Name: 인간 호흡기 세포융합 바이러스 감염에 대한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 면역 반응을 연구하기 위한 체외 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 배우세요 인간 말초 혈액 단핵 세포를 이용한 호흡기 세포융합 바이러스 면역 반응 분석 방법입니다. 초고속 원심분리와 세포 자극 기법으로 염증 사이토카인 발현을 평가하여 바이러스 병원성 연구에 활용합니다.

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RSV A2는 R. de Swart 박사(Erasmus MC, Rotterdam, The Netherlands)가 친절하게 제공했습니다. MV 및 GF는 네덜란드 정부 프로젝트 번호 FES0908와 네덜란드 유전체학 이니셔티브(NGI) 프로젝트 번호 050-060-452의 자금 지원을 받는 Virgo 컨소시엄의 지원을 받습니다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

참고:
HRSV를 이용한 실험은 생물안전 2등급(BSL-2) 실험실의 생물안전작업대 내에서 수행해야 합니다. 생물학적 위험으로 인해 바이러스성 폐기물 및 바이러스와 접촉한 모든 재료는 적절한 폐기를 위해 수거하십시오.
감염 가능성이 있는 인간 혈액을 사용할 때는 특별한 주의를 기울여야 합니다.
모든 프로토콜 전반에 걸쳐 엔도톡신이 없는 시약을 사용하는 것이 매우 중요합니다.
1. HRSV A2의 배양
<ol>
	<li>HeLa 또는 HEp-2 세포를 10% 태아 송아지 혈청(FCS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 첨가된 DMEM 배지에서 175 cm² 배양 접시에 배양한다.2 세포가 약 50% 정도 합쳐질 때까지 배양 플라스크에서 배양합니다.</li>
	<li>실온의 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline)로 세포를 3회 세척하십시오. (PBS).</li>
	<li>HRSV 시딩 스톡 바이러스가 들어 있는 바이알을 다음 온도에서 해동하십시오. 37 °C 항온수조에서 처리하십시오. MOI를 0.1 이하로 유지하도록 바이러스 스톡을 희석합니다. 이는 결함 간섭 입자(DIPs)의 생성을 방지하기 위함입니다. 바이러스 스톡을 플라스크당 4ml의 감염 배지(DMEM + 1% P/S)로 희석하여 HeLa 또는 HEp-2 세포에 첨가합니다. 세포가 마르지 않는 범위 내에서 이 부피를 가능한 한 낮게 유지하십시오. 부피가 낮을수록 감염률은 더 높아집니다.</li>
	<li>~에서 2-4시간 동안 배양하십시오. 37 °C, 5% CO22배지를 재분배하기 위해 15분마다 플라스크를 흔들어 줍니다.</li>
	<li>접종물을 제거하고 PBS로 1회 세척하십시오.</li>
	<li>배양액(DMEM + 10% FCS + 1% P/S) 15 ml를 첨가하고 3~5일 동안 다음 조건에서 배양한다. 37 °C, 5% CO22일반 명시야 현미경으로 세포를 관찰하여 바이러스로 인한 세포병변 효과(cytopathological changes)가 있는지 확인하십시오. 예: 합포체 형성 및 사멸 및 부유 세포.</li>
	<li>세포병성 효과가 나타나면, 세포를 긁어내어 HRSV를 수확하고 멸균된 50ml 튜브에 바이러스 현탁액을 수집하십시오. 세포 현탁액을 볼텍싱합니다. 세포를 긁어내고 볼텍싱하면 더 많은 바이러스 입자가 방출됩니다.</li>
	<li>세포 잔해를 침전시키기 위해 바이러스 현탁액을 상온에서 1,800 x g로 10분간 원심분리하십시오. 상층액에 포함된 HRSV는 이 속도에서 침전되지 않으므로, 상층액을 사용하여 여러 개의 175 cm 배양 접지를 직접 감염시킬 수 있습니다.2 플라스크 또는 -에서 보관할 수 있습니다.80 °C 향후 사용을 위해 1ml씩 분주하여 시딩 스톡(seeding stock)으로 보관하십시오. 감염성 바이러스 입자의 손실을 방지하기 위해 HRSV는 항상 액체 질소에 급속 냉동하십시오.</li>
	<li>위에서 언급한 바와 같이, 상기 프로토콜에 따라 제조된 시딩 스톡(seeding stock)은 다수의 175 cm^2 배양 용기에 감염시키는 데 사용됩니다.2 배양 플라스크. 정제를 위한 바이러스를 더 많이 생산하기 위해 동일한 프로토콜을 반복한다. 1회의 초원심분리 사이클당 최대 180ml의 바이러스 현탁액을 정제한다.</li>
	<li>세포병변효과(cytopathology)가 나타나면, 세포를 긁어내어 HRSV를 수확하고 상층액을 수집한다. 바이러스 현탁액을 볼텍싱(vortex)한다. 세포 파편을 침전시키기 위해 실온에서 1,800 x g로 10분간 원심분리한다. 상층액 속의 HRSV는 이 속도에서 침전되지 않으며, 상층액을 50 ml 튜브당 15 ml씩 분주한다. 급속 냉동하여 -에서 보관한다.80 °C 정제 전까지.</li>
</ol>
2. HRSV의 정제
주의: 초원심분리기를 사용하기 전에, 이 장비가 잠재적으로 위험할 수 있음을 인지하십시오. 매뉴얼을 숙지하고, 첫 초원심분리 가동은 경험이 풍부한 사람의 감독 하에 수행하십시오.
<ol>
	<li>초원심분리기 버킷을 70% 에탄올로 세척한 후 생물안전작업대 내에서 건조하십시오.</li>
	<li>각 버킷에 멸균 원심분리 튜브를 넣으십시오.</li>
	<li>30% (w/v) PBS sucrose 용액을 준비하고, 필터 멸균하십시오(0.2 μm (여과)한 후, 각 원심분리관 바닥에 5ml씩 추가합니다. 더 빠른 프로토콜을 위해, 설탕 용액(sucrose solution)이 들어있는 튜브를 냉동 보관할 수 있습니다. 이때 반드시 멸균 상태를 유지하십시오.</li>
	<li>자당 용액이 얼지 않은 상태라면, 이 자당 용액 위에 HRSV 용액 30ml를 매우 조심스럽게 첨가하십시오. 자당 용액이 섞이지 않도록 천천히 피펫팅하십시오. 층 경계가 명확하게 유지되어야 합니다. 튜브가 얼어 있었다면, 얼어 있는 자당 용액 위에 바이러스 현탁액을 붓고 그대로 해동하십시오.</li>
	<li>멸균된 PBS를 사용하여 6개의 초원심분리 버킷의 무게를 매우 정밀하게 맞추십시오. 모든 과정의 멸균 상태를 유지하기 위해 저울을 클린벤치(flow cabinet) 안에 넣으십시오. 튜브의 가장자리에서 3~5mm 아래까지 용액을 채우십시오. 그렇지 않으면 원심분리 튜브가 찌그러질 수 있습니다. 캡의 무게가 완전히 동일하지 않을 경우를 대비하여 스크루 캡을 포함시킨 상태로 버킷의 무게 오차가 0.1g 이내가 되도록 맞추십시오.</li>
	<li>초원심분리기로 1.5시간 동안 원심분리하십시오. 4 °C 20,000 rcf에서.</li>
	<li>멸균 핀셋을 사용하여 버킷에서 원심분리관을 조심스럽게 꺼냅니다. 바이러스 입자는 자당 층을 통과하여 펠릿을 형성하게 됩니다. 반대로, 세포 분비 수용성 인자들은예: 사이토카인(cytokines)은 용액 상태로 유지됩니다. 원심분리 튜브를 기울여 모든 액체를 따라냅니다. 튜브를 멸균된 표면 위에 거꾸로 세워 둡니다. 예: 배양 플레이트에 옮겨 건조시키되, 펠릿이 완전히 마르지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>펠렛에 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS) 1ml를 조심스럽게 가한 후, 원심분리 튜브를 기울여 HBSS를 배출하십시오. 다시 튜브를 멸균된 표면 위에 거꾸로 세워 건조시킵니다. 이때 펠렛이 완전히 마르지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>펠렛을 1 ml HBSS에 넣고 피펫팅을 40회 반복하여 재현탁합니다. 이때 공기 방울이 형성되면 바이러스가 파괴될 수 있으므로 주의하십시오.</li>
	<li>바이러스를 소분하여 액체 질소에 급속 냉동시킨 후 -80°C에서 보관하십시오. °추후 사용 시까지 C에 보관하십시오. 반복적인 동결-해동은 감염 역가를 감소시키므로, 각 실험마다 새로운 바이러스 분주액을 사용하십시오. 해동 시에는 항상 바이러스를 다음 온도에서 해동하십시오. 37 °C HRSV는 -20°C에서 보다 불안정하기 때문에 15 °C.</li>
</ol>
3. HRSV의 정량 분석
참고: 데이터의 재현성을 보장하기 위해, 정량 분석을 최소 3회 반복하여 이중 측정(duplicate)으로 수행하십시오.
3.1. A549 세포 감염
<ol>
	<li>A549 세포를 24-well 플레이트에서 완전히 밀집될 때까지 배양합니다.</li>
	<li>실온에서 1 ml의 PBS로 A549 세포를 두 번 세척합니다.</li>
	<li>Reduced Serum Medium을 사용하여 HRSV의 5배 연속 희석액을 준비합니다. 희석된 바이러스 100 μl를 각 웰에 첨가합니다. 최소 4단계의 희석 농도를 설정하십시오 (예: 4배, 20배, 100배 및 500배 희석). 가장 높은 용량의 바이러스를 감염시킨 추가 웰 2개(아이소타입 대조군으로 사용)와 모의 감염(mock-infected) 웰 2개를 포함합니다.</li>
	<li>5% CO2, 37 °C 조건에서 세포를 2시간 동안 배양합니다. 건조를 방지하기 위해 15분마다 24-well 플레이트를 흔들어 줍니다.</li>
	<li>바이러스 현탁액을 제거하고 실온에서 1 ml의 PBS로 세포를 1회 세척합니다.</li>
	<li>Reduced Serum Medium으로 4% (w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 준비합니다. 0.2 μm 필터로 여과 멸균한 후, 각 웰에 500 μl를 첨가합니다.</li>
	<li>5% CO2, 37 °C에서 22시간 동안 배양합니다.</li>
</ol>
3.2. FACS 준비
<ol>
	<li>배지를 제거하고 상온의 PBS 1 ml로 세포를 1회 세척한다.</li>
	<li>각 웰에 미리 데운 trypsin (37 °C) 200 μl를 첨가하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 10분 동안 배양한다.</li>
	<li>현미경으로 세포의 탈착 여부를 확인한다. 세포가 탈착되었다면, trypsin을 중화시키기 위해 DMEM + 10% FCS + 1% P/S 800 μl를 첨가한다. 세포를 재부유시킨다.</li>
	<li>세포를 원추형의 비조직 배양 처리된 96-웰 플레이트로 옮긴다. 상온에서 400 x g로 5분 동안 원심분리한다. 펠릿을 차가운 PBS 200 μl에 재부유시킨다.</li>
	<li>4 °C에서 400 x g로 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 따라내고 차가운 PBS 200 μl에 재부유시킨다.</li>
	<li>4 °C에서 400 x g로 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 따라내고 80% 얼음냉각 아세톤 150 μl에 재부유시킨다.</li>
	<li>상온에서 15분 동안 세포를 고정한다.</li>
	<li>4 °C에서 400 x g로 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 따라내고 차가운 PBS + 0.1 % BSA 200 μl에 재부유시킨다.</li>
	<li>4 °C에서 400 x g로 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 따라내고 anti-NP-RSV-FITC (PBS + 1% BSA에 1:50으로 희석) 50 μl 또는 IgG2 anti mouse-FITC (이소타입 대조군이므로 동일한 항체 농도를 사용한다) 50 μl에 재부유시킨다.</li>
	<li>이후 과정 동안 튜브를 암소에 보관한다. 4 °C에서 최소 1시간 동안 배양하며, 필요시 하룻밤 동안 연장할 수 있다.</li>
	<li>차가운 PBS + 0.1% BSA 150 μl를 첨가한다.</li>
	<li>4 °C에서 400 x g로 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 따라내고 차가운 PBS + 0.1% BSA 200 μl에 재부유시킨다.</li>
	<li>4 °C에서 400 x g로 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 따라내고 차가운 PBS + 0.1% BSA 200 μl에 재부유시킨다. FACS 측정 전까지 플레이트를 얼음 위에 암소 보관한다.</li>
	<li>유세포 분석기로 감염된 세포를 측정한다.</li>
</ol>
3.3. FITC-50 계산
<ol>
	<li>유세포 분석 프로그램을 사용하여 음성 대조군(동형 대조군)을 기준으로 컷오프를 설정하십시오. Pseudocolor 그래프 유형을 사용하십시오. 양성 세포가 Q3 영역에 위치하도록 쿼드런트 게이트를 그리십시오. 두 동형 대조군 모두에서 위양성 비율이 0.2% 미만이어야 합니다.</li>
	<li>데이터를 스프레드시트 프로그램으로 내보내고, 각 희석 배수별 FITC+ 세포의 백분율을 나타내는 표를 작성하십시오. 각 실험의 각 값에서 (동형 대조군으로 결정된) 위양성의 평균값을 빼십시오.</li>
	<li>통계 프로그램에서 새 파일(XY 산점도, 단일 X 및 다중 Y 열)을 여십시오. 데이터를 이 프로그램으로 복사하십시오: X = 희석 배수, Y = 감염된 세포 %, n = 3이며, 각 희석 배수당 두 번 측정값의 평균을 사용하십시오. 비선형 회귀 분석인 단상 지수 감쇠(one-phase exponential decay) 통계 분석을 수행하십시오. 곡선이 데이터 포인트에 적합한지 확인하고, 그렇지 않은 경우 다른 통계 분석법을 선택하십시오.</li>
	<li>곡선 방정식과 방정식 값을 스프레드시트 프로그램으로 복사하십시오. Y = 50%일 때의 X 값을 계산하십시오. 이에 따라, 다음 방정식을 사용하여 감염률이 50%가 되는 희석 배수에서의 FITC 검출 감염성 입자/ml (FIP/ml)를 계산하여 FITC-50 값을 결정하십시오. 
	<img alt="FITC50 계산 공식; 형광 강도 측정 방정식을 설명하는 도표." fo:src="/files/ftp_upload/50766/50766eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50766/50766eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="방정식 1"> 
	A = 웰당 A549 세포의 평균 수 
	B = 감염에 사용된 웰당 바이러스 μl 
	C = 감염률이 50%가 되는 희석 배수</li>
</ol>
4. 건강한 자원자의 혈액으로부터 말초혈액 단핵구(PBMC) 분리
<ol>
	<li>고지된 동의를 얻은 건강한 자원봉사자로부터 10 ml EDTA 튜브에 정맥혈을 채취합니다. 혈액 10 ml당 약 107개의 PBMC가 얻어집니다.</li>
	<li>지금부터는 클린벤치 내에서 멸균 상태로 작업하십시오.</li>
	<li>50 ml 튜브에서 상온의 PBS를 사용하여 혈액을 2배로 희석합니다. 50 ml 튜브당 최대 35 ml의 희석된 혈액을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>멸균된 50 ml 주사기에 멸균된 Luer lock 바늘을 장착합니다. 주사기로 밀도 구배 매질을 흡입합니다. 희석된 혈액이 들어있는 튜브 바닥에 바늘을 놓고, 희석된 혈액 아래로 밀도 구배 매질 15 ml를 조심스럽게 분주합니다. 밀도 구배 매질과 혈액 사이에 명확한 경계층이 유지되도록 합니다.</li>
	<li>상온에서 800 x g로 20분 동안 원심분리하며, 가속도는 9(최대)로 설정하고 브레이크는 끕니다. 사용 후 원심분리기의 온도를 4 °C로 설정하십시오.</li>
	<li>밀도 구배 원심분리를 하면 여러 층이 형성됩니다. 바닥에는 적혈구가 포함된 펠렛이 형성되며, 그 위로 호중구가 포함된 은색 층이 나타납니다. 이 펠렛 위의 투명한 층은 밀도 구배 매질입니다. 밀도 구배 매질과 상단의 혈장 층 사이의 얇은 층에 PBMC가 포함되어 있습니다.</li>
	<li>파스퇴르 피펫을 사용하여 PBMC를 조심스럽게 수집하고 새로운 50 ml 튜브로 세포를 옮깁니다. 지금부터 PBMC는 얼음 위에 보관하고 ice-cold PBS를 사용하십시오. 부피가 50 ml가 되도록 ice-cold PBS를 추가하고 4 °C에서 400 x g로 10분 동안 원심분리합니다(브레이크는 9로 설정).</li>
	<li>흡입법으로 상층액을 제거하고, 펠렛을 50 ml의 ice-cold PBS에 재현탁한 후 4 °C에서 400 x g로 10분 동안 원심분리하며, 이 과정을 2회 반복합니다.</li>
	<li>상층액을 제거한 후, ice-cold 배지(RPMI + 1% P/S) 1 ml를 추가하고 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.</li>
	<li>세포 농도를 5 x 106 PBMCs/ml로 조정합니다.</li>
</ol>
5. 활성 HRSV를 이용한 PBMC 자극
<ol>
	<li>실험 설정을 준비하며, 각 조건마다 실험 반복구를 포함하십시오.</li>
	<li>필요한 모든 자극제를 배지(RPMI + 1% P/S)로 희석하십시오. 웰당 최종 부피가 200 μl가 된다는 점에 유의하십시오. 50 μl의 자극제를 첨가하므로 4배 농축된 자극제 스톡을 준비하십시오.</li>
	<li>라운드 바텀 96-well plate의 각 웰에 앞서 언급한 세포 현탁액 100 μl를 첨가하십시오(5 x 105 PBMC/well).</li>
	<li>희석된 자극제 50 μl를 각 웰에 첨가하십시오. 두 가지 서로 다른 자극제를 첨가하여 총 부피를 200 μl로 맞출 수 있습니다. 하나의 자극제만 필요한 경우, 배지를 사용하여 부피를 200 μl로 조정하십시오.</li>
	<li>96-well plate를 5% CO2 인큐베이터, 37 °C에서 필요한 배양 시간 동안 배양하십시오. 대부분의 사이토카인의 경우 24시간 배양으로 충분합니다.</li>
</ol>
6. 자극 결과 측정
<ol>
	<li>배양 기간이 지난 후, 96-well 플레이트를 실온에서 450 x g로 5분 동안 원심분리하여 세포를 바닥에 모읍니다.</li>
	<li>상층액을 수집하고(최대 180 μl 취함), 이후의 사이토카인 분석을 위해 -20 °C에 보관하거나 바이러스 생산을 위해 -80 °C에 보관합니다.</li>
	<li>펠렛에 존재하는 자극된 PBMC는 라이시스 버퍼를 첨가하여 qPCR/Western blot으로 분석하거나, 또는 유세포 분석을 위해 염색할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

우리는 공개할 것이 없습니다.

이 연구에서 우리는 HRSV에 의한 PBMC 감염이 염증 경로를 연구할 수 있는 빠르고 신뢰할 수 있는 모델 시스템임을 보여줍니다. PBMC를 자극하려면 HRSV 스톡을 준비하고 정량화해야 합니다.
여러 세포주가 HRSV 감염에 취약합니다. HRSV 배양에 가장 많이 사용되는 세포주는 HEp-2, HeLa 및 Vero 세포입니다. 그러나 Vero 세포에서 HRSV를 배양하면 HRSV10의 G-단백질이 잘리는 것으로 나타났기 때문에 HRSV 배양에 Vero 세포의 사용을 권장하지 않습니다. 또한, 결함이 있는 간섭 입자를 생성할 위험이 있으므로 배양을 위해 세포를 감염시키기 위해 항상 적은 양의 바이러스를 사용하십시오11. 결함 간섭 입자(DIP)는 게놈의 일부 또는 전부를 놓친 바이러스 입자입니다. 따라서 DIP는 스스로 감염을 지속할 수 없으며 감염성 바이러스에 의존할 수 있습니다. 게놈이 작기 때문에 완전한 기능을 갖춘 바이러스보다 더 ...

인간 호흡기 세포융합 바이러스(HRSV)는 어린이의 하기도 감염의 가장 흔한 원인입니다. 매년 5세 미만 아동 3,300만 명 이상이 HRSV에 감염되어 300만 명 이상이 입원하고 약 20만 명이 사망합니다1. HRSV가 기저 만성 질환을 앓고 있는 노인과 성인에게도 상당한 위협이 된다는 증거가 점점 늘어나고 있다2.
소아에서 발생하는 대부분의 HRSV 감염은 일반 감기에 필적하는 경미한 증상을 보이며 임상적 개입이 필요하지 않습니다. 그러나 소수의 환자는 심각한 세기관지염으로 인해 입원과 기계 환기가 필요합니다.
HRSV 질병의 발병 기전 중 일부는 감염에 대한 숙주의 과잉적이고 부적절한 면역 반응입니다3,4. 이것은 몇 가지 관찰에 의해 설명됩니다. 최대 질환 기간은 바이러스 감염이 최고조에 달하기 전에 발생하는 경우가 많으며, 감염된 조직의 세포 침투 및 염증성 사이토카인(cytokine)의 방출과 더 잘 일치한다3. 또 다른 증거는 1960년대의 포르말린 불활성화 HRSV(FI-RSV) 임상시험에서 비롯되었습니다. 백신은 어린 영아에게 보호를 유도하는 대신 면역 반응을 과장하여 호흡기 질환을 강화하고 이환율과 사망률을 높였습니다.
HRSV 감염의 발병 기전을 연구하기 위해 여러 모델이 개발되었습니다. HEp-2 및 A549와 같은 연속 세포주는 in vitro HRSV 감염을 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 상피 세포는 HRSV 감염5의 주요 표적이므로 이러한 세포 유형에 많은 초점이 맞춰져 있습니다. 그러나 in vivo 상황은 훨씬 더 복잡하며 한 가지 세포 유형에 국한되지 않습니다. 이러한 복잡한 상호 작용을 조사하기 위해 HRSV 발병 기전을 연구하기 위해 여러 동물 감염 모델이 개발되었습니다. 지금까지 두 가지 전략이 사용되었는데, 이종(비인간) 모델과 동족 숙주-뉴모바이러스 모델에 초점을 맞추고 있습니다. HRSV에 대한 이종 모델의 예로는 침팬지, 양, 목화쥐 및 생쥐가 있습니다. 자연 숙주에서의 RSV 감염은 소 RSV와 뉴모바이러스를 각각 사용하여 소와 생쥐에서 연구되었습니다.
이러한 각 모델은 질병 발병에 대한 중요한 통찰력을 제공했지만, HRSV는 인간에게 매우 적합합니다. 따라서 현재 사용되는 세포주 및 동물 모델에 추가하여 HRSV를 통한 자극 모델로 인간 1차 PBMC를 사용할 것을 제안합니다. 인간 PBMC는 어린이6, 면역저하자, 건강한 성인7 또는 노인8을 포함한 특정 연구 질문을 해결하기 위해 다양한 개인으로부터 얻을 수있습니다. PBMC는 바이러스에 대한 적응 반응뿐만 아니라 감염의 선천적 측면을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. HRSV 질환의 발병에 중요한 활성화된 염증 경로는 mRNA 및 단백질 수준에서 연구할 수 있습니다. 또한, 면역 세포의 (부분 집합) 바이러스 감염은 유세포 분석에 의해 결정될 수 있습니다. 우리는 이전에 이 모델을 사용하여 전염증성 사이토카인 유도에 대한 박테리아 리간드 무라밀 디펩티드(MDP)와 함께 HRSV 감염의 시너지 효과를 확인했습니다7. 우리는 HRSV 질환의 발병기전과 관련된 염증 경로를 연구하기 위해 인간 1차 PBMC의 HRSV 자극을 강력하고 쉽고 빠른 체외 모델로 사용할 것을 제안합니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">시약</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>PBS without Ca2+ Mg2+ 또는 페놀 레드</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025-100</td><td>HBSS, 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>없음 Invitrogen</td><td>31966-047</td><td>DMEM, 고포도당, 글루타MAX, 피루베이트</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>72400054</td><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX, HEPES</td></tr><tr><td>Reduced Serum Medium (Opti-MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>51985-026</td><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Greiner Bio-one</td><td></td><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>소 혈청</td></tr><tr><td>P/S</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>페니실린-스트렙토마이신, 액체</td></tr><tr><td>트립신</td><td>인비트로겐</td><td>25300-054</td><td>0.05% 트립신-EDTA (1x), 페놀 레드</td></tr><tr><td>HeLa 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>A549 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>시그마 알드리치</td><td>S7903</td><td>자당 BioXtra, &ge; 99.5%</td></tr><tr><td>IgG2 안티-마우스-FITC</td><td>BD 파밍겐</td><td>555057</td><td>Ms IgG2b K FITC 이소타입 제어</td></tr><tr><td>안티-NP-RSV-FITC</td><td>Abcam</td><td>ab25849</td><td>안티-호흡기 세포융합 바이러스 항체 [671] (FITC)</td></tr><tr><td>밀도 구배 매체(림프렙)</td><td>축 쉴드</td><td>1114545</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Merck Millipore</td><td>1000141000</td><td>분석</td></tr><tr>용 아세톤<td colspan="4">Material </td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>326823 Thinwall, Polyallomer, 38.5 ml, 25 mm x 89 mm</td></tr><tr><td>SureSpin 630 Rotor with 36 ml bucket</td><td>Sorvall</td><td>79368</td><td>스윙 버킷 티타늄 로터</td></tr><tr><td>Sorvall WX80 Ultracentrifuge</td><td>Sorvall</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>CB 150l CO2 인큐베이터</td><td>바인더</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인간 호흡기 세포융합 바이러스 감염에 대한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 면역 반응을 연구하기 위한 체외 모델

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

인간 호흡기 세포융합 바이러스(HRSV) 감염은 경미한 감염에서 생명을 위협하는 세기관지염에 이르기까지 광범위한 질병 중증도를 나타냅니다. 중증 질환의 발병 기전에서 중요한 부분은 면역 병리학을 유발하는 향상된 면역 반응입니다.	여기에서는 HRSV 감염에 대한 인간 면역 세포의 면역 반응을 조사하는 데 사용되는 프로토콜에 대해 설명합니다. 먼저 HRSV의 배양, 정제 및 정량화에 사용되는 방법을 설명합니다. 그 후, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)가 살아있는 HRSV로 자극되는 인간 체외 모델에 대해 설명합니다. 이 모델 시스템은 선천성 및 적응 면역 반응을 포함하여 질병 중증도에 기여할 수 있는 여러 매개변수를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 반응은 전사 및 번역 수준에서 측정할 수 있습니다. 또한 세포의 바이러스 감염은 유세포 분석을 사용하여 쉽게 측정할 수 있습니다. 종합하면, 살아있는 HRSV를 통한 PBMC의 자극은 HRSV 유발 질환과 관련된 메커니즘을 조사하기 위한 빠르고 재현 가능한 모델 시스템을 제공합니다.

여기에 기술된 HRSV A2 배양 및 정제 방법은 ml당 2 x 107에서 2 x 108의 FITC-50 정량 감염성 바이러스 입자 수율을 제공합니다. FITC로 염색된 감염 세포를 계수하여 얻은 현미경 분석 결과(결과 미제시)를 FACS 정량 결과(그림 1)와 비교하였습니다. 두 방법 모두 유사한 역가가 도출되었으나, FACS 방법이 서로 다른 실험 간의 표준 편차가 훨씬 낮았고 노동력이 덜 소모되었습니다.
PBMC 자극 실험을 수행할 때는 자극-분할법(stimuli-fraction method)을 사용하는 것을 권장합니다. 이 방법에서는 조건을 자극 조건과 분할 조건으로 나눕니다(그림 2). 자극 조건은 표준 조건(예: RPMI 및 HRSV)입니다. 분할 조건은 테스트 조건(예: RPMI, MDP 및 LPS)입니다. 각 실험에는 항상 음성 대조군...

인간 호흡기 세포융합 바이러스(HRSV)는 어린 유아에게 심각한 세기관지염을 유발할 수 있습니다. 중증 HRSV 질환의 발병 기전 중 일부는 숙주 면역 반응에 의해 발생합니다. HRSV를 이용한 일차 인간 면역 세포의 자극은 염증 경로 및 감염의 활성화를 연구하기 위한 빠르고 재현 가능한 모델 시스템을 제공합니다.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

본 절차의 전반적인 목표는 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV) 감염에 대한 인간 면역 세포의 반응을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 HeLa 세포에서 감염성 RSV 스톡을 배양합니다. 두 번째 단계에서는 초원심분리를 통해 배양된 RSV 스톡을 정제합니다.다음으로 밀도 구배 원심분리를 통해 일차 인간 혈액 면역 세포를 분리합니다. 마지막 단계에서 분리된 면역 세포를 바이러스로 자극합니다. 최종적으로 RSV 감염에 대한 세포성 면역 반응은 ELISA, qPCR 또는 유세포 분석법으로 평가할 수 있습니다.이 기술은 호흡기 세포 융합성 바이러스(RSV) 감염 연구에 귀중한 보완 방법입니다. RSV는 인간에게 매우 잘 적응하는 특성이 있습니다. 따라서 바이러스의 병인에 관여하는 염증 경로를 연구하기 위해서는 인간 면역 세포를 사용하는 것이 중요합니다.본 영상에서는 RSV 바이러스를 사용하였으나, 이 방법은 인플루엔자 바이러스나 라이노바이러스와 같은 다른 바이러스 연구에도 쉽게 적용될 수 있습니다. 먼저 human RSV seed stock이 든 바이알을 37°C 항온수조에서 가온합니다. 바이러스가 해동되면, 플라스크당 4 mL씩 감염 배지를 분주하여 stock을 희석합니다.MOI를 0.1 이하로 유지하면서, 세포가 마르지 않을 정도의 최소 총 부피로 바이러스를 heli 세포에 첨가합니다. 그런 다음 37°C, 5% CO2 조건에서 2~4시간 동안 배양하며, 배지가 고르게 분포되도록 15분마다 플라스크를 흔들어 줍니다. 다음으로, 접종액을 제거하고 PBS로 세포를 1회 세척합니다.그런 다음 플라스크에 배양액 15 milliliters를 첨가하고 동일한 배양 조건에서 3~5일 동안 배양합니다. 일반 명시야 현미경을 통해 매일 한 번씩 바이러스에 의한 세포병성 변화가 있는지 관찰하십시오. 이러한 변화가 관찰되면 세포를 긁어내어 RSV를 수확한 후, 멸균된 50 milliliter 튜브에 현탁액을 수집하고, 세포를 vortexing한 다음, 실온에서 1800 Gs로 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 침전시킵니다.RSV는 이 속도에서 침전되지 않으므로, 상층액을 1 mL씩 분주하여 -80 °C에서 시딩 스톡(seeding stock)으로 보관할 수 있습니다. 향후 사용을 위한 분주액은 감염성 바이러스 입자의 손실을 방지하기 위해 항상 액체 질소로 급속 냉동하십시오. RSV를 정제하려면 먼저 초원심분리기의 각 버킷에 멸균 원심분리 튜브를 배치하는 것으로 시작합니다.그런 다음, 갓 준비하여 필터 멸균한 sucrose 용액 5 mL를 각 튜브 바닥에 추가합니다. 다음으로, sucrose 용액이 흐트러지지 않도록 주의하며 층이 뚜렷하게 유지되도록 RSV 용액 30 mL를 sucrose 용액 위에 매우 천천히 추가합니다. 그 후 멸균 상태를 유지하기 위해 클린벤치 내에서 캡을 포함한 6개의 초원심분리 버킷의 무게를 멸균 PBS를 사용하여 서로 0.1 g 이내의 오차로 정밀하게 맞춥니다. 20,000 RCF, 4 °C 조건에서 1.5시간 동안 바이러스를 원심분리합니다.원심분리가 완료되면, 멸균 집게를 사용하여 원심분리 튜브를 버킷에서 조심스럽게 꺼냅니다. 바이러스 입자는 수크로스 층을 통과하여 펠릿을 형성하게 됩니다. 원심분리 튜브를 바이러스 폐기 플라스크에 기울여 붓고, 멸균된 표면 위에서 튜브를 거꾸로 세워 내용물이 완전히 빠지도록 둡니다.펠릿이 완전히 마르지 않도록 하십시오. 다음으로 1 mL의 HPSS를 펠릿 위로 조심스럽게 흘려보낸 후, 원심분리 튜브를 다시 기울여 HPSS를 배출합니다. 그런 다음 펠릿이 마르지 않도록 주의하면서 튜브를 다시 거꾸로 뒤집으십시오.이제 바이러스가 파괴될 수 있으므로 기포가 생기지 않도록 주의하며, 다른 1 mL의 HBSS에서 펠릿을 40회 트라이튜레이션합니다. 그런 다음 바이러스 분주액을 액체 질소에 급속 냉동시킵니다. 정량 및 향후 사용 전까지 바이러스를 -80 °C에서 보관합니다. 건강한 자원봉사자로부터 10 mL EDTA 튜브에 혈액을 채취한 후, 실온의 PBS로 혈액을 최대 2배까지 희석하여 50 mL 튜브에 희석된 혈액을 최대 35 mL까지 준비합니다.다음으로, 멸균된 루어 락 니들을 멸균된 50 milliliter 시린지에 장착한 후, 밀도 구배 배지를 시린지로 흡입합니다. 희석된 혈액이 담긴 튜브 바닥에 니들을 대고, 밀도 구배 배지와 혈액 사이에 명확한 경계가 유지되도록 주의하며 15 milliliters의 밀도 구배 배지를 혈액 아래로 피펫팅합니다. 이제 실온에서 800 GS의 최대 가속도 및 브레이크 오프 설정으로 20분 동안 세포를 분리합니다. 분리가 완료되면, 튜브 바닥의 펠릿에서 적혈구가 발견되며 그 위에 은색의 호중구 층이 형성됩니다.펠릿 위의 투명한 층은 밀도 구배 배지를 포함하며, 밀도 구배 배지와 상단의 혈장 층 사이의 얇은 층에 PBMC가 포함되어 있습니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBMC를 조심스럽게 수집한 다음, 세포를 얼음 위에 놓인 새로운 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 얼음처럼 차가운 PBS를 넣어 총 부피를 50 milliliters로 맞추고, 원심분리가 완료되면 세포를 펠릿화합니다.상층액을 흡입하여 제거하고, 얼음처럼 차가운 PBS 50 milliliters로 펠릿을 2회 세척합니다. 두 번째 세척 후 펠릿에 얼음처럼 차가운 배지 1 milliliter를 첨가하고, 세포 수를 측정하여 세포 농도를 milliliter당 5 × 10⁶ pbmc로 조정합니다. 살아있는 RSV로 pbmc를 자극하려면, 먼저 96-well round bottom plate의 각 웰에 pbmc 100 microliters를 분주합니다. 그 다음, 각 웰에 갓 희석한 자극제 50 microliters를 각각 첨가합니다.플레이트를 37°C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양한 후, 플레이트를 원심분리하고 상층액을 수집하여 추후 ELISA 분석에 사용합니다. 펠릿에 있는 자극된 PBMC는 qPCR로 분석하거나 유세포 분석을 위해 염색할 수 있습니다. PBMC 자극 실험을 수행할 때, 본 방법과 함께 자극제 분획법을 사용할 것을 권장합니다.조건은 RPMI 또는 인간 RSV와 같은 표준 자극 조건과 mial, dipeptide 또는 LPS와 같은 테스트 분획 조건으로 나뉩니다. 중요한 점은, 각 실험에 RPMI 단독 처리와 같은 음성 대조군과 LPS와 같은 양성 대조군이 항상 포함된다는 것입니다. RSV로 24시간 동안 자극한 후, 서로 다른 PBMC 집단은 용량 의존적인 감염률과 RSV 감염 효율의 차이를 보입니다. 바이러스로 24시간 동안 자극한 후 PBMC에서 TNF alpha 또는 interferon gamma의 발현에 대해 qPCR R 분석을 수행한 결과, RSV가 이 두 염증성 사이토카인의 전사를 강력하게 상향 조절한다는 것이 입증되었습니다. 반대로, miam dipeptide 또는 LPS 자극은 약한 mRNA 발현만을 유도했습니다.P BMC를 RSV와 MIAL 디펩타이드로 동시에 자극했을 때, 강력한 시너지 상향 조절이 관찰되었습니다. 자극된 pbmc에서 ELISA를 통해 TNF Alpha 또는 Interferon gamma의 생성을 분석하였습니다. 전사 수준에서의 관찰 결과와는 대조적으로, RSV는 p BMC의 TNF alpha 및 interferon gamma 단백질 분비를 유도하는 능력이 낮았으며, miam 디펩타이드 자극 시에는 적은 양의 TNF alpha가 생성되었고 interferon gamma는 생성되지 않았습니다.전사 분석과 유사하게, 사이토카인 유도가 RSV 복제에 의존적인지 확인하기 위한 대조군으로서 RSV와 MIAM 디펩타이드를 함께 자극했을 때 TNF alpha와 interferon gamma 모두 시너지 효과를 통한 상향 조절을 보였습니다. 그래프에 나타난 바와 같이, P BMCs를 생존 RSV 또는 beta propal, lactone으로 불활성화시킨 RSV로 자극한 결과, 생존 RSV와 불활성화 RSV 모두 전염증성 사이토카인 생성을 유도했습니다. RSV 관련 실험은 반드시 생물안전 2등급(BSL-2) 실험실의 생물안전 작업대 내에서 수행해야 함을 유의하십시오.또한, 이 방법을 시도할 때는 전체 과정 전반에 걸쳐 엔도톡신 제거(endotoxin free) 시약과 재료를 사용하는 것이 매우 중요하다는 점을 기억하십시오. 이 영상을 시청한 후에는 RSV로 인간 PBMC를 자극하는 방법과 면역 반응 분석에 사용할 수 있는 여러 분석법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

인간 호흡기 세포 융합 바이러스 감염에 대한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 면역 반응을 연구하기 위한 in vitro 모델

이 방법은 EpiAirways, 공기 - 액체 인터페이스에서 성장 기본 인간의 호흡기 상피 조직, 생물학 관련 공동 문화 확장 박테리아의 특성을...

장기 호스트 병원체 상호 작용을 특성화에 대한 EpiAirway 모델의 사용

이 비디오는 유형이 불가능한 헤모필루스 인플루엔자(NTHi)를 통해 림프구를 자극하고 면역 반응을 평가하는 체외 기술을 보여줍니다. NTHi와 함께 분리된 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 배양하면 박테리아 세포가 T 림프구를 자극하여 사이토카인 생성을 유도합니다. 사이토카인의 분비를 억제하면 면역형광 염색을 수행하여 자극된 T 림프구에 축적된 세포 내 사이토카인을 검출합니다.

병원성 박테리아를 통해 림프구를 자극하는 체외 기술

이 비디오는 인간 면역결핍 바이러스 1형, HIV-1에 의한 인간 자궁 점막 조직의 생체 외 감염 및 공기-액체 계면에서 젤라틴 스펀지 위에 대한 유지 관리를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 인간 조직 내에서 HIV-1 복제 및 발병 기전을 모니터링할 수 있습니다.

생체 외 조건에서 HIV 발병기전을 연구하기 위한 인간 자궁경부 점막 감염 모델

이 비디오는 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 대한 중화 항체를 측정하기 위한 분석을 보여줍니다. RSV 중화 항체가 포함된 혈청을 사용한 사전 배양은 바이러스 입자를 중화하여 세포 감염 및 플라크 형성을 줄입니다. 그런 다음 바이러스에 감염된 세포는 플라크 시각화를 위해 고정, 차단 및 형광단 접합 항체 표지를 받습니다. 이 과정을 통해 RSV의 50%를 중화하는 가장 높은 혈청 희석액을 식별할 수 있으며, 이는 중화 역가를 나타냅니다.

호흡기 세포융합 바이러스에 특이적인 중화항체 역가를 측정하기 위한 분석

이 비디오는 쥐의 폐에 서식하는 면역 세포를 식별하는 체외 기술을 보여줍니다. 쥐의 폐 조직에서 표적 면역 세포를 분리한 후, 선천성 및 적응 면역 세포의 특정 마커에 대해 형광단 표지 항체 칵테일을 사용하여 표면 표지됩니다. 또한 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포는 세포 내 마커를 사용하여 표지됩니다. 그런 다음 유세포 분석을 사용하여 다양한 면역 세포 유형을 식별합니다.

쥐의 폐에 서식하는 선천적 및 적응적 면역 세포를 식별하는 In vitro 방법

백신이 어떻게 작용하는지에 대한 전반적인 지식이 부족합니다. 여기에서는 수지상 세포와 T 세포 면역에 특히 중점을 두고 백신에 대한 초기 숙주 면역 반응에 대한 통찰력을 얻기 위해 역유전학과 골수 키메라 마우스를 함께 사용할 것을 제안합니다.

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

인간 동시 감염은 체외에서 복제하기 어렵습니다. 그러나 인간 말라리아 기생충은 HIV에 자연적으로 감염된 갓 분리된 인간 말초 혈액 단핵 세포와 마찬가지로 체외에서 쉽게 배양할 수 있습니다. 이는 HIV 동시 감염의 맥락에서 말라리아 기생충에 대한 조기 면역 반응을 연구하기 위한 훌륭한 모델을 제공합니다.

<em&gt; 체외</em&gt; HIV 공동 감염의 맥락에서 말라리아에 면역 반응을 측정하기위한 모델

높은 처리량,이 연구에 설명 합니다 호흡 syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 특정 중화 항 체 titer를 확인 하려면 이미징 기반 마이크로 중화 분석 결과. 이 분석 결과 형식은 다른 샘플 형식에 대해 테스트 되었습니다.

향상 된 높은 처리량 호흡 Syncytial 바이러스 (RSV) 마이크로 중화 분석 결과

우리를 생성 하는 방법을 설명 하 고 RSVs에 대 한 호흡 syncytial 바이러스 (RSVs)와 최적화 된 패 분석 결과 수정 유전자 증폭. 우리는 두 재조합 바이러스는 각각 RSV 복제의 정량화를 허용 하 고 라이브 RSV 포함 몸과 포함 시체 관련 된과 립 역동성의 분석을 생성 하 여이 프로토콜을 설명 합니다.

생성, 증폭 및 재조합 호흡 Syncytial 바이러스의 적정

이 프로토콜은 바이러스적으로 감염된 비강 상피 세포와 선천적 세포 활성화 사이의 초기 상호 작용에 대한 조사를 자세히 설명합니다. 면역 세포의 개별 서브세트는 바이러스 감염에 대한 반응에서의 그들의 활성화에 기초하여 구별될 수 있다. 그런 다음 초기 항 바이러스 반응에 미치는 영향을 결정하기 위해 더 조사 할 수 있습니다.

호흡기 바이러스 감염 동안 선천적 면역 세포 활성화의 연구를 위한 비접촉식 공동 배양 모델

이 프로토콜은 IAV의 비강내 투여 및 마우스 폐 손상 및 폐 세포 유형에 대한 관련 전사 변화의 다운스트림 분석에 대한 지침을 제공합니다.

인플루엔자 감염 후 이형성 및 기능적 폐포 복구 모델링

배우세요 인간 말초 혈액 단핵 세포를 이용한 호흡기 세포융합 바이러스 면역 반응 분석 방법입니다. 초고속 원심분리와 세포 자극 기법으로 염증 사이토카인 발현을 평가하여 바이러스 병원성 연구에 활용합니다.

인간 호흡기 세포융합 바이러스 감염에 대한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 면역 반응을 연구하기 위한 체외 모델

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