세포 추적을위한 생체 ¹⁹ F MRI에서

이 절차의 전반적인 목표는 19 FMRI를 사용하여 생체 내에서 19 F 표지된 세포의 수를 이미지화하고 정량화하는 것입니다. 이는 임상 또는 전임상 환경에서 수행할 수 있습니다. 이는 먼저 적절한 19 F 제제로 세포를 라벨링함으로써 달성됩니다.

이것은 대부분 생체 외에서 수행됩니다. 두 번째 단계는 셀당 19 F 함량을 정량화하는 것이며, 이는 알려진 참조와 함께 19 F 및 MR을 사용하여 수행할 수 있습니다. 셀당 19F 함량은 실험 중에 일정하게 유지되는 것으로 간주되며, 그렇지 않으면 보정 계수를 계산해야 합니다.

다음으로, 전달된 표지된 세포의 국소화를 위해 1개의 H 및 19 FMRI를 사용하여 피험자를 in vivo에서 이미지화합니다. 알려진 참조 및 적절한 이미징 매개변수는 이미지 데이터에서 정량화하는 데 필수적입니다. 마지막 단계는 이미지 데이터를 처리하여 셀 수를 계산하는 것입니다.

가능한 경우 생체 외 조직학 또는 기타 기술을 사용하여 데이터를 확증할 수 있습니다. 궁극적으로, 생체 내 세포 추적을 위한 19 FMRI는 텍스트에 설명된 특정 가정을 감안할 때 해당 기간 동안 전달된 세포의 위치 및 수 측면에서 세포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 초상자성 세포 라벨을 사용하는 HMRI와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 교란스러운 배경 신호가 없고 이미지 데이터에서 직접 세포 수를 결정할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 세포가 어디에 있는지, 다양한 시점에 얼마나 많은 세포가 존재하는지와 같은 세포 치료제 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜을 시작하려면 먼저 2밀리리터의 배지에서 100만 세포당 4밀리그램의 농도로 미성숙 수지상 세포에 19F 라벨을 추가합니다. 그런 다음 부드럽게 휘젓습니다.

다음으로, 수지상 세포를 라벨로 3일 동안 배양한 후 성숙시키고 수확합니다. 그런 다음 세포를 수집하고 최소 3회 세척하여 초과 라벨을 제거합니다. PBS 계수에서 생성된 세포는 주입 또는 추가 테스트를 위해 소량의 PBS에 재현탁됩니다.

여기에 설명된 프로토콜은 이러한 특정 수지상 세포 및 표지와 관련이 있습니다. 따라서 다른 세포 유형에 대한 프로토콜은 문헌에서 찾거나 연구자가 최적화해야 합니다. 알려진 수의 라벨링된 세포를 NMR 튜브에 넣습니다.

그런 다음 10 마이크로 리터의 5 % tri Fluor 또는 산성 산 또는 TFA를 첨가하십시오. TFA의 공진 주파수가 라벨과의 중복으로 인해 적합하지 않은 경우 대체 용해성 화합물을 사용하십시오. NMR 분광계에 샘플을 넣고 불소 19 스펙트럼을 얻습니다.

그런 다음 기준과 샘플의 피크 또는 샘플의 주 피크 아래의 상대 면적을 계산한 다음 샘플의 셀당 평균 불소 수를 계산합니다. 이 전체 프로세스는 통계적 유의성에 도달하기 위해 평균적으로 반복되어야 합니다. 이는 MRI 스캐너에서 직접 분광학을 사용하여 수행할 수도 있습니다.

또한 이 절차는 많은 수의 세포에 대한 평균 불소 19 부하만 나타내며 세포 간의 변동성은 나타내지 않습니다. 세포 흡수의 균일성을 확인하려면 19 F 제제와 함께 형광 성분이 존재해야 합니다. 여기서 시나리오 3만이 세포의 균질한 표지를 보여주지만, 이는 계산에서 항상 가정되지만, 완전히 마취된 마우스를 요람에 놓고 스캔 중 움직임을 방지하기 위해 움직이지 못하게 하여 이미징을 위해 설정된 현미경 검사와 같은 보완 기술을 사용하여 확인할 수 있습니다.

또한 스캔 중 생리학적 모니터링을 위해 온도 및 호흡 제어를 연결합니다. 필요한 경우 동물 옆에 외부 참조를 배치하고 참조와 관심 영역이 모두 코일 중앙에 있어야 합니다. 19 F 이미징을 위한 해부학적 참조로 기존의 양성자 MRI 스캔으로 수집을 시작합니다.

그런 다음 시스템을 세포 마커의 19F 주파수로 조정하고 19 FMRI 스캔을 수행합니다. 이상적으로 19 FMRI 스캔은 기존 MRI와 동일한 시야와 슬라이스 선택을 갖지만 해상도는 더 낮을 수 있습니다. 다음으로, 여기에 표시된 공식을 사용하여 19F 기준 펄스 이득을 결정하고 19 FNMR 스펙트럼을 획득하여 19F 주파수를 결정합니다.

무선 주파수 코일 종속 요인 C를 별도의 시험관 내 실험에서 추정합니다. 표면 코일과 같은 균일한 B 단일 프로파일이 있는 무선 주파수 코일을 사용하면 19F 데이터의 정량화를 방해할 수 있습니다. 신호는 19F 농도뿐만 아니라 코일과의 거리에 따라 달라지기 때문입니다.

따라서 19F 데이터를 소급하여 수정하기 위해 1H 채널에서 B one map을 획득합니다. 이를 위해서는 비례 계수 C를 제외하고 하나의 H 및 19 F 코일 프로파일이 동일하고 19 F 영역에서 충분한 하나의 H 백그라운드 신호가 제공되어야 합니다. 19F 데이터를 수정하려면 먼저 두 개의 플립 각도 방법을 사용하여 하나의 H 플립 각도 맵을 획득합니다.

매우 긴 TR이 3배 이상인 그래디언트 에코 스캔을 사용하여 코일에 가까운 90도 미만의 예상 플립 각도를 가진 1개의 HT로 스캔합니다. 그런 다음 첫 번째 스캔의 플립 각도의 두 배로 두 번째 그라디언트 에코 스캔을 획득합니다. 첫 번째 및 두 번째 그래디언트 ECHO 스캔의 신호 및 감지를 통해 vle X, Y, Z에서 1H 플립 각도 알파를 계산합니다.

19F 플립 각도는 비례 B 1로 인한 요인 1 C를 제외하고는 동일하며, 여기, 플립 각도, 알파 재초점, 플립 각도, 신호 수신 중 알파 2 알파로 인한 스핀 에코 시퀀스에서 19F 신호 강도의 감쇠를 프로파일합니다. 불완전 여기(imperfect excitation)로 인한 감쇠가 여기에서 볼 수 있습니다. 그런 다음 전체 감쇠를 계산할 수 있습니다.

완벽한 90도, 180도 여기 재초점 플립 각도의 경우 1로 정규화되며, B는 19F 이미지 신호 강도 SI 19F 보정의 경우 1로 정규화되며, 이 공식을 통해 1개의 H 및 19F 오버레이 이미지를 생성합니다. 이미지 데이터를 내보내고 이미지 J와 같은 이미지 처리 프로그램에서 파일을 열고 필요에 따라 이미지 조정을 적용하고 모든 이미지에 대해 조정을 동일하게 유지해야 합니다. 그런 다음 19개의 F 이미지를 가색으로 렌더링한 다음 해당 H 이미지에 오버레이합니다.

신호의 위치를 파악하려면 관련 셀이 있는 19F 크기 이미지를 선택하고 샘플에 표시된 대로 노이즈 값에 대해 관련 셀, 참조 및 피사체 외부 영역에 대한 ROI를 표시합니다. 여기서는 명확성을 위해 one H 해부학적 스캔이 표시됩니다. 그런 다음 간단한 비례성과 셀당 19F의 값을 사용하여 ROI의 셀 수를 추정할 수 있습니다.

이 이미지는 19F 표지된 세포를 배출 림프절로 귀환시키는 것과 관련된 프로토콜의 일반적인 결과에서 가져온 것입니다. 여기에서는 TFA 참조를 사용하여 100만 개의 라벨링된 세포로 구성된 19개의 FNMR 스펙트럼을 볼 수 있으며, 여기에서는 생체 내 이미징을 위해 처리된 대표적인 이미지를 볼 수 있습니다. 세포에 사용된 것과 동일한 라벨의 밀봉된 용기로 구성된 참조를 마우스의 발 사이에 배치했습니다.

설명된 프로토콜을 적용하여 원시 19F 크기 이미지를 기반으로 약 120만 개의 세포 수를 계산했습니다. 19 F 이미지는 그레이 스케일, 해부학적 양성자 이미지 위에 가색으로 겹쳐져 있습니다. 새로운 실험을 설정할 때 불소를 검증하는 것이 중요합니다.

MRI 결과는 조직학, 광학 이미징 또는 기타 방법을 사용합니다. 예를 들어, 불소 표지는 세포가 죽을 때 조직에 남아 거짓 양성 신호로 이어질 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.