Name: 시험 관내 분석에서 HIV 특정 CD4 T 세포의 이펙터 기능에 면역 경로의 영향을 평가하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 학습하세요 시험 관내 분석을 통해 HIV 특이 CD4 T 세포의 사이토카인 분비와 면역 조절 경로의 영향을 평가하는 방법을. 차단 항체를 이용하여 T 세포 이펙터 기능을 복원하는 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 항 PD-L1 차단 항체를 제공 고든 프리먼 감사합니다. 우리는 매사 추세 츠 종합 병원이 프로젝트에 자신의 귀중한 역할에 대한 모든 연구 참가자의 임상 및 실험실 직원을 감사드립니다. 국립 심장 폐 건강의 국립 연구소의 혈액 연구소 (RO1 HL-092565, DEK)이 연구는 알레르기의 국립 연구소와 국립 보건원 (DEK PO1 AI-080192)의 전염병에 의해 지원되었다. DEK는 퀘벡 건강 연구 기금의 연구 학술 경력 수상 (FR​​QS)에 의해 지원된다. FP는 연구와 하버드 글로벌 건강 연구소 (HGHI)에 매사 추세 츠 종합 병원 집행위원회의 화목 교부금에 의해 지원됩니다.

1. 피콜 분리를 통해 고갈 된 PBMC의 분리 <ol><li> 전체 혈액의 50 μL / ㎖에서 인간 CD8 + 공핍 칵테일을 첨가하여 CD8 + T 세포를 고갈. </li><li> 잘 섞어 실온 (18-25 ℃)에서 20 분 동안 품어. </li><li> 배양 후, (칼슘 + 마그네슘 또는 2 +없이 행크의 균형 소금 솔루션) HBSS로 전체 혈액을 혼합 Histopaque을 통해 계층. 30 분 (노 브레이크, 느린 가속) 340 RCF에 스핀. </li><li> PBMC를 수집하고 새로운 50 ML 원뿔로 전송할 수 있습니다. 340 RCF에서 10 분 동안 회전시켜 50 IU 페니실린, 50 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 2 밀리미터 L-글루타민, 1 %의 HEPES와 보충 45 ML의 RPMI 1640 워시 2 배. </li></ol> 2. 항체 봉쇄 및 세포의 항원 특이적인 자극 <ol><li> 50 IU 페니실린, 50 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 2 밀리미터 L-글루타민, 1 % HEPES와 보충 10 % 인간 혈청이 포함 된 RPMI 1640 상태 당 2 × 6에서 재현 탁 세포,조건 당 500 μL를 차지한다. </li><li> FACS 튜브 당 세포 현탁액의 나누어지는 500 μL. </li><li> 조사 경로에 따라, PD-L1, 10 ㎍ / ml로 항체 및 / 또는 이소 컨트롤을 차단하는 IL-10Rα를 추가하고 37 ° C, 5 % CO 2에서 15 분 동안 품어. </li><li> 1 ㎍ / ㎖ / 펩타이드 최종 농도에서 HIV-1 개그 펩티드 풀과 세포를 자극한다. 또한 각각의 차단 상태에 대해 &quot;자극 없음&quot;컨트롤을 포함. 37 ° C, 48 시간 동안 5 % CO 2에서 배양한다. </li></ol> 3. 수집 및 상층의 분석 <ol><li> 48 시간 후, 340 RCF에서 7 분 동안 FACS 튜브를 스핀 다운. </li><li> 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 루미 넥스 비드 배열의 에펜 도르프 튜브에 2 × 225 ㎕의 상층 액을 수집합니다. </li><li> 0.05 % PBS-트윈 (Tween)의 최종 농도를 제공하기 위해 25 ㎕의 0.5 % PBS-트윈 (Tween)으로 수집 된 상청액에서 바이러스를 비활성화. </li><li> IMMED하지 스토어 수집 상층 액iately -80 ° C 냉동고에 사용됩니다. </li><li> 제조자의 프로토콜에 따라 밀리 포어 루미 넥스 키트를 사용하여 원하는 사이토 카인 농도를 측정한다. </li></ol> 4. 유동 세포 계측법을 통해 수집 및 세포의 표현형 분석 <ol><li> 상층 액을 수집 한 후, 3 ㎖ PBS로 세포를 씻어. 340 RCF에서 7 분 동안 세포를 스핀 과잉 세척을 가만히 따르다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 죽은 고칠 / 라이브 죽은 세포 얼룩 키트를 사용하여 생존을위한 얼룩. </li><li> 340 RCF에서 4 ℃에서 12 분 동안 PBS에 세포를 씻으십시오 100 ㎕의 PBS 1 % FBS에 재현 탁. </li><li> 의 FcR 시약과 혼합하는 소용돌이를 차단의 1.4 μl를 추가하여 단​​핵구 또는 다른 항원 제시 세포, 블록의 Fc 수용체 발현이 관찰합니다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 품어 </li><li> 표면 항체, 소용돌이를 추가하고 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 품어. </li><li> , PBS 1 % FBS로 세포를 씻어 초과 세척을 가만히 따르다, 200 ㎕의 4 % 파라 포름 알데히드를 추가합니다. 품다어둠 속에서 20 분 동안 실온에서. </li><li> 250 ㎕의 PBS 1 % FBS에서 PBS 1 % FBS,에 resuspend로 세포를 씻어 흐름 cytometer multilaser에 취득 (예 : BD LSRII 또는 Fortessa). </li></ol> 5. QRT-PCR을 통해 세포의 분석 <ol><li> 세포에 대한 유동 세포 계측법을 통해 분석되지 : 상층 액을 수집 한 후, 1 % 베타 - 머 캅토 에탄올을 포함하는 300 ㎕의 키아 버퍼 RLT의 세포를 Lyse. 프로토콜을 계속하지 않으면 세포는이 시점 후 -80 ° C에서 고정 할 수 있습니다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜을 다음 RNA 분리 키트를 사용하여 RNA를 분리합니다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜을 다음 cDNA 합성 키트를 사용하여 RNA로부터 cDNA를 합성. </li><li> SYBR 녹색 기술을 사용하여 정량 PCR을 수행합니다. </li><li> 10의 최종 농도가 물없는 클레아하는 프라이머를 추가로 하우스 키핑 유전자 (예 : IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH)을 포함하여 사용되는 각 프라이머 프라이머 믹스를 만들기μM. 얼음에 보관하십시오. </li><li> 물론 10.5 μL의 nuclease가없는 물, 12.5 μL의 SYBR 녹색, 접시 당 1 μL 프라이머 믹스를 추가하여 각각의 프라이머에 대한 마스터 믹스를 만듭니다. 얼음에 보관하십시오. </li><li> 사용되는 플레이트의 각 웰에 피펫 24 μL 마스터 믹스. </li><li> 템플릿에 따라 각도에 1 μL의 cDNA를 추가. </li><li> 800 RCF에서 3 분 동안 우물과 원심 분리 판을 모자. </li><li> QRT-PCR 기계, 예를 들어 스트라 타진 MX3005P 악기 판을 실행합니다. </li></ol> 6. 48 시간에 세포 내 사이토 카인 염색법에 대한 적응 Brefeldin와 모 넨신 이전의 세포 내 사이토 카인 염색법에 6 시간을 추가합니다. 모 넨신은 제조업체의 지시에 따라 첨가되는 동안 Brefeldin은 10 ㎍ / ㎖의 농도로 첨가된다. 편의상 Brefeldin은 5 ㎍ / ㎖의 농도로 염색하기 전에 12 시간을 추가 할 수있다. <ol><li> 표면의 얼룩 후,에 대한 PBS 1 % FBS와 얼룩 세포를 씻어이러한 IL-12, IFN-γ, 및 고정 / Permeabilization 솔루션 키트 및 프로토콜을 사용하여 TNF-α와 같은 사이토 카인 tracellular. </li><li> 250 ㎕의 PBS 1 % FBS에서 세포에 resuspend을 세척하고, (예를 들어, BD의 LSR II 또는 Fortessa) 유동 세포 multilaser에서 실행됩니다. </li></ol> 7. 셀 정렬에 대한 적응 <ol><li> 생존을위한 자극, 염색 후 16 시간은 제조 업체의 프로토콜에 따라 LIVE / DEAD 고칠 죽은 세포 얼룩 키트를 사용. 전체 절차를 수행하는 동안 얼음에 세포를 보관하십시오. </li><li> 340 RCF에서 4 ℃에서 12 분 동안 PBS로 세포를 씻어 100 ㎕의 PBS 1 % FBS에 재현 탁. </li><li> 혼합 표면 항체, 소용돌이를 추가하고 20 분 동안 어둠 속에서 얼음에 세포를 배양한다. </li><li> 340 RCF에서 4 ° C에서 PBS 1 % FBS와 세포를 세척하고 500 μL에 재현 탁은 10 % 소 태아 혈청을 함유하는 차가운 RPMI 1640 50 IU 페니실린, 50 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 2 밀리미터 L-글루타민, 1 %로 보충 HEPES. </li><li> 5 ㎖ 폴리스티렌을 사용하여 필터 세포셀 스트레이너 캡 르네 둥근 바닥 관. </li><li> 태아 혈청 50 IU 페니실린, 50 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 2 밀리미터 L-글루타민, 각 튜브에 1 % HEPES와 보충 10 %가 포함 된 200 μL의 RPMI 1640에 추가하여 정렬에 수집 튜브를 준비합니다. 정렬하는 동안 얼음에 모든 튜브를 유지합니다. </li><li> 라이브 악기 생물학적 위험 물질에 장착 된 시설에 위치 (예 : BD FACS 아리아 II)에 대한 관심의 세포 부분 집합을 정렬 할 수 있습니다. </li><li> 세포가 분류 한 후, 다시 시간이 원하는 양에 대한 보육 및 상층 액을 수집 / 루미 넥스 분석 및 세포 펠렛 수집 / PCR 분석을 수행 장소 세포. </li></ol>

<ol><li>Zajac, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+immune+evasion+due+to+persistence+of+activated+T+cells+without+effector+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function.</a> J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).</li>
<li>Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+persistence+alters+CD8+T-cell+immunodominance+and+tissue+distribution+and+results+in+distinct+stages+of+functional+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment.</a> J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).</li>
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<li>Porichis, F., Kaufmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+PD-1+in+HIV+pathogenesis+and+as+target+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+HIV%2FAIDS+Rep%22%5BJournal%5D)">Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).</li>
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<li>Zhang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+up-regulation+is+correlated+with+HIV-specific+memory+CD8%2B+T-cell+exhaustion+in+typical+progressors+but+not+in+long-term+nonprogressors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors.</a> Blood. 109, 4671-4678 (2007).</li>
<li>Ndhlovu, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+immunomonitoring+models+of+HIV-1-specific+CD8+T-cell+responses+accurately+identify+subjects+achieving+spontaneous+viral+control%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control.</a> Blood. 121, 801-811 (2013).</li>
<li>Porichis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+HIV-specific+CD4+T+cells+to+PD-1+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade.</a> Blood. 118, 965-974 (2011).</li>
<li>Kwon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+CD25%2B+regulatory+T+cells+impair+HIV-1-specific+CD4+T+cell+responses+by+upregulating+interleukin-10+production+in+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes.</a> 86, 6586-6594 (2012).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

뜨는 컬렉션이 실험 설계의 필수적인 부분입니다. 루미 넥스 분석을위한 상층 액을 수확하면, 분액 만들어주기 - 해동 동결에 의한 단백질 분해를 방지하기 위해 -80 ° C에 보관 하였다. 냉동과 해동 단백질 및 동결 해빙을 최소화하여 가혹한 과정이 될 수 있습니다, 신호 분석에 극대화 될 것입니다. 따라서, 동일한 횟수를 동결 - 해동 된 분액에서 작업 할 때 반복 가능하고보다 정확한 데이터를 구하는 것이 용이하다. 우리는 이전에 HIV-개그 펩티드 풀 (12)와 자극 후 사이토 카인의 분비와 mRNA 수준의 운동 분석을 수행했습니다. 이러한 동역학에 기초하여, 우리는 시토 킨 분비 측정을 수행하기 위해 48 시간 시점을 선택했다. mRNA와 단백질의 분비뿐만 아니라 다른 자극 사이에 관찰 된 차이를 감안할 때, 그것은 연구자들은 자극에 따라 자신의 운동 분석을 수행하는 것이 필수적입니다그들은 mRNA 발현 또는 단백질의 사이토 카인 분비를 측정되는지 여부...

영구 바이러스 감염 동안 바이러스의 특정 T-세포는 T 세포의 고갈로 알려진 과정에서 기능적 결함을 취득. 초기 만성 바이러스 감염의 쥐 LCMV 모델에서 생체 내 연구에 지쳐 바이러스 특정 T 세포는 바이러스 성 감염 세포에 대한 세포 용해 기능을 감소 증식 할 수있는 능력을 잃게하고 IL-2, TNF-와 같은 사이토 카인을 생산하는 능력을 감소 한 것으로 나타났다 α 1,2를 IFN-γ는. 같은 PD-1과 IL-10 등의 면역 조절 경로의 복잡한 네트워크는 만성 감염시 상향 조절 및 (3,4 검토) T 세포 기능 장애에 기여하고 있습니다.에서 LCMV 마우스에이 억제 경로에 대한 항체를 차단 생체 관리 모델은 T 세포 고갈 (5 검토) 부분적으로 가역적 인 현상임을 나타내는 소진 바이러스 특정 T 세포의 기능 및 향상된 바이러스 제거를 복원. 일에 발견전자 LCMV 모델은 신속하게 HBV, HCV와 HIV 5와 같은 인간의 만성 바이러스 성 감염으로 확장되었다. 만성 HIV-1 감염, PD-1과 IL-10 경로는 감염된 과목에서 상향 조절하고 CD4와 반대로 바이러스 부하와 직접, 질병의 진행의 매개 변수와 상관 관계가 6-8을 계산합니다. LCMV 마우스 모델과 비슷, 인간의 T 세포 고갈이 부분적으로 가역적 인 현상, 나타내는 HIV 특정 CD4와 CD8 T 세포의 체외 복원 증식 PD-1, IL-10 경로의 항체 봉쇄. 그러나, 섬세한 인간의 샘플에 대한 실험의 성격뿐만 아니라 체외 분석, 이러한 개입에 의해 달성되는 기능 복원 프로필의 철저한 조사의 감도의 한계로 인해 막히게 결석. 대량 살상 무기 확산의 분석은, 지금까지 대부분의 연구에서 시험 만 신뢰할 수있는 시험 관내 분석했습니다, 그러나이 상호의 영향에 대한 증거의 놀라운 부족하다에 ventions : 세포 독성 T 세포의 1) 살상 능력, 2) 바이러스 복제에 대한 T 세포의 항 바이러스 효과, 3) 사이토 카인 분비 프로필 및 다른 세포 서브셋에 CD4 T 세포 도움에 4) 효과. 세포 내 사이토 카인 염색법 (ICS)는 매우 유용하고 널리 사용되는 유동 마우스 및 인간 모두에서 다양한 종류의 세포에서 사이토 카인의 생산을 검출하는 데 사용되는 기초 세포 계측법 분석이다. 또한 억제 경로의 항체 봉쇄의 효과를 조사하기 위해 사용되어왔다. ICS 내 분석, 사이토 카인 분비는 Brefeldin 및 / 또는 모 넨신의 첨가에 의해 차단된다. 세포 안에 갇혀 사이토 카인은 다음 다색 유동 세포 계측법을 사용하여 형광 항체로 검출된다. 일반적으로 항원 첨가 2 시간 이내에 첨가 Brefeldin 및 모 넨신, 모두 세포에 독성 때문에 분석의 기간은 일반적으로 항원 자극 후 10 또는 12 시간으로 제한된다. ICS 분석에 유용 내가되었습니다 강력한 기술이다N 세포를 항체에 노출 후 15 시간의 특정 기간 후에 압축 해제 된 마우스에서 항체 개입 차단의 생체 내 투여의 효과의 조사. 그러나, 인간의 샘플에서 억제 수용체의 봉쇄의 영향을 평가하는이 실험 방법의 응용 프로그램에 대한 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 체외에서 10 또는 12 시간 자극 (인간 샘플 전형적 케이스)의 억제 경로의 항체 중재를 수행 할 때 표준 ICS 분석법에 의해 측정 한, 대부분의 경우에 억제 수용체의 봉쇄가 항원 특이적인 T 세포 응답의 주파수를 변경하지 않는다 6, 7. 평균 또는 평균 형광 강도로 측정 한 셀 당 사이토 카인 생산의 측정은 일치하지 않는 결과 6, 7, 10을 받고 있습니다. 한편, ICS는 이후 늦은 시점에서 수행 될 때 자극 (즉 육일), 사이토 카인 분비 C의 개수의 변화ELL 학생은 관찰 할 수있다. 차이가 변경된 증식, 생존, 그리고 6시 지정된 기간 동안 축적 이펙터 기능의 변화의 결합 된 효과입니다. 부분적으로 이러한 한계를 극복하기위한 한 가지 방법은 증식이 발생하기를 기다리지 않고 사이토 카인 분비 차단제의 첨가 전에 항원으로 오랜 기간 (예를 들면 36 시간, 60 시간, 등.) 동안 배양한다. 우리는 성공적 HIV 특정 CD4 및 CD8 T 세포 11,12 의해 사이토 카인 분비의 동력학을 결정하기 위해이 방법을 사용하고 있으나,이 방법은 작은 반응을 검출 할 수없고, 전체 사이토 카인 분비가 발생의 통합 결과를주지 않을 것이다 자극입니다. 따라서, ICS가 supernatan에서 사이토 카인의 mRNA 정량 또는 사이토 카인 분비의 측정에 비해 활성화 된 T 세포에 의해 생산 된 사이토 카인의 양에 억제 경로의 봉쇄의 영향을 검출하는 방법에 충분히 민감 아니다같은 시간 지점에서 t. 또한, 활성화 된 T 세포에 의해 생성되는 사이토 카인의 대부분이 긍정적이거나 부정적인 피드백에 기여에 의해 분비 방식으로 행동은 항원 제시 세포와의 상호 작용을 반복합니다. 따라서, ICS 분석 중에 Brefeldin 또는 모 넨신 첨가는 사이토 카인 분비를 방지하고, 따라서 T 세포의 자극은 최적이 아니다. 마지막으로, ICS 여러 사이토 카인의 검출은 유동 세포 계측법과 사이토 카인의 검출뿐만 아니라 특정 패널에 동시에 사용할 수있는 형광 색소의 수에 제약 조건에 대한 가용성과 항체의 감도에 의해 제한됩니다. 우리는 세포 (장갑차) 및 자연 살해 세포 (NK 세포)를 항원 제시하는 HIV 특정 CD4 T 세포에 의해 사이토 카인 분비를 조절하고 이후 CD4 도움말에서 면역 조절 경로의 영향을 평가하는 매우 중요한 생체 외 실험 방법을 개발했다. 이 방법은 또한 IMPA을 평가할 수있다PBMC를에서 CD4 T 세포를 파괴하거나 만 CD8 T 세포에 의해 인식되는 최적의 펩티드로 자극하여 CD8 T 세포의 기능에 억제 분자의 봉쇄 CT. 2) 넓은 패널을 조사 1) 제조 사이토킨 수준의 더 정확한 정량화를 수행 세포 내 사이토 카인 염색법 어 세이는 달리, 우리는 행 수 있도록하기 위해 HIV 특정 CD4 T 세포에 의한 사이토 카인의 분비를 방해하지 않기로 사이토 카인 또는 이펙터 분자, 3) 다른 세포 서브셋에 HIV 특정 CD4 T 세포에 의해 생산 된 사이토 카인의 영향을 평가. 우리는 관심의 면역 조절 경로에 대한 항체를 차단 존재 HIV-1 개그 펩티드 풀과 CD8 고갈 된 PBMC를 자극한다. 배양, 보통 48 시간 원하는 시간 후, 우리는 비드 어레이와 사이토 카인의 분비를 측정하고 다른 세포 부분 집합의 표현형 분석을 위해 또는 전사 분석을위한 하나 세포 펠렛을 수집하는 상층 액을 수집합니다. 의 t에서,주의그의 48 시간 시점, 우리는 T 세포 (12) 증식의 중요한 인구를 감지하지 않습니다. 이것은 유연한 접근이며,이 설계의 여러 가지 다른 적응 가설을 해결하기 위해 적용될 수있다. 예를 들어, (예 등 HIV 특정 CD4 T 세포 또는 PD-1 높은 CD4 T 세포, 등.) 개별 셀의 부분 집합은 상층 액과 세포 펠렛을 수집 한 다음 36 시간 동안 추가 배양하기 전에 배양 12 시간 후 정렬 할 수 있습니다 더 구체적으로 된 PBMC의 정의 모집단에 의한 사이토 카인 분비에 봉쇄 개입의 영향을 조사한다.

<table><tbody><tr><td>Ca2+ 또는 Mg2+</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum AB</td><td>Gemini BioProducts</td><td>100-512</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Mediatech</td><td>30 001 CI</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Mediatech</td><td>25 005 CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 완충액</td><td>Mediatech</td><td>25060CI</td><td></td></tr><tr><td>FcR 차단 시약, human</td><td>Miltenyi</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail </td><td>Stem Cell</td><td>15663</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td><td>Invitrogen</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Improm-II 역전사 시스템</td><td>Promega</td><td>A3800</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant II SYBR qPCR Low Rox 마스터 믹스</td><td>Agilent</td><td>600830</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm 고정/투과화 솔루션 키트</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337100</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&#947; 프라이머</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>용도: CGAGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA</td></tr><tr><td>GAPDH 프라이머</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>용도: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG</td></tr></tbody></table>

시험 관내 분석에서 hiv 특정 cd4 t 세포의 이펙터 기능에 면역 경로의 영향을 평가하기

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T 세포 고갈은 만성 바이러스 감염 동안 실패 병원체 정리의 주요 요인이다. 같은 PD-1과 IL-10 등의 면역 조절 경로는이 지속적인 항원 노출에 상향 조절 및 확산의 손실 감소 세포 용해 기능에 기여하고, CD4와 CD8 T 세포에 의해 사이​​토 카인의 생산을 손상됩니다. LCMV 감염의 뮤린 모델에서 T 세포 반응을 증강 이러한 두 경로에 대한 항체를 블로킹 투여. 그러나, 사람의 샘플에서 세포의 사이토 카인 분비와 같은 차단의 효과를 측정하는 시험 관내 분석은 현재 존재하지 않는다. 우리의 프로토콜과 실험 방법은 정확하고 효율적으로 HIV에 감염된 과목에서 HIV 특정 CD4 T 세포에 의한 사이토 카인 생산의 복원을 정량화 할 수있게. 여기, 우리는 HIV 특정 CD4 T 세포와 다른 CEL에 미치는 영향에 의해 사이토 카인의 분비를 측정 할 수있는 시험 관내 실험 설계를 묘사L의 부분 집합. CD8 T 세포는 전혈로부터 고갈시키고, 잔존 된 PBMC는 피콜 분리 방법을 통해 분리 하였다. CD8 고갈 된 PBMC는 다음 HIV-1 개그 펩타이드 수영장 자극 한 후, 세포를 37 ° C, 5 % CO 2에서 배양하고, PD-L1 및 / 또는 IL-10Rα에 대한 항체를 차단하고 함께 배양 하였다. 48 시간, 상층 액 구슬의 배열 및 세포 펠렛에 의해 사이​​토 카인 분석을 위해 수집 한 후 QRT-PCR을 이용하여 세포 계측법 또는 전사 분석 흐름을 이용하여 표현형 분석도 수집했다. 더 자세한 분석을 위해, 서로 다른 세포 집단이 된 PBMC에서 선택적 집합 고갈 또는 같은 분석에서 평가되기 전에 유동 세포 계측법을 사용하여 정렬을 얻을 수 있었다. 이들 방법은 항원 특이적인 T-헬퍼 세포에 의해 시토 킨 생산의 조절을 결정하고, 면역 세포의 개체군 간의 기능적 상호 작용을 결정하는 매우 민감하고 구체적인 방법을 제공한다.

이 시험 관내 시스템을 사용하여 사이토 카인을 측정 할 때, 자극 제어 명에 비해 항원 특이적인 반응을 구별 할 수있을 것이 필수적이다. 일반적으로, 우리는 자극 제어하는​​ 분석의 선형 범위 내에서 있었다 없음에 비해 사이토 카인 수준의 최소 3 배 증가를 제공 항원 자극의 값으로 긍정적 인 반응을 고려했다. 우리는 약한 항원 특이 CD4 T 세포 반응을 관찰하기 위해 우리를있게, 0.16 PG / ㎖의 낮은 사이토 카인의 농도를 검출 할 수있는 고감도 비드 어레이 분석을 사용하고 있습니다. 샘플이 정확한 값을 얻을 수 있습니다 확인하기 위해 중복으로 실행됩니다. 그림 2A는 IFN-γ의 생산, 분석이 더 자극에 비해 800 배 증가의 평균을 감지 할 수 있음을 보여줍니다. 이 값은없는 자극에 비해 같은 IL-13 및 IL-2로 인해 그들 중 일부에 대한 검사를 사이토 카인, 낮은 값에 따라 달라집니다관찰 될 수있다. 비슷한 접근 방식은 다양한 사이토 카인 시험의 mRNA 전사 ...

우리는 HIV 특정 CD4 T 세포에 의한 사이토 카인 분비의 조절에 면역 경로의 역할을 조사하기 위해 시험 관내 분석을 개발 하였다.

시험 관내 분석에서 HIV 특정 CD4 T 세포의 이펙터 기능에 면역 경로의 영향을 평가하기

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

이 절차의 전반적인 목표는 자극된 T 세포의 사이토카인 분비, 전사 및 형태학적 영향을 분석하는 것입니다. 먼저, FI call gradient를 사용하여 HIV 감염자로부터 말초 CD 8개의 고갈된 혈액 단핵 세포를 분리하고 관심 있는 isotype control 또는 차단 항체로 세포를 배양합니다. 그런 다음 관심 항원으로 세포를 자극합니다.다음으로, 사이토카인 측정을 위한 상등액과 표현형 분석 또는 원하는 경우 전사 분석을 위한 세포 펠릿을 수집하기 위해 세포 배양물을 원심분리합니다. 사이토카인 분비에 대한 유세포 분석 결과에 따라 개별 세포 유형을 분류하는 것을 포함하도록 이 프로토콜을 조정합니다. 표현형 또는 전사 분석은 HIV 특이적 CD 4개의 T 세포의 효과기 기능 회복에 대한 억제 경로의 항체 차단의 영향을 보여줄 수 있습니다.이 in vitro assay는 억제 경로의 차단에 의해 회복된 사이토카인 수치를 정량화하고, 광범위한 effector 분자 패널을 조사하고, T 세포에 대한 HIV 특이적 C에 의해 생성된 사이토카인이 다른 세포 subset에 미치는 영향을 평가하는 데 효과적으로 사용할 수 있습니다. 우리 실험실의 연구 기술자인 Megan Hart는 이제 이 절차를 시연할 것입니다: 전혈 혼합물 1밀리리터당 50마이크로리터에 human CD eight 양성 고갈 칵테일을 잘 첨가하여 CD 8 양성 T 세포를 고갈시키고 20분 동안 배양합니다. 실온에서 전혈을 행크 완충액과 혼합합니다.이제 히스토 팩 위에 혈액을 조심스럽게 층을 이룬 다음 540 RCF에서 30분 동안 그래디언트를 원심분리합니다. 말초 혈액 단핵 세포층을 수집합니다. 세포를 새로운 50ml 원추형 튜브로 옮기고 45ml의 완전한 RPMI 1640으로 두 번 세척합니다.세척된 셀을 완전한 RPMI 1640에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 팩스 튜브당 500마이크로리터의 세포 현탁액을 분취합니다. 조사한 경로에 따라 차단 항체를 추가합니다.또한 적절한 튜브에 isotype 컨트롤을 추가합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 15분 동안 세포를 배양합니다. 다음으로, HIV 원 개그 펩타이드 풀로 세포를 자극합니다.또한 각 차단 조건에 대한 자극 없음 제어를 포함합니다. 48시간 동안 세포를 계속 배양합니다. 펠릿을 방해하지 않고 원심분리로 세포를 펠렛화합니다.25마이크로리터의 0.5%PBS 트윈에서 바이러스를 비활성화하기 위해 루미넥스 스피드 어레이를 위해 225마이크로리터의 상등액을 EOR 튜브로 두 번 이동합니다. 그런 다음 제조업체의 프로토콜에 따라 Millipore luminex 키트를 사용하여 원하는 사이토카인 농도를 측정합니다. 생존력을 위해 3 밀리리터의 PBS 염색으로 세포를 세척 한 후, 1.4 마이크로 리터의 FCR 차단 시약 와류에서 세포를 나타내는 단핵구 또는 기타 항원에 대해 염색하는 경우 100 마이크로 리터의 PBS에 세포를 재현탁시켜 섭씨 4 도에서 10 분 동안 혼합하고 배양합니다.다음으로, 표면 항체 와류를 추가하고 어둠 속에서 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다. 200 마이크로 리터의 4 % 파라 포름 알데히드로 한 번 세척 한 후 실온에서 20 분 동안 어두운 곳에서 배양합니다. 한 번의 세척 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA 분리 키트를 사용하여 1% Beamer keto ethanol isolate RNA를 포함하는 300마이크로리터의 kyogen buffer, RLT의 정량적 R-T-P-C-R lyce를 위한 다중 레이저 유세포 분석기에서 세포를 분석하기 위해 250마이크로리터의 1%FBS에 세포를 현탁시킵니다.이제 CD NA 합성 키트를 사용하고 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA에서 CD NA를 합성합니다. 다음으로, 뉴클레아제가 없는 물에 프라이머를 추가하고 얼음에 보관하여 하우스키핑 유전자를 포함하여 각 프라이머에 대한 프라이머 믹스를 만듭니다. 각 증폭 마스터 믹스에 대해 플레이트당 10.5마이크로리터의 뉴클레아제 무함유수, 12.5마이크로리터의 사이버 그린 및 1마이크로리터의 프라이머 믹스를 추가합니다.이제 24 마이크로 리터의 마스터 믹스를 각 반응에 피펫으로 만듭니다. 글쎄, 또한 템플릿에 따라 각각에 1 마이크로 리터의 CD NA를 추가하십시오. 웰을 덮고 1500 RCF에서 3분 동안 플레이트를 원심분리합니다.그런 다음 세포 표면 염색을 위해 A QRT PCR R R 기계에서 플레이트를 실행합니다. 세포 내 사이토카인 염색 약 6시간 전에 felden 및 monin 염색을 추가합니다. 그런 다음 PBS에서 1%FBS로 세포를 세척하고 세포를 세척한 후 고정 투과 용액 키트 및 프로토콜을 사용하여 세포 내 사이토카인을 염색합니다.펠릿을 250마이크로리터의 1%FBS에 현탁시킨 후, 살아있는 사체 고정 사세포 염색 키트를 사용하여 생존력을 위해 자극 염색 후 16시간 후에 다중 레이저 유세포 분석기에서 샘플을 실행합니다. 제조업체의 프로토콜에 따르면, PBS 세척 1회 후 표면 항체 와류에서 100마이크로리터의 1% FBS에 세포를 현탁시켜 어둠 속에서 20분 동안 얼음 위에서 세포를 혼합하고 배양합니다. 세포를 한 번 세척하고 500마이크로리터의 저온 보충 RPMI 1640에 세포를 현탁시킵니다.그런 다음 배지는 세포 여과기 캡을 통해 세포를 5ml 폴리스티렌 원형 바닥 튜브로 여과합니다. 다음으로 200마이크로리터의 보완된 RPMI 1640 매체를 각 수집 튜브에 주입합니다. 모든 튜브를 얼음 위에 유지: 생체 유해 물질 배양을 위한 시설에 위치한 기기에 있는 기기에서 관심 세포 하위 집합을 라이브 분류하는 동안.원하는 시간 동안 정렬된 셀입니다. 이 실험에서 luminex 및 PCR 분석 분석에 이어 HIV V one gag 펩타이드 풀을 사용한 CD 8 고갈 pbmc 자극은 인터페론 감마 생성에 대한 중앙값을 800배 증가시킵니다. 인터페론 감마 전사체의 수준은 자극 후 중앙값이 10배 증가했습니다.이에서, HIV 특이적 CD 4개의 T-세포 기능에 대한 시험관 내 분석은 인터페론 감마 단백질 분비와 인터페론 감마 mRNA 수치 사이에 강한 상관관계가 있음을 나타냅니다. 흥미롭게도, HIV 개그 펩타이드 풀에 의한 자극은 파상풍의 박테리아 항원보다 더 큰 인터페론 감마 분비를 초래합니다. IL 13 분비에 대한 톡소이드 추가 결과는 HIV와 파상풍 특이적 CD 4 T 세포 반응의 서로 다른 사이토카인 프로파일을 나타냅니다.PD one pathway의 차단은 일반적으로 항원 자극 없이 cytokine 분비에 큰 영향을 미치지 않지만, interferon gamma와 IL two 분비를 강화한다. 세포가 HIV로 자극되면 하나의 개그 펩타이드가 고입니다. CD 3 세포가 pbmc에서 고갈되면 항원 자극에 대한 반응으로 인터페론 감마 또는 IL 2 세포가 생성되지 않습니다.이러한 데이터는 인터페론, 감마, IL2의 분비가 HIV 특이적 CD 4개의 T세포 및 항원 특이적 자극에 반응하여 유도된다는 것을 나타냅니다. 이 실험은 사실 분류된 CD 4개의 T 세포를 사용하여 입증된 워크플로우를 사용하여 PD 1 차단이 인터페론 감마 및 IL 2에 미치는 영향을 조사합니다. 이 방법의 주요 장점은 면역 조절 분자가 HIV 특이적 CD 4개의 T 세포와 항원 제시 세포의 상호 작용을 어떻게 조절하는지 평가할 수 있는 능력입니다.여기서 프로토콜은 자극 후 48시간에 세포 내 사이토카인 염색을 수행하도록 조정되었습니다. 결과는 단핵구가 HIV one 개그 펩타이드 풀로 자극 후 IL 12의 주요 공급원임을 보여줍니다. 이 체외 실험 접근법을 통해 T 세포 면역학 분야의 연구자들은 인간 샘플에서 Addison 특이 tcell의 효과적인 기능을 조절하는 데 있어 면역 조절 경로의 영향을 탐구할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Tregs는 면역 시스템의 강력한 진압하고 있습니다. 그들을 정의하는 독특한 표면 마커의 부족이있다, 그러므로, Tregs의 정의는 주로 기능입니다. 여기서 우리는 최적화된...

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

이 비디오는 사전 활성화된 이펙터 T 세포에 의해 유도된 암세포의 세포사멸 분석을 보여줍니다. 이러한 세포를 형광 핵으로 표시된 암세포와 함께 배양함으로써 카스파제로 절단할 수 있는 형광 기질을 추가합니다. 세포사멸 암세포는 핵에서 다른 색을 표시하여 이중 형광을 유발합니다. 이 이중 형광은 암세포가 세포사멸을 겪고 있음을 나타냅니다.

암세포에 대한 사전 활성화된 CD8+ T 세포의 세포 독성을 연구하기 위한 체외 분석

CD4+ 조절 T 세포는 강력한 면역 조절제이며 면역 항상성에서 중요한 기능을 수행합니다. 말초 혈액에서 이러한 세포가 부족하기 때문에 특히 HIV-1 감염과 관련하여 기능 연구가 어렵습니다. 여기에서는 HIV-1에 감염된 개인의 말초 혈액에서 기능적 CD4+ Tregs를 분리하고 확장하는 방법을 설명합니다.

새로운 도구는 HIV-1에 감염된 개인으로부터 규제 T 세포를 확장하려면

이러한 단일 세포 수준에서 사이토 카인 생성을 감지하고 T 세포 반응의 양적 및 질적 인 특성을 제공하는 감마 인터페론 (IFN-γ) ELISPOT 등 기능적 분석법 비발 세대 수두 대상 포진 향한 세포 매개 성 면역 반응을 평가하기 위해 사용될 수있다 바이러스 (VZV).

제대혈 이식을 다음과 IFN-γ 평가하기 ELISPOT 분석을 수두 - 대상 포진 바이러스 - 특정 세포 성 면역의 개발

여기에서는 간단한 수동 단백질 침전 단계와 온라인 컬럼 추출을 사용하여 건조된 혈액 반점에서 면역억제제 타크로리무스를 정량화하기 위한 고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(HPLC-MS/MS) 분석에 대해 설명합니다.

LC-MS / MS를 사용하여 건조 혈액 명소에 면역 억제제 타 크롤리 무스의 정량화

이 프로토콜은 HIV 감염에 대한 줄기 세포 기반 엔지니어링 면역을 가진 인간화 된 골수/간/흉선 마우스 모델을 구성하는 방법을 설명합니다.

인간화 된 마우스 모델에 HIV 감염에 대 한 줄기 세포를 기반으로 설계된 내성

여기에서는 바이러스에 감염된 미성숙한 림프구성 융모수막염 마우스에서 분리된 조절 T(Treg) 세포의 표현형을 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한, Treg cell의 억제 활성을 평가하는 프로세스를 제공합니다.

표현형 및 만성 림프 구성 맥락 수막염 바이러스에 감염된 마우스에서 고립 활성화 규제 T 세포의 기능 분석

여기, 선물이 프로토콜을 이식, 허용 오차를 유발 하 고 생체 외에서 그리고 vivo에서 평가 받는에서 고유한 셀 하위 집합의 진압 용량 및 기증자 또는 외 인 항 원 받는 사람의 면역 상태.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 T, B 및 골수성 세포 진압 활동 및 이식 받는 체액 응답의 평가

여기에서는 종양 항 원에 대 한 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 반응에서 면역 우세의 검사를 가능 하 게 하는 유 세포 분석 기반의 생체 사 멸 분석 법을 설명 한다. 이 우아한 분석을 기계 론 적 연구와 약물 효능 테스트에 사용 하는 방법의 예를 제공 합니다.

종양 특이 CD8+ T 세포 반응에서 면역 우세를 연구 하기 위한 생체 내 세포 독성 분석 법

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이 프로토콜은 조절 T 세포가 이펙터 T 세포의 증식 및 분화에 미치는 영향을 조사하기 위한 시험관 내 공동 배양 전략을 제공합니다.

시험관 내 조절 T 세포의 기능 분석: 증식과 분화에 초점을 맞춘다

학습하세요 시험 관내 분석을 통해 HIV 특이 CD4 T 세포의 사이토카인 분비와 면역 조절 경로의 영향을 평가하는 방법을. 차단 항체를 이용하여 T 세포 이펙터 기능을 복원하는 연구에 활용할 수 있습니다.

시험 관내 분석에서 HIV 특정 CD4 T 세포의 이펙터 기능에 면역 경로의 영향을 평가하기

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