Name: 조류 종의 소화 기관을 통과 한 후 감염성 프리온을 확인하기위한 절차 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-06T21:30:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 학습하세요 미국 까마귀의 소화 기관을 통과한 후에도 감염성 프리온이 배설되는지 확인하는 방법을. 쥐 생체 검정과 웨스턴 블롯 분석을 통해 프리온 감염성을 검증하는 이 기법은 야생동물 질병 전파 연구에 활용됩니다.

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우리는이 연구와 USDA에 사용 된 까마귀를 제공하기위한 S. 베르너에게 감사의 말씀을 전합니다, APHIS, 동물 관리 및 모니터링을위한 WS, NWRC 동물 관리 직원. 기재 또는 제품의 사용은 USDA의 보증을 의미하지는 않습니다. 이 연구를위한 자금 조달은 USDA, APHIS, 수의 서비스에 의해 제공되었다.

우리 프로토콜은 우리가 이전에 7을 발표 한에서 적용됩니다. 동물과 관련된 모든 절차는 미국 농무부 (USDA) 동식물 건강 검사 서비스 (APHIS), 야생 동물 서비스 (WS), 국립 야생 동물 연구 센터 (NWRC)의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 까마귀 Gavaging <ol><li> 미국의 까마귀의 소화관을 통해 &#39;의사 뇌 물질&#39;의 통과 시간을 예상하고있다. <ol><li> 요리 (그림 1) 투여 바늘 2를 사용하여 청색 염료 및 위관 1 까마귀와 계란을 스크램블 5 ㎖를 혼합한다. </li><li> 블루 / 그린 묻은 대변 배설을 더 이상 제공하지 않습니다 때까지 까마귀에게 30 분마다 확인합니다. </li></ol></li><li> 감염되지 않은 및 말기 RML (챈들러 주)에 감염된 C57BL / 6 마​​우스의 뇌를 얻습니다. </li><li> 1X와 총알 블렌더 균질의 정상 20 % 중량 / 부피 감염된 마우스의 뇌 균질 생성인산염 완충 생리 식염수 (PBS)과 유리 구슬, 다음 큰 입자상 물질을 제거하기 위해 1 분 3,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 멸균 PBS의 10 % 중량 / 부피를 생성하는 1X PBS의 동일한 볼륨을 넣어. 필요할 때까지 -80 ° C에서 동결. </li><li> 이전 위관 17 시간은 까마귀 펜에서, 물없는 음식을 제거 할 수 있지만. </li><li> 무작위로 치료 그룹에 까마귀를 할당하고 경구 투여 바늘에 2를 사용하여 정상 또는 감염 중 하나를 마우스의 뇌 균질 5 ㎖에 각 까마귀 위관. </li><li> 전송 개별 케이지에 까마귀와 4 시간 포스트 위관 (그림 2) 각 케이지 내의 모든 배설물을 수집하고 풀. </li><li> 균일 한 질감이 달성 될 때까지 유리 구슬 총알 믹서 균질화 각 까마귀에 대한 풀링 대변을 균질화. * 까마귀 배설물은 대부분 액체하고 쉽게 혼합 할 수 있습니다. </li><li> 각 까마귀를 들어, 10 ㎖의 총 부피 9.5 ㎖의 1X PBS로 대변 균질의 500 μl를 희석. </li><li> 배설물 homogena을 원심 분리기1,400 XG에 15 분 동안 테 상층 액을 추출합니다. </li><li> 2 차 세균 감염의 위험을 최소화 균질의 100 μL 당 100 단위의 μL / ㎖ 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신 (인비 트 로젠, NY)와 상층 액을 치료하는 다음 줄이기 위해 20 분 동안 실온에서 UV 빛의 밑에 배치 바이러스와 세균 오염의 위험이 있습니다. UV 노출 후, 남아있는 미생물의 세포막을 방해하는 30 초 70를 설정에서 3000 MP를 초음파기의 초음파 처리 샘플. </li></ol> 2. 마우스 접종 <ol><li> 무작위로 다음 치료 그룹 (표 1)에 마우스를 할당 : <ol><li> 그룹 1 - 긍정적 인 치료 마우스는 구두로 5 ㎖에 감염된 마우스의 뇌에 gavaged 까마귀의 배설물 균질 1 ㎖로 (IP)을 복강 내 주사. </li><li> 그룹 2 - 음의 치료 마우스는 경구 5ml는 정상 마우스의 두뇌와 gavaged 까마귀의 배설물 균질 1 ㎖로 IP를 접종. </li><li> infecte 희석1:100 W / 1X PBS에서 V에 그룹 3, 4 D와 일반 마우스의 뇌 균질. </li><li> 그룹 3 - 긍정적 인 제어 마우스는 감염된 마우스의 뇌 파쇄 액 1 ㎖로 IP를 접종. </li><li> 그룹 4 - 음성 대조군 마우스는 정상 마우스의 뇌 균질 물 1 ㎖로 IP를 접종. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 치료 그룹 </td><td> 동물의 수 </td></tr><tr><td> 그룹 1 </td><td> 스크래피 + 까마귀 배설물 </td><td> (100) </td></tr><tr><td> 그룹 2 </td><td> 스크래피 - 까마귀 배설물 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 그룹 3 </td><td> 스크래피 + 마우스의 뇌 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 그룹 4 </td><td> 스크래피 - 마우스의 뇌 </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> . 표 1 스크래피 접종의 상태 (음 양의 +, -)과 동물의 수는 7을 사용했다. <ol start="2"><li> 복강 마우스를 접종 : <ol><li> 부드럽게 목덜미의 엄지와 검지 손가락으로 등쪽 목 모피로 마우스와는 복부 측면을 노출 회전. </li><li> 머리가 약간 낮은 그래서 마우스의 후방 끝을 올립니다. </li><li> 1cm 피부, 중간 선 1 센티미터 측면을 통해 25 G 바늘을 삽입하고 1~2cm 전방 천장 관절에 바늘 잠금 주사기를 사용. </li><li> 1 ml의 마우스 체강 내에 접종 천천히 주입한다. </li></ol></li></ol> 3. 마우스 모니터링 <ol><li> 그들은 마우스 스크래피의 임상 증상을 표현할 때까지 매일 쥐를 모니터링합니다. 임상 적 증상이 포함될 수 있습니다 : 후만 변형, 운동 장애, 뻣뻣한 꼬리, 손질의 부족, 쇠약, 무기력합니다. </li><li> 0 표시 = 없음, 1 = 보통, 2 = 심한 곳에 흔적이 분명 할 때 6 임상 증상 각각에 대해 마우스를 점수. </li><li> 각 기호에 대한 일일 총 점수는 1 일 동안 ≥ 8에 도달 할 때 쥐를 안락사, ≥ 6 연속 3 일간, 또는 365에서 일 접종 (DPI)을 배치한다. </li><li> 수확의 두뇌 바로 다음에 euthan-70 ° C에서 아시아 및 저장 </li><li> , 스크래피의 진단을 확인하기 다음과 같이 희석 된 단백질 분해 효소-K 용액 (PK)의 50 ㎍ / ㎖의 3 μL와 뇌 샘플을 소화하기 : 3.1. μL PK, 500 mM의 EDTA의 12.5 μL, pH가 8, 45 ° C에서 30 분 동안 1X PBS의 109.39 μL은 다음 8 μL 로딩 버퍼를 추가하고 5 분 동안 95 ° C에서 샘플을 배양하여 PK를 비활성화. 12 % SDS-PAGE 젤, electrophorese 실온에서 1 시간 동안 PBS 0.2 % 트윈 20 Immobilon PVDF 막 5 % 무 지방 우유와 함께 블록에 전송 상에로드 샘플. 다음, 상온에서 1 시간 동안 슈퍼 블록에 희석 냉이 퍼 옥시 다제,에 접합 Bar224 안티의 PrP 단일 클론 항체로 프로브. PBS-0.2 % 트윈 20과 1 시간 동안 멤브레인을 씻어. 시각화, G-상자 젤 문서 시스템에 화학 발광 기판과 이미지로 웨스턴 블롯 5 분을 배양합니다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 까마귀의 소화 시스템을 통해의 PrP 해상도 물질의 통과를 문서화하는 과정을 보여줍니다. 우리는 까마귀는 질병이없는 지리적 영역의 PrP 해상도 물질을 이동시키다 수있는 능력을 가지고 있는지 확인하기 위해 기존의 방법을 사용했다. 다른 사람은 그것을 제거하는 데 실패 둘 다 19 ~ 21과 설치류 (22, 23) 소화 체액을 반추하는의 PrP 해상도의 저항을 평가했다. 그들은 또한 잠재적으로 썩은 트리암시놀론 주입술 해상도 물질 발생 및 프리온 질병의 확산을 촉진 풍경을 통해이 물질을 수송 할 수 이러한 기술의 미래 응용 프로그램은 다른 육식 동물 (24)에 적용되어야한다. 우리는 까마귀의 소화관을 통해 균질 마우스 뇌의 대략적인 통과 시간을 평가하는 간단한 방법을 제공하고, 우리의 스크램블 &#39;의사 두뇌 물질에 파란색 식용 색...

전염성 해면상 뇌증 (TSE)는 야생 동물에 영향을 미치는 치명적인 전염성 신경 퇴행성 질환, 가축, 인간입니다. TSE 질병의 전염 물질은 프리온 단백질 1의 잘못 폴딩 또는 병원성 이소 PRP (해상도)이 나타납니다. 양과 염소의 스크래피,, 소 해면상 뇌증 (동물 TSE 질환 노새 사슴 (Odocoileus의 hemionus), 흰 꼬리 사슴 (Odocoileus의 virginianus), 엘크 (Cervus의의 elaphus), 그리고 사슴 (에 Alces alces)에 만성 소모성 질병 (CWD)를 포함 국내 가축의 BSE) 으 농장 밍크의 전염성 밍크 뇌증, 고양이의 고양이 해면상 뇌증, 인간이 아닌 영장류 8과 해면상 뇌증, 이국적인 동물원에 이국적인 유제 해면상 뇌증은 가족 Bovidae의 반추. 하나의 인간 TSE 질환, 변종 크로이츠 펠트 - 야콥 병은 희귀의 PrP RES-contamin 소비에 의해 인수 될 것으로 생각됩니다ated 음식 9. 오염 된 쇠고기가 10을 소비하는 경우 마찬가지로, BSE가 인간을 감염시킬 수 있습니다. 모든 TSE 질환, 스크래피와 CWD는 동물에서 동물 2,3,11뿐만 아니라 환경 소스를 4-6로 추정되는 자립 전염병 감염에 대한 근원을 가진 유일한 두 가지입니다. 연구는 대부분의 TSE 질환은 임상 증상의 발현에의 PrP 해상도 재료의 자연적인 노출 사건에서 주목할만한 확장 배양 기간을 필요로 2-4,6,8 및 명백한 종의 장벽을 최소화하지만, 종간 전송 12-14의 가능성을 제거하지 않는 것이 좋습니다 . 감염성 프리온 PRP (해상도) 물질의 확산 메커니즘을 식별 TSE 질환이 풍경을 가로 질러 이동하는 방법에 대한 질문에 대한 답변을 위해 매우 중요하다. 실험 조사는 15, 16, 가금류 및 돼지 17과 미국의 까마귀 (까마귀 풀어야 곤충 것을 제안했습니다hyrhynchos) 7,18가의 PrP 해상도 재료의 수동적 인 사업자 또는 분배기입니다. 까마귀의 소화 시스템을 통해의 PrP 해상도 물질의 통로는 최근에 그들이 TSE 질환 (7)의 분산에 재생할 수있는 역할을 시연, 설명되어 있습니다. 이러한 결과는, 까마귀, 헤매다가 발생할 수 있음이 그럴듯하게 소비하고, 질병이없는 지역에, 대변 증착을 통해 전염성 물질을 수송한다. 우리가 여기에서 설명하는 절차는 까마귀의 소화 시스템을 통해의 PrP 해상도 물질의 통과를 문서화하는 데 사용되었습니다 크게 관련 미래 연구의 다른 폐품과 육식 동물의 종 - 특정 모델에 이러한 방법의 적용을 용이하게합니다. 본 연구에서는 기존의 방법의 PrP 해상도 물질의 확산 및 전반적인 부담에 기여할 수의 PrP 해상도 재료를 인신 매매의 틀에 얽매이지 않는 방법을 연구하는 데 사용되었습니다.

<table><tbody><tr><td>RML 챈들러 균주 마우스 적응 스크래피</td><td>Rocky Mountain Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RC57BL/6 마우스</td><td>Hilltop Lab Animals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미국 까마귀</td><td>야생 포획</td><td></td><td></td></tr><tr><td>펜/스트렙</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Invitrogen</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Misonix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase-K 용액</td><td>Roche</td><td>3115887001</td><td></td></tr><tr><td>로딩 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007 및 0009</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris SDS PAGE 12% 겔</td><td>Invitrogen</td><td>NP0342</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon PVDF 멤브레인</td><td>Millipore</td><td>1SEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Bullet 블렌더 균질화기</td><td>Braintree Scientific</td><td>BBX24B</td><td></td></tr><tr><td>2.3mm 지르코니아/실리카 비드</td><td>BioSpec Products</td><td>11079125Z</td><td></td></tr><tr><td>Bar224 anti-PrP monoclonal 항체</td><td>Cayman Chemical</td><td>10009035</td><td></td></tr><tr><td>Superblock</td><td>Thermo Scientific</td><td>37517</td><td></td></tr><tr><td>화학발광 기질</td><td>Millipore WBKLS0500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>G-box 젤 문서화 시스템</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

조류 종의 소화 기관을 통과 한 후 감염성 프리온을 확인하기위한 절차

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

감염성 프리온 PRP (해상도) 재료는 가능성이 치명적인 신경 퇴행성 전염성 해면상 뇌증 (TSE) 질병 (1)의 원인이된다. 만성 소모성 질병 (CWD) 등 TSE 질병의 전송은, 동물 2,3에 동물에서뿐만 아니라 환경 소스를 4-6로 추정된다. 청소부와 육식 소비와 CWD 오염 된 썩은 고기의 배설물을 통해의 PrP 해상도 물질을 이동시키다하는 가능성이있다. 최근 작품은 미국의 까마귀의 소화 시스템 (까마귀 brachyrhynchos), 공통 북미 헤매다 ~ 7의 PrP 해상도 물질의 통과를 기록했다. 우리는 미국의 까마귀를 통해 고해상도의 PrP 물질의 통과를 문서화하는 데 사용되는 절차에 대해 설명합니다. 크로우는 RML 변형 마우스 적응 스크래피와 gavaged하고, 배설물은 4 시간 포스트 위관을 수집 하였다. 까마귀 배설물로 다음 풀링 및 복강 주사 하였다C57BL / 6 마​​우스. 그들은 마우스 스크래피의 임상 증상을 표현하고, 그 후 안락사 될 때까지 마우스는 매일 관찰 하였다. 증상이 마우스는 365 일 후 접종 할 때까지 감시했다. 웨스턴 블롯 분석은 질병 상태를 확인하기 위하여 실시 하였다. 결과 프리온 테스트 마우스에있는 질병을 일으키는 원인이 까마귀의 소화 시스템을 통해 여행 후 감염을 유지하고 배설물에 존재하는 것으로 나타났다.

사용 절차는 까마귀의 소화 시스템이 스크래피 뇌 균질 7의 경구 위관 이후의 PrP 해상도 감염 4 시간을 제거하지 않음을 보여줍니다. 의 PrP 해상도 재료로 gavaged 된 모든 스물 까마귀 이후 마우스에 대변을 통해의 PrP 해상도의 자료를 전송. 병에 걸린 마우스는 임상 마우스 스크래피 증상과 질병의 확인이 웨스턴 블롯 분석에 의해 완성되었다의 발현에 의해 확인되었다. 까마귀에 의해 섭취 된 물질의 유지 시간의 조사는 대변에있는 염료의 존재 (그림 1)에 따라 4 시간, 될 수있는 gavaged 까마귀의 소화관 통과 시간을 공개했다. 모든 배설물은 일회용 피펫으로 수집하고 각 까마귀 (그림 2)을 위해 풀링했다. 치료 까마귀 배설물에서 급성 독성 원시 배설물 상등액 파일럿 테스트 마우스에 IP를 주입 할 때 발생했습니다. 페니실린...

청소부는 질병이없는 지역에 자신의 배설물에 전염성 전염성 해면상 뇌증의 프리온을 이동시키다 수있는 가능성이있다. 우리 마우스 적응 스크래피 프리온은 미국의 까마귀의 소화 기관 (까마귀 brachyrhynchos), 죽은 동물의 일반적인 소비자 비록 통과 후 감염성 유지 여부를 확인하는 데 사용 세부 방법.

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

이 절차의 전반적인 목표는 미국 까마귀의 소화 기관을 통한 감염성 PreOn 물질의 통과를 문서화하는 것입니다. 이것은 먼저 전염성 PreOn 물질로 까마귀를 측정하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 배설물 후 4시간 동안 까마귀 배설물을 채취하여 생쥐에게 주입할 준비를 하는 것입니다.다음 마우스는 1ml의 까마귀 배설물 균질액을 복강내에 접종합니다. 마지막 단계는 생쥐가 생쥐의 임상 징후를 보일 때까지 매일 모니터링하는 것입니다. 궁극적으로 웨스턴 블롯 분석은 마우스 모델에서 감염성 PreOn의 존재를 확인하고 질병 전파를 확인하는 데 사용됩니다.까마귀가 운반할 수 있다는 아이디어. CWD는 어느 겨울날 사육 엘크 시설로 차를 몰고 가서 조사를 하다가 로드킬 엘크가 까마귀에게 잡아먹히는 것을 보았고, 그날 늦게 까마귀가 하늘에서 튀어나와 이 사료통에 내려앉아 엘크 바로 옆에서 먹이를 먹고, 엘크가 먹고 있던 곡물을 배설하는 것을 보았을 때 우리에게 왔습니다. 그 여름 콜로라도, 와이오밍 전역에서 뉴 멕시코의 집중 지역에서 겨울을 보내고, 뉴 멕시코의 그 지역이 어떤 CABD가 튀어 나온 곳이며 균열 낭비 질병의 진원지에서 수백 마일 떨어진 곳에 있습니다. 그래서 이 두 가지 관찰을 통해 우리는 잠재적으로 까마귀가 CWD를 주변 지역으로 운반하는 역할을 할 수 있다는 생각을 하게 되었습니다.잘못된 복강내 및 구강 위장 기술은 연구 동물의 죽음을 초래할 수 있으므로 이러한 기술의 시각적 시연이 중요합니다. 먼저 스크램블 에그에 파란색 염료 4방울을 넣고 잘 섞는다. 그런 다음 염료와 달걀 혼합물 5ml를 2인치 가비지 바늘에 넣고 한 사람이 까마귀를 부드럽게 제지합니다.까마귀의 부리를 목구멍 아래가 보일 만큼 넓게 벌리고 위장 바늘을 식도에 조심스럽게 삽입합니다. 호흡 변화가 감지되면 주사기를 제거하고 기관에 삽입되었을 수 있으므로 다시 시도하십시오. 위장 바늘이 식도에 있다는 것이 확실해지면 주사기의 내용물을 천천히 표현합니다.청록색으로 얼룩진 배설물이 더 이상 배설되지 않을 때까지 30분마다 까마귀를 확인하십시오. 실험용 까마귀는 파랗게 염색된 배설물을 그만두는 데 약 4시간이 걸렸습니다. 다음으로, 감염되지 않은 C 57 검정 6 마우스 뇌 1 부분과 멸균 PBS 4 부분 및 유리 구슬 몇 개를 총알 블렌더에 넣습니다.균질화기는 매끄러운 견실함이 달성될 때까지 1 5 분 동안 표본을 균질화합니다. 불치병에 걸린 R ML 챈들러 균주에 감염된 C 57 블랙 식스 마우스 뇌를 사용하여 이 과정을 반복합니다. 다음 1 분 동안 3000 시간 G에서 균질한 것을 원심 분리하십시오.더 큰 입자상 물질을 제거합니다. 그런 다음 상등액을 제거하고 동일한 부피의 멸균 XPBS로 희석하여 뇌 물질 부피당 10%의 중량을 생성합니다. PBS에서는 가스 주입 17시간 전에 필요할 때까지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.까마귀 우리에서 음식은 제거하되 물은 제거하지 마십시오. 까마귀를 무작위로 치료 그룹에 할당하고 2인치 개배지 바늘을 사용하여 갓 해동한 정상 또는 감염된 쥐 뇌 균질화 5ml로 각 까마귀를 구강 배징합니다. 그런 다음 까마귀를 개별 우리로 옮깁니다.배설 후 4시간 동안 각 케이지 내의 모든 배설물을 수집하고 모읍니다. 다음으로, 균일한 질감이 얻어질 때까지 유리 구슬이 있는 파란색 총알 균질화기에서 각 까마귀에 대해 고인 배설물을 균질화합니다. 그런 다음 혼합물 500 마이크로 리터를 가져 와서 9.5 밀리리터의 멸균 PBS 원심 분리기로 1에서 20으로 희석하고 희석 된 대변 균질산염을 15 분 동안 사용합니다.1, 300배 G를 추가한 다음 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 2차 미생물 감염의 위협을 최소화하려면 균질산염 1밀리리터당 페니실린 1단위와 스트렙토마이신 1마이크로그램을 첨가하십시오. 그런 다음 3000 MP 에이터에서 30초 동안 70의 전력 설정으로 샘플을 초음파 처리하여 남아 있는 미생물의 멤브레인을 파괴합니다.먼저, 마우스를 여기에 표시된 4개 그룹 중 하나에 무작위로 할당합니다. 그룹 1은 감염된 까마귀 배설물을 받게 됩니다. 그룹 2는 감염되지 않은 까마귀 배설물을 받게 됩니다.그룹 3은 감염된 쥐의 뇌를 받고 그룹 4는 정상적인 쥐의 뇌를 받습니다. 그런 다음 MN 그룹 1과 2의 경우 긁힌 양성 또는 긁힌 음성 까마귀 배설물을 1밀리리터 추출합니다. 마우스의 그룹 번호에 따라 25 게이지 바늘을 사용하여 균질화합니다.그런 다음 등쪽 목 털로 쥐의 목덜미를 긁습니다. 엄지와 검지를 사용하여 부드럽게 회전하여 복부 쪽을 노출시킵니다. 머리가 약간 낮도록 마우스의 뒤쪽 끝을 들어 올립니다.바늘을 피부를 통해 1cm, 정중선 옆으로 1cm, 천장관절 앞쪽으로 1-2cm 삽입하십시오. 그런 다음 약간 뒤로 당겨 균질한 것을 마우스의 체강에 천천히 주입합니다. 다음으로, 그룹 3과 4의 동물에 주입하기 위해 스크랩피를 사용하거나 사용하지 않고 동결된 마우스 뇌를 준비합니다.먼저 haws stock 혼합물을 1-10 멸균 PBS로 희석합니다. 그런 다음 그룹 3의 마우스에 희석된 스크래피 포지티브 뇌 균질액 1밀리리터를 주입하고 묽게 된 스크래피 음성 뇌 균질액 1밀리리터를 마우스에 주입합니다. 그룹 4에서.마우스가 긁힌 마우스의 임상 징후가 나타날 때까지 매일 모니터링합니다. 임상 징후에는 후만증, 운동 실조, 뻣뻣한 꼬리, 그루밍 부족, 수척 및 무기력증이 포함될 수 있습니다. 6가지 임상 징후 각각에 대해 매일 점수를 매기십시오.눈에 보이는 징후가 분명한 경우. 0은 눈에 보이는 기호가 없음을 의미합니다. 하나는 보통과 같고 두 개는 심각한 수준의 징후와 같습니다.각 별자리에 대한 일일 총 점수가 1일 동안 8 이상, 3일 동안 또는 365일 동안 연속적으로 6 이상일 때 마우스를 안락사시킵니다. 접종 후, 안락사 직후의 뇌를 적출하여 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 그런 다음 단편적인 진단을 확인하기 위해 사체를 적절하게 폐기하십시오.얼어붙은 쥐의 뇌를 해동하고 균일한 질감이 얻어질 때까지 유리 구슬이 있는 파란색 총알 균질화기에서 개별적으로 균질화합니다. 다음으로, pH 8에서 109.39 마이크로리터의 PBS와 12.5 마이크로리터의 500 밀리몰 EDTA 및 3.1 마이크로리터의 50 마이크로그램 단백질 분해 효소 K 용액을 결합하여 125 마이크로리터의 단백질 분해 효소 K 분해 용액을 준비합니다. 그런 다음 3마이크로리터의 소화액을 뇌 17마이크로리터에 첨가합니다. 균질화.섭씨 45도의 진탕 열 블록에서 샘플을 30분 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 8마이크로리터의 SDS 페이지 로딩 버퍼를 추가하여 분해 용액을 비활성화하고 섭씨 95도에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 샘플을 12%SDS 페이지에 로드합니다.젤 전기 이동법은 단백질을 전기이동법하고 한 번 옮겨지는 IMON PVDF 막에 젤을 옮깁니다, 20 사이 0.2%를 가진 PBS에 있는 5%non-fat 우유를 가진 PVDF 막을 막고 실내 온도에 1 시간 동안 바위. 그런 다음 차용 224 및 IPRP 단클론 항체를 말 무 peroxidase에 접합 한 IPRP 단클론 항체를 사용하여 배양 후 실온에서 1 시간 동안 수퍼 블록과 암석에서 1 시간 동안 희석합니다. PBS에서 20 % 사이에 0.2 %로 멤브레인을 1 시간 동안 헹굽니다.멤브레인을 화학발광 기질로 5분 동안 배양하여 단백질을 시각화합니다. 그런 다음 G box gel 문서화 시스템에서 멤브레인을 이미징합니다. 병에 걸린 마우스는 임상적 마우스 긁힌 징후의 징후에 의해 확인되었고, 질병 확인은 서양의 혈액 분석에 의해 완료되었습니다.스크래피가 없는 균질한 정상 마우스의 뇌가 여기에 나와 있으며, 프로테아제 K의 도움이 있거나 없는 두 개의 레인이 왼쪽에 표시되며, 프로테아제 K가 없는 경우 세 개의 굴곡이 보입니다. 그러나 정상 단백질은 단백질 분해 효소에 취약하기 때문에 두 번째 줄에서는 굴곡이 보이지 않습니다. 3번째 열은 프로테아제로 절단된 긁힌 양성 대조군 샘플을 보여줍니다.프로테아제는 단백질의 n 및 c 말단의 손실로 인해 3개의 원래 밴드에서 이동을 일으킵니다. 그러나 감염된 단백질은 정상적인 뇌 샘플에서처럼 완전히 소화될 수 없다. 접종된 까마귀의 배설물을 접종한 쥐의 뇌를 소화한 단백질분해효소 K가 오른쪽에 표시되어 있으며, 띠가 소화되지 않아 샘플에 프리온이 존재함을 확인합니다.이 비디오를 시청하고 나면 까마귀의 소화 기관을 통한 감염성 프리온 물질의 이동을 문서화하는 방법을 더 잘 이해할 수 있을 것입니다. 그런 다음 복강간 마우스 생물학적 분석법으로 감염성을 확인합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기 우리는 즉시 정화하여 intraperitoneal 접종 다음과 찬란 다음 주사 사이트에서 자신의 이해와 움직임을 모니터링하고 이러한 이벤트를 중재 전지 특성화 감염 두뇌 자료에서 집계 프리온 봉 라벨 면역 세포 프리온 이해와 인신 매매를 감시를위한 소설 분석을 설명합니다.

Intraperitoneal 감염 후 면역 세포의 인신 매매 형광등 프리온 로즈 시간을 모니터링

이 연구는 휴대용 RRT - PCR 시스템을 사용 야생 조류에서 조류 독감의 진단을 설명합니다. 방법은 확산 시나리오의 전형이 아닌 실험실 환경에서 야생 조류를 화면에 냉동 건조 시약을 활용합니다. 분자 도구의 사용은 신속한 진단을 위해 정확하고 민감한 대안을 제공합니다.

야생 조류에서 조류 독감 바이러스의 신속한 진단 : 현장에서 휴대용 RRT - PCR 및 정지 - 건조 시약의 사용

조류 독감 바이러스의 RNA를 보존 감지하고 순서 방법 확인과 조류의 자연 faecal 샘플을 사용하여 확장되었습니다. 이 기술은 시원한 체인 및 전염성 바이러스의 취급을 유지의 필요성을 제거하고 96 - 웰 높은 처리량 설치에 적용할 수 있습니다.

조류 FTA 카드 인플루엔자 감시 : 필드 방법, Biosafety, 그리고 교통 문제 해결

단백질 misfolding의 순환 증폭 (PMCA)는 prion 변환과 변형 및 종 장벽의 연구에서 시험 관내 분석이다. 또한 prion 검출 분석으로 사용할 수 있습니다.

Prions의 단백질 Misfolding의 순환 증폭

이 비디오는 면역조직화학을 사용하여 뇌 절편에서 잘못 접힌 프리온 단백질을 검출하는 기술을 보여줍니다. 포름산으로 뇌 절편을 처리하여 프리온을 변성시키고 감염 위험을 최소화하고, 열 유도 항원결정기 회수를 사용하여 프리온 응집체의 가면을 벗기면 잘못 접힌 프리온 단백질 응집체에 대한 절편을 면역 표지하고 현미경으로 관찰합니다.

면역조직화학을 이용한 뇌 조직에서 비정상적인 프리온 단백질 검출

Transsynaptic tracing은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 대상을 조절하는 중심 원심성을 분석하기 위한 강력한 도구가 되었습니다. 여기에서는 시냅스경이 횡단하는 광견병 바이러스를 활용하여 기능적인 뇌 회로를 식별하고 국소화하는 프로토콜을 제시한 다음, 식별된 뉴런 그룹 간의 회로에서 특정 연결을 검증하기 위한 고전적인 요로 추적 기술을 제시합니다.

Transsynaptic는 콜레라 독소와 바이오틴 덱스 트란 아민 두 번 라벨로 이어 (僞) 바이러스에 주변 대상에서 추적

짧은 임상 시험 프로토콜은 양과 염소에서 고전적이고 비정형 스크레이피의 검출을 돕기 위해 제시된다.

양에서 비정형 및 고전적인 스크레이키를 감지하는 임상 시험 프로토콜

프리온 질병의 종간 전염에 대한 장벽을 측정하는 것은 까다로우며 일반적으로 동물 챌린지 또는 생화학적 분석이 포함됩니다. 여기에서는 종 장벽을 예측할 수 있는 능력을 가진 체외 프리온 단백질 전환 분석을 제시합니다.

와 전염성 해면상 뇌증 종 장벽 평가<em&gt; 체외</em&gt; 프리온 단백질 변환 분석

여기, 우리는 간단, 신속 하 고 효율적인 프리온 증폭 기술, 실시간 떨게 유발 변환 (RT-QuIC) 메서드를 설명 하는 프로토콜을 제시.

실시간 떨게 유발 CWD Prions 지저분한 자료의 검색을 위한 변환 분석 결과

면역조직화학 프로토콜을 사용하여 비정상 프리온 단백질을 면역표지하려면 특정 샘플 및 항-PrP 항체 준비 방법론이 필요합니다. 본 프로토콜은 적절한 PrP 면역표지를 보장하고 비특이적 배경 염색을 최소화하기 위한 에피토프 마스킹의 주요 단계를 설명합니다. 또한, 이 접근법은 프리온 감염 조직으로 면역조직화학 연구를 수행할 때 생물학적 안전성 조치를 고려합니다.

면역조직화학에 의한 비정상적인 프리온 단백질 검출

실험실 환경에서 일반적으로 사용되는 영역을 프리온 오염 및 효과적인 오염 제거를 평가하는 방법은 부족합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 특정 실험실의 개별 요구 사항을 충족하도록 쉽게 수정할 수 있는 실험실 프리온 안전 스와이프 테스트를 구현하기 위한 핵심 기본 사항을 제공합니다.

Prion 안전 연구소 스와이프 테스트

학습하세요 미국 까마귀의 소화 기관을 통과한 후에도 감염성 프리온이 배설되는지 확인하는 방법을. 쥐 생체 검정과 웨스턴 블롯 분석을 통해 프리온 감염성을 검증하는 이 기법은 야생동물 질병 전파 연구에 활용됩니다.

조류 종의 소화 기관을 통과 한 후 감염성 프리온을 확인하기위한 절차

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