Name: 세포 추적을위한 생체 19 F MRI에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 학습하세요 생체 내 19F MRI를 이용한 세포 추적 방법으로, 마우스 모델에서 ex vivo 라벨링된 세포를 비침습적으로 이미징하고 정량화하는 기술입니다. 이 프로토콜은 임상 및 전임상 연구에 활용됩니다.

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우리는 자신의 소중한 도움을 나딘 HENN 및 렌드 Heerschap을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 재생 의학의 네덜란드 연구소 (NIRM, FES0908), EU FP7 프로그램 ENCITE (건강 F5-2008-201842) 및 TargetBraIn (HEALTH-F2-2012-279017), 폭스 바겐 재단에서 부여 (에 의해 지원되었다 I/83 443), 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (VENI 700.10.409 및 보았 노라 917.76.363), ERC (고급 그랜트 269019), 그리고 라드 바 우드 대학 네이 메헨 의료 센터 (AGIKO-2008-2-4).

주 : 동물을 포함한 모든 실험과 절차는 관련 윤리 지침에 따라 실시 및 표준 동물 관리 및 인도적 요구 사항을 준수해야합니다. 1. 셀 라벨 (Coincubation와 표준 프로토콜) <ol><li> (2 ㎖ 매체에서) 4 mg/10 6 세포의 농도로 미성숙 수지상에 19 F 레이블 추가 8. 혼합 부드럽게 소용돌이. </li><li> DC의 성숙 및 수확 전에 3 일 동안 레이블 세포를 품어. </li><li> 수지상를 수집하고 PBS 세척 적어도 3 배에 의해 초과 라벨을 제거합니다. 세포를 계산합니다. </li><li> 주사 또는 추가 테스트를위한 PBS의 작은 부피에 재현 탁. </li></ol> 참고 :이 프로토콜은 이러한 특정 수지상 및 레이블 관련이 있습니다. 이 프로토콜의 초점은 촬상에 이후 절차는 다른 간행물 8 최적화 및 여기에 포함 된 이미지에 샘플을 제조하는 단계이다 만 하였다. H줬어은, 절연, 문화와 특정 세포 유형의 라벨에 대한 프로토콜은 문헌에서 찾을 수 또는 연구원으로 최적화해야합니다 하나. 문헌에 사용 된 모든 다른 19 F 레이블의 요약은 다른 6 표시됩니다. 2. 19 F NMR을 사용하여 19 F / 셀의 결정 <ol><li> NMR 튜브에 표시된 세포의 알려진 숫자 (일반적으로 0.5 × 10 6, 충분한 신호 결과 숫자)를 놓습니다. </li><li> 5 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA)의 10 μl를 추가합니다. TFA의 공진 주파수는 라벨과 중첩하기 때문에 적합하지 않으면, 바람직하게는 19 번의 F 공진과, 대체 가용성 화합물을 사용한다. </li><li> NMR 분광계에 샘플을 놓고 19 F 스펙트럼을 얻을 수 있습니다. 대역폭이 TFA (참고)와 에이전트 모두에 대한 충분한 지 확인합니다. </li></ol> 참고 : TR은 F 충분히 길어야한다ULL의 참조의 휴식과 샘플 회전 (튜브에서 가장 긴 T 1 성분의 약 5 배 T 1 휴식 시간을, 일반적으로 TR ~ 5-8 초). 일부 분석기는 주파수 로크 신호 D 2 O를 필요로한다. 표준 19 F 스펙트럼은 충분하다. 세포의 숫자가 낮은 경우 라벨의 세포 흡수가 좋지 않거나 경우 광범위한 평균 이상 세포 숫자가 필요합니다. 수정이 부분 여기에 대해 설명하기 위해 만든되지 않는 스펙트럼은, 기준 및 관련 라벨 봉우리 사이를 중심으로해야한다. <ol start="4"><li> 기준 시료 (또는 시료의 주 피크)의 피크 하에서 상대 영역을 계산하고, 다음 샘플 (19)의 F / 세포의 평균 수를 계산한다. </li></ol> 참고 : 전체 과정을 반복하고 통계적 유의성에 도달 할 정도로 광범위하게 평균을해야합니다. 이것은 MRI 스캐너 직접 분광법을 사용하여 또한 행해질 수있다. However,이 절차는 다수의 셀이 아닌 셀 사이의 변화 만 평균 19 F 로딩을 알 수 있습니다. 세포 흡수의 균일 성을 확인하는 19 F 에이전트에서 형광 구성 요소의 존재가 필요하므로 해당 셀의 흡수는 현미경을 사용하여 또는 유동 세포 계측법 분석 할 수 있습니다. 3. 세포 주입 - 실험 설계에 대한 고려 사항 인해 세포 추적, 세포가 많은 수에 집중한다 동물 모델의 19 F MRI의 상대적으로 가난한 감도는 생체 내 이미징에 성공적으로 필요합니다. 전형적인 감도 값은 10 (11) -10 (13) 불소 원자의 범위에있는 셀 로딩으로, 1,000 ~ 100,000 cells/voxel/1 열연에서 스캔 시간을 6 범위. 이 마취제의 선택에 영향을 미치는로 영상 세션의 수와 주파수는 신중하게 계획해야합니다. 그 이소 플루 란이 suitabl하지 않을 수도 있습니다19 F MRI에 대한 전자 이소 플루 란의 19 F의 공진 주파수가 사용되는 라벨 화합물에 가까운 경우. 영상 세션이 상당한 축적을 방지하기 위해 충분히 짧은 경우 이소 플루 란은 여전히​​ 적합 할 수있다. 몇몇 대안 마취제는 문헌 10,11 사용되고있다; 예 촬상 프로토콜에 포함된다. 마취제는 다른 마우스 종자 및 질병 모델에 맞게 최적화 할 필요가 있습니다. 4. 외부 19 F 참조 디자인 <ol><li> 정량화 (12) 19 F 신호의 알려진 양을 포함하는 외부 참조를 사용합니다. 주제에서 예상되는 것과 거의 유사한 것으로 기준의 신호 강도를 선택합니다. </li></ol> 주 : 기준 화합물이 휴식 매개 변수와 일치하는 셀 라벨과 같은 경우 일반적으로, 간단합니다. 공간 지역화없이 분광 시퀀스 또는 시퀀스가​​ 사용되는 경우, ACompound 다른 화학적 변화로 필요할 수 있습니다. <ol start="2"><li> 관심 (ROI)의 영역에 따라 필요에 따라 위치, 크기 및 참조의 모양을 수정합니다. 참고 : 참고로 균일 한 단면으로 튜브를 사용하는 것이 일반적으로 가장 쉬운 방법입니다. </li></ol> 5. 이미징 및 마우스 준비 <ol><li> 10 ㎎ / ㎖의 케타민 (ketamine) 원액을 2 ㎎ / ㎖ 자일 라진을 산출하기 위해 생리 식염수로 시중에서 케타민과 자일 라진 1시 10분 V / V를 희석. </li><li> 마우스가 이미지가되기 전에 구멍이 따뜻해질 수 있도록 스캐너 (일반적으로 따뜻한 공기)에 난방 시스템을 켭니다. </li><li> 100 ㎎ / kg 케타민을 주사 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 복강 마취를 시작합니다. 참고 :이 복용 CD1 (ICR) 및 NU-Foxn1의 뉴 8 주령의 수컷 마우스에 대해 테스트되었습니다. 다른 변종은 별도의 실험에서 최적화되어야한다 약간 다른 복용을 필요로 할 수도있다. 이 용량에 마취 마우스를 유지합니다시합 45 분. 주 : 동물이 발 핀치에 아무런 반응을 보이지 않고있는 경우 마취의 깊이는 일반적으로 충분하다. </li><li> 마취 후, 동물 크래들에 동물을 배치하고 MRI 동안 움직임을 방지하기 위해 고정시킨다. 필요한 경우, 다음 동물에 대한 외부 참조를 배치합니다. 참조 및 ROI (분사 셀의 예상 위치)은 모두 코일의 중심에 있어야한다. 동물은 주사하는 동안 생리 학적 모니터링을위한 온도와 호흡 조절에 연결해야합니다. </li><li> 긴 영상 세션 동안 건조 방지하기 위해 무균 눈 연고와 마우스의 눈을 감아 라. </li><li> 촬영 시간이 40 분을 초과하는 경우에는 동물이 일어날 수 있습니다 전에, 추가 케타민 / 자일 라진 주사에 대한 추가 카테터를 준비합니다. 케타민 (ketamine)과 자일 라진의 작업 솔루션과 위치 두 개의 피하 카테터. 마우스에게 처음 40 분 후 마취제의 추가 2.5 MG 매 20 분을 제공하는이 카테터를 사용하여. 필요한 경우, 상기 초기 주입 후, 카테터를 통해 추가로 0.5 밀리그램 자일 라진의 주사에 의해 100 분 마취을 연장. 모든 경우에, 실험 시간이 가능한 단말기 마취를 제외하고 3 시간을 초과하지 않아야합니다. </li><li> 마우스가 첫 번째 주사 후 직접 따뜻하게하고 37 ° C의 체온 유지되어 있는지 확인합니다. 이 프로토콜을 사용하여, &lt;80 %의 혈액 산소는 대기의 공기를 호흡​​에서 검출되었다. , 하강 혈액 산소화에서 부작용을 방지 산소 100 % (0.3 L / 분)을 사용. 체온과 호흡이 전체 실험을하는 동안과 동물의 전체 복구 할 때까지 제어 할 수 있어야합니다. 케타민 / 자일 라진에서 자발적 호흡 속도 (200-250/min) 매우 높은합니다. 호흡 패턴보다는 호흡 속도의 불규칙, 높은 복용량이 마취의 적합한 상태를 유지하는 것이 필요하다는 것을 나타낼 수 있습니다. 마우스가 afte 20 ~ 30 분 이내에 자연적으로 보게 될 것이다R 마취의 마지막 복용량. </li></ol> 참고 : 셀 추적의 경우,이 두 번 이상 같은 동물의 이미지가 필요합니다. 그 경우, 촬상 세션 학회 시스템 및 동물 용 지침에서 마취의 정리에 필요한 시간을 고려하여 스케줄한다. 6. 영상 1 H 조정 및 이미징 <ol><li> 투자 수익 (ROI)은 다른 슬라이스 방향과 낮은 해상도, 해부학 적 검사 (지역화)를 사용하여 등각에 있도록 스캐너 내부에 동물을 배치합니다. </li><li> 예를 들어, 코일 내부의 전체 볼륨에 글로벌 심 1 시간에 정규 shimming 프로토콜을 사용합니다. </li><li> 공급 업체에서 제공하는 조정 스캔을 사용하여, 미트 90 ° RF 펄스 1 밀리 초는 dB로 측정 송신기 전력 즉, 기준 펄스 이득 (RG)을 조정합니다. </li></ol> 참고 :이 조정 것RF 코일의 종류에 따라 다양하며, 19 F 주파수의 신호가 직접 조정을 위해 일반적으로 너무 낮기 때문에 19 F MRI 필수적이다. 결과적으로, RG의 추정은 1 H 신호에 대한 측정으로부터 만들어 져야한다. 표면 코일 RF 송신을 위해, 1 H의 RG는 동질 B 한 프로파일 볼륨 강대에 대하여, 그 부분을 통해 코일에 평행 한 평면으로 조정되어야 조절 실 설정은 덜 중요하다. <ol start="4"><li> 1 H 19 F RF 전송이 모두 동일 (단일 또는 이중 조정) RF 코일로 수행되는 경우에만 19 F 참조 펄스 게인 조정의 다음과 같은 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 이러한 촬상 셋업, 1 H에 코일 프로파일 (B 1 송신 필드) 고정 RG가 적용된 19 F 코일 프로파일에 비례해야, 즉 B 1,1 H = C * B 1,19 F 소품과 함께ortionality 일정 C. <ol><li> 그 코일 프로파일 특정 설정을위한 비례 확인하려면, 1 H와 19 F 플립 각도의지도를 취득 높은 (1:1 V 물에 19 F, 예를 들어, TFA를 농축 튜브 (B 1 보정에 다음 섹션 참조) / V) (그림 3) 사전에) 동일한 필드 -보기 (영상 범위를 사용하여. </li><li> 같은 RG를 사용하여, 두지도는 글로벌 인자 C.를 제외하고 동일한 지 확인 </li><li> 1 H RG가 결정되면,이 번호를주지. </li></ol></li><li> 수행 기존의 1 H MRI는 19 F 영상에 대한 해부학 적 기준으로 검사합니다. 세포 마커의 19 F 주파수에 튜닝 시스템과 19 F MR 스캔을 실시한다. 이상적으로 19 F MRI 스캔 것 같은 시야와 1 H MRI로 슬라이스 선택, 일반적으로 낮은 해상도 있지만.에게 동물은 즉시 이마 기로서 부활 할 수 있습니다NG가 완료됩니다. 화상 처리는 오프라인에서 수행 될 수있다. </li><li> 관계 dB 19F = dB 1H를 통해 19 F RG를 결정 -20 * 10 (C)를 ​​기록합니다. 별도의 시험 관내 실험에서 19 F 에이전트 주파수를 추정하고있다. </li></ol> 주 : 생체 내에서, 정확한 주파수가 다른 shimming 조건에 의한 실험을 실험과 약간 다를 수 있습니다. 가능하면 정확한 주파수 따라서 19 F MRS하여 각 실험에서 결정되어야 케미컬 시프트 아티팩트를 방지 할 수있다. 매우 낮은 19 F 신호에 대한 일반적인 검사는 글로벌 (펄스 취득) 분광법 (TR = 200 밀리 초, NEX = 3000, TA = 10 분, BW = 50 kHz에서) 일 것입니다. NEX 따라서 TA는, 극적으로 높은 19 F 신호에 대해 감소 될 수있다. 19 F 에이전트 주파수는 푸리에 변환 및 위상 보정 후의 스펙트럼으로부터 결정된다. NEX는 음원 정보의 수를 의미, TA는 획득 시간과 BW는 있습니다대역폭을 제공합니다. 참고 : 11.7T/16 cm 전용 동물 스캐너에 일반적인 이미지 매개 변수 (9)가있다 : 해부학 1 H 이미징 터보 스핀 에코 (TSE) 순서 TR / 효과적인 에코 시간 (TE의 EFF)과을 사용하여 스캔 = 2,200 msec/42.8 밀리 초, 여기에 8 에코, NEX는 = 2, 10 년 연속 1 mm 두께의 조각, FOV = 1.92 X 1.92 cm 2, 128 x 128의 행렬, 즉 150 X 150 X 1,000 μm의 3, TA = 1 분, BW = 50의 해상도 kHz와 선형 위상 인코딩 방식. 19 F 이미지는 동일한 순서와 일치하는 형상으로 획득하지만, 한 낮은 평면 해상도와 낮은 BW에 (NEX = 256, 48 x 48 매트릭스, 즉 400 X 400 X 1000의 해상도 μm의 3, TA = 57 분, BW = 10 kHz에서). <ol start="7"><li> B 1 보정 신호 의존하기 때문에 불균일 한 프로파일 B, 예 표면 코일 RF 코일을 이용하여, 19 F 데이터의 정량화를 방해 할뿐만 아니라 19 F 농도에뿐만 아니라 코일의 거리에. 소급 올바른 19 F 데이터에 순서대로 1 H 채널에 B 1지도를 획득. 이것은 1 H 및 19 F 코일 프로필 비례 계수 C를 제외한 동일하다는 것을 필요로하고, 충분한 1 H 배경 신호는 19 F.의 영역에 제공된다 19 F 스핀 에코 시퀀스의 보정의 예 프로토콜은 1 H 19 F 모두에 단일 조정 송 / 수신 표면 코일 튜너 블을 사용하여 제시하고 비례 B 1 프로파일 (13)에있다. <ol><li> 두 플립 각도 방법 (14)과 1 H 플립 각도의지도를 획득. 바로 아래 90 °의 추정 플립 각도와 기울기 에코 스캔 매우 긴 TR (&gt; 3 회 1 HT 1) 취득. 코일에 닫습니다. RG와 두 번째 그라데이션 에코 검사를 취득 = dB 1H -6, 즉 두 번 플립첫 번째 스캔의 각도. </li><li> 1 H 플립 각도를 계산, α, 복셀, 제 1 및 제 2 구배 에코 스캔 신호 강도 (SI)를 통해 (x, y, z)에서 : α (x, y, z) = 아르 코스 (SI GE, 1 ( x, y, z) / 2SI GE, 2 (x, y, z)) 14. 19 F 플립 각도로 인해 비례 B 1 프로파일 (요소 1 / C 제외)과 동일하다. 상호 (15), 신호 수신시 스핀 에코 시퀀스 (여기 플립 각도 α, 플립 각도 2α 다시 초점을 맞 춥니 다) 19 F 신호 강도의 감쇠 패러데이의 원리에 따라 수신 (X, Y, Z) ~ α (X, Y, AT &amp; T입니다 , z). 때문에 불완전 여기에 감쇠는 텍사스 (X, Y, Z) ~ 죄 3 (α (X, Y, Z)) 16 AT &amp; T이다. 전체 감쇠는 AT &amp; T는 = attRx * attTx = α의 *의 죄 3 (α) / 90 °로 기록됩니다. 완벽 90 ° / 180 ° 여자 / 재 집속 플립 각도의 경우에는 1로 표준화되어 있습니다. B (1) 수정19 F 화상 신호 강도 SI 19F, 19F CORR는 SI, CORR (x, y, z) = SI 19F (x, y, z) / ATT (x, y, z)을 통해 계산된다. </li><li> 다른 실험으로부터의 신호 강도와 비교 시야에서 정의한 19 F 농도 기준 관을 배치하고, 상기 기준의 평균 신호 SI 19F, corr를 정상화하기 위해. </li></ol></li></ol> 주의 : 다른 한 HB 1 / 플립 각도 매핑 방법이 사용될 수 있고, 다른 19 F 펄스 시퀀스 TX, 19F ATT의 수정을 요구한다. B1 보정 방식의 모든 종류의 세포 정량화 절차에서 추가 오류를 소개합니다. 정확한 셀 정량화 대전제이면 균질 B1 프로파일 RF 코​​일은 프로토콜의이 부분을 회피하는데 사용될 수있다. 7. 이미지 처리 <ol><li> 1 H 19 F 오버레이 이미지 만들기 <ol><li> 이미지 데이터를 내보내기최종 1 H 및 스캐너에서 19 F의 크기의 이미지. </li><li> 같은 ImageJ에 (프리웨어, NIH)과 같은 이미지 처리 프로그램에서 파일을 엽니 다. </li><li> 모든 이미지에 동일한 조정을 유지 필요 (자르기, 밝기, 대비)로 이미지 조정을 수행하십시오. 19 F 이미지는 일반적으로 해당하는 1 H 이미지에 맞게 높은 해상도로 업 스케일 할 필요가있을 것이다. </li><li> (이미지 J의 &quot;이미지&quot;메뉴에서 다른 룩업 테이블을 선택) 한 다음 신호를 집중하기 위해 해당 1 H 이미지에 오버레이 거짓 색상의 19 F의 이미지를 렌더링합니다. </li></ol></li><li> 19 F 정량화 <ol><li> 관련 세포 및 표시를 참조하여 19 F 이미지 (크기의 이미지)을 선택합니다. </li><li> 같은 이미지 J 등의 프로그램에서 관련 세포, 대상 (노이즈) 외부 참조 및 영역에의 ROI를 그립니다. </li><li> 명령이 분석 사용다음 측정 (또는 단순히 Ctrl 키 + M)이 지역 내에서의 평균 픽셀 강도를 계산하고, 자신의 영역입니다. S (세포) 세포를 통해 투자 수익 (ROI)의 평균 픽셀 강도를 참조하자. 전체 신호를 계산하는 볼륨 (= 면적 X 슬라이스 두께)에 의해 그것을 곱합니다. </li><li> SNR을 계산, 수식 SNR을 사용하여 예를 들어 = 0.65 X의 S (셀) / σ 여기서, σ (일반적으로 배경 공기에서) 어떤 화학 변화 이슈의 무료 샘플 외부의 투자 수익 (ROI)의 픽셀 강도의 표준 편차 17. SNR이 5 미만인 경우, 노이즈로 인한 신호에 대한 보정이 필요할 수 있고, 그 밖에 11 10 바와 같이 수행 될 수있다. </li><li> 그렇지 않으면, 레퍼런스 19 F의 농도에 의한 슬라이스 두께 (용적은 계산)에 의해 슬라이스의 참조 영역을 곱하여 기준 이상의 ROI에서의 신호에 대해 책임 19 F의 총량을 계산공지 균일하다고 가정된다. </li><li> 셀 (19) F의 양을 계산하는 기준 위에 전체 신호로 나누어 세포 이상의 ROI에서 전체 신호에 의해 그 값을 곱한다. </li><li> 섹션 2에서 계산 된 19 F / 셀에 대한 값으로 해당 번호를 분할하여 세포의 수를 계산한다. </li></ol></li></ol>

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<li>Firbank, M. J., Coulthard, A., Harrison, R. M., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+two+methods+for+measuring+the+signal+to+noise+ratio+on+MR+images%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">A comparison of two methods for measuring the signal to noise ratio on MR images.</a> Phys. Med. Biol. 44, 261-264 (1999).</li>
<li>de Chickera, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelling+dendritic+cells+with+SPIO+has+implications+for+their+subsequent+in+vivo+migration+as+assessed+with+cellular+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Labelling dendritic cells with SPIO has implications for their subsequent in vivo migration as assessed with cellular MRI.</a> Contrast Media Mol. Imaging. 6, 314-327 (2011).</li>
</ol>

저자는 공개 할 이익의 충돌이 없습니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 생체 내 19 F MRI 세포 추적을위한 일반적인 절차를 설명합니다. 기술 공동 배양 방법에도 불구하고, 19 F 에이전트와 세포를 라벨에 대한 몇 가지 다른 프로토콜이 있습니다. 그러나, 공동 배양 가장 자주 사용되며 상기 형질 제 6 첨가하여 예를 최적화 할 수있다. 실제 셀 라벨링 프로토콜은 세포 유형에 의존 할 것이다. 만 키 표시 단계는 여기에서 프로토콜에 설명되어 있습니다. 일반적으로, 레이블은 몇 시간에서 몇 일까지 선택된 시간을 준비하고 세포에 추가됩니다. 마지막으로, 세포를 화상 데이터로부터 정량화 3을 실시 할 것, 특히 라벨의 과잉을 제거하기 위하여주의 깊게 세정되어야한다. 19 F 에이전트 형광 태그, 외부 (아닌지에 바인딩) 라벨의 존재를 포함하는 경우 세포는 현미경을 사용하여 검출 될 수있다. 표지 후에, 세포를 연구 할 필요가있다(트리 판 블루 ...

생체 내 세포 추적에 세포 치료제 1의 최적화 및 모니터링을 위해 필수적입니다. 그것의 비 침습적 인 특성으로, 영상은 생체 내에서 세포를 모니터링하는 훌륭한 기회를 제공합니다. 자기 공명 영상 (MRI)은 이온화 방사선 독립적이며 뛰어난 이미지 해상도 및 고유의 부드러운 조직의 대비를 할 수 있습니다. MRI 기반 세포 추적은 이미 흑색 종 환자 2 수지상 세포를 수행하기 위해 임상 적으로 사용되었습니다. 기존의 임상 MRI는 조직에서 모바일 물에 존재하는 1 H 핵에 실시한다. 그런 13 C, 19 F 및 23 나 다른 활성 핵에서 MRI를 수행하는 것도 가능하다. 그러나, 19 F MRI는 1 H. 이후 가장 높은 감도를 제공으로 생체 내 세포 추적에 성공적으로 적용되었습니다 조직에서 MRI-19 F 검출 내생의 부재에 대해 높은 신호 선택성 허용외인성 19 F 조영제의 검출 및 허용 화상 데이터로부터 직접적으로 불소 농도의 정량. 19 F MRI에 대한 자세한 설명은 3-5를 참조하십시오. 19 F MRI와 핵심 문제는 몇 개의 라벨이 복합 제제 6 향한 트렌드와 함께, 개발되었지만, 적합한 19 F 셀 라벨을 개발하고 최적화 할 필요가있다. 우리가 여기에서 설명하는 프로토콜은 10, 11를 추적하는 생체 정량적 19 F MRI 기반의 셀을 설명하는 첫 번째 기사를 포함하여 우리의 그룹 7-9으로 연구를 기반으로합니다. 19 F MRI를 사용하여 세포 추적의 일반적인 절차는 그림 1에 요약되어있다. 우리는 사용자 정의 - 만든 퍼플 루오로 카본 조영제 8을 사용하여 수지상 세포의 라벨 및 이미징을위한 일반적인 프로토콜을 설명합니다. 이미징 프로토콜은 세포 유형, 상표 및 동물 모델 다른 일반적으로 적용 할 수있다.여기에 설명 된 셀 타입 및 동물 모델은 예를 들어 이동해야하고, 따라서 우리는 세포 격리 및 라벨에 관한 세부 정보를 제공 할뿐만 아니라 촬상 프로토콜에 집중하지 않는다. 개조는 각각의 라벨, 세포 분류, 동물 모델, 촬상 설정에 필요한 것, 및 이들 문헌에서 찾을 수 또는 연구자에 의해 최적화 될 필요가있다. 일반적인 수정은 토론에 포함되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MFCD00131855</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>케타민(Ketavet)</td><td>Pfizer</td><td>778-551</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine(Rompun)</td><td>Bayer</td><td>QN05 cm92</td><td></td></tr><tr><td>Ophtosan </td><td>Produlab Pharma</td><td>2702</td><td>눈 연고</td></tr><tr><td colspan="4">재료 이름 </td></tr><tr><td>MRI 스캐너</td><td>Bruker Biospec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR 분광계</td><td>Bruker Biospec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

세포 추적을위한 생체 19 f mri에서

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

생체 내에서 19 F MRI는 전리 방사선의 사용없이 정량적 셀 추적을 허용한다. 이는 인간에게 적용될 수있다 비침 기술이다. 여기, 우리는 셀 라벨, 영상 및 이미지 처리를 위해 일반적으로 프로토콜을 설명합니다. 여기에서 우리는 뮤린 면역 세포의 추적을위한 전형적인 마우스 모델에 초점 비록 기술은, 세포 유형 및 다양한 동물 모델에 적용 가능하다. 이러한 모든 모델에 관련된으로 셀 라벨의 가장 중요한 문제는, 설명합니다. 자세한 내용은 MRI 시스템과 각각의 설정에 따라 달라질 수 있지만, 마찬가지로 키 이미지 매개 변수가 나열되어 있습니다. 마지막으로, 우리는 정량화를위한​​ 이미지 처리 프로토콜을 포함한다. 이 변형을하고, 프로토콜의 다른 부분은 토론 섹션에서 평가됩니다. 여기에 설명 된 세부 절차에 기초하여, 사용자는 각각의 특정 세포 유형, 세포 라벨, 동물 모델 및 촬상 셋업 프로토콜을 적용해야한다. 참고 Protocol도만큼 임상 제한이 충족 될 때, 사람의 사용을 위해 적응 될 수있다.

여기에서 우리는 배수 림프절에 원점 복귀 19 F-라벨 세포의 이동과 관련된 프로토콜에 대한 일반적인 결과를 보여줍니다. 그림 2는 TFA 참조를 사용하여 10 6 표지 세포의 19 F NMR 스펙트럼을 보여줍니다. 프로토콜 (도 3)에서 설명한 촬상 설정 행했다. 생체 내 이미징을 위해, 우리는 쥐의 다리 사이에 배치 된 셀에 대해 사용 된 동일한 라벨의 밀봉 된 실린더로 구성된 기준을 사용했다. 대표적인 처리 된 이미지는도 4에 도시된다. 7.2 절에 설명 된 프로토콜을 적용하여, 우리는 약의 세포 수를 계산 하였다. 1.2 × 10 6 원시 19 F의 크기의 이미지를 기반으로. <img alt="그림 1...

우리는 생체 표지 세포와 마우스 모델에서 MRI를 사용하여 생체 내 세포 추적을위한 일반적인 프로토콜을 설명합니다. 셀 라벨, 이미지 수집 처리 및 정량화를위한​​ 일반적인 프로토콜이 포함되어 있습니다.

세포 추적을위한 생체 19 F MRI에서

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

이 절차의 전반적인 목표는 19 FMRI를 사용하여 생체 내에서 19 F 표지된 세포의 수를 이미지화하고 정량화하는 것입니다. 이는 임상 또는 전임상 환경에서 수행할 수 있습니다. 이는 먼저 적절한 19 F 제제로 세포를 라벨링함으로써 달성됩니다.이것은 대부분 생체 외에서 수행됩니다. 두 번째 단계는 셀당 19 F 함량을 정량화하는 것이며, 이는 알려진 참조와 함께 19 F 및 MR을 사용하여 수행할 수 있습니다. 셀당 19F 함량은 실험 중에 일정하게 유지되는 것으로 간주되며, 그렇지 않으면 보정 계수를 계산해야 합니다.다음으로, 전달된 표지된 세포의 국소화를 위해 1개의 H 및 19 FMRI를 사용하여 피험자를 in vivo에서 이미지화합니다. 알려진 참조 및 적절한 이미징 매개변수는 이미지 데이터에서 정량화하는 데 필수적입니다. 마지막 단계는 이미지 데이터를 처리하여 셀 수를 계산하는 것입니다.가능한 경우 생체 외 조직학 또는 기타 기술을 사용하여 데이터를 확증할 수 있습니다. 궁극적으로, 생체 내 세포 추적을 위한 19 FMRI는 텍스트에 설명된 특정 가정을 감안할 때 해당 기간 동안 전달된 세포의 위치 및 수 측면에서 세포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 초상자성 세포 라벨을 사용하는 HMRI와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 교란스러운 배경 신호가 없고 이미지 데이터에서 직접 세포 수를 결정할 수 있다는 것입니다.이 방법은 세포가 어디에 있는지, 다양한 시점에 얼마나 많은 세포가 존재하는지와 같은 세포 치료제 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜을 시작하려면 먼저 2밀리리터의 배지에서 100만 세포당 4밀리그램의 농도로 미성숙 수지상 세포에 19F 라벨을 추가합니다. 그런 다음 부드럽게 휘젓습니다.다음으로, 수지상 세포를 라벨로 3일 동안 배양한 후 성숙시키고 수확합니다. 그런 다음 세포를 수집하고 최소 3회 세척하여 초과 라벨을 제거합니다. PBS 계수에서 생성된 세포는 주입 또는 추가 테스트를 위해 소량의 PBS에 재현탁됩니다.여기에 설명된 프로토콜은 이러한 특정 수지상 세포 및 표지와 관련이 있습니다. 따라서 다른 세포 유형에 대한 프로토콜은 문헌에서 찾거나 연구자가 최적화해야 합니다. 알려진 수의 라벨링된 세포를 NMR 튜브에 넣습니다.그런 다음 10 마이크로 리터의 5 % tri Fluor 또는 산성 산 또는 TFA를 첨가하십시오. TFA의 공진 주파수가 라벨과의 중복으로 인해 적합하지 않은 경우 대체 용해성 화합물을 사용하십시오. NMR 분광계에 샘플을 넣고 불소 19 스펙트럼을 얻습니다.그런 다음 기준과 샘플의 피크 또는 샘플의 주 피크 아래의 상대 면적을 계산한 다음 샘플의 셀당 평균 불소 수를 계산합니다. 이 전체 프로세스는 통계적 유의성에 도달하기 위해 평균적으로 반복되어야 합니다. 이는 MRI 스캐너에서 직접 분광학을 사용하여 수행할 수도 있습니다.또한 이 절차는 많은 수의 세포에 대한 평균 불소 19 부하만 나타내며 세포 간의 변동성은 나타내지 않습니다. 세포 흡수의 균일성을 확인하려면 19 F 제제와 함께 형광 성분이 존재해야 합니다. 여기서 시나리오 3만이 세포의 균질한 표지를 보여주지만, 이는 계산에서 항상 가정되지만, 완전히 마취된 마우스를 요람에 놓고 스캔 중 움직임을 방지하기 위해 움직이지 못하게 하여 이미징을 위해 설정된 현미경 검사와 같은 보완 기술을 사용하여 확인할 수 있습니다.또한 스캔 중 생리학적 모니터링을 위해 온도 및 호흡 제어를 연결합니다. 필요한 경우 동물 옆에 외부 참조를 배치하고 참조와 관심 영역이 모두 코일 중앙에 있어야 합니다. 19 F 이미징을 위한 해부학적 참조로 기존의 양성자 MRI 스캔으로 수집을 시작합니다.그런 다음 시스템을 세포 마커의 19F 주파수로 조정하고 19 FMRI 스캔을 수행합니다. 이상적으로 19 FMRI 스캔은 기존 MRI와 동일한 시야와 슬라이스 선택을 갖지만 해상도는 더 낮을 수 있습니다. 다음으로, 여기에 표시된 공식을 사용하여 19F 기준 펄스 이득을 결정하고 19 FNMR 스펙트럼을 획득하여 19F 주파수를 결정합니다.무선 주파수 코일 종속 요인 C를 별도의 시험관 내 실험에서 추정합니다. 표면 코일과 같은 균일한 B 단일 프로파일이 있는 무선 주파수 코일을 사용하면 19F 데이터의 정량화를 방해할 수 있습니다. 신호는 19F 농도뿐만 아니라 코일과의 거리에 따라 달라지기 때문입니다.따라서 19F 데이터를 소급하여 수정하기 위해 1H 채널에서 B one map을 획득합니다. 이를 위해서는 비례 계수 C를 제외하고 하나의 H 및 19 F 코일 프로파일이 동일하고 19 F 영역에서 충분한 하나의 H 백그라운드 신호가 제공되어야 합니다. 19F 데이터를 수정하려면 먼저 두 개의 플립 각도 방법을 사용하여 하나의 H 플립 각도 맵을 획득합니다.매우 긴 TR이 3배 이상인 그래디언트 에코 스캔을 사용하여 코일에 가까운 90도 미만의 예상 플립 각도를 가진 1개의 HT로 스캔합니다. 그런 다음 첫 번째 스캔의 플립 각도의 두 배로 두 번째 그라디언트 에코 스캔을 획득합니다. 첫 번째 및 두 번째 그래디언트 ECHO 스캔의 신호 및 감지를 통해 vle X, Y, Z에서 1H 플립 각도 알파를 계산합니다.19F 플립 각도는 비례 B 1로 인한 요인 1 C를 제외하고는 동일하며, 여기, 플립 각도, 알파 재초점, 플립 각도, 신호 수신 중 알파 2 알파로 인한 스핀 에코 시퀀스에서 19F 신호 강도의 감쇠를 프로파일합니다. 불완전 여기(imperfect excitation)로 인한 감쇠가 여기에서 볼 수 있습니다. 그런 다음 전체 감쇠를 계산할 수 있습니다.완벽한 90도, 180도 여기 재초점 플립 각도의 경우 1로 정규화되며, B는 19F 이미지 신호 강도 SI 19F 보정의 경우 1로 정규화되며, 이 공식을 통해 1개의 H 및 19F 오버레이 이미지를 생성합니다. 이미지 데이터를 내보내고 이미지 J와 같은 이미지 처리 프로그램에서 파일을 열고 필요에 따라 이미지 조정을 적용하고 모든 이미지에 대해 조정을 동일하게 유지해야 합니다. 그런 다음 19개의 F 이미지를 가색으로 렌더링한 다음 해당 H 이미지에 오버레이합니다.신호의 위치를 파악하려면 관련 셀이 있는 19F 크기 이미지를 선택하고 샘플에 표시된 대로 노이즈 값에 대해 관련 셀, 참조 및 피사체 외부 영역에 대한 ROI를 표시합니다. 여기서는 명확성을 위해 one H 해부학적 스캔이 표시됩니다. 그런 다음 간단한 비례성과 셀당 19F의 값을 사용하여 ROI의 셀 수를 추정할 수 있습니다.이 이미지는 19F 표지된 세포를 배출 림프절로 귀환시키는 것과 관련된 프로토콜의 일반적인 결과에서 가져온 것입니다. 여기에서는 TFA 참조를 사용하여 100만 개의 라벨링된 세포로 구성된 19개의 FNMR 스펙트럼을 볼 수 있으며, 여기에서는 생체 내 이미징을 위해 처리된 대표적인 이미지를 볼 수 있습니다. 세포에 사용된 것과 동일한 라벨의 밀봉된 용기로 구성된 참조를 마우스의 발 사이에 배치했습니다.설명된 프로토콜을 적용하여 원시 19F 크기 이미지를 기반으로 약 120만 개의 세포 수를 계산했습니다. 19 F 이미지는 그레이 스케일, 해부학적 양성자 이미지 위에 가색으로 겹쳐져 있습니다. 새로운 실험을 설정할 때 불소를 검증하는 것이 중요합니다.MRI 결과는 조직학, 광학 이미징 또는 기타 방법을 사용합니다. 예를 들어, 불소 표지는 세포가 죽을 때 조직에 남아 거짓 양성 신호로 이어질 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

새로운 줄기 세포 요법의 평가는 생체내에 주입된 세포를 추적 비 invasively하는 것이 중요합니다. 이 동영상은 생체내의 후속 MR 영상에 대한 생체내의 철 산화물 기반의 콘트라스트 에이전트와 인간 mesenchymal와 배아 줄기 세포를 레이블하는 방법을 보여줍니다.

이런 산화물로 hESCs과 hMSCs을 라벨링하는 MR 영상과 생체내 추적 비침습에 대한 Nanoparticles

이 작품은 비침 투 작은 동물 MRI 및 MRS의 기본 절차를...

비침 투 VIVO에서 스몰 애니멀 MRI 및 MRS : 기본 실험 절차

MRI를 사용하여 세포 추적 지난 몇 년 동안 괄목할만한 주목을 받고있다. 이 프로토콜은 불소와 수지상 세포의 라벨 설명...

사용 모니터링 수지상 세포 이동<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H 자기 공명 영상

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs) 및 골수 틈새 시장 사이의 상호 작용의 본질은 제대로 이해된다. 맞춤형 하드웨어 변형 및 다단계 획득 프로토콜은 생체 화상 골수 영역 내에 홈 표지 HSPCs 추적 상호 작용과 움직임 이광자 및 공 초점 현미경의 사용을 허용한다.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

단핵구는 선천성 면역의 핵심 조절자이며 말초 단핵 식세포 시스템의 재생과 염증의 경우에 중요한 역할을 합니다. 이 원고는 단핵구 동원 메커니즘을 연구하기 위해 마우스 칼바리아 골수를 실시간으로 이미징하는 절차를 설명합니다.

마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

뒤에 소프트웨어 기반 후 처리 시간 경과 비디오 현미경에 의해 신경 인구를 모니터링 하는 강력한 프로토콜 설명 되어 있습니다. 이 메서드는 선택 된 인구 라이브 이미징 실험 동안에 생물 학적 이벤트를 식별 하는 강력한 도구를 나타냅니다.

영상 모니터 세포 생물학과 여러 신경 인구의 계보 진행을 추적 하는 단일 셀 다음 라이브

우리는 전 임상 생체 내에서 암 전이의 추적에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 그것은 비 침략 적 [18F] tetrafluoroborate-애완 동물, 그리고 유선형 비보 전 확인에 대 한 형광 단백질에 의해 감지 나트륨 요오드 화물 symporter 결합 방사성 핵 종 형광 기자를 기반으로 합니다. 방법은 전 임상 vivo에서 세포 종양 생물학 넘어 추적에 적용 합니다.

방사성 핵 종 형광 취재 원 유전자 설치류 종양 모델에서 종양의 진행을 추적 하기 위해 이미징

종양 세포의 Orthotopic intracranial 주사 공부 뇌 종양 생물학, 진행, 진화, 그리고 치료 응답을 암 연구에 사용 되었습니다. 여기 선물이 형광 분자의 단층 촬영 종양 xenografts 실시간 intravital 이미징 및 종양의 정량화 임상 세포종 모델에서 대량 제공.

Vivo에서 이미징 세포종 Xenografts의 형광 분자 단층 촬영

형태학적 변화는 활성화 다음 면역 반응 섬유 아세포 세포에서 발생하고 세포 모집에 변경을 촉진. 유전자 조작섬유아세포 특이적 단백질 1(FSP1)-cre와 함께 2광자 이미징을 활용; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) 마우스 라인과 녹색 형광 태그 lipopolysaccharide-FITC, 우리는 진피 섬유아세포와 생체 내 형태학적 변화에 있는 lipopolysaccharide의 고도로 특정 한 섭취를 설명할 수 있습니다.

피부에 있는 유전으로 표를 붙인 기자 세포의 Vivo 2 색 2-광자 화상 진찰에서

여기에 제시된 비침습적 중간엽 줄기 세포(MSC) 전달 및 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 추적을 위한 프로토콜이 제시된다. 초파라마그네틱 산화물 나노입자는 실시간 MRI를 이용한 비강 내 전달 후 생체 내 추적 및 비침습적 MSC 라벨링을 위한 자기 공명 영상(MRI) 프로브로 사용된다.

외상성 뇌 손상 뮤린 모델에서 비강 내 전달 후 MRI를 사용하여 수퍼 파라마그네틱 철 산화물 표지 메젠키말 줄기 세포 추적

세포 요법은 전구 세포를 사용하여 손상된 조직을 복구하고 폐 기능을 개선함으로써 폐 섬유증에 대한 유망한 중재를 제공합니다. 이미징이 세포 통합을 추적하는 데 중추적인 역할을 하기 때문에 여기에서는 마우스 모델에서 폐 섬유증에 대한 세포 요법의 자기 입자 이미징 유도 생체 내 추적에 대해 설명합니다.

자기 입자 이미징을 사용한 폐 섬유증에 대한 이식된 원위 폐 상피 전구 세포의 이미지 유도 생체 내 추적

학습하세요 생체 내 19F MRI를 이용한 세포 추적 방법으로, 마우스 모델에서 ex vivo 라벨링된 세포를 비침습적으로 이미징하고 정량화하는 기술입니다. 이 프로토콜은 임상 및 전임상 연구에 활용됩니다.

세포 추적을위한 생체 ¹⁹ F MRI에서

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