조류 종의 소화 기관을 통과 한 후 감염성 프리온을 확인하기위한 절차

이 절차의 전반적인 목표는 미국 까마귀의 소화 기관을 통한 감염성 PreOn 물질의 통과를 문서화하는 것입니다. 이것은 먼저 전염성 PreOn 물질로 까마귀를 측정하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 배설물 후 4시간 동안 까마귀 배설물을 채취하여 생쥐에게 주입할 준비를 하는 것입니다.

다음 마우스는 1ml의 까마귀 배설물 균질액을 복강내에 접종합니다. 마지막 단계는 생쥐가 생쥐의 임상 징후를 보일 때까지 매일 모니터링하는 것입니다. 궁극적으로 웨스턴 블롯 분석은 마우스 모델에서 감염성 PreOn의 존재를 확인하고 질병 전파를 확인하는 데 사용됩니다.

까마귀가 운반할 수 있다는 아이디어. CWD는 어느 겨울날 사육 엘크 시설로 차를 몰고 가서 조사를 하다가 로드킬 엘크가 까마귀에게 잡아먹히는 것을 보았고, 그날 늦게 까마귀가 하늘에서 튀어나와 이 사료통에 내려앉아 엘크 바로 옆에서 먹이를 먹고, 엘크가 먹고 있던 곡물을 배설하는 것을 보았을 때 우리에게 왔습니다. 그 여름 콜로라도, 와이오밍 전역에서 뉴 멕시코의 집중 지역에서 겨울을 보내고, 뉴 멕시코의 그 지역이 어떤 CABD가 튀어 나온 곳이며 균열 낭비 질병의 진원지에서 수백 마일 떨어진 곳에 있습니다. 그래서 이 두 가지 관찰을 통해 우리는 잠재적으로 까마귀가 CWD를 주변 지역으로 운반하는 역할을 할 수 있다는 생각을 하게 되었습니다.

잘못된 복강내 및 구강 위장 기술은 연구 동물의 죽음을 초래할 수 있으므로 이러한 기술의 시각적 시연이 중요합니다. 먼저 스크램블 에그에 파란색 염료 4방울을 넣고 잘 섞는다. 그런 다음 염료와 달걀 혼합물 5ml를 2인치 가비지 바늘에 넣고 한 사람이 까마귀를 부드럽게 제지합니다.

까마귀의 부리를 목구멍 아래가 보일 만큼 넓게 벌리고 위장 바늘을 식도에 조심스럽게 삽입합니다. 호흡 변화가 감지되면 주사기를 제거하고 기관에 삽입되었을 수 있으므로 다시 시도하십시오. 위장 바늘이 식도에 있다는 것이 확실해지면 주사기의 내용물을 천천히 표현합니다.

청록색으로 얼룩진 배설물이 더 이상 배설되지 않을 때까지 30분마다 까마귀를 확인하십시오. 실험용 까마귀는 파랗게 염색된 배설물을 그만두는 데 약 4시간이 걸렸습니다. 다음으로, 감염되지 않은 C 57 검정 6 마우스 뇌 1 부분과 멸균 PBS 4 부분 및 유리 구슬 몇 개를 총알 블렌더에 넣습니다.

균질화기는 매끄러운 견실함이 달성될 때까지 1 5 분 동안 표본을 균질화합니다. 불치병에 걸린 R ML 챈들러 균주에 감염된 C 57 블랙 식스 마우스 뇌를 사용하여 이 과정을 반복합니다. 다음 1 분 동안 3000 시간 G에서 균질한 것을 원심 분리하십시오.

더 큰 입자상 물질을 제거합니다. 그런 다음 상등액을 제거하고 동일한 부피의 멸균 XPBS로 희석하여 뇌 물질 부피당 10%의 중량을 생성합니다. PBS에서는 가스 주입 17시간 전에 필요할 때까지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

까마귀 우리에서 음식은 제거하되 물은 제거하지 마십시오. 까마귀를 무작위로 치료 그룹에 할당하고 2인치 개배지 바늘을 사용하여 갓 해동한 정상 또는 감염된 쥐 뇌 균질화 5ml로 각 까마귀를 구강 배징합니다. 그런 다음 까마귀를 개별 우리로 옮깁니다.

배설 후 4시간 동안 각 케이지 내의 모든 배설물을 수집하고 모읍니다. 다음으로, 균일한 질감이 얻어질 때까지 유리 구슬이 있는 파란색 총알 균질화기에서 각 까마귀에 대해 고인 배설물을 균질화합니다. 그런 다음 혼합물 500 마이크로 리터를 가져 와서 9.5 밀리리터의 멸균 PBS 원심 분리기로 1에서 20으로 희석하고 희석 된 대변 균질산염을 15 분 동안 사용합니다.

1, 300배 G를 추가한 다음 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 2차 미생물 감염의 위협을 최소화하려면 균질산염 1밀리리터당 페니실린 1단위와 스트렙토마이신 1마이크로그램을 첨가하십시오. 그런 다음 3000 MP 에이터에서 30초 동안 70의 전력 설정으로 샘플을 초음파 처리하여 남아 있는 미생물의 멤브레인을 파괴합니다.

먼저, 마우스를 여기에 표시된 4개 그룹 중 하나에 무작위로 할당합니다. 그룹 1은 감염된 까마귀 배설물을 받게 됩니다. 그룹 2는 감염되지 않은 까마귀 배설물을 받게 됩니다.

그룹 3은 감염된 쥐의 뇌를 받고 그룹 4는 정상적인 쥐의 뇌를 받습니다. 그런 다음 MN 그룹 1과 2의 경우 긁힌 양성 또는 긁힌 음성 까마귀 배설물을 1밀리리터 추출합니다. 마우스의 그룹 번호에 따라 25 게이지 바늘을 사용하여 균질화합니다.

그런 다음 등쪽 목 털로 쥐의 목덜미를 긁습니다. 엄지와 검지를 사용하여 부드럽게 회전하여 복부 쪽을 노출시킵니다. 머리가 약간 낮도록 마우스의 뒤쪽 끝을 들어 올립니다.

바늘을 피부를 통해 1cm, 정중선 옆으로 1cm, 천장관절 앞쪽으로 1-2cm 삽입하십시오. 그런 다음 약간 뒤로 당겨 균질한 것을 마우스의 체강에 천천히 주입합니다. 다음으로, 그룹 3과 4의 동물에 주입하기 위해 스크랩피를 사용하거나 사용하지 않고 동결된 마우스 뇌를 준비합니다.

먼저 haws stock 혼합물을 1-10 멸균 PBS로 희석합니다. 그런 다음 그룹 3의 마우스에 희석된 스크래피 포지티브 뇌 균질액 1밀리리터를 주입하고 묽게 된 스크래피 음성 뇌 균질액 1밀리리터를 마우스에 주입합니다. 그룹 4에서.

마우스가 긁힌 마우스의 임상 징후가 나타날 때까지 매일 모니터링합니다. 임상 징후에는 후만증, 운동 실조, 뻣뻣한 꼬리, 그루밍 부족, 수척 및 무기력증이 포함될 수 있습니다. 6가지 임상 징후 각각에 대해 매일 점수를 매기십시오.

눈에 보이는 징후가 분명한 경우. 0은 눈에 보이는 기호가 없음을 의미합니다. 하나는 보통과 같고 두 개는 심각한 수준의 징후와 같습니다.

각 별자리에 대한 일일 총 점수가 1일 동안 8 이상, 3일 동안 또는 365일 동안 연속적으로 6 이상일 때 마우스를 안락사시킵니다. 접종 후, 안락사 직후의 뇌를 적출하여 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 그런 다음 단편적인 진단을 확인하기 위해 사체를 적절하게 폐기하십시오.

얼어붙은 쥐의 뇌를 해동하고 균일한 질감이 얻어질 때까지 유리 구슬이 있는 파란색 총알 균질화기에서 개별적으로 균질화합니다. 다음으로, pH 8에서 109.39 마이크로리터의 PBS와 12.5 마이크로리터의 500 밀리몰 EDTA 및 3.1 마이크로리터의 50 마이크로그램 단백질 분해 효소 K 용액을 결합하여 125 마이크로리터의 단백질 분해 효소 K 분해 용액을 준비합니다. 그런 다음 3마이크로리터의 소화액을 뇌 17마이크로리터에 첨가합니다. 균질화.

섭씨 45도의 진탕 열 블록에서 샘플을 30분 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 8마이크로리터의 SDS 페이지 로딩 버퍼를 추가하여 분해 용액을 비활성화하고 섭씨 95도에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 샘플을 12%SDS 페이지에 로드합니다.

젤 전기 이동법은 단백질을 전기이동법하고 한 번 옮겨지는 IMON PVDF 막에 젤을 옮깁니다, 20 사이 0.2%를 가진 PBS에 있는 5%non-fat 우유를 가진 PVDF 막을 막고 실내 온도에 1 시간 동안 바위. 그런 다음 차용 224 및 IPRP 단클론 항체를 말 무 peroxidase에 접합 한 IPRP 단클론 항체를 사용하여 배양 후 실온에서 1 시간 동안 수퍼 블록과 암석에서 1 시간 동안 희석합니다. PBS에서 20 % 사이에 0.2 %로 멤브레인을 1 시간 동안 헹굽니다.

멤브레인을 화학발광 기질로 5분 동안 배양하여 단백질을 시각화합니다. 그런 다음 G box gel 문서화 시스템에서 멤브레인을 이미징합니다. 병에 걸린 마우스는 임상적 마우스 긁힌 징후의 징후에 의해 확인되었고, 질병 확인은 서양의 혈액 분석에 의해 완료되었습니다.

스크래피가 없는 균질한 정상 마우스의 뇌가 여기에 나와 있으며, 프로테아제 K의 도움이 있거나 없는 두 개의 레인이 왼쪽에 표시되며, 프로테아제 K가 없는 경우 세 개의 굴곡이 보입니다. 그러나 정상 단백질은 단백질 분해 효소에 취약하기 때문에 두 번째 줄에서는 굴곡이 보이지 않습니다. 3번째 열은 프로테아제로 절단된 긁힌 양성 대조군 샘플을 보여줍니다.

프로테아제는 단백질의 n 및 c 말단의 손실로 인해 3개의 원래 밴드에서 이동을 일으킵니다. 그러나 감염된 단백질은 정상적인 뇌 샘플에서처럼 완전히 소화될 수 없다. 접종된 까마귀의 배설물을 접종한 쥐의 뇌를 소화한 단백질분해효소 K가 오른쪽에 표시되어 있으며, 띠가 소화되지 않아 샘플에 프리온이 존재함을 확인합니다.

이 비디오를 시청하고 나면 까마귀의 소화 기관을 통한 감염성 프리온 물질의 이동을 문서화하는 방법을 더 잘 이해할 수 있을 것입니다. 그런 다음 복강간 마우스 생물학적 분석법으로 감염성을 확인합니다.