시간 또는 24시간 동안 공동 배양한 후 Caco 2 세포와 상호작용하거나 침입한 CJ jui의 수를 비교하여 보여줍니다. 예를 들어, 표준 세포 배양 조건에서 24시간 공동 배양 후에는 Caco 2 세포와 상호작용하는 CJ juna의 CFU가 10⁷ 미만으로 관찰될 수 있습니다. 그러나 VDC 모델에서 24시간 공동 배양 후에는 약 10⁸ CFU의 CJ jui가 Caco 2 세포와 상호작용하는 것이 관찰되었으며, 이는 CJ jui와 IEC의 상호작용이 거의 10배 증가했음을 나타냅니다.

표준 배양 조건과 VDC 배양 조건에서 침입한 CJ jui의 수를 비교했을 때, 표준 세포 배양 조건 하에서는 24시간 후에 CACO two 세포로부터 약 10⁵ intracellular CFUs의 CGE jui를 분리할 수 있습니다. 반면 VDC 모델에서 24시간 동안 공동 배양한 후에는 CACO two 세포로부터 약 10⁷ intracellular CFUs를 분리할 수 있으며, 세포 내 CGE가 거의 100배 증가합니다. 이 절차를 수행할 때는 기저 외측 챔버(basal lateral chamber)의 가스 흐름이 형성된 후 이를 모니터링하는 것이 중요합니다.

이 기술은 abuc 병원성 분야의 연구자들이 장 상피 세포와 박테리아 상호작용의 유전적 기초뿐만 아니라, 박테리아 감염에 대한 숙주의 선천성 면역 반응을 조사할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 수직 확산 챔버 모델을 사용하여 다른 장내 박테리아와 장 상피 세포 간의 상호작용을 연구하는 방법과 인간의 장내 환경을 더욱 밀접하게 재현하는 조건들에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.