칩에 스트레스 유발 항생제 감수성 테스트

다음 실험의 전반적인 목표는 관심 항생제에 대한 박테리아의 감수성을 신속하게 결정하는 것입니다. 이것은 먼저 로그 위상 박테리아를 미세유체 채널의 바닥으로 고정시킴으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 항생제와 살아 있는 죽은 형광 염색제가 포함된 배지를 높은 유속으로 채널을 통해 밀어 넣어 박테리아에 스트레스를 주고 항생제 표적 생화학 경로를 활성화합니다.

다음 위상차 및 형광 이미지는 박테리아 생존력을 모니터링하기 위해 1시간 동안 2분마다 자동으로 수집되며, 실험의 각 시점에서 획득한 이미지로부터 정규화된 박테리아 사멸률이 계산됩니다. 궁극적으로, 박테리아의 항생제 감수성 표현형은 시간이 지남에 따라 정규화된 세포 사멸률의 증가에 따라 결정됩니다. 육수, 희석 또는 미세배양과 같은 기존 표현형 감수성 검사 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 당사의 방법이 박테리아 분열 모니터링을 필요로 하지 않는다는 것입니다.

오히려, 우리는 기존의 작은 인구 집단에서 직접 그들의 감수성 프로필에 접근할 수 있습니다. 이 기법의 함의는 내성 세균 감염 진단에 미치는 영향이 빠르고, 쉽게 다중화 및 자동화될 수 있기 때문에, PDMS 층을 생성하기 위해 실온의 진공 챔버에서 갓 준비된 PDMS 점성 혼합물을 탈기하는 것으로 시작하고, 한 시간 후에 스케일을 사용하여 알루미늄 몰드에 미리 정의된 질량의 DGA PDMS 혼합물을 채웁니다. PDMS를 금형 중앙에 천천히 붓고 금형의 수평을 유지하고 핀이 덮이지 않도록 주의하십시오.

PDMS를 섭씨 37도의 오븐에서 하룻밤 동안 경화시킵니다. 다음 날 아침, 상단 몰드 플레이트를 분리하고 금형에서 경화된 PDMS를 조심스럽게 제거하여 플로우 셀을 조립합니다. 먼저 유리창을 플로우 셀 포켓에 넣습니다.

그런 다음 활성 면이 위로 향하게 하여 플로우 셀(flow cell) 포켓 내부의 유리창 위에 코팅된 유리 슬라이드를 놓습니다. 채널이 아래를 향하도록 새로 생성된 PDMS 레이어는 채널 입력이 금속판의 관통 구멍과 정렬되도록 그 위에 있습니다. 레이어 사이에서 공기를 부드럽게 밀어낸 다음 PDMS가 유리 창을 향하도록 PDMS 유리 슬라이드 어셈블리를 뒤집습니다.

PDMS 채널 입력을 금속판의 관통 구멍과 겹친 다음 압력판을 위에 놓고 나사를 조입니다. 이제 조립된 플로우 셀을 현미경 아래에 놓고 현미경 배율을 60배로 설정하고 채널 위치를 미리 정렬하여 로그 상 박테리아를 플로우 셀에 로딩할 준비를 하고 하룻밤 동안 배양된 관심 박테리아 콜로니 50마이크로리터를 50ml의 신선한 MH 2 브로스에 혼합합니다. 250 RPM과 37 °C에서 흔들면서 3 시간 동안 배양 10 밀리리터를 1, 650 회 G 및 실온에서 2 분 동안 배양 원심 분리

그런 다음 상등액을 제거하고 펠릿을 1ml의 새로운 MH 2 매체에 재현탁합니다. 다음으로, 1ml 주사기에 짧은 길이의 튜브를 부착하고 1ml의 매체로 튜브를 세척하고 박테리아 현탁액을 흡입할 때 기포를 방지하기 위해 튜브에 소량의 매체를 남겨둡니다. 그런 다음 0.7ml의 박테리아를 주사기에 넣고 플로우 셀의 두 채널을 박테리아 세포 배양으로 채웁니다.

채널의 투명도는 박테리아로 채워짐에 따라 변합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 45분 동안 플로우 셀을 배양하여 박테리아가 슬라이드 표면에 부착할 수 있도록 합니다. 실험을 위한 솔루션을 준비합니다.

먼저, 60ml 주사기 2개에 새로 준비된 대조 용액을 채우고 60ml 주사기 2개에 새로 준비된 항생제 용액을 채웁니다. 주사기를 튕겨 기포를 제거한 다음 입력 튜브를 부착하여 튜브 끝을 통해 해당 용액을 밀어 넣습니다. 시약의 광에 의한 분해를 방지하기 위해 용액을 알루미늄 호일로 싸서 보관하십시오.

이제 실험 용액이 있는 주사기를 한 번에 하나씩 펌프에 장착합니다. 필요에 따라 플런저를 짜서 펌프에 끼웁니다. 크로스바를 고정하는 주사기로 주사기를 제자리에 잠급니다.

펌프 속도를 분당 1밀리리터로 설정하고 펌프 부피를 60밀리리터로 설정하고 모든 주사기에서 일정한 액체 흐름이 보일 때까지 펌프를 세척합니다. 이제 인큐베이터에서 플로우 셀(flow cell)을 제거하고 정렬되지 않은 사전 현미경 스테이지에 장착하여 실험을 시작합니다. 다음으로, 주사기에서 나오는 하나의 입력 튜브와 폐기물 병으로 가는 하나의 출력 튜브를 각 플로우 셀 채널에 연결합니다.

이 시점에서 실험이 완전히 설정되고 시작할 준비가 되었습니다. 위상차 획득 시간을 10밀리초로 설정하고 형광 획득 시간을 1600밀리초로 설정한 다음, 흐름을 시작하기 전에 각 위치에 대한 위상차 및 형광 이미지를 얻습니다. 흐름 이미지를 시작하기 전에 채널 내에 로드된 박테리아의 밀도가 높기 때문에 채널 바닥에 초점을 맞추지 못할 수 있습니다.

이제 액체 흐름을 시작하십시오. 현미경이 채널 하단에 초점이 맞춰져 있는지 즉시 확인하십시오. 그런 다음 흐름의 1분 이내에 대상 영역의 위상차 및 형광 이미지를 촬영합니다.

첫 번째 이미지 세트 이후 60분의 흐름이 발생할 때까지 2분마다 이미지를 획득합니다. 실험이 제대로 진행되고 있는지 확인하기 위해 필요에 따라 초점을 다시 맞추면 획득한 위상차 및 형광 데이터를 검사할 수 있습니다. 이 데이터 샘플에서 민감성 변형률은 채널 1과 2에 로드된 반면 저항 변형률은 채널 3과 4에 로드되었습니다.

실험이 끝나면 표백제와 물을 순차적으로 도포하여 세척 주기를 실행합니다. 20ml 주사기 4개에 10mL의 10% 표백제 용액을 채우고 60ml 주사기 4개에 디워터를 채웁니다. 버블링 제거 후 표백제로 채워진 주사기를 플로우 셀에 부착하고 펌프 속도를 분당 1ml로, 펌프 용량을 3ml로 설정합니다.

펌프를 3 분 동안 실행하고 화면에서 채널 청소를 모니터링하십시오. 3분 후 표백제 주사기를 물 주사기로 교체하고 분당 1밀리리터씩 30분 동안 작동시킵니다. 마지막으로 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 각 이미지의 박테리아 수를 계산합니다.

이 공식을 사용하여 정규화된 박테리아 세포 사멸률을 시간 함수로 계산하며, 여기서 NF는 형광 이미지 수에 계산된 죽은 박테리아의 수와 같습니다. 그리고 NP는 위상차 이미지에서 결정된 박테리아의 총 수와 같습니다. 여기에 표시된 이미지는 미세유체 플로우 셀 내부의 옥사실린에 대한 감수성 포도상구균 아리아 균주의 시간 의존적 반응을 보여줍니다.

이 사분면은 실험 시작 후 1분 후와 1시간 후에 얻은 위상차 이미지를 여기에 표시된 해당 형광 이미지와 함께 보여줍니다. 실험이 끝날 때까지 형광 박테리아의 수가 크게 증가하는 것이 관찰되었으며, 이는 채널 내의 세포 사멸과 개별 에폭시 코팅 슬라이드의 확률적 불균일성으로 인한 항생제에 대한 균주의 감수성을 나타냅니다. 이러한 변화를 설명하기 위해 지속적인 순전한 스트레스 하에서 실험 전반에 걸쳐 박테리아 세포 손실이 있을 수 있으며, 죽은 세포 집단의 각 형광 이미지는 co 획득 위상차 이미지로 정규화되어 전체 세포 집단을 동일한 시점의 1초 이내로 제공합니다.

이러한 확대는 계수 알고리즘이 조밀하게 채워진 위상차 이미지보다 형광 이미지에서 개별 박테리아를 더 정확하게 계수하는 데 더 성공적임을 보여줍니다. 사세포 염색은 개별 사균에 대해 높은 형광 대비를 제공합니다. 형광균의 수가 전체 수의 5%를 넘는 경우가 거의 없기 때문에 각 박테리아는 배경에 비해 매우 밝습니다.

따라서 형광 박테리아는 높은 정확도로 쉽게 계수 할 수 있습니다. 예를 들어, 이 실험에서 5개의 총 828개의 박테리아가 검출되고 빨간색으로 강조 표시된 174개가 여기에서 죽은 것으로 확인되었습니다. 3가지 다른 실험에 대한 정규화된 MSSA 및 Mr.RSA 데이터는 내성 균주에 대해 예상대로 설명되었으며, 정규화된 세포 사멸은 크기가 0.5% 미만으로 낮고 실험 과정에서 변하지 않습니다.

그러나 감수성이 있는 균주는 세포 사멸이 꾸준히 증가하고 실험이 끝날 때까지 1% 이상의 높은 값을 보여줍니다. 감수성 균주에 대한 세포 사멸 시작은 실험마다 약간 다르지만 일반적으로 10분에서 30분 사이에 발생합니다. 항생제 내성 병원체와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 정화조 기술과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

이 기술은 연구자들이 박테리아가 스트레스에 어떻게 반응하는지 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것이며 새로운 신속한 진단의 개발과 신약 발견에 영향을 미칠 것입니다.