마우스 저항 동맥의 미세 혈관 내피 튜브의 분리

이 절차의 전반적인 목적은 마우스의 상복벽동맥(superior epigastric artery, SEA)에서 혈관내피세포 튜브를 분리하여, 천연 상태의 온전한 미세혈관 내피의 세포 내 및 세포 간 신호 전달 역학을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마우스 복부 골격근 벽에서 SEA를 분리합니다. 두 번째 단계에서는 혈관을 부드럽게 체세포 소화시킨 후, 조심스럽게 TAT 처리를 하여 평활근 세포와 외막을 혈관내피세포 튜브로부터 해리시킵니다.

마지막 단계로, 튜브를 유동 챔버(flow chamber)에 고정하고 생리식염수로 관류합니다. 최종적으로, 공초점 이미징을 통해 원래의 온전한 미세혈관 내피 튜브 내의 칼슘 신호 전달을 시각화할 수 있습니다. 내피세포를 배양하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 튜브를 구성하는 내피세포가 고유의 형태, 단백질 발현 및 반응성을 유지한다는 점입니다. 내피는 전신에 걸친 혈류 조절에 필수적인 역할을 합니다.

이 기술을 적용하면 혈류 조절을 매개하는 세포 간 신호 전달 사건과 혈관 기능 장애 발생 시 이러한 과정이 어떻게 잘못될 수 있는지를 조사할 수 있습니다. SEA를 분리하기 위해, 먼저 마취된 생쥐의 치골 부위 바로 위 피부에 작은 절개를 가하고, 절개 부위를 각 후지로 하여 양옆으로 확장한 다음, 복부 정중선을 따라 흉곽 상단까지 절개를 계속하고 다시 양옆으로 확장하여 네 가지를 모두 노출시킵니다. 이제 피부를 부드럽게 들어 올려 피부와 아래쪽 근육을 연결하는 결합 조직을 절단하여 복부 근육층의 전체 표면을 노출시킵니다.

노출된 근육을 상온의 생리식염수로 세척합니다. 그다음 실체 현미경 하에서 흉골 하단에 위치한 지방 패드를 들어 올립니다. 지방 패드를 통해 그리고 갈비뼈 하단을 따라 절개합니다.

이제 SEA가 보일 것입니다. 동맥이 손상되지 않도록 주의하면서, 노출된 조직을 상온의 식염수로 더 세척하십시오. 골격근의 상층을 젖힌 후 SEA의 길이를 확인하고, 동맥 아래의 얇은 근육층을 조심스럽게 절제하십시오. 다음으로, 각도가 진 포셉을 사용하여 6-0 silk 봉합사를 SCA 아래로 통과시킵니다.

그다음, 압력을 유지하고 혈액이 혈관 내강에 머물도록 동맥과 인접한 정맥을 결찰합니다. 반대측 SCA를 결찰한 후, 복근의 중앙선을 따라 절개하여 양측을 분리하고, 피부와 마찬가지로 절개선을 각 방향의 외측으로 확장합니다. 복근을 신체에서 완전히 분리하기 위해 외측 가장자리를 따라 수직으로 절개를 계속합니다.

그런 다음, 밀봉 상태를 유지하기 위해 ligation 윗부분의 SEA를 절단하고, 분리한 근육과 동맥을 4°C의 dissection buffer 10 mL가 담긴 50 mL 비커에 넣습니다. 복부 반대편에서 근육을 분리한 후, 조직들을 dissection buffer에서 10분 동안 배양합니다. 이제 SEA가 포함된 복부 근육을 cyl guard 층이 코팅되어 있고 dissection buffer가 담긴 4°C의 Petri dish에 놓습니다. 0.15 mm 곤충 핀을 사용하여 SEA와 근육을 이전에 기록해 둔 대략적인 in vivo 길이까지 늘립니다.

복막을 향하는 얇은 층이 위로 오도록 근육의 방향을 맞추어 SEA를 실린더 가드에 고정합니다. 그런 다음 결찰의 상류 지점에서 하류 끝 방향으로, 첫 번째 주요 분지 지점까지 SEA의 약 1~2cm 구간을 쌍을 이루는 정맥 및 주변 조직으로부터 분리합니다. 분지 지점 바로 위와 결찰 지점 바로 아래에서 SEA를 절단합니다.

다음으로, 탄성 튜브를 사용하여 피펫의 뒷부분을 얼음처럼 차가운 해부 완충액이 들어 있는 5 mL 주사기에 연결합니다. 캐뉼레이션 피펫 팁을 해부 챔버 내에 고정하고 SEA를 캐뉼레이션합니다. 이후 모든 적혈구가 씻겨 나가면, 캐뉼레이션 피펫에서 SEA를 분리하고 해부 접시에서 피펫을 제거하여 혈관 내피 튜브를 분리합니다.

먼저, 12 by 75 mm 유리 배양 튜브에 얼음처럼 차가운 박리 완충액을 절반 정도 채웁니다. 그다음 SEA를 1~3 mm 크기로 절단한 후, 각진 핀셋을 사용하여 동맥 조각들을 배양 튜브로 옮기고 튜브를 얼음에 둡니다. 이어서, 별도의 12 by 75 mm 배양 튜브에 소화 효소와 해리 완충액을 혼합하여 최종 부피를 1 mL로 맞추고, 가열 블록을 사용하여 효소 용액을 37 °C로 예열합니다.

동맥 조각이 들어 있는 배양 튜브를 4°C에서 꺼내 실온에 두고, 그동안 효소 용액을 37°C로 가온합니다. 배양 튜브에서 실온 상태가 된 해부 버퍼를 조심스럽게 흡입하여 제거하되, 혈관 분절이 담긴 소량의 용액은 남겨둡니다. 이제 효소가 포함되지 않은 실온의 해리 버퍼를 동맥 조각이 배양 튜브 바닥에 그대로 남아 있도록 천천히 첨가하여 남아 있는 해부 버퍼를 씻어냅니다.

효소 용액이 37°C에 도달하면, 혈관 분절이 들어 있는 배양 튜브에서 혈관 분절이 포함된 소량의 액체만 남기고 해리 완충액을 다시 흡입하여 제거합니다. 이제 37°C의 효소 용액을 배양 튜브로 옮기고, 가열 블록에서 37°C로 30분 동안 배양 튜브를 배양합니다. 배양하는 동안 미네랄 오일이 채워진 리터레이션 피펫을 준비하고, 피펫에 금을 그은 후 깨끗하게 절단하며, 포셉으로 피펫을 부러뜨리고, 피펫 끝을 연마하여 마이크로 매니퓰레이터에 장착된 마이크로 시린지에 고정합니다.

그 다음 마이크로 시린지 플런저를 당겨 피펫에 2 nL의 해리 완충액을 채우고, 배양 시간이 종료되면 피펫 팁을 흐름 챔버 위에 위치시킵니다. 방금 시연한 대로 완충액을 조심스럽게 흡입한 후, 동맥 분절을 4 mL의 상온 해리 완충액으로 세척합니다. 다음으로, 1 mL 마이크로 피펫을 사용하여 혈관 분절 하나를 부드럽게 흡입하고, 1 mL의 해리 완충액이 들어 있는 흐름 챔버에 혈관을 넣습니다.

tation 피펫의 팁을 혈관 분절의 한쪽 끝 근처에 위치시킨 다음, 내피세포에 기계적 변형을 주지 않도록 초당 약 225 nanoliters의 속도로 혈관 분절을 tating 피펫으로 흡입하고, 다시 챔버로 배출하십시오. 소화가 성공적이었다면 평활근 세포와 외막이 내피관으로부터 분리됩니다. 외막이 관에 엉키지 않도록 가능한 한 빨리 내피관에서 멀리 옮긴 후, 모든 평활근 세포가 분리될 때까지 방금 시연한 tation 과정을 반복하십시오.

마지막 반복 작업 후, 분리된 혈관 내피 세포관을 흐름 챔버 중앙에 흐름 방향을 따라 정렬하여 배치하고 트리거링 피펫을 제거합니다. 흐름 챔버 양단에 장착된 마이크로 조작기에 고정 피펫을 단단히 고정한 다음, 피펫 팁을 혈관 내피 세포관의 양 끝단에 맞게 위치시킵니다. 고정 피펫을 한 번에 하나씩 튜브의 반대쪽 끝단 위로 내려, 각 끝단에서 약 50 micrometers 떨어진 지점에서 튜브를 챔버 바닥에 밀착시킵니다.

고정 피펫이 튜브에 닿는 즉시, 튜브의 축을 따라 천천히 뒤로 당겨 체내(in vivo) 길이와 비슷하게 늘려줍니다. 피펫을 챔버 바닥에 눌러 튜브를 고정한 후, 연동 펌프를 사용하여 관류액의 흐름을 시작함으로써 혈관 내피 튜브 전체에 관류액이 일정하게 흐르도록 유지합니다. 이 미분 간섭 대비(differential interference contrast) 이미지에서는 실온에서 3 mL/min의 속도로 1시간 동안 관류 버퍼로 관류한 후 분리된 SEA 유래 혈관 내피 세포 튜브가 나타나 있습니다.

이 영상은 1 µM acetylcholine 자극에 따른 fluo-4가 로딩된 혈관 내피세포 튜브의 칼슘 반응을 보여줍니다. 이 대표 형광 이미지들은 acetylcholine로 내피세포 튜브를 자극한 후 다양한 시점에서 수집되었습니다. 세포 내 칼슘이 시간에 따라 어떻게 진동하는지 확인하십시오.

이 절차를 수행할 때, 혈관 내피세포는 매우 섬세하여 손상되기 쉬우므로 삼각대 배치 및 고정 과정에서 내피관에 기계적인 손상을 주지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하신 후면, 마우스의 상복벽 동맥(superior epigastric artery)에서 내피관을 분리하는 방법과 이를 통해 천연 상태의 온전한 미세혈관 내피를 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.