마우스 저항 동맥의 미세 혈관 내피 튜브의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 생쥐 상복부 동맥 또는 SEA에서 내피 세포관을 분리하여 본래의 온전한 미세혈관 내피의 세포 내 및 세포 간 신호 전달 역학을 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐의 복부 골격근 벽에서 SEA를 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 혈관을 부드럽고 체적으로 소화한 다음 조심스럽게 TAT하여 내피 세포관에서 평활근 세포와 외막을 분리합니다.

마지막 단계에서 튜브는 흐름 챔버에 고정되고 생리학적 식염수 용액과 슈퍼 융합됩니다. 궁극적으로, 컨포칼 이미징은 본래의 온전한 미세혈관 내피관에서 칼슘 신호를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 내피 세포 배양과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 내피 세포가 관을 구성하고 고유한 형태, 단백질 발현 및 반응성을 유지한다는 것이며, 내피는 몸 전체의 혈류 조절에 필수적입니다.

이 기술을 적용하면 혈류 조절을 중재하는 세포 간 신호 전달 이벤트와 혈관 기능 장애 중에 어떻게 잘못될 수 있는지 조사할 수 있습니다. SEA를 먼저 분리하기 위해 마취된 마우스의 치골 부위 바로 위의 피부를 통해 작은 절개를 만들고 각 방향으로 절개를 각 뒷다리까지 측면으로 확장한 다음 복부 정중선을 따라 흉곽 상단까지 절개를 계속하여 각 방향으로 각 방향으로 절개를 각각의 네 다리까지 측면으로 더 확장합니다. 이제 피부를 부드럽게 들어 올리고 피부를 아래 근육에 고정하고 있는 결합 조직을 절단하여 복부 근육 조직의 전체 표면을 노출시킵니다.

노출된 근육에 실온의 식염수를 관개합니다. 그런 다음 실체 현미경으로 흉골 바닥에 있는 지방 패드를 들어 올립니다. 지방 패드와 아래쪽 갈비뼈를 따라 절개합니다.

이제 SEA가 보여야 하며 동맥이 손상되지 않도록 주의하고 노출된 조직에 더 많은 실온의 식염수로 세척해야 합니다. 골격근의 최상층을 후퇴시킨 후 SEA의 길이를 기록한 다음 동맥 아래의 얇은 근육층을 조심스럽게 절제합니다. 다음으로, 각진 집게를 사용하여 SCA 아래에 6개의 실크 봉합사를 통과시킵니다.

그런 다음 동맥과 그 인접 정맥을 결찰하여 압력을 유지하고 혈관이 내강 내에 유지되도록 합니다. 반대쪽 SCA를 결찰한 후 복부 근육의 정중선을 따라 절개하여 양쪽을 분리한 다음 피부에 대해 했던 것처럼 절개를 각 방향으로 측면으로 확장합니다. 바깥쪽 가장자리를 따라 수직으로 절개를 계속하여 복부 근육을 몸에서 완전히 분리합니다.

그런 다음 밀봉을 유지하기 위해 결찰 위의 SEA를 절단하고 고립된 근육과 동맥을 섭씨 4도의 박리 완충액 10밀리리터가 들어 있는 50ml 비커에 넣습니다. 복부 반대쪽에서 근육을 분리한 후 10분 동안 해부 완충액에서 조직을 배양합니다. 이제 SEA를 포함하는 복부 근육을 섭씨 4도의 페트리 접시에 넣고 cyl 가드 층으로 코팅되고 해부 완충액이 들어 있습니다.0.15mm 곤충 핀을 사용하여 SEA와 근육을 이전에 언급한 대략적인 생체 내 길이로 늘립니다.

SEA를 실린더 가드에 고정하여 복막을 향하는 얇은 층이 맨 위에 오도록 근육의 방향을 잡습니다. 그런 다음 상류 결찰 부위에서 하류 끝을 향해 작업하면서 쌍을 이루는 정맥과 주변 조직에서 첫 번째 주요 분기 위치까지 약 1-2cm의 SEA를 제거합니다. 분기 부위 바로 위와 결찰 바로 아래에서 SEA를 자릅니다.

다음으로, 탄성 튜브 조각을 사용하여 피펫의 뒤쪽 끝을 얼음 저온 해부 버퍼가 들어 있는 5ml 주사기에 부착합니다. 해부 챔버 내에 캐뉼레이션 피펫 팁을 고정하고 SEA를 캐뉼레이트합니다. 그런 다음 모든 적혈구가 씻겨 나가면 캐뉼레이션 피펫에서 SEA를 제거하고 해부 접시에서 피펫을 제거하여 내피 튜브를 분리합니다.

먼저 12 x 75mm 유리 배양 튜브에 얼음 저온 해부 완충액을 반쯤 채웁니다. 그런 다음 SEA를 1-3mm 조각으로 자른 후 각진 집게를 사용하여 동맥 조각을 배양 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 별도의 12 x 75mm 배양 튜브에 분해 효소와 해리 완충액을 최종 부피 1ml까지 결합하고 가열 블록으로 효소 용액을 섭씨 37도로 예열합니다.

동맥 조각이 들어있는 배양관을 섭씨 4도에서 제거하고 효소 용액이 섭씨 37도로 예열되는 동안 실온에 두어 예열합니다. 배양 튜브에서 현재 실온 해부 완충액을 조심스럽게 흡입하여 용기 세그먼트를 포함하는 작은 부피를 남깁니다. 이제 효소가 없는 실온의 해리 완충액을 혈관 분절에 천천히 첨가하여 동맥 조각이 배양 튜브 바닥에 남아 남아 남아 있는 박리 완충액을 씻어냅니다.

효소 용액이 섭씨 37도에 도달하면 용기 분절이 포함된 배양관에서 해리 완충액을 다시 흡인하여 혈관 분절을 포함하는 작은 부피를 남깁니다. 이제 37도 효소 용액을 배양 튜브로 옮기고 섭씨 37도에서 30분 동안 가열 블록에서 배양 튜브를 배양합니다. 배양하는 동안 미네랄 오일로 다시 채워진 리터레이션 피펫을 준비하고, 피펫에 점수를 매기고, 깨끗하게 끊고, 집게 불로 피펫을 부수고, 피펫 끝을 연마하고, 마이크로 매니퓰레이터에 장착 된 마이크로 주사기에 고정합니다.

그런 다음 마이크로 주사기 플런저를 후퇴시켜 피펫에 2나노리터의 해리 완충액을 채우고 배양 종료 시 유동 챔버 위에 피펫 팁을 놓습니다. 방금 시연한 대로 완충액을 조심스럽게 흡인한 후 4ml의 실온 해리 완충액으로 동맥 분절을 세척합니다. 다음으로, 1ml 마이크로 피펫으로 하나의 용기 세그먼트를 부드럽게 흡인하고 1ml의 해리 완충액이 있는 흐름 챔버에 용기를 놓습니다.

용기 분절의 한쪽 끝 근처에 양이온 피펫의 끝을 배치한 다음 내피 세포에 기계적 변형을 일으키지 않도록 초당 약 225나노리터의 속도로 용기 분절을 테이팅 피펫으로 흡인하고 혈관을 챔버로 다시 배출합니다. 소화가 성공적으로 이루어졌다면 평활근 세포와 외막은 내피관에서 해리될 것입니다. 가능한 한 빨리 내피관에서 외막을 멀리 옮겨 내피관이 내피관에 얽히지 않도록 한 다음 모든 평활근 세포가 해리될 때까지 방금 설명한 대로 tation을 반복합니다.

최종 반복 후, ASEE는 분리된 내피관을 유동 챔버 중앙에 배치하고 유동 방향을 따라 정렬하고 트리거링 피펫을 제거했습니다. 플로우 챔버의 양쪽 끝에 장착된 마이크로 매니퓰레이터에 피펫을 고정한 다음 팁을 내피 튜브의 각 끝에 배치합니다. 튜브의 반대쪽 끝에서 한 번에 하나씩 피펫을 내리고 튜브의 각 끝에서 약 50마이크로미터 떨어진 챔버 바닥에 튜브를 누릅니다.

피펫이 튜브에 닿을 때 튜브의 축을 따라 천천히 집어넣어 대략적인 생체 내 길이로 늘립니다. 챔버 바닥에 피펫을 눌러 튜브를 고정한 다음 연동 펌프를 사용하여 과융합 용액의 흐름을 시작하여 내피관을 가로지르는 과융합 용액의 일정한 흐름을 유지합니다. 이 미분 간섭 대비 이미지에서는 SEA에서 분리된 내피 세포 튜브가 실온에서 분당 3밀리리터의 초융합 버퍼를 사용한 1시간 과융합이 표시됩니다.

이 동영상은 1마이크로몰 아세틸콜린 자극에 대한 반응으로 독감 오 4가 로드된 내피 세포관의 칼슘 반응을 보여줍니다. 이러한 대표적인 형광 이미지는 아세틸콜린으로 내피관 자극 후 다양한 시점에서 수집되었습니다. 세포 내 칼슘이 시간이 지남에 따라 어떻게 진동하는지 주목하십시오.

이 절차를 시도하는 동안 내피 세포는 매우 섬세하고 쉽게 손상되기 때문에 트라이 포지셔닝 및 핀 링 중에 내피관이 기계적으로 손상되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스의 상복부 동맥에서 내피관을 분리하는 방법에 대해 잘 알게 될 것이며, 이를 통해 본래의 온전한 미세혈관 내피를 연구