Name: MTT의 분석에 의해 합성 및 세포 독성 평가 : 항암 금속 합성물 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 학습하세요 항암 금속 합성물의 합성 및 MTT 분석을 통한 세포 독성 평가 방법을. 티타늄과 바나듐 기반 화합물을 합성하고 인간 암 세포주에서 IC50 값을 측정하여 항암 효능을 검증하는 실험 절차를 익히세요.

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<ol><li> V의 제조 (V) 복잡한 (그림 2), 18 행위는 글로브 박스에 1.1 ~ 1.4 단계, 글로브 박스를 사용할 수없는 경우, 대체로 이동 2 (2.1-2.6)를 반복합니다. <ol><li> 리간드의 0.42 밀리몰 건조 THF에있는 H 2 L 녹여 THF에서 VO의 동등한 양의 교반 용액 (O 나는 잠) 3에 추가합니다. </li><li> 실온에서 15 분간 반응 혼합물을 교반하고, 진공하에 휘발성 물질을 제거한다. </li><li> 차가운 헥산을 추가하고 진공 상태에서 제거합니다. 어두운 자주색 분말을 정량적 수율로 얻을 수 있어야합니다. </li><li> 에펜 도르프 유리 병에서 얻어진 화합물의 8 mg의 무게. 3 단계로 건너 뜁니다. </li></ol></li><li> 쉬 렌크 줄을 사용하여 V (V) 복합체를 준비합니다. <ol><li> 격막 모자와 건조 쉬 렝크 플라스크에 건조 THF의 리간드 H 2 L의 0.42 밀리몰을 녹이고, 쉬 렌크 라인에 부착 진공 / 불활성 가스 (N 2 또는 AR) 환경을 교대로 적용, 그것은 세 가지의를 적용하는 것이 좋습니다라운드를 UCH 진공 단계에 2-5 분을 기다립니다. </li><li> 격막 캡을 주사기를 통해 건조 THF를 추가합니다. </li><li> VO (O 나는 잠)의 상당 금액을 추가 라인에 적절한 건조 쉬 렝크 플라스크를 후킹 불활성 환경을 적용하고의에 바나듐 솔루션에서 주사기를 통해 시약을 추가하여 유사하게 제조 한 THF 용액, 3 리간드. </li><li> 실온에서 15 분간 반응 혼합물을 교반하고, 진공하에 휘발성 물질을 제거; 불안정한 제품의 우려가있는 경우, 불활성 분위기 하에서 휘발 쉴 렌크 분류 증류를 수행; 예비 건조했다 필요한 유리를 부착하기 위하여 불활성 가스의 흐름을 사용 . </li><li> 차가운 헥산을 추가하고 진공 상태에서 제거합니다. 어두운 자주색 분말을 정량적 수율로 얻을 수 있어야합니다. </li><li> 에펜 도르프 유리 병에서 얻어진 화합물의 8 mg의 무게. </li></ol></li><li> 티타늄의 제조 (IV) 복잡한 (그림 2), 28 </s업&gt; 행위는 글러브 박스에 3.1-3.3 단계를, 글러브 박스를 사용할 수없는 경우, 대신 쉬 렌크 라인을 사용 바나듐 아날로그 (2 단계)에 대한 논의 대체 단계를 조정합니다. <ol><li> 건조 THF의 리간드 H 2 L의 0.35 밀리몰을 녹여 용액에 티 (O 나 홍보) 4의 동등한 양의 교반 솔루션에 추가합니다. </li><li> 실온에서 2 시간 동안 반응 혼합물을 교반 하였다. 정량적 인 수율에 노란색 제품을 제공하기 위해 진공 상태에서 휘발성 물질을 제거합니다. </li><li> 에펜 도르프 유리 병에서 얻어진 화합물의 8 mg의 무게. </li></ol></li><li> HT-29 세포를 96 - 웰 플레이트의 제조 <ol><li> 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 항생제, 1 % L-글루타민, 37 ° C에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 5 % CO 2를 포함 RPMI-1640 배지와 75cm 2 플라스크에 문화 HT-29 세포 . </li><li> HT-29 세포 (배양하지 않고 모든 3~4일 90~100%) 최대 포화 상태에 도달했을 때 매체를 제거합니다. 1 ㎖로 세척의 트립신 (0.25 %) / EDTA (0.05 %) 용액을 제거합니다. </li><li> 트립신 1 ㎖ (0.25 %) / EDTA (0.05 %) 솔루션을 추가하고 5 분 동안 품어. </li><li> 플라스크에서 HT-29 세포를 분리하고 트립신의 활동을 해제하는 매체의 10 ML을 추가합니다. 튜브에 세포 혼합물의 5 ML을 전송합니다. </li><li> 카운터 챔버 내로 세포 혼합물을 몇 방울을 전송 피펫을 사용한다. 카운터 챔버는 5 × 5 정사각형을 포함한다. </li><li> 모서리에 4 개의 사각형과 중간에 하나를 현미경을 사용하여 5 대표 사각형의 세포를 계산합니다. </li><li> 현재 셀의 예상 금액을 계산합니다. 5 대표 사각형의 셀 합계를 20로 나눕니다. </li><li> 단계 4.7의 결과로 0.6을 나눈다. 수신 번호는 접시 당 필요한 세포 혼합물의 금액입니다. 이 계산은 0.6 × 10 6 세포 (물론 당 9,000 세포)를 포함하는 판을 말한다. </li><li> P 당 필요한 세포 혼합액의 양을 전송 피펫을 사용후반 (4.8 절에서 계산 된) 및 매체의 13.2 mL를 넣고 (물론 × 66 웰 당 200 μL). </li><li> 11 채널 피펫 (물론 당 200 μL, 6 라인, 총 66 웰)로 96 - 웰 플레이트에 혼합물을 추가합니다. 각 라인의 한 잘 빈 제어 비어있게해야합니다. </li><li> 세포가 플레이트에 부착 할 수 있도록 24 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 접시를 품어. </li></ol></li><li> 화합물의 삽입 <ol><li> 단계 1.4 (또는 2.6) 또는 3.3에 설명 된대로 각 화합물의 8 밀리그램 건조 THF의 (원하는 농도 범위에 따라 또는 다른 금액) 200 μl를 추가 무게. 도 리간드 H 2 L의 8 밀리그램 무게. </li><li> 9 다른 에펜 도르프 튜브에 THF 60 μl를 추가하여 더욱 각 화합물 용액을 희석. </li><li> 10 개의 서로 다른 농도가 O 때까지에 대한 최초의 에펜 도르프 유리 병,에 resuspend하고 다음 유리 병에 전송 60 μl를, 그리고에 5.1 절에있는 혼합물의 피펫 60 μL로 이동(5.1 절에서 부모의 혼합물을 포함한다) btained. </li><li> 매체의 180 μL와 THF의 각 농도의 20 μl를 희석. </li><li> 만 THF와 제어 솔루션을 준비, 각 측정 매체의 180 μL와 THF 20 ㎕. </li><li> 이미 농도 범위는 수 (최대 200 ㎎ / L의 화합물의 최종 농도를 제공하기 위해 중간에있는 세포의 상기 용액 200 μl를 포함 각 웰에, (THF 제어 포함), 생성 된 용액을 10 μl를 추가합니다 )의 화합물의 활성에 따라 변화 될 수있다. </li><li> 당신은 화합물의 용해도에 따라 적용되는 높은 농도에 약간의 침전을 관찰 할 수 있습니다. </li><li> 화합물의 3 배 (같은 화합물의 접시에 3 선)의 각 측정을 반복, 각 라인은 포함 10 가지의 농도, 잘 빈에 대한 세포없이 만 제어 및 1 용매로 처리 한 잘 포함하는 셀의 화합물로 처리 된 세포를 제어 할 수 있습니다. </li><li> CO 2 분위기 5 %에서 37 ° C에서 3 일간로드 플레이트를 품어. </li></ol></li><li> MTT 분석을 이용하여 세포 독성을 측정 <ol><li> 페놀 레드없는 RPMI-1640 배지 200 ㎖ 용액에 MTT 분말 1g을 첨가하여 MTT 용액을 준비한다. 원액은 15 ML 튜브로 나누어 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li><li> (단계 4.10에서 세포없이 빈 제어 우물 제외) 각 잘 사용하여 11 채널 피펫에 MTT 용액 20 μl를 추가, 추가 3 시간 동안 접시를 품어. </li><li> 각 우물에서 매체 솔루션을 제거합니다. </li><li> 포르 마잔을 용해 각 웰에 이소프로판올 200 μl를 추가합니다. 균질성이 도달 할 때까지 0.5 시간 동안 접시를 저어. </li><li> 마이크로 플레이트 리더 분광 광도계에 의한 상기 용액을 200 ㎕의 550 nm에서의 흡광도를 측정한다. </li><li> 3 다른 일에 (즉, 3 반복을 포함, 단계 5.8 참조) 각 측정을 반복합니다. </li><li> T를 계산THF 용매 제어 값의 흡광도로 나눈 결과, 측정 값에서 빈 제어 흡광도 값을 공제하고 100 % 곱하여 세포 생존의 고 비율. </li><li> 그래프 패드 프리즘 소프트웨어 (또는 이에 상응하는)를 사용하여 IC 50 값을 계산합니다. </li><li> 보고 된 IC (50)는 적어도 세 개의 다른 날에 수집 된 모든 IC 50 값의 평균이며, 상기 에러 값은 표준 편차이다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해가없는 선언합니다.

이 논문에 기재된 방법은 생물학적 세포 생존 분석으로 화학 합성을 결합한다. 생존 세포에 관한 생물학적 방법과 마찬가지로 층류 후드에서 작업하고, 멸균 유기 용매의 사용을 포함하여 멸균 조건을 유지하기 위해 필수적이다. 또한, 가수 분해 불안정한 금속 기반 약물의 제조 및 저장되는 글로브 박스 또는 쉬 렝크 라인 기법들이 이용되어야 불활성 조건 하에서 수행되어야한다. 불활성 환경에서 일할 수있는 기술의 선택은 글로브 박스의 가용성에 주로 의존한다. 가능한 경우, 실내 온도 조건을 필요로하는 모든 합성은 그 안에 수행하기가 매우 편리합니다. 난방을 필요로 합성은 일반적으로 쉬 렝크 플라스크에 상자 밖으로 촬영하고 쉬 렌크 라인에 연결됩니다. 글로브 박스를 사용할 수없는 경우, 모든 조작은 Schle에 엄선 된 유리와 함께 수행 할 수있다NK 라인 건조한 분위기를 유지하기 위해 진공 / 불활성 가스 (N 2 또는 AR) 조작을 이용하면서. <p clas...

화학 요법은 여전히​​ 다양한 암 질환의 임상 치료에 사용의 주된 과정 중 하나이며, 따라서 연구의 방대한 양의 새롭고 개선 된 항암제를 개발하는 것을 목표로 세계적으로 수행된다. 이러한 연구는 주로 시험 관내 세포 독성 특성의 생물학적 평가에이어서 화합물의 설계 및 제조와, 화학적 레벨에서 시작한다. 세포 생존 능력은 세포 활동 1-2에 대한 정보를 제공하는 다양한 분석에 의해 평가 될 수있다. 시스플라틴은 광범위 정소 및 난소 암 3-4 주로 효율적인 치료 간주 화학 치료 약물로 사용되는 백금 착물의 예이다. 그러나, 좁은 활성 범위 및 심각한 부작용은 다른 유력한 전이 금속 착체 5-8의 연구 결과를 발생시킨다. 다른 사람의 사이에서, 티타늄 (IV) 및 바나듐 (V) 단지는 높은 활동의 유망한 결과를 보여 주었다 감소독성 9-16. 티타늄 (IV) 컴플렉스 때문에 이러한 속성에 시스플라틴 후 임상 시험을 입력하는 첫번째이었다, 그러나, 그들은 인해 배합 어려움과 가수 불안정 시험을 실패했습니다. 내수성 15,17-21 높은 항암 활성을 결합 할 수있는 금속 착체의 개선 된 유도체를 개발하기 위해 현재 필요하므로있다. 티타늄 (IV) 및 V의 제조에 도전 (V) 착물 전구체 시약의 가수 불안정성을 의미하므로, 불활성 분위기가 유지되어야한다. 티타늄 (IV) 및 V (V) 화합물의 제조는 글로브 박스 또는 쉬 렝크 라인 기술을 사용하여 N 2 또는 아르곤 조건 하에서 수행된다. 분석 - 항암 활성의 평가를위한 하나의 일반적인 방법은 MTT ((4,5 - dimethylthiazolyl) -2,5 - 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 3)에 기초한다. 이 분석은 Mosmann에 의해 1983 년에 발표 된 비색 생존 분석입니다22. 그것은 매우 잘 연구되고 특징으로 인해 정밀도, 신속성 및 세포주의 다양한 적용되는 그 기능에 새로운 세포 독성 화합물의 효과를 평가할 때, 그것은 매우 효율적으로 간주된다. 이 생존력 분석은 그것이 가능한 세포에 노출 MTT 분자의 색상 변화에 근거한다. 생존 세포의 수에 비례하여 흡광도, 및 미처리 컨트롤과 비교하여 측정은, 시험 된 화합물의 세포 성장 억제 능력의 평가를 가능하게한다. MTT 비색 분석은 96 - 웰 플레이트 포맷 (23)에서 수행된다. 세포는 시험 약물을 추가하기 전에 우물에서 예비 배양을 필요로 할 수있다. 예비 배양 시간은 세포주의 특성에 따라 0-24 시간과 다를 수 있습니다. 셀은 일반적으로 약물 활동에 따라 24-96 시간 동안 약물에 노출된다. MTT 용액을 엘 처리 된 세포에 첨가된다오우 MTT (그림 1) (24) 실행 가능한 세포에서 운영되어 미토콘드리아와 세포질 다양한 효소에 의해 보라색 포르 마잔로 감소된다. MTT 분자는 죽은 세포 또는 적혈구 (대사 비활성 셀), 비장 세포 (휴식 세포)와 콘 카나 발린 A를 자극 림프구 (활성화 된 세포) (22)에 의해 감소되지 않습니다. MTT 포마 침전물과 배양 3 ~ 4 시간 후. 포르 마잔의 형성은 배양 0.5 시간 후 시작하지만, 최적의 결과를 위해 적어도 3 시간 (22) MTT에 세포를 노출하는 것이 가장 좋습니다. 따라서, 성장 배지를 제거하고 DMSO도 26을 사용할 수 있지만 포르 마잔은, 유기 용매, 바람직하게는 이소프로판올 (25)에 용해된다. 매체의 제거는 성장 배지에서 널리 일반적인 페놀 레드, 이후 정확한 결과를 달성하고, 단백질은 흡광도 측정 (25)을 방해 할 수 석출 위해 결정적이다. 때 견적잔 용액 용액의 흡광도를 마이크로 플레이트 리더 분광 광도계를 사용하여 측정되고, 균질 도달한다. 550 nm에서의 흡광도는 웰 당 200-50,000 셀 범위의 셀의 개수에 비례하고, 따라서 셀의 매우 작은 양 (22)을 검출 할 수있다. 흡광도는 약물 치료 후에 남아 생존 세포의 양을 나타내며, 약물에 노출되지 않은 대조군 세포의 흡광도와 비교된다. 적절한 소프트웨어에 의해 결과의 분석은 IC 50 (억제 농도, 50 %) 제공 값과 통계적 오차 측정의 몇몇 반복에 따라. MTT 분석은 정확성과 단순함으로 인해 새로운 항암 화합물을 스크리닝 세포 독성 연구에서 널리 일반적입니다. 효소 반응에 의존 MTT 분석법을 사용한 경우에는, 하나는 각종 효소 저해제는 MTT의 감소에 영향을 미칠 수 있다는 것을 참고해야false 결과 27로 이어질 거라고. 또, MTT 분석법은 약물 2의 세포 상해 활성의 기전에 대한 어떠한 정보도 제공하지 않는다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">시약/재료</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>Hexane AR</td><td>Gadot</td><td>830122313</td><td>용매 건조 시스템을 사용하여 건조</td></tr><tr><td>HT-29 세포주</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol AR</td><td>Gadot</td><td>830111370</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>생물 산업</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>시그마-알드리치</td><td>M5655-1G</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 항생제</td><td>생물학 산업</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 페놀 레드 포함 L-글루타민</td><td>시그마-알드리치</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 페놀 레드 없음</td><td>생물학 산업</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>테트라하이드로푸란(THF) AR</td><td>Gadot</td><td>830156391</td><td>용매 건조 시스템</td></tr><tr><td>Ti(OiPr)를 사용하여 건조4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>205273-500ML</td><td>수분 민감성</td></tr><tr><td>트립신/EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>VO(OiPr)3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>404926-10G</td><td>수분 민감한</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>12-channel pipette 30-300 &mu; l</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12채널 피펫 5-50 &mu; l</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 플라스크</td><td>NUNC</td><td>156472</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트(뚜껑 포함)(바닥이 편평함)</td><td>NUNC</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>바인더</td><td>APT.line C150</td><td></td></tr><tr><td>카운터 챔버</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>650030</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 바이알</td><td>KARTELL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>글러브 박스</td><td>M. Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>층류 후드</td><td>ADS LAMINAIRE</td><td>OPTIMALE 12</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 플레이트 리더 분광 광도계</td><td>Bio-Tek</td><td>El-800</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>피펫 20-200 &mu; l</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 5-50 &mu; l</td><td>핀피펫</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mtt의 분석에 의해 합성 및 세포 독성 평가 : 항암 금속 합성물

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

티타늄 (IV) 및 바나듐 (V) 착물은 매우 강력한 항암제이다. 자신의 합성 문제는 자신의 가수 분해 불안정을 의미하므로 자신의 준비는 불활성 분위기 하에서 수행되어야한다. 이러한 복합체의 항암 활성의 평가는 MTT 분석에 의해 달성 될 수있다. MTT 분석은 그것이 가능한 세포에 노출되었을 때 MTT 포마 잔하는 분자의 환원 효소에 기반 비색 생존력 분석법이다. 환원의 결과는 MTT 분자의 색 변화이다. 컨트롤을 기준으로 흡광도 측정은 복합 항암 활성 및 IC 50 값으로 변환하는 테스트 화합물의 농도 변화와의 다음과 같은 치료 가능한 암 세포를 나머지의 비율을 결정합니다. MTT 분석은 정확성, 신속성, 그리고 상대적으로 단순에 의한 세포 독성 연구에서 널리 일반적입니다. 여기에서 우리는 사전셀 플레이트의 제조, 세포와 화합물의 배양 등 공기에 민감한 금속 기반 약물 및 세포 생존 능력 측정의 합성에 대한 상세한 프로토콜을 전송, MTT 분석하고 IC 50 값의 판정을 사용하여 생존력을 측정.

착체 설정된 절차 18, 28 및 그들의 순도 NMR 및 원소 분석에 의해 평가 될 수있다에 근거 제조 하였다. MTT 분석으로부터 수신 된 데이터는 18,21 화합물의 세포 독성을 평가하기 위해 분석된다. 첫째, 모든 다른 값에서 빈 제어 흡광도 값의 감산을 행한다. 둘째, THF 용매 제어 값은 억제 화합물 제공된 성장이 첨가하지 않은 것처럼, 100 % 생존율로 설정된다. 다른 모든 값은 컨트롤에 따라 생존의 비율로 변환됩니다. 농도는 적용 및 계산 된 상대 생존 비율은 다음 변수 기울기 (네 개의 매개 변수) 모델의 비선형 회귀 (그림 4, 표 1) 29를 기준으로 IC 50 값을 결정하기 위해 그래프 패드 프리즘 소프트웨어 (또는 이에 상응하는 금액)에 삽입됩니다. 측정 범위에서 수행되어야각각의 고원에 적어도...

공기에 민감한 티탄 및 바나듐 항암제의 합성 방법은 MTT 분석에 의해 인간의 암 세포주를 향해 자신의 세포 상해 활성의 평가와 함께 설명한다.

MTT의 분석에 의해 합성 및 세포 독성 평가 : 항암 금속 합성물

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

본 실험 절차의 전체적인 목표는 항암 금속 의약품을 제조하고 MTT 분석법을 통해 그 세포독성을 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 금속 기반의 항암 화합물을 합성합니다. 두 번째 단계는 암세포를 96웰 플레이트에 준비하는 것입니다.다음으로, 금속 기반 항암 화합물을 암세포에 투입합니다. 마지막 단계는 MTT assay를 통해 세포 생존율을 측정하는 것으로, 미토콘드리아 및 세포질 효소에 의해 MTT가 환원되어 포르마잔(formazan)이 형성되는 정도를 측정하여 최종적으로 항암 활성과 반 최대 억제 농도(half maximal inhibitory concentration) 또는 화합물의 IC₅₀ 값을 결정합니다.일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 실험자의 전적인 주의가 필요하고 엄격한 시간 계획에 따라 진행되는 다단계 절차이기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 살아있는 세포를 다루기 위해서는 특정 가이드라인을 따라야 하므로 세포 플레이트 준비 과정이 간단하지 않으며, 따라서 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 글로브 박스 내에서 리간드 전구체 0.42 millimole을 건조한 THF에 녹여 바나듐 5 복합체를 준비하십시오.그 다음, THF에 녹여 교반 중인 동일 양의 vanadium ox tris isopropoxide 용액에 이를 첨가합니다. 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반한 후, 진공 상태에서 휘발성 물질을 제거합니다. 이어서, 차가운 hexane을 첨가한 뒤 진공 상태에서 이를 제거합니다.정량적인 수득률로 진한 보라색 분말을 얻어야 합니다. 얻어진 화합물 8 mg을 epi orph 바이알에 정밀하게 답니다. 티타늄 4 착물을 제조하려면 리간드 전구체 0.35 mmol을 건조된 THF에 녹인 후, THF에 용해되어 교반 중인 동량의 titanium tetra isop oxide 용액에 첨가합니다.반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한다. 그 다음 진공 상태에서 휘발성 성분을 제거하여 정량적 수율로 노란색 생성물을 얻는다. 96-well 플레이트의 1차 배양에서 HT 29 세포를 준비하기 위해, 얻은 화합물 8 mg을 eph vial에 정밀하게 잰다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 75 square centimeter 플라스크 내의 세포를 준비하고, HT 29 세포가 최대 합류도(confluency)에 도달했을 때 배지를 제거합니다. 1 milliliter의 trypsin EDTA 용액으로 세포를 세척한 후, 동일한 용액 1 milliliter를 추가하고 5분 동안 배양합니다. 플라스크에서 HT 29 세포를 떼어내고, trypsin 활성을 억제하기 위해 배지 10 milliliters를 추가합니다.세포 혼합액 5 mL를 튜브로 옮깁니다. 피펫을 사용하여 세포 혼합액 몇 방울을 카운팅 챔버로 옮깁니다. 카운팅 챔버는 5x5 격자 두 부분으로 구성되어 있습니다.현미경을 사용하여 각 부분의 대표적인 구역 5곳의 세포 수를 측정합니다. 네 모서리의 구역 4곳과 중앙의 구역 1곳을 측정합니다. 이를 통해 존재하는 세포의 추정량을 계산합니다.각 부분의 대표 사각형 5개에 있는 세포 수를 합산합니다. 두 부분의 합계 평균을 계산하고 이를 20으로 나눕니다. 그다음, 0.6을 해당 몫으로 나눕니다.계산된 수치는 플레이트당 필요한 세포 혼합물의 양입니다. 이 계산은 웰당 9,000 cells가 포함된 플레이트를 기준으로 합니다. 피펫을 사용하여 플레이트당 필요한 양의 세포 혼합물을 13.2 milliliters의 배지와 혼합하십시오.혼합물을 96-웰 플레이트에 넣습니다. 11채널 피펫을 사용하여 총 66개의 웰이 포함된 6개 라인에 웰당 200 µL씩 분주합니다. 블랭크 대조군을 위해 각 라인의 웰 하나는 비워두어야 합니다.세포가 플레이트에 부착될 수 있도록 37 °C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 화합물을 처리하기 위해, 먼저 8 mg의 화합물 중량에 200 µL의 건조한 THF를 첨가합니다. 9개의 서로 다른 이노 파일(einor file)에 각각 60 µL의 THF를 먼저 첨가하여 화합물 용액을 추가로 희석합니다. 각 용액에 대해, 피펫을 사용하여 화합물 용액에서 60 µL를 첫 번째 이노 파일로 옮깁니다.그런 다음 다시 현탁하여 60 µL를 다음 바이알로 옮기는 과정을 반복하여 10가지의 서로 다른 농도를 얻습니다. 각 농도의 THF 용액 20 µL를 배지 180 µL로 희석합니다. 또한, THF 20 µL를 배지 180 µL에 첨가하여 용매 전용 대조군 용액을 준비합니다.다음으로, 각각의 결과 용액에서 10 µL씩을 각 웰에 첨가합니다. 해당 웰에는 이미 배지 내 세포 용액 200 µL가 포함되어 있으며, 이를 통해 화합물의 최종 농도가 최대 200 mg/L가 되도록 합니다. 각 라인은 10가지 서로 다른 농도의 화합물로 처리된 세포를 포함합니다.용매로만 처리한 세포가 포함된 대조군 웰 하나와 세포가 없는 웰 하나를 준비합니다. 공백 대조군의 경우, 화합물의 각 측정값을 세 번씩 반복하도록 라인을 설정합니다. 로딩된 플레이트를 37 °C, 5% CO2 분위기에서 3일 동안 배양합니다. 11채널 피펫을 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 MTT 용액을 준비합니다.공백 대조군 웰을 제외한 각 웰에 MTT 용액 20 µL를 추가합니다. 배양 후 플레이트를 3시간 동안 추가로 배양합니다. 각 웰에서 배지 용액을 제거하고 각 웰에 이소프로판올 200 µL를 추가합니다.포민(formin)을 용해하기 위해, 균질해질 때까지 플레이트를 30분 동안 교반합니다. 마이크로플레이트 리더 또는 분광광도계를 사용하여 균질한 용액 200 µL의 흡광도를 550 nm에서 측정하며, 각 측정은 서로 다른 세 날에 걸쳐 반복합니다. 다음으로, 측정값에서 공시료 대조군(blank control)의 흡광도를 빼고, 그 결과를 THF 용매 대조군의 흡광도로 나눈 뒤 100%를 곱하여 세포 생존율을 계산합니다. 그래프 소프트웨어를 사용하여 반최대 억제 농도(half maximal inhibitory concentration) 값을 계산합니다.보고된 IC 50은 최소 3일 이상의 서로 다른 날짜에 수집된 모든 IC 50 값의 평균이며, 오차 값은 표준 편차입니다. 화합물의 세포 독성을 평가하기 위해 MTT assay로부터 얻은 데이터를 분석합니다. 측정은 각 고원 영역(plateau)에 최소 3개의 지점이 있고 기울기를 정의하는 3개의 지점이 포함되어, 그래프상에 지점이 고르게 분포될 수 있는 농도 범위에서 수행해야 합니다.고농도 또는 저농도에서의 측정값이 불충분하면 IC 50 값 결정에 필요한 곡선의 비선형 회귀 적합도가 떨어지며, 결과적으로 정확도가 감소합니다. 비선형 회귀 적합으로 결정된 상대적 IC 50 값은 테스트한 화합물에 의해 가능한 세포 성장 억제 정도의 50%에 도달하는 농도에 해당합니다. 이는 측정된 최대 세포 생존율과 최소 세포 생존율의 중간 지점으로 계산되며, 이 값들이 반드시 각각 100%와 0%인 것은 아닙니다.프로토콜에 기술된 실험 결과를 살펴보면, cisplatin뿐만 아니라 티타늄 및 바나듐 복합체가 매우 활성적임을 알 수 있습니다. 또한, 서로 다른 화합물 간의 IC 50 값을 비교할 때, 특정 화합물의 최대 억제 값이 100%에 가까울수록 상대적 IC 50 값이 절대적 IC 50 값에 더 가까워진다는 점이 눈에 띕니다.티타늄 4가 복합체는 가장 높은 세포독성을 나타내며, 그 IC 50 값은 cisplatin 및 바나듐 5가 복합체의 값보다 낮습니다. 그러나 유리 리간드의 경우, 다양한 농도로 리간드를 첨가한 후의 활성이 현저히 감소하는 것으로 나타났습니다. 세포 생존율이 복합체의 경우만큼 크게 떨어지지 않습니다.이를 통해 착물들의 높은 항암 활성이 금속 중심에 기인한다는 것을 확인할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 멸균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, MTT 분석법을 통해 항암 화합물의 세포 독성을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

MTT 분석은 노란색 MTT의 감소와 물 불용성 보라색 formazan의 생산을 기반으로 세포 생존 능력 평가를위한 간단하고 재현성 colorimetric 분석이다. 여기 nanogenomedicine 치료시 MCF - 7 세포의 생존 능력이 평가되었습니다.

MCF - 7 세포주에서 세포 독성 Nanogenomedicine의 : MTT 분석

이 비디오는 암세포에서 약물 유도 세포 독성을 측정하고 암세포의 대사 활성을 결정하기 위한 비색 분석, 메틸 티아졸 테트라졸륨(MTT) 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 테트라졸륨 염이 세포의 미토콘드리아 활성을 반영하는 착색 제품으로의 대사 변환을 기반으로 합니다.

메틸 티아졸릴 테트라졸륨 또는 MTT 분석법: 암세포의 대사 활성을 측정하여 약물 내성을 측정하기 위한 비색 분석

여기에서는 전이의 in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane(CAM) 모델과 결합된 종양 세포 대사의 실시간 모니터링을 사용하여 종양 세포를 DNA를 손상시키는 화학 요법에 감작하는 능력에 대해 새로운 항암 표적/제제를 평가하는 데 사용됩니다.

암 약물 과민 반응의 효과를 평가<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

이 프로토콜 Chou와 Talalay 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 암 항 체와 전 임상 모델에서 antineoplastic 마약 성분 평가 하는 방법을 설명 합니다.

Potentiation Antineoplastic 약물으로 항 암 항 체 효능: 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 체-마약 성분의 검출

이 프로토콜은 세포 생존 가능성을 효율적으로 결정하기 위한 신속하고 높은 처리량, 신뢰할 수 있고 저렴하며 편견없는 분석서를 설명합니다. 이 분석은 세포의 미토콘드리아가 손상되어 다른 분석과 방해가 되는 경우에 특히 유용합니다. 분석은 두 개의 핵 염료로 염색 된 세포의 자동 계수를 사용합니다 - Hoechst 33342 및 프로피듐 요오드.

미토칸 세포 독성의 정확한 측정을 위한 자동화된 차동 핵 염색 분석

이 방법론은 유세포 분석, RT-PCR, 면역세포화학, 기타 세포 및 분자 생물학 기술을 포함한 생존력 분석 및 표현형 분석을 사용하여 가용성 추출물의 제조를 통해 생체 재료 세포 독성을 평가하는 것을 목표로 합니다.

생체 재료에 대한 세포 독성 및 세포 반응에 접근

여기에서는 이전에 합성 된 스피로 사이클릭 옥심을 테스트하기 위해 3- (4', 5'- 디메틸 티아 졸 -2'- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT)를 사용하는 생물학적 분석에 대해 설명합니다.

기능화된 스피로사이클릭 헤테로사이클 합성 및 세포독성 분석

이 프로토콜은 치료용 항-HER-2 항체가 있는 상태에서 자연 살해 세포 매개 유방암 세포 사멸을 조절하는 화합물을 식별하기 위한 자동화된 이미지 기반 고처리량 기술을 제시합니다.

항체 의존성 세포 독성 변형 화합물의 식별을 위한 High-content screening assay

이온 채널의 약리학적 표적화는 고형 종양을 치료하는 유망한 접근 방식입니다. 암세포에서 이온 채널 기능을 특성화하고 암 생존력에 대한 이온 채널 조절제의 효과를 분석하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다.

암세포의 이온 채널 스크리닝

여기에서는 항종양 항체의 중요한 암세포 사멸 기전인 ADCC 기전을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제시합니다. NK 세포의 세포독성 효과는 트라스투주맙이 있는 유방암 세포 스페로이드에서 측정됩니다. 이미지 분석은 스페로이드에서 살아있는 킬러와 죽은 킬러와 표적 세포를 식별합니다.

종양 스페로이드 모델에서 항체 의존성 세포 독성 정량화: 약물 발견을 위한 응용

여기에서는 ADCC bioassay kit를 사용하여 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC) 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 ADCC 메커니즘을 규명하고 암 면역 요법에서 항체의 치료 가능성을 평가하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

항체 의존성 세포 매개 세포 독성 리포터 생물학적 분석을 사용하여 암세포의 항체 의존성, 세포 매개 세포 독성 평가

학습하세요 항암 금속 합성물의 합성 및 MTT 분석을 통한 세포 독성 평가 방법을. 티타늄과 바나듐 기반 화합물을 합성하고 인간 암 세포주에서 IC50 값을 측정하여 항암 효능을 검증하는 실험 절차를 익히세요.

MTT의 분석에 의해 합성 및 세포 독성 평가 : 항암 금속 합성물

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