단일 클론 항체 TG30 및 GCTM-2를 사용하여 세포 표면 항원 검출에 의한 인간 배아 줄기 세포의 농축 및 정화

이 절차의 전반적인 목표는 TG 30 및 GC TM 두 단클론 항체의 세포 표면 항원 결합에 따라 인간 배아 줄기 세포 하위 집합을 분류하는 것입니다. 이는 먼저 인간 배아 줄기 세포 또는 HESC 배양을 단일 세포 현탁액으로 해리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서 HESC는 단클론 항체인 TG 30 및 GCTM 2로 염색됩니다.

마지막으로, 세포는 형광 활성화 세포 분류에 의해 분리되어 배양으로 돌아갑니다. 궁극적으로 분류된 세포의 집락 형성 능력은 유세포 분석과 위상차 현미경으로 평가할 수 있습니다. 육안 관찰과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 이미지는 많은 수의 세포에 대해 세포별로 다능성의 객관적인 측정을 제공하고 이를 통해 분화된 세포에서 배아 줄기 세포를 쉽게 분리할 수

이 방법은 배양 조건의 변화가 다양한 인간 배아 줄기 세포 및 인간 유도 만능 줄기 세포주에 어떻게 정량적으로 영향을 미치는지와 같은 다능성 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 오늘 제 연구실의 연구 과학자인 George Zoe Hun Chi와 Bay Wang이 이 절차를 시연할 예정이며, 배양된 Hess 세포주를 포함하는 두 개의 T 75 플라스크에서 Hess 배양 배지를 흡인하여 Hess 단일 세포 현탁액을 만드는 것으로 시작합니다. 각 플라스크를 10ml의 DPBS로 세척한 다음 각 배양물을 섭씨 37도 및 5%CO2에서 3ml의 트리플 E 발현 해리 용액으로 배양합니다.

5분 후 플라스크 측면을 부딪쳐 세포를 제거한 다음 현미경으로 분리를 확인합니다. 다음으로, 멸균 10ml 피펫을 사용하여 각 플라스크에 10ml의 저온 배양 배지를 추가합니다. 해리된 세포를 플라스크 벽에 대해 여러 번 부드럽게 삼중화하여 주로 단일 세포 현탁액을 달성합니다.

이제 70미크론 세포 여과기를 통해 Hes 단일 세포 현탁액을 멸균 50ml 폴리프로필렌 튜브에 모아 Hess 세포 표면 항원을 염색합니다. 첫째, Eloqua는 150 마이크로 리터의 매체에 약 100, 000 개의 세포를 6 개의 제어 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 각각 넣습니다. 다음으로, 대조 튜브와 나머지 분류 샘플을 isotype 대조군을 포함한 배양 배지에서 각각 200 마이크로리터 및 약 9 밀리리터의 최종 반응 부피에서 관심있는 1차 항체와 함께 배양합니다.

튜브를 얼음 위에 수평으로 놓고 흔들리는 플랫폼에서 30분 동안 부드럽게 섞습니다. 세포를 회전시킨 후 상등액을 버리고 분류 샘플을 20ml의 저온 배양 배지와 대조 샘플을 200마이크로리터의 동일한 배양 배지로 세척합니다. 이제 저온 배양 배지에서 적절한 2차 항체와 함께 2.5ml 최종 부피의 분류 샘플을 배양하고 200μL 최종 부피의 대조군을 배양한 다음 새로 준비된 PE anti-US CD 90.2 항체를 적절한 대조 튜브에 추가합니다.

다시 한 번, 흔들리는 플랫폼에서 30분 동안 얼음 위에서 튜브를 수평으로 부드럽게 혼합합니다. 세포를 스핀다운한 후, 분류 샘플을 20ml의 저온 배양 배지에 다시 현탁시키고 대조군을 200마이크로리터에 재현탁시키고 배지에서 세포를 두 번 세척합니다. 분류 샘플을 프로피듐 요오드화물이 보충된 2 내지 3 밀리리터의 저온 배양 배지와 염색되지 않은 세포를 제외한 각 대조군에 300 마이크로리터의 동일한 배지에 재현탁시킵니다.

그런 다음 5밀리리터 폴리스티렌 원형 바닥 테스트 튜브에 연결된 35미크론 뚜껑 셀 스트레이너를 통해 각 개별 셀 현탁액을 걸러내고 튜브를 원심분리하여 스트레이너 뚜껑의 잔류 셀 현탁액을 튜브로 밀어 넣습니다. 그런 다음 튜브의 측면을 두드려 각 단일 세포 현탁액을 다시 현탁시키고 세포를 얼음 위에 놓습니다. TG 30 GCTM 2 형광 활성화 세포 분류를 위한 유세포 분석기를 설정하여 해리된 Hess 세포 현탁액이 단일 세포로 게이트되어 잠재적인 덩어리 및 이중항을 제거합니다.

다음으로, 온전한 세포만 분류되도록 전방 및 측면 산란 게이트를 사용하여 잠재적인 파편을 제거합니다. 그런 다음 프로피듐 요오드화물 발현에 따라 생존 불가능한 세포를 제외합니다. 마우스 CD 90.2 pe의 발현에 기초한 음성 선택에 의해 마우스 배아 섬유아세포 또는 메스 공급세포를 게이트아웃합니다.

TG 30 G CTM 2 음성 보행을 염색되지 않은 세포에 대한 배경 자가형광과 동형 대조군에 따라 설정합니다. 그런 다음 필로폰 공급자가 없는 분리된 생존 가능한 HESC 분획을 최종적으로 TG 30 음성 GCT M 2개, 낮은 GCT M 2개, 낮은 TG 30, 중간 GC TM 2개 및 TG 30 높은 GCTM 두 개의 높은 하위 집단으로 분획할 수 있습니다. 유세포 분석기를 설정한 후 2개의 5밀리리터 폴리스티렌 원형 바닥 테스트 튜브 각각에 1ml의 필로폰 컨디셔닝 배지를 추가하고 얼음 위에 놓습니다.

그런 다음 분화된 TG 30 음성 GC TM 2 음성 및 만능 TG 30 높은 GCTM 2 높은 세포 소분물에서 각각 400, 000 세포를 복구합니다. 수집 튜브를 회전시킨 후 resus는 각 세포 펠릿을 1ml의 사전 평형 MEF 컨디셔닝 배지에 현탁시킵니다. 그런 다음 메스에 의하여 조절된 매체에 있는 각 분획에서 HESC를 가진 1개의 미리 평형을 이루고, 1/3 MEF 조밀도 T 75 플라스크를 파종하고, 대략 2 주 동안 매체를 매일 새로고침, 37°C에서 5%CO2에서 세포 배양물을 배양한다.

만능 TG 30 높은 GCTM 두 개의 높은 세포의 배양은 1주일 후에 인간 줄기와 같은 집락을 나타내고 9-11일에 약 80%co 유창성에 도달합니다. TG 30 음성 GC TM 두 개의 음성 세포의 배양은 대부분 11-13일에 co-fluency에 도달하는 세포와 같은 섬유아세포의 잔디밭으로 자랍니다. 세포 표면 항원 TG 30 및 GC TM two의 결합된 검출은 이전 보고에 따라 줄기 세포 마커 및 계통 특이적 전사 인자의 발현에 의해 나타난 바와 같이 만능 단계 및 초기 HESC 분화의 다양한 단계에서 여러 세포 subset을 구별할 수 있으며, TG 30 GC TM two negative low, 본 연구에 사용된 인간 배아 줄기세포 수컷 one line 내에서 mid 및 high subfractions를 구별할 수 있으며, TG 30 GCTM two flow cytometry 분석의 전형적인 서로 다른 게이트 subpopulation의 비율은 여기에 표시된 실험에 나와 있습니다.

정의된 수의 TG 30 음성 GCT M 2 음성 세포를 약 2주 동안 분류 후 연속적으로 배양한 후, 재플레이팅 전에 TG 30 음성 GCT M 2 음성 분획물만 수집하였다. 각 계대에서 결과는 초기 TG 30 음성 gct M 2개의 음성 소분획이 연속 패키징 후 TG 30 음성 GCT M 2개의 음성 분화 세포에 대해 농축됨을 나타냅니다. TG 30 high GCT M two high cell의 작은 집단은 초기 계대에서 검출되지만 결국 추가 포장으로 인해 사라지고 만능 줄기 세포 무료 샘플만 남습니다.

여기에서는 14일 후 분화된 TG 30 음성 GCT M 2개의 음성 세포의 잔디밭의 전형적인 형태를 보여줍니다. 14일 후에 관찰된 산발적인 HESC 유사 콜로니는 오염된 TG 30 높은 GCT M 두 개의 높은 세포에 의해 생성되었을 가능성이 가장 높은 TG 30 음성 GC TM 두 개의 음성 세포와 섞였습니다. 이는 드물게 발생하며 이 분석을 사용한 이전 관찰을 기반으로 한 초기 사후 사후 지문에서 TG 30 높은 GCTM 두 개의 높은 세포의 수집 및 배양은 만능 HSC를 형성하는 집락을 위해 농축되어야 할 것으로 예상됩니다.

따라서, 유세포 분석에 의해 분류한 후 만능 TG 30 높은 GCTM 두 개의 높은 세포의 연속 패키징도 이러한 대표적인 배양에서 조사되었으며, 세포는 TG 30 및 G CT M 2개를 사용하여 팩스 분류하고, 각 계대에서 TG 30 높은 G CTM 2개의 높은 세포만 대체하였다. 이러한 방식으로, 대다수의 세포가 다능성과 관련된 소분획에 위치하는 것이 관찰되었는데, 이는 또한 TG 30 음성 G CTM 2개의 음성 세포의 작은 비율을 분화 및 재생하는 능력을 유지하는 만능 세포의 농축된 집단을 나타냅니다. 또한, TG 30 high G CTM two high sorted cell의 연속 배양은 passaging 후 많은 수의 HESC 유사 콜로니를 나타내며, 이는 또한 다능성 상태의 유지를 나타냅니다.

이 절차를 시도하는 동안 이 절차를 따르는 경우 결과의 재현성을 보장하기 위해 매번 사용하기 전에 팩스기를 보정해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 마이크로어레이, 전체 게놈 염기서열분석 또는 기형종과 같은 다른 방법을 수행하여 이러한 세포가 개발 후 정말 만능인지와 같은 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 유도 만능 줄기 세포 분야의 연구자들이 인간 배아 줄기 세포와 비교하여 이러한 세포의 안전성과 안정성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 periet 세포를 농축하기 위해 인간 enbr 줄기 세포의 혼합 배양을 신중하게 준비하고 염색하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 인간 세포로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑을 착용하고 안전 캐비닛으로 2등급으로 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.