인간 호흡기 세포융합 바이러스 감염에 대한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 면역 반응을 연구하기 위한 체외 모델

이 절차의 전반적인 목표는 호흡기 세포융합 바이러스 또는 RSV 감염에 대한 인간 면역 세포의 반응을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 helo 세포에서 감염성 RSV 스톡을 배양하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 배양된 RSV 스톡을 초원심분리로 정제합니다.

다음으로, 일차 인간 혈액 면역 세포는 밀도 원심분리에 의해 분리됩니다. 마지막 단계에서는 분리된 면역 세포를 바이러스로 자극합니다. 궁극적으로 RSV 감염에 대한 세포 면역 반응은 E iza QPCR 또는 유세포 분석으로 평가할 수 있습니다.

이 기술은 호흡기 syn situ 바이러스 감염을 연구하는 데 유용한 추가 기술입니다. RSV는 인간에 대한 적응력이 매우 높습니다. 따라서 인간 면역 세포를 사용하여 바이러스의 발병기전과 관련된 염증 경로를 연구하는 것이 중요합니다.

이 비디오에 사용된 바이러스는 RSV이지만 이 방법은 인플루엔자 바이러스나 리노바이러스와 같은 다른 바이러스를 연구하는 데에도 쉽게 적용할 수 있습니다. 인간 RSV 좌석 스톡이 담긴 바이알과 섭씨 37도의 수조를 데우는 것으로 시작합니다. 바이러스가 해동되면 플라스크당 감염 배지 4ml 분취량으로 스톡을 희석합니다.

MOI를 0.1 이하로 유지하고, 세포를 건조시키지 않도록 헬리 세포에 바이러스를 최대한 낮게 첨가합니다. 그런 다음 섭씨 37도, CO2 5%에서 2-4시간 동안 배양물을 배양하고 15분마다 플라스크를 소용돌이쳐 배지를 재분배합니다. 다음으로, 접종물을 제거하고 PBS로 세포를 한 번 씻습니다.

그런 다음 플라스크에 15ml의 배양 배지를 추가하고 동일한 배양 조건에서 3-5일 동안 배양합니다. 매일 하루에 한 번 일반 명시야 현미경 검사로 세포를 관찰하여 바이러스에 의한 세포 병리학적 변화를 확인합니다. 이러한 변화가 관찰되면 세포를 긁어내어 RSV를 채취한 다음 멸균 50ml 튜브에 현탁액을 수집하고 세포를 피질한 다음 1800Gs 및 실온에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다.

RSV는 이 속도로 펠릿화되지 않으므로 상등액은 섭씨 영하 80도에서 1밀리리터의 파종량으로 저장할 수 있습니다. 향후 사용을 위한 부분 표본은 감염성 바이러스 입자의 손실을 방지하기 위해 항상 스냅 동결 RSV 및 액체 질소를 사용합니다. RSV를 정화하려면 먼저 초원심분리기의 각 버킷에 멸균 원심분리기 튜브를 배치하십시오.

그런 다음 갓 준비한 필터 멸균 자당 용액 5ml를 각 튜브의 바닥에 추가합니다. 다음으로, 매우 천천히 자당 용액 위에 RSV 용액 30 밀리리터를 첨가하고 자당 용액을 방해하지 않도록주의하고 층을 구별 상태로 유지 한 다음 무균 상태를 유지하기 위해 흐름 캐비닛에서 멸균 PBS가있는 6 개의 초 원심 분리 버킷을 캡을 포함하여 서로 0.1g 이내의 균형을 조심스럽게 유지하십시오. 20, 000 RCF 및 섭씨 4도에서 1.5시간 동안 바이러스를 스핀다운합니다.

그런 다음 스핀이 완료되면 멸균 집게를 사용하여 버킷에서 원심분리기 튜브를 조심스럽게 제거합니다. 바이러스 입자는 자당 층을 통과하여 펠릿을 형성합니다. 원심분리기 튜브를 바이러스 폐기물 플라스크에 넣고 튜브를 멸균 표면에서 거꾸로 배수합니다.

펠릿이 완전히 마르지 않도록 하십시오. 다음으로 조심스럽게 HPSS 1ml를 펠릿 위로 흘리게 하고 원심분리기 튜브를 다시 기울여 HPSS를 배출합니다. 그런 다음 튜브를 다시 거꾸로 뒤집고 펠릿이 마르지 않도록 주의하십시오.

이제 HBSS의 또 다른 밀리리터로 펠릿을 40 번 삼중 평가하여 바이러스를 파괴 할 수 있으므로 거품 형성을 피하도록주의하십시오. 그런 다음 액체 질소에서 바이러스의 분취액을 스냅 동결합니다. 정량화 및 추가 사용이 가능할 때까지 바이러스를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오: 건강한 지원자로부터 10ml EDTA 튜브에 혈액을 채취한 후, 50ml 튜브에 최대 35ml의 희석된 혈액을 실온 PBS로 최대 2배까지 희석합니다.

다음으로, 멸균 루어 잠금 바늘을 멸균 50ml 주사기에 부착한 다음 밀도 구배 매체를 주사기에 흡입합니다. 희석된 혈액 튜브 바닥에 바늘을 놓고 밀도 구배와 혈액 사이의 깨끗한 경계를 유지하면서 혈액 아래에 15ml의 밀도 구배 매체를 조심스럽게 피펫팅합니다. 이제 분리 후 최대 가속도로 실온에서 800GS에서 20분 동안 세포를 분리합니다.분리 후 적혈구는 상단에 은빛 호중구층이 있는 튜브 바닥의 펠릿에서 발견됩니다.

펠릿 위의 투명한 층에는 밀도 구배 매체가 포함되어 있고 밀도 구배 매체와 상단의 혈장층 사이의 얇은 층에는 pbmc가 포함되어 있습니다. 페이스트 피펫을 사용하여 pbmc를 조심스럽게 수집한 다음 세포를 얼음 위의 새 50ml 튜브로 옮깁니다. 얼음처럼 차가운 PBS를 50 밀리리터 용량에 첨가하고 스핀이 완료되면 세포를 펠렛

상층액을 흡인하고 펠릿을 50 밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번째 세척 후 2 번 세척하고, 펠릿에 1 밀리리터의 얼음 차가운 매체를 첨가하고, 세포를 계수하고, 세포 농도를 밀리리터 당 6 pbmc의 5 곱하기 10으로 조정한다. 먼저 라이브 RSV로 pbmc를 자극하려면 100 웰 원형 바닥 플레이트의 각 웰에 96 마이크로리터의 pbmc를 추가합니다. 그런 다음 각각 새로 희석된 두 가지 자극을 50마이크로리터로 추가합니다.

섭씨 37도, CO2 5%에서 24시간 동안 플레이트를 잘 배양한 다음 플레이트를 원심분리하고 Eliza의 추후 분석을 위해 상등액을 수집합니다. 펠릿의 자극된 pbmc는 QPCR로 분석하거나 유세포 분석을 위해 염색할 수 있습니다. A-P-B-M-C 자극 실험을 수행할 때 이 방법으로 자극 분율 방법을 제안합니다.

조건은 RPMI 또는 인간 RSV와 같은 표준 자극 조건과 mial, dipeptide 또는 LPS와 같은 테스트 분획 조건으로 나뉩니다. 중요한 것은, RPMI 단독과 같은 음성 대조군과 LPS와 같은 양성 대조군이 항상 각 실험에 포함된다는 것입니다: RSV로 자극한 후 24시간 후에 서로 다른 PBMC 집단이 용량 의존적 감염률과 RSV 감염 효율의 차이를 나타냅니다. 바이러스 qPCR 자극 24시간 후 TNF 알파 또는 인터페론 감마의 발현에 대한 P BMC의 R 분석은 RSV가 강력한 상향 조절을 유도한다는 것을 보여줍니다. 이 두 가지 염증성 사이토카인의 전사. 반대로, miam dipeptide 또는 LPS를 사용한 자극은 약한 mRNA 발현만을 초래합니다.

RSV와 MIAL 디펩타이드를 함께 사용하여 P BMC를 자극하면 강력한 시너지 상향 조절이 관찰됩니다. 자극된 pbmc는 또한 Eliza에 의해 TNF 알파 또는 인터페론 감마의 생산에 대해 분석되었습니다. 전사 수준에서의 관찰과 대조적으로, RSV는 miam dipeptide를 사용한 p BMC 자극에 의한 TNF 알파 및 인터페론 감마 단백질 분비의 불량 유도자로서 적은 양의 TNF 알파 및 인터페론 감마의 생성을 초래합니다.

전사 분석과 유사하게, TNF 알파와 인터페론 감마는 모두 사이토카인 유도가 RSV 복제에 의존하는지 여부를 확인하기 위해 RSV 및 MIAM 디펩타이드를 대조군으로 동시 자극할 때 시너지 상향 조절을 나타냅니다. P BMC는 살아있는 RSV 및 불활성화된 RSV가 PRO-염증성 사이토카인 생성을 유도하는 그래프에 나타난 바와 같이 살아있는 또는 베타 프로팔, 락톤 비활성화 RSV로 자극되었습니다. RSV를 사용한 실험은 생물 안전 수준 이중 실험실의 생물 안전 캐비닛에서 수행되어야 한다는 것을 잊지 마십시오.

또한, 이 방법을 시도하는 것은 전체 절차에서 내독소가 없는 시약과 물질을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요하지만, 이 비디오를 시청한 후에는 RSV로 인간 pbmc를 자극하는 방법과 면역 반응을 분석하는 데 사용할 수 있는 몇 가지 분석법을 잘 이해하게 될 것입니다.