MTT의 분석에 의해 합성 및 세포 독성 평가 : 항암 금속 합성물

이 절차의 전반적인 목표는 항암 메탈로 약물을 준비하고 MTT 분석을 통해 세포 독성을 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 금속 기반 항암 화합물을 합성하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 암세포로 구성된 96웰 플레이트를 준비하는 것입니다.

다음으로, 금속계 항암 화합물을 암세포에 삽입합니다. 마지막 단계는 MTT 분석법으로 세포 생존율을 측정하는 것으로, 여기서 미토콘드리아 및 세포질 효소에 의한 MTT의 감소가 궁극적으로 항암 활성과 절반의 최대 억제 농도를 측정합니다. 또는 화합물의 50 가지 값이 결정되는 것을 볼

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 실험실 작업자의 완전한 주의가 필요하고 엄격한 일정에 놓인 다단계 절차이기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 생존 가능한 세포로 작업하려면 특정 지침을 따라야 하기 때문에 세포판을 준비하는 것이 간단하지 않기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 글로브 박스에서 작업하면서 0.42 밀리몰의 리간드 전구체를 건조 THF에 용해시켜 바나듐 5 복합체를 준비합니다.

그런 다음 THF에서 동등한 양의 바나듐 ot tris isop 산화물의 교반 용액에 첨가하십시오. 진공 상태에서 휘발성 물질을 제거하기 전에 실온에서 15분 동안 반응 혼합물을 저어줍니다. 다음으로 차가운 헥산을 넣고 진공 상태에서 제거합니다.

짙은 자주색 분말은 정량적 수율로 얻어야 합니다. 얻어진 화합물 8mg을 에피 고아 바이알에 무게를 잰다. 티타늄 4 복합체를 제조하기 위해 0.35 밀리 몰의 리간드 전구체를 건조 THF에 용해시키고 THF의 티타늄 테트라 이소프 산화물 양과 동등한 양의 교반 용액에 첨가한다.

반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반합니다. 그런 다음 진공 상태에서 휘발성 물질을 제거하여 정량적 수율로 노란색 제품을 제공합니다. 얻어진 화합물 8mg을 에프 바이알에 넣어 96웰 플레이트에서 HT 29 세포를 1차 배양하여 준비합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 75제곱센티미터 플라스크의 세포는 HT 29 세포가 최대 cofluency에 도달하면 배지를 제거합니다. 1ml의 트립신 EDTA 용액으로 세포를 세척한 후 동일한 용액 1ml를 넣고 5분 동안 배양합니다. 플라스크에서 HT 29 세포를 분리하고 배지 10ml를 첨가하여 트립신 활성을 비활성화합니다.

세포 혼합물 5ml를 튜브로 옮깁니다. 피펫을 사용하여 세포 혼합물 몇 방울을 카운터 챔버로 옮깁니다. 카운터 챔버는 5 x 5 사각형의 두 부분으로 구성됩니다.

현미경을 사용하여 각 부분의 5개의 대표 사각형에 있는 세포를 세십시오. 모서리에 4개의 사각형과 중간에 1개의 사각형이 있습니다. 존재하는 세포의 예상 수를 계산합니다.

각 부분의 5개 대표 사각형에 있는 셀을 합산합니다. 두 부분의 평균 합을 계산하고 20으로 나눕니다. 다음으로 0.6을 몫으로 나눕니다.

수신된 숫자는 플레이트당 필요한 세포 혼합물의 양입니다. 이 계산은 웰당 9, 000개의 셀을 포함하는 플레이트를 참조합니다. 피펫을 사용하여 플레이트당 필요한 세포 혼합물의 양을 13.2ml의 배지와 결합합니다.

혼합물을 96웰 플레이트에 추가합니다. 총 66개의 웰을 포함하는 6개 라인에서 웰당 200마이크로리터의 11채널 피펫을 사용합니다. 빈 컨트롤을 위해 각 라인의 하나의 웰이 비어 있어야 합니다.

섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 플레이트를 24 시간 동안 배양하여 세포가 플레이트에 부착되어 화합물을 먼저 삽입하도록하고 200 마이크로 리터의 건조 THF를 8 밀리그램의 중량 화합물에 첨가하십시오. 먼저 9개의 서로 다른 einor 파일에 60마이크로리터의 THF를 첨가하여 화합물 용액을 더 희석합니다. 각 용액에 대해 피펫을 사용하여 복합 용액에서 첫 번째 einor 파일로 60마이크로리터를 이동합니다.

그런 다음 resus는 10개의 다른 농도가 얻어질 때까지 60마이크로리터를 현탁하고 다음 바이알로 옮기는 식으로 계속합니다. THF에 각 농도의 20마이크로리터를 180마이크로리터의 배지로 희석합니다. 또한 180마이크로리터의 배지에 20마이크로리터의 THF를 첨가하여 용매 전용 제어 용액을 준비합니다.

다음으로, 각 결과 용액에서 10마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 그것은 이미 리터당 최대 200 밀리그램의 화합물의 최종 농도를 제공하기 위해 배지에 앞서 언급 한 세포 용액의 200 마이크로 리터를 포함하고 있습니다. 각 라인에는 10가지 농도의 화합물로 처리된 세포가 포함되어 있습니다.

하나는 용매로만 처리된 세포를 포함하는 우물을 대조하고 세포가 없는 우물을 대조군은 공백 대조군의 경우 화합물의 각 측정을 세 번 반복하도록 라인을 설정합니다. 적재 된 플레이트를 5 % 이산화탄소 대기에서 섭씨 37도에서 3 일 동안 배양합니다. 11채널 피펫을 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 MTT 용액을 준비합니다.

블랭크 컨트롤 웰을 제외한 각 웰에 20마이크로리터의 MTT 용액을 추가합니다. 배양 후 추가로 3시간 동안 플레이트를 배양합니다. 각 웰에서 매체 용액을 제거하고 각 웰에 200마이크로리터의 이소프로판올을 추가합니다.

포르민을 용해시키려면 균질해질 때까지 플레이트를 30분 동안 저어줍니다. 마이크로플레이트 리더로 균질한 용액의 200마이크로리터에 대해 550나노미터에서 흡광도를 측정하고 분광 광도계는 3일 동안 각 측정을 반복합니다. 다음으로, 측정된 값에서 blank control 흡광도 값을 빼고, 그 결과를 THF 용매 control 값의 흡광도로 나누고 100%를 곱하여 세포 생존율의 백분율을 계산합니다.tage 그래프 소프트웨어를 사용하여 절반 최대 억제 농도 값을 계산합니다.

보고된 IC 50은 최소 3일 동안 수집된 모든 IC 50 값의 평균이며, 오류 값은 표준 편차입니다. MTT 분석에서 수신된 데이터를 분석하여 화합물의 세포 독성을 평가합니다. 측정은 균일한 점 분포를 표시하는 그래프를 생성하는 농도 범위에서 수행되어야 하며, 각 고원에서 최소 3개의 지점과 기울기를 정의하기 위한 3개의 지점이 있어야 합니다.

고농도 또는 저농도에서 불충분한 측정은 IC 50 값을 결정하는 데 필요한 곡선의 비선형 회귀 피팅을 손상시키고 결과적으로 정확도를 감소시킵니다. 비선형 회귀 적합도에 의해 결정된 상대 IC 50 값은 테스트된 화합물에 의해 가능한 세포 성장 억제의 50%로 이어지는 농도에 해당합니다. 이는 측정된 최대 세포 생존율과 최소 세포 생존율 사이의 중간점으로 계산되며, 각각 100%와 0%일 필요는 없습니다.

프로토콜에 설명된 실험 결과를 검사할 때. 시스플라틴과 티타늄 및 바나듐 복합체가 매우 활성이라는 것은 분명합니다. 또한 주어진 화합물의 최대 억제 값이 100%에 가까울수록 서로 다른 화합물 간의 IC 50 값을 비교할 때 상대 IC 50 값이 절대 값에 가깝다는 것도 눈에 띕니다.

티타늄 4 복합체는 세포 독성이 가장 높으며 IC 50 값은 시스플라틴 및 바나듐 5 복합체보다 낮습니다. 그러나, 자유 리간드는 다른 농도에서 리간드를 첨가한 이후 현저하게 감소된 활성을 나타냅니다. 세포 생존율은 복합체만큼 크게 떨어지지 않습니다.

이것은 복합체의 높은 항암 활성이 이 절차를 시도하는 동안 금속 센터에 의존한다는 것을 보장합니다. 항상 멸균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 M-T-T-S-A로 항암 화합물의 세포 독성을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.