Name: 칩에 스트레스 유발 항생제 감수성 테스트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: 배우세요 마이크로플루이딕 플랫폼을 이용한 항생제 감수성 신속 테스트 방법으로, 세균을 고정시키고 스트레스 조건에서 항생제를 적용하여 세균 생존율을 실시간으로 평가합니다. 이 기술은 기존 배양법보다 빠르고 효율적인 감염 진단에 활용됩니다.

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우리는 제조 혁신을위한 Fraunhofer 센터의 엔지니어와 학생들에게 감사드립니다. 실험 시스템의 설계, 가공 및 자동화를 돕기 위해 안드레아스 프린젠, 홀거 워스, 더그 포스, 데이비드 차긴, 수동 슈 박사에게 감사드립니다. 줄리아 쿠카르츠, 멜라니 짐머만, 니코 크라에츠마르, 팀 검벨, 조쉬 비야누에바, 미노리 시미즈, 카타르지나 쿨리가 실험 프로토콜 및 데이터 수집 테스트에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 우리는 셀 프로파일러의 이미지 분석 루틴의 개발에 도움을 하버드와 MIT의 넓은 연구소에서 이미징 플랫폼의 박사 앤 E. 목수와 마크 앤서니 브레이 박사를 인정합니다. 설명된 이 프로젝트는 국립 알레르기 및 감염증 연구소의 R21AI079474 및 1R01AI101446에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 알레르기 및 전염병 연구소 또는 국립 보건 원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 이 프로젝트는 또한 프라운호퍼 미국에 의해 지원되었다.

1. PDMS 레이어 만들기(그림 1)
<ol><li>10:1 비율로 PDMS 및 경화제를 적극적으로 혼합합니다. 거품을 제거하려면 실온에서 1 시간 동안 진공 챔버에서 점성 혼합물을 탈가스합니다.</li>
	<li>스케일로 알루미늄 금형 위에 PDMS를 천천히 붓습니다. 중앙에서 붓고 금형을 수평상태로 유지합니다. 핀을 지키지 않도록 하십시오. 목표 중량이 달성되면 붓는 것을 중지합니다. 우리의 금형에는 PDMS 4 g과 경화 시약 0.4 g가 필요합니다.
</li>
	<li>오븐 내부의 금형을 평평하게 하고 밤새 37°C에서 치료합니다. 대체 경화 시간은 60°C에서 2시간 또는 90°C에서 1시간입니다.
</li>
	<li>경화 된 PDMS 층을 금형 가장자리를 따라 해부하고 조심스럽게 집게 한 쌍으로 금형 표면에서 벗겨냅니다. 70% 에탄올과 Q-tip으로 금형 표면을 청소합니다.</li>
</ol>2. 그림 2에 따라 흐름 셀을 조립합니다.
유리 슬라이드를 갖춘 PDMS의 표준 조립은 두 표면의 산소 플라즈마 처리를 통해 수행되며 PDMS와 현미경 유리 슬라이드 사이의 누출없는 결합을 보장합니다. 제시된 프로토콜에서, 플라즈마 처리는 유리 슬라이드에 화학 코팅을 파괴할 것입니다. 따라서 슬라이드는 플라즈마 처리가 아닌 압력 밀봉입니다.
<ol><li>유리 창을 유동 셀 포켓에 넣습니다.</li>
	<li>플로우 셀의 주머니 안쪽유리 창 위에 코팅된 유리 슬라이드를 놓고, 채널이 그 위에 내려다보이는 PDMS 층을 배치합니다. 채널 입력이 금속 판의 관통 구멍과 일치하는 방식으로 PDMS 슬라이드를 배치합니다. 레이어 사이에 공기를 부드럽게 밀어냅니다.</li>
	<li>PDMS가 유리 창을 향할 수 있도록 PDMS/유리 슬라이드 어셈블리를 뒤집습니다. PDMS 채널 입력을 금속 판의 관통 구멍과 겹칩니다.</li>
	<li>압력 플레이트를 위에 놓고 나사를 조입니다.</li>
	<li>조립된 유동 세포를 현미경 아래에 놓습니다. 현미경 배율을 60X로 설정하고 채널 위치를 미리 정렬합니다.</li>
</ol>3. 로그 단계 박테리아 준비
<ol><li>실험 전날: 세균 성 식민지와 2 % NaCl (MH2)을 포함하는 뮬러 힌턴 국물의 50 ml를 접종. 37 °C에서 하룻밤 250 rpm에서 흔들어. 하나 또는 두 개의 세균성 균주는 기술된 셋업을 위한 1개의 실험에서 공부될 수 있습니다.
</li>
	<li>실험 전: 하룻밤 박테리아 배양 50 μl을 MH2 배지 50ml에 섞는다. 박테리아가 로그 단계에 있는지 확인하기 위해 37 °C에서 3 시간 동안 250 rpm에서 흔들어.</li>
</ol>4. 실험 솔루션 구성 요소가 필요 하기 최소 10 분 전에 따뜻하게
<ol><li>실온에서 형광염료(5mM 스톡) 및 리조스타핀(10 μg/ml 스톡)을 해동한다.</li>
	<li>옥사실린 파우더를 실온으로 데우십시오.</li>
</ol>5. 세균 현탁액을 준비하고 적재합니다.
<ol><li>3 시간 하위 문화가 끝난 후 : 2 분 동안 1,650 x g에서 박테리아 배양 및 원심 분리기 10ml를 복용하십시오.</li>
	<li>상체를 제거하고 신선한 MH2 매체 1 ml에서 박테리아를 다시 중단하십시오.</li>
	<li>1ml 루어 잠금 주사기에 짧은 길이의 튜빙을 부착합니다. 주사기 튜빙을 1 ml의 미디어로 플러시합니다. 세균 현탁액에 그릴 때 기포를 피하기 위해 튜브에 약간의 미디어를 남겨 둡니다.</li>
	<li>주사기에 박테리아 타입 1의 0.7 ml를 로드합니다. 박테리아 유형 1로 유동 세포의 두 개의 채널을 채웁니다. 액체가 ca 후 채널의 반대편에 나타나는 것을 지켜보십시오. 150 μl. 채널의 투명성은 박테리아로 채워지면서 바뀝습니다.
</li>
	<li>여러 박테리아 유형을 실험하는 경우, 유동 세포의 두 개의 나머지 채널로 박테리아 유형 2에 대한 로딩 절차를 반복한다.</li>
	<li>인큐베이터 내부에 유동 셀을 37°C에서 45분 동안 배치하여 슬라이드 표면에 세균침착 및 부착을 허용합니다.</li>
</ol>6. 실험 용액을 준비하고 적재합니다.
<ol><li>형광염 육수(5mM)의 14 μl과 MH2 매체의 126 μl을 혼합하여 0.5mM형염염액 140μl을 준비한다.</li>
	<li>250 μg/ml 옥사실린의 최종 농도를 얻기 위해 MH2 매체의 40 ml에 옥사실린 10 mg을 희석.</li>
	<li>최종 농도0.25 μM 형광염과 0.7 ng/ml의 리조스타핀농도로 130ml의 제어 용액을 준비하십시오. 이렇게 하려면 형광 염료(0.5mMM), 리소스타핀 재고 의 9.12 μl(10 μg/ml) 및 MH2 미디어 130ml를 혼합하십시오.</li>
	<li>최종 농도0.25 μM 형광염, 0.7 ng/ml 의 리소스타핀 및 50 μg/ml 옥사실린의 최종 농도로 130ml의 항생제 용액을 준비하십시오. 이렇게 하려면 형광 염료(0.5mM), 리소스타핀 재고 9.12 μl(10 μg/ml), 옥사실린 26ml(250 μg/ml), MH2 미디어 104ml를 섞는다.</li>
	<li>제어 용액으로 60ml 주사기 2개와 항생제 용액으로 60ml 주사기 2개를 채웁니다. 시약의 빛 유발 저하를 방지하기 위해 알루미늄 호일에 감싼 솔루션을 유지합니다. 튜빙의 플러시로 인한 손실을 설명하기 위해 주사기를 과다 채웁니다.
</li>
	<li>주사기에서 기포를 제거합니다. 실험용 솔루션으로 팁에 입력 튜브를 부착하고 채웁니다.</li>
	<li>펌프에 주사기를 장착합니다. 가장 작은 볼륨으로 주사기를 먼저 배치한 다음 플런저 위치를 잠급합니다. 나머지 주사기에 펌프에 맞고 필요에 따라 플런지를 압박합니다.</li>
	<li>펌프 속도를 1ml/분으로 설정하고 펌프 볼륨을 60ml로 설정합니다. 모든 주사기에서 꾸준한 액체 스트림이 보일 때까지 펌프와 함께 플러시하십시오.</li>
</ol>7. 현미경으로 유동 셀 설정
<ol><li>원심분리기에서 유동셀을 제거하고 현미경단계(도 3)에장착한다.</li>
	<li>각 흐름 셀 채널(채널당 하나의 입력/1 출력)에 입력/출력 튜브를 연결합니다. 4개의 다른 컨테이너로 출력을 수집하면 개별 채널 출력 볼륨을 측정할 수 있습니다.</li>
</ol>8. 60분 실험 실행
<ol><li>2.5단계에서 미리 정렬된 위치를 확인합니다. 현미경 필드 필드가 채널에 중심이 없거나 초점이 바 절되지 않은 경우 설정을 조정하고 새 위치를 저장합니다. 적재된 박테리아의 고밀도로 인해 흐름이 시작되기 전에 정밀한 초점 집중이 불가능할 수 있습니다.
</li>
	<li>위상 대비 획득 시간을 10msec로 설정하고 형광 획득 시간을 1,600msec로 설정합니다.</li>
	<li>흐름을 시작하기 전에 각 위치에 대한 위상 대비 및 형광 이미지를 가져옵니다. 이것은 로드된 세균성 조밀도의 질적 추정치를 제공합니다.
</li>
	<li>액체 흐름을 시작하고 현미경이 채널의 바닥에 초점을 맞추고 있는지 즉시 확인합니다.</li>
	<li>흐름의 첫 번째 분 이내에 대상 영역의 위상 대비 및 형광 이미지를 가져 가라.</li>
	<li>첫 번째 이미지 세트 가 60분까지 이미지를 수집합니다. 필요에 따라 다시 초점을 맞춥니다.</li>
</ol>9. 흐름 셀 소독
<ol><li>비커(100ml)로 표백제 용액을 10% 만듭니다. 혼합물 의 10ml와 함께 4 x 20ml 주사기를 채웁니다. 주사기를 디플로우하고 유량 셀에 부착합니다. 채널이 박테리아가 명확해지려면 ~ 1-2 분이 소요됩니다.
</li>
	<li>펌프 속도를 1ml/분으로 설정하고 펌프 볼륨을 3ml로 설정합니다. 3분 동안 실행하십시오.</li>
	<li>4 x 60ml 주사기를 60ml의 DI 워터로 채웁니다. 주사기를 디플로우하고 유량 셀에 부착합니다.</li>
	<li>펌프 속도를 1ml/분으로 설정하고 펌프 볼륨을 30ml로 설정합니다. 30분 동안 실행하십시오.</li>
	<li>현미경으로 채널 청소를 모니터링합니다.</li>
	<li>흐름 셀을 분해합니다. 사용 된 에폭시 슬라이드를 폐기하십시오. 20 분 동안 DI 물에 유동 셀 성분을 담급니다.</li>
</ol>10. 이미지를 분석하고 데이터를 생성합니다.
<ol><li>각 이미지의 박테리아 수를 계산합니다. 오픈 액세스 소프트웨어인 CellProfiler는 배치 이미지처리(16)를수행하는 데 사용됩니다. CellProfiler 루틴의 높은 수준의 윤곽선은 표 1에요약됩니다. 상 대비 영상(Np)에존재하는 박테리아의 수는 총 세균 수를 준다. 형광 이미지(Nf)에서보이는 박테리아의 수는 죽은 박테리아의 수를 준다.
</li>
	<li>시간의 함수로 정규화된 세균 세포 사멸 비율을 계산합니다.<ol>
<li>개별 이미지에 대한 Nf 및 Np를 데이터 분석 소프트웨어로 가져옵니다.</li>
		<li>t = T에서 분획(Nf/N p)에의해 주어진 특정 시점에서 각 채널의 죽은 박테리아의 분수를 계산합니다.</li>
		<li>실험 의 시작 부분에 존재하는 죽은 박테리아의 분획을 빼는다 (t = 1 분) 대조군 및 실험 채널 모두에 대한.</li>
		<li>다음 방정식으로 각 시점에서 실험 채널에 존재하는 것에서 제어 채널에 존재하는 죽은 박테리아의 분수를 뺍니다. <img alt="Data Analysis Equation" fo:content-width="6in" height="217" src="/files/ftp_upload/50828/Data_analysis_equation.png" width="620">
</li>
		 <li>실험 과정에 대한 그래프 DP규범 대 t. 세포 사망률이 1% 이상인 샘플은 취약하다고 판단되는 반면, 0.5% 미만의 사망은 저항성을 나타냅니다. 이 두 컷오프 사이에 떨어지는 백분율은 확정되지 않은 것으로 간주되며 샘플을 다시 테스트해야 합니다.
</li>
		<li>스프레드시트를 사용하여 다양한 실험의 결과를 요약하고 분석합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

미세 유체 방법은 특허 출원 중입니다: 사우어-버지 A, 샤론 A, 칼라쉬니코프 M, Wirz H, 발명가; 세균성 항생제 내성/감수성 특허 PCT/US10/33523의 신속한 검출을 위한 방법 및 장치.

제시된 프로토콜은 메티실린에 민감하고 메티실린 내성 황색포도상구균 10균을가진 실험 세트에서 검증되고 최적화되었다. 따라서 수정없이이 프로토콜은 세균성 세포 벽 생합성에 영향을 미치는 작용 메커니즘을 가진 S. 아우레우스 및 기타 항생제의 다른 균주에 직접 적용해야합니다. S. 아우레우스 이외의 박테리아 유형은 스트레스 매개 변수의 변이를 요구할 수 있습니다: 수용성 (효소) 및 기계적 스트레스. 용해성 스트레스제가 포도상 구균 이외의 세균 종의 시험에서 원하는 경우 리소스타핀은 포도상구균이기때문에 다른 스트레스 에이전트가 필요합니다 - 특정 효소.
전단 응력의 양은 액체의 유량에 비례하며 채널의 크기에 반비례하므로 원칙적으로 는 값의 넓은 범위 내에서 다양할 수 있습니다. 응력의 달성된 값은 다음과 같은 실험적 요인에 의해 제한됩니다: 더 높은 유량 하에서 박테리아를 제자리에 고...

세균성 저항의 상승은 최후의 수단의 우리의 약을 보호하기 위하여 빠른 표현형 기지를 둔 항생제 감수성 시험에 대한 필요를 강화합니다. 표준 감수성 검사는 여러 (8-24) 시간이 걸리는 항생제의 존재에서 세균 성장 억제에 기초한다. 우리는 항생제의 작용을 가속화하기 위하여 생합성 통로의 긴장 활성화에 의존하는 미세유체 플랫폼에 새로운 항생제 감수성 시험을 개발했습니다.
미세 유체 척도에서 항생제 감수성 검사는 박테리아의 작은 숫자를 필요로하기 때문에 효과적인 샘플 사용의 이점을 수행합니다. 또한, 미세 유체 장치는 다중 조건1,2에서여러 샘플을 테스트하기 위해 멀티플렉스될 수 있다. 최근에는 항생제 감수성 검사를 위한 다수의 미세유체 방법이3-9로보고되고 있다. 이러한 방법에서, 박테리아는 나노 및 피콜리터 물방울3,7,미세 유체 채널4-6,8의전체 부피에서, 또는 채널9의바닥 표면에 전기적으로 국한된 단일 박테리아로서 재배된다. 이 시험은 미세 유체 채널에서 수행되지만, 그들은 모두 기존의 방법과 유사한 항생제의 존재와 부재에서 미생물 성장을 모니터링합니다. 성장 측정은 광학 밀도, pH 민감한 염료 또는 밝은 필드/위상 대비 또는 형광 이미지를 통해 수행됩니다. 이러한 테스트 중 일부는 전통적인 방법 보다 빠른, 그들은 각각 수동적으로 항생제 저항을 감지. 즉, 이러한 방법은 여전히 최종 판독으로 세균 성장을 기다려야 하는 사용자를 요구합니다.
대조적으로, 우리는 항생제에 민감한 생화학적 경로를 활성화하기 위해 전단과 효소 스트레스의 조합을 사용하는 방법을개발했다(10). 그 항생제로 스트레스 박테리아에 도전하는 것은 더 빠른 감수성 시험을 만듭니다. 항생제에 저항하는 박테리아는 스트레스가 많은 조건을 견딜 수 있습니다. 반면에, 민감성 박테리아는 결합된 응력에 의해 급속하게 죽습니다. 형광 죽은 세포 얼룩을 사용하여 현미경 검사법에 의해 측정 된 1 시간 후에 세포 사멸의 비율은 박테리아의 표현형을 정의합니다 (저항성 대 민감성).
우리의 방법의 성공적인 구현을 위해, 박테리아는 미세 유체 채널의 바닥 표면에 고정되어야합니다. 이러한 방식으로 박테리아는 단일 평면에서 현미경으로 다양한 스트레스를 받고 동시에 심을 수 있습니다. 코팅 된 현미경 유리 슬라이드는 박테리아 고정에 사용됩니다. 슬라이드는 비특이적 단백질 결합을 위해 에폭화물 군을 가진 제조 업체에 의해 미리 코팅됩니다. 세균성 표면 단백질에 이러한 에산화물의 비특이적 결합은 박테리아를 슬라이드 표면에 공유합니다.
균주는 항생제의 부재 (대조군) 및 존재 (실험)에서 동일한 조건 (전단 + 효소 스트레스)에서 테스트됩니다. 각 채널의 위상 대비 및 형광 현미경 사진은 1 시간 동안 2 분마다 자동으로 촬영됩니다. 저항 지정은 그 때 대조군 채널에 있는 죽은 박테리아의 백분율을 대조채널에 있는 것과 비교하여 만들어집니다. 1 시간 후에, 세포 죽음 백분율이 1% 보다 큰 견본은 저항의 표시인 동안, 영향을 받기 쉬운 것으로 간주됩니다. 이 두 컷오프 사이에 떨어지는 백분율은 확정되지 않은 것으로 간주되며 샘플을 다시 테스트해야 합니다.
미세 유체 채널은 PDMS에 정의되며, 이는 미세 유체장치(11)에대한 선택의 재료이다. PDMS는 광범위한 파장, 생체 적합성, 불활성, 가스에 투과성이 있는 광활한 범위에서 광학적으로 투명하며 액체에 대한 투과성이 낮습니다. 따라서 이러한 실험에 적합합니다.
기계적/전단 응력은 고정된 박테리아를 통해 실온 매체의 흐름에 의해 생성됩니다. (참고: 미디어를 37°C로 온난화하는 것은 분석 결과에 큰 영향을 미치지 않습니다.) 자동 주사기 펌프는 1 ml/분의 유속으로 미세 유체 채널(200 μm x 400 μm)을 통해 미디어(사구 얼룩 +/-항생제 포함)를 강제하여 6.25kPa의 전단 력 또는 전단 속도 6,000초-1을제공합니다. 이 비율은 황색포도상구균에이전에 연구된 전단 응력과 같거나 초과합니다.
효소, 리소스타핀은 황색포도상구균 세포벽에 직접적인 손상을 일으키기 때문에 예비 실험을 위해 선택되었다. 리소스타핀(0.7 ng/ml)의 농도는 세균성 세포벽 손상을 유발하기에 충분했지만, 실험 기간 내에 항생제 없이 세균세포사멸을 유발하는 것만으로는 충분하지 않았다. Lysostaphin세균성 감수성의 정확한 지정을 위해 필요하지 않습니다 그러나 그것은 영향을 받기 쉬운 긴장에 있는 증가한 세포 죽음으로 이끌어 내는 결과를 증강않습니다. 대조적으로, 전단 응력은 분석 기능에 중요합니다. 메티실린에 민감한 황색포도상구균균이 흐름이 없는 경우 리소스타핀과 옥사실린으로 치료될 때, 실험 과정에서 세포 사멸이 기록되지 않는다.
세포 생존가능성은 형광사세포얼룩(12)으로모니터링된다. 염료의 선택은 손상된 세포만 선택적으로 얼룩지게 하는 능력, 살아있는 세포에 대한 독성, 그리고 낮은 배경 형광에 기초하여, 추가 단계없이 세포 미디어에 직접 첨가할 수 있었습니다. 0.25 μM의 형광염 염료 농도의 선택은 형광 분광광에 대한 1.6초 노출 시간 동안 허용 가능한 신호 수준을 달성하기 위한 것이었다.
베타 락탐, 옥사실린, 우리의 예비 연구에서 사용 되었다. 메티실린 내성 S. 아우레우스(MRSA) 종은 옥사실린에 내성이 있으며 실험 기간 내에 상당한 세포 사멸을 나타내지 않습니다. 50 μg/ml의 농도는 예비 연구에서 결정되었다. 항생제의 낮은 농도는 저항과 영향을 받기 쉬운 긴장 사이 더 적은 분리를 주었습니다, 높은 농도는 실험 결과에 있는 감사한 다름을 일으키는 원인이 되지 않는 동안.
우리는 이전에 세포벽 생합성을 억제하는 항생제로 세균성세포벽(13)에 직접 영향을 미치는 기계적 및 효소 응력을 결합한 시험의 성공적인 개발에 대해보고하였다 14,15. 이러한 원칙 증명 실험은 MRSA 및 메티실린에 민감한 S. 아우레우스(MSSA)의 패널에서 수행되었다. 그러나, 적절 한 실험 매개 변수의 선택으로, 우리의 방법은 박테리아의 여러 종 및 항생제의 여러 클래스에 적용 해야 합니다.

<table><tbody><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen Corporation</td><td>S7020</td><td>데드 셀 형광 염색</td></tr><tr><td>소 세럼 알부민 (BSA)</td><td>Sigma Aldrich, Inc</td><td>A9418-5G</td><td>리소스타핀 저장에 사용</td></tr><tr><td>아세테이</td>트 <td>나트륨 Sigma Aldrich, Inc</td><td>S8750-500G</td><td>리소스타핀 저장에 사용</td></tr><tr><td>리소스타핀&nbsp;</td><td>Cell Sciences</td><td>CRL309A</td>은 <td>1 mg 고형분으로 제공됩니다. 보관: 20mM 아세트산 나트륨에 녹입니다. BSA 용액과 혼합하여 1% BSA 및 100 &마이크로의 최종 농도를 얻습니다. g/ml &nbsp; 보관용 리소스타핀&nbsp;</td></tr><tr><td>Oxacillin salt</td><td>Sigma Aldrich, Inc</td><td>28221-1G</td><td>항생제</td></tr><tr><td>Mueller Hinton Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0757-17-6</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma Aldrixh</td><td>S3014-500G</td><td>2% 첨가 Mueller-Hilton 육수에 1</td></tr><tr><td>ml, Luer-lock 주사기&nbsp;</td><td>BD (벡턴, 디킨슨, 컴프)</td><td>14-823-2F</td><td></td></tr><tr><td>2온스, 루어락 주사기</td><td>BD(Beckton, Dickinson 및 Comp.)</td><td>309653 - 60 mL</td><td>오버필 ~65 ml</td></tr><tr><td>현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>도립 형광 현미경 Olympus IX-70</td><td>Cambridge Scientific</td><td>9349</td><td></td></tr><tr><td>60X, 형광/위상차 대물렌즈</td><td>Olympus Corp.</td><td>LCPlan F1 60x/0.70 Ph2</td><td></td></tr><tr><td>Retiga 12비트 흑백 CCD 카메라</td><td>QImaging</td><td>RET-4000R-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>현미경 자동화</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>셔터 위상차/형광</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H204/H202</td><td></td></tr><tr><td>X/Y 스테이지&nbsp;</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H107AENN</td><td></td></tr><tr><td>포커스 모터</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H122</td><td></td></tr><tr><td>XYZ 제어용 조이스틱</td><td>PRIOR Scientific</td><td>CS152EF</td><td></td></tr><tr><td>프로스캔 컨트롤러</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H3-XY2</td><td></td></tr><tr><td>이미지 수집 소프트웨어</td><td>Fraunhofer CMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플로우 셀 어셈블리 및 PDMS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플로우 셀</td><td>BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI</td><td>3333-1044</td><td>엔지니어링 도면은 Fraunhofer CMI</td></tr><tr><td>Glass window</td><td>Fraunhofer CMI</td><td>3333-1054</td>에서 제작하였으며, <td>Glass window는 Fraunhofer CMI</td></tr><tr><td>BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm</td><td>Edmund Optics Inc</td>.에서 적절한 크기로 절단하였습니다.<td>NT48-543</td><td></td></tr><tr><td>씰링 플레이트</td><td>BU Scientific Instruments Facility</td><td>3333-1045</td><td></td></tr><tr><td>에폭사이드 유리 슬라이드</td><td>Arrayit Corporation</td><td>SuperEpoxy 2</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 마스터</td><td>Fraunhofer CMI</td><td>3333-1053</td><td>UPM-0005 (초정밀 플라이 절단기)</td></tr><tr><td>PDMS 슬라이드 디자인</td><td>Fraunhofer CMI</td><td>3333-1053</td><td></td>으로 알루미늄 또는 황동으로 가공 된 마스터</tr><tr><td>튜빙</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>너트, 슈퍼 플랜지 없는 Tinytight, 헤드리스, 1/16 인치, PEEK, 녹색&nbsp;</td><td>IDEX 건강 과학</td><td>M-644-03</td><td>플로우 셀 입력/출력은 이 페룰</td></tr><tr><td>페룰, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS 잠금 링, 블랙</td><td>IDEX 건강 과학</td><td>M-657</td><td></td></tr><tr><td>너트, 슈퍼 플랜지 없는 Tinytight, 헤드리스, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, 자연</td><td>IDEX 건강 과학</td><td>P-255</td><td></td></tr><tr><td>페룰, 슈퍼 Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), 노란색</td><td>IDEX Health Science에 대해 탭됩니다.</td><td>P-259</td>는 <td>Luer-lock 어댑터</td></tr><tr><td>튜빙, 테플론 FEP, .030 인치 x 1/16 인치 x 20 피트, 녹색에 적합합니다.</td><td>IDEX Health Science</td><td>1520G</td><td></td></tr><tr><td>어댑터, 빠르게 여성 루어를 여성 1/4-28에 연결, PEEK, 빨간색&nbsp;</td><td>IDEX 건강 과학</td><td>P-658</td><td></td></tr></tbody></table>

칩에 스트레스 유발 항생제 감수성 테스트

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

우리는 스트레스 기반 환경에서 항생제 감수성 검사를 위한 신속한 미세 유체 방법을 개발했습니다. 유체는 미세 유체 채널의 바닥에 고정 된 박테리아를 통해 고속으로 전달됩니다. 스트레스와 항생제의 존재에서, 박테리아의 취약 한 긴장 은 급속 하 게 죽는다. 그러나, 저항하는 박테리아는 이 스트레스가 많은 조건에서 살아남습니다. 이 방법의 뒤에 가설은 새로운: 항생제의 표적인 생화확적인 통로의 스트레스 활성화는, 항생제 감수성 시험을 가속화할 수 있습니다. 표준 항생제 감수성 검사 방법에 비해, 속도 제한 단계 - 세균 성장 - 항생제 적용 중에 생략된다. 이 방법의 기술적 구현은 표준 기술과 혁신적인 접근 방식의 조합입니다. 이 방법의 표준 부분에는 세균 배양 프로토콜, 폴리디메틸실록산(PDMS)의 미세 유체 채널 정의, 형광을 이용한 세포 생존 가능성 모니터링, 박테리아 계수에 대한 배치 이미지 처리 등이 포함됩니다. 이 방법의 혁신적인 부분은 기계적 응력 적용을 위한 배양 매체 흐름의 사용, 박테리아를 손상시키지 만 손상시키지 않는 효소의 사용, 세균 부착을 위한 미세어기 기판의 사용에 있다. 개발 된 플랫폼은 항생제 및 비 항생제 관련 약물 개발 및 테스트에 사용할 수 있습니다. 표준 세균현절 실험과 비교하여, 약물의 효과는 조절 기간 동안 반복적으로 켜고 끌 수 있다. 동일한 세균 집단의 반복적인 관찰은 동일한 실험의 과정을 통해 가능하다.

도 4에 제시된 데이터는 항생제 함유 미세 유체 채널에서 시간이 지남에 따라 취약한 황색포도상구균 균주의 반응을 보여줍니다. 1분에서 획득한 위상 대비 이미지는 1시간 실험의 끝에 그림 4A 및 B로 나타낸다. 분석된 1시간 데이터는 적색(5,828)으로 강조표시된 박테리아와 함께 도 4C로 도시된다. 해당 형광 이미지는 그림 4D 및 E로표시됩니다. 분석된 1시간 데이터는 적색(174명 사망)으로 강조된 형광균을 가진 도 4F로 도시된다.
이 이미지 집합은 여러 점을 보여 줍니다. 가장 중요한 것은, 형광균의 수가 크게 증가하여 실험이 끝날 때까지 관찰된다(그림 4D 및 E에서</strong...

우리는 급속한 항생제 감수성 시험을 위한 미세유체 플랫폼을 개발했습니다. 유체는 미세 유체 채널의 바닥에 고정 된 박테리아를 통해 고속으로 전달됩니다. 스트레스와 항생제의 존재에서, 박테리아의 취약 한 긴장 은 급속 하 게 죽는다. 그러나, 저항하는 박테리아는 이 스트레스가 많은 조건을 살아남을 수 있습니다.

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

다음 실험의 전반적인 목표는 관심 항생제에 대한 박테리아의 감수성을 신속하게 결정하는 것입니다. 이것은 먼저 로그 위상 박테리아를 미세유체 채널의 바닥으로 고정시킴으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 항생제와 살아 있는 죽은 형광 염색제가 포함된 배지를 높은 유속으로 채널을 통해 밀어 넣어 박테리아에 스트레스를 주고 항생제 표적 생화학 경로를 활성화합니다.다음 위상차 및 형광 이미지는 박테리아 생존력을 모니터링하기 위해 1시간 동안 2분마다 자동으로 수집되며, 실험의 각 시점에서 획득한 이미지로부터 정규화된 박테리아 사멸률이 계산됩니다. 궁극적으로, 박테리아의 항생제 감수성 표현형은 시간이 지남에 따라 정규화된 세포 사멸률의 증가에 따라 결정됩니다. 육수, 희석 또는 미세배양과 같은 기존 표현형 감수성 검사 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 당사의 방법이 박테리아 분열 모니터링을 필요로 하지 않는다는 것입니다.오히려, 우리는 기존의 작은 인구 집단에서 직접 그들의 감수성 프로필에 접근할 수 있습니다. 이 기법의 함의는 내성 세균 감염 진단에 미치는 영향이 빠르고, 쉽게 다중화 및 자동화될 수 있기 때문에, PDMS 층을 생성하기 위해 실온의 진공 챔버에서 갓 준비된 PDMS 점성 혼합물을 탈기하는 것으로 시작하고, 한 시간 후에 스케일을 사용하여 알루미늄 몰드에 미리 정의된 질량의 DGA PDMS 혼합물을 채웁니다. PDMS를 금형 중앙에 천천히 붓고 금형의 수평을 유지하고 핀이 덮이지 않도록 주의하십시오.PDMS를 섭씨 37도의 오븐에서 하룻밤 동안 경화시킵니다. 다음 날 아침, 상단 몰드 플레이트를 분리하고 금형에서 경화된 PDMS를 조심스럽게 제거하여 플로우 셀을 조립합니다. 먼저 유리창을 플로우 셀 포켓에 넣습니다.그런 다음 활성 면이 위로 향하게 하여 플로우 셀(flow cell) 포켓 내부의 유리창 위에 코팅된 유리 슬라이드를 놓습니다. 채널이 아래를 향하도록 새로 생성된 PDMS 레이어는 채널 입력이 금속판의 관통 구멍과 정렬되도록 그 위에 있습니다. 레이어 사이에서 공기를 부드럽게 밀어낸 다음 PDMS가 유리 창을 향하도록 PDMS 유리 슬라이드 어셈블리를 뒤집습니다.PDMS 채널 입력을 금속판의 관통 구멍과 겹친 다음 압력판을 위에 놓고 나사를 조입니다. 이제 조립된 플로우 셀을 현미경 아래에 놓고 현미경 배율을 60배로 설정하고 채널 위치를 미리 정렬하여 로그 상 박테리아를 플로우 셀에 로

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

세균성 병원체 진단을위한 간단 하루 워크플로우 방식의 디자인은 혈류 감염의 급속한 인식을 가능하게합니다. 여덟 임상적으로 관련성이 높은 세균성 대상과 항생제 저항 프로파일을 포함하는 더 적절한 치료로 이어질 수있는 당일에 임상 초기 통찰력을 제공합니다.

혈액 배양에서 세균 병원체 탐지 및 항균 저항 테스트를위한 하루 워크플로 계획

출처: Liu, P. C., et al. 항생제 선택 하에서 박테리아의 적응 진화를 위한 저비용의 자동화된 Morbidostat의 설계 및 사용. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 미세유체 칩을 사용하여 트리메토프림 항생제 스트레스 하에서 야생형 및 트리메토프림 내성 대장균 균주의 성장과 형태를 시각화하고 비교하는 방법을 보여줍니다.

항생제 약물 내성을 연구하기 위한 미세유체 칩의 박테리아 성장

출처: Zhang, M. 외, 단일 박테리아 내 중수소 통합 자극 라만 산란 영상을 통한 신속 항균 감수성 검사. J. Vis. Exp. (2022)이 영상은 자극 라만 산란 현미경을 활용해 중수소 표지된 대사 활동을 추적하여 항생제에 대한 감수성을 평가하는 방법을 시연합니다. 탄소-중수소 신호를 모니터링함으로써 내성 및 감수성 박테리아 집단을 신속히 검출할 수 있게 합니다.

자극 라만 산란 현미경을 이용한 박테리아 항생제 감수성 검출

이 비디오는 트랜스듀서 칩에 고정된 표적 항원과 항체의 상호 작용을 연구하기 위한 전도도 측정 바이오센서 분석을 보여줍니다. 바이오센서는 고정되지 않은 표적 항원에 결합하기 위해 나노바디에 융합된 기능적 촉매 부위가 있는 β-락타마제 효소인 이중 기능 키메라 단백질을 갖도록 설계되었습니다. 결합시 β-락타마제 효소에 의한 항생제 기질의 촉매 가수분해는 전기 신호를 생성하여 항원-항체 상호 작용을 확인합니다.

단백질-단백질 상호작용을 위한 β-Lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay

약물 농도를 동적으로 조정하여 항생제 약물 내성의 특성을 분석할 수 있는 저비용의 구성 가능한 모비드도스타트를 설명합니다. 이 장치는 다중화된 미세유체 플랫폼과 통합될 수 있습니다. 이 접근 방식은 실험실 항생제 약물 내성 연구를 위해 확장할 수 있습니다.

디자인과 낮은 비용의 사용, 자동 Morbidostat 박테리아의 적응 진화에 대한 항생제 약물 선택에서

항균 시너지 테스트 조합에 사용 되는 두 개 이상의 항생제의 효과 평가 하는 데 사용 하 고는 일반적으로 두 가지 방법 중 하나에 의해 수행: 바둑판 배열 또는 시간 죽 일 분석 결과. 여기, 우리는 자동화 된, 잉크젯 프린터 기반 바둑판 배열 시너지 기술 및 고전적인 시간 죽이기 시너지 연구 제시.

잉크젯 프린터 기반으로 테스트 자동화 된 바둑판 배열 및 수동 시간 죽 일 방법 항균 시너지

이 프로토콜은D2O대사의 단일 세포 자극 라만 산란 이미징에 의해 2.5시간 이내에 신속한 항균 감수성 테스트(AST) 분석을 제공합니다. 이 방법은 소변 또는 전혈 환경의 박테리아에 적용되며, 이는 클리닉에서 신속한 단일 세포 표현형 AST를 변형시킵니다.

단일 박테리아에 혼입된 중수소의 자극된 라만 산란 이미징에 의한 신속한 항균 감수성 테스트

이 프로토콜은 자연 환경에서 난치성 토양 미생물의 현장 배양을 위한 격리 칩(iChip)의 설계 및 사용을 설명합니다. 또한 항균제를 생산하는 토양 박테리아의 현장 재배에 대해서도 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 바람직한 특성을 가진 다양한 틈새에서 박테리아를 회수하도록 조정될 수 있습니다.

현장 분리 칩을 이용한 난치성 토양 박테리아의 분리 및 배양 (iChip)

본 프로토콜은 중환자실(ICU) 환자의 하기도 감염을 유발하는 15종의 병원체를 1시간 이내에 현장 진단(point-of-care detection)할 수 있는 완전 통합형 미세유체 칩 기반 LAMP 방법을 설명합니다.

중환자실 환자의 하기도 감염 원인균에 대한 신속 현장 진단

lensless 온칩 형광 현미경 플랫폼 시연입니다 예의 울트라 와이드 뷰 필드 이상의 이미지를 형광 물체 수, 디코딩 알고리즘을 기반으로 압축 샘플링을 사용하여 &lt;4μm 해상도&gt; 0.6-8 cm2. 이러한 작고 넓은 분야 형광 온 칩 영상 양상은 높은 처리량 cytometry, 희귀 세포 연구와 microarray 분석을 위해 도움이 될 수 있습니다.

칩에 Lensless 형광 현미경

배우세요 마이크로플루이딕 플랫폼을 이용한 항생제 감수성 신속 테스트 방법으로, 세균을 고정시키고 스트레스 조건에서 항생제를 적용하여 세균 생존율을 실시간으로 평가합니다. 이 기술은 기존 배양법보다 빠르고 효율적인 감염 진단에 활용됩니다.

칩에 스트레스 유발 항생제 감수성 테스트

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