인간 호흡기 세포융합 바이러스 감염에 대한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 면역 반응을 연구하기 위한 체외 모델

본 절차의 전반적인 목표는 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV) 감염에 대한 인간 면역 세포의 반응을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 HeLa 세포에서 감염성 RSV 스톡을 배양합니다. 두 번째 단계에서는 초원심분리를 통해 배양된 RSV 스톡을 정제합니다.

다음으로 밀도 구배 원심분리를 통해 일차 인간 혈액 면역 세포를 분리합니다. 마지막 단계에서 분리된 면역 세포를 바이러스로 자극합니다. 최종적으로 RSV 감염에 대한 세포성 면역 반응은 ELISA, qPCR 또는 유세포 분석법으로 평가할 수 있습니다.

이 기술은 호흡기 세포 융합성 바이러스(RSV) 감염 연구에 귀중한 보완 방법입니다. RSV는 인간에게 매우 잘 적응하는 특성이 있습니다. 따라서 바이러스의 병인에 관여하는 염증 경로를 연구하기 위해서는 인간 면역 세포를 사용하는 것이 중요합니다.

본 영상에서는 RSV 바이러스를 사용하였으나, 이 방법은 인플루엔자 바이러스나 라이노바이러스와 같은 다른 바이러스 연구에도 쉽게 적용될 수 있습니다. 먼저 human RSV seed stock이 든 바이알을 37°C 항온수조에서 가온합니다. 바이러스가 해동되면, 플라스크당 4 mL씩 감염 배지를 분주하여 stock을 희석합니다.

MOI를 0.1 이하로 유지하면서, 세포가 마르지 않을 정도의 최소 총 부피로 바이러스를 heli 세포에 첨가합니다. 그런 다음 37°C, 5% CO2 조건에서 2~4시간 동안 배양하며, 배지가 고르게 분포되도록 15분마다 플라스크를 흔들어 줍니다. 다음으로, 접종액을 제거하고 PBS로 세포를 1회 세척합니다.

그런 다음 플라스크에 배양액 15 milliliters를 첨가하고 동일한 배양 조건에서 3~5일 동안 배양합니다. 일반 명시야 현미경을 통해 매일 한 번씩 바이러스에 의한 세포병성 변화가 있는지 관찰하십시오. 이러한 변화가 관찰되면 세포를 긁어내어 RSV를 수확한 후, 멸균된 50 milliliter 튜브에 현탁액을 수집하고, 세포를 vortexing한 다음, 실온에서 1800 Gs로 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 침전시킵니다.

RSV는 이 속도에서 침전되지 않으므로, 상층액을 1 mL씩 분주하여 -80 °C에서 시딩 스톡(seeding stock)으로 보관할 수 있습니다. 향후 사용을 위한 분주액은 감염성 바이러스 입자의 손실을 방지하기 위해 항상 액체 질소로 급속 냉동하십시오. RSV를 정제하려면 먼저 초원심분리기의 각 버킷에 멸균 원심분리 튜브를 배치하는 것으로 시작합니다.

그런 다음, 갓 준비하여 필터 멸균한 sucrose 용액 5 mL를 각 튜브 바닥에 추가합니다. 다음으로, sucrose 용액이 흐트러지지 않도록 주의하며 층이 뚜렷하게 유지되도록 RSV 용액 30 mL를 sucrose 용액 위에 매우 천천히 추가합니다. 그 후 멸균 상태를 유지하기 위해 클린벤치 내에서 캡을 포함한 6개의 초원심분리 버킷의 무게를 멸균 PBS를 사용하여 서로 0.1 g 이내의 오차로 정밀하게 맞춥니다. 20,000 RCF, 4 °C 조건에서 1.5시간 동안 바이러스를 원심분리합니다.

원심분리가 완료되면, 멸균 집게를 사용하여 원심분리 튜브를 버킷에서 조심스럽게 꺼냅니다. 바이러스 입자는 수크로스 층을 통과하여 펠릿을 형성하게 됩니다. 원심분리 튜브를 바이러스 폐기 플라스크에 기울여 붓고, 멸균된 표면 위에서 튜브를 거꾸로 세워 내용물이 완전히 빠지도록 둡니다.

펠릿이 완전히 마르지 않도록 하십시오. 다음으로 1 mL의 HPSS를 펠릿 위로 조심스럽게 흘려보낸 후, 원심분리 튜브를 다시 기울여 HPSS를 배출합니다. 그런 다음 펠릿이 마르지 않도록 주의하면서 튜브를 다시 거꾸로 뒤집으십시오.

이제 바이러스가 파괴될 수 있으므로 기포가 생기지 않도록 주의하며, 다른 1 mL의 HBSS에서 펠릿을 40회 트라이튜레이션합니다. 그런 다음 바이러스 분주액을 액체 질소에 급속 냉동시킵니다. 정량 및 향후 사용 전까지 바이러스를 -80 °C에서 보관합니다. 건강한 자원봉사자로부터 10 mL EDTA 튜브에 혈액을 채취한 후, 실온의 PBS로 혈액을 최대 2배까지 희석하여 50 mL 튜브에 희석된 혈액을 최대 35 mL까지 준비합니다.

다음으로, 멸균된 루어 락 니들을 멸균된 50 milliliter 시린지에 장착한 후, 밀도 구배 배지를 시린지로 흡입합니다. 희석된 혈액이 담긴 튜브 바닥에 니들을 대고, 밀도 구배 배지와 혈액 사이에 명확한 경계가 유지되도록 주의하며 15 milliliters의 밀도 구배 배지를 혈액 아래로 피펫팅합니다. 이제 실온에서 800 GS의 최대 가속도 및 브레이크 오프 설정으로 20분 동안 세포를 분리합니다. 분리가 완료되면, 튜브 바닥의 펠릿에서 적혈구가 발견되며 그 위에 은색의 호중구 층이 형성됩니다.

펠릿 위의 투명한 층은 밀도 구배 배지를 포함하며, 밀도 구배 배지와 상단의 혈장 층 사이의 얇은 층에 PBMC가 포함되어 있습니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBMC를 조심스럽게 수집한 다음, 세포를 얼음 위에 놓인 새로운 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 얼음처럼 차가운 PBS를 넣어 총 부피를 50 milliliters로 맞추고, 원심분리가 완료되면 세포를 펠릿화합니다.

상층액을 흡입하여 제거하고, 얼음처럼 차가운 PBS 50 milliliters로 펠릿을 2회 세척합니다. 두 번째 세척 후 펠릿에 얼음처럼 차가운 배지 1 milliliter를 첨가하고, 세포 수를 측정하여 세포 농도를 milliliter당 5 × 10⁶ pbmc로 조정합니다. 살아있는 RSV로 pbmc를 자극하려면, 먼저 96-well round bottom plate의 각 웰에 pbmc 100 microliters를 분주합니다. 그 다음, 각 웰에 갓 희석한 자극제 50 microliters를 각각 첨가합니다.

플레이트를 37°C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양한 후, 플레이트를 원심분리하고 상층액을 수집하여 추후 ELISA 분석에 사용합니다. 펠릿에 있는 자극된 PBMC는 qPCR로 분석하거나 유세포 분석을 위해 염색할 수 있습니다. PBMC 자극 실험을 수행할 때, 본 방법과 함께 자극제 분획법을 사용할 것을 권장합니다.

조건은 RPMI 또는 인간 RSV와 같은 표준 자극 조건과 mial, dipeptide 또는 LPS와 같은 테스트 분획 조건으로 나뉩니다. 중요한 점은, 각 실험에 RPMI 단독 처리와 같은 음성 대조군과 LPS와 같은 양성 대조군이 항상 포함된다는 것입니다. RSV로 24시간 동안 자극한 후, 서로 다른 PBMC 집단은 용량 의존적인 감염률과 RSV 감염 효율의 차이를 보입니다. 바이러스로 24시간 동안 자극한 후 PBMC에서 TNF alpha 또는 interferon gamma의 발현에 대해 qPCR R 분석을 수행한 결과, RSV가 이 두 염증성 사이토카인의 전사를 강력하게 상향 조절한다는 것이 입증되었습니다. 반대로, miam dipeptide 또는 LPS 자극은 약한 mRNA 발현만을 유도했습니다.

P BMC를 RSV와 MIAL 디펩타이드로 동시에 자극했을 때, 강력한 시너지 상향 조절이 관찰되었습니다. 자극된 pbmc에서 ELISA를 통해 TNF Alpha 또는 Interferon gamma의 생성을 분석하였습니다. 전사 수준에서의 관찰 결과와는 대조적으로, RSV는 p BMC의 TNF alpha 및 interferon gamma 단백질 분비를 유도하는 능력이 낮았으며, miam 디펩타이드 자극 시에는 적은 양의 TNF alpha가 생성되었고 interferon gamma는 생성되지 않았습니다.

전사 분석과 유사하게, 사이토카인 유도가 RSV 복제에 의존적인지 확인하기 위한 대조군으로서 RSV와 MIAM 디펩타이드를 함께 자극했을 때 TNF alpha와 interferon gamma 모두 시너지 효과를 통한 상향 조절을 보였습니다. 그래프에 나타난 바와 같이, P BMCs를 생존 RSV 또는 beta propal, lactone으로 불활성화시킨 RSV로 자극한 결과, 생존 RSV와 불활성화 RSV 모두 전염증성 사이토카인 생성을 유도했습니다. RSV 관련 실험은 반드시 생물안전 2등급(BSL-2) 실험실의 생물안전 작업대 내에서 수행해야 함을 유의하십시오.

또한, 이 방법을 시도할 때는 전체 과정 전반에 걸쳐 엔도톡신 제거(endotoxin free) 시약과 재료를 사용하는 것이 매우 중요하다는 점을 기억하십시오. 이 영상을 시청한 후에는 RSV로 인간 PBMC를 자극하는 방법과 면역 반응 분석에 사용할 수 있는 여러 분석법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.