Name: 녹농균에서 MexAB 유출 펌프의 체외 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-17T21:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: 배우세요 Pseudomonas aeruginosa의 MexAB 유출 펌프를 리포솜 재구성을 통해 체외에서 기능적으로 분석하는 방법을. 이 프로토콜은 항생제 내성 메커니즘 연구와 신규 억제제 선별에 활용됩니다.

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본 연구는 직원은 국립 드 라 공들인 (프로젝트 ANR-2010-BLAN-1535)에 의해 지역 일 레드 프랑스 (DIM-Malinf 110058을)에서 부여에 의해 지원되었다.

1. 단백질 생산 및 정제 <ol><li> MEXA, 녹농균에서 MexB <ol><li> E.의 MEXA 및 MexB 유전자를 품고 플라스미드를 변환 콜라이 생산 균주 (예 C43 DE3). LB 한천 플레이트에 중간 적절한 항생제로 보충. O / N의 전 배양액을 접종하기 위해 하나의 식민지를 선택합니다. 다음 날 아침, LB의 1 L에 예비 배양을 접종하고 교반 (240 RPM)에서 37 ° C에서 성장한다. </li><li> 세포가 기하 급수적 단계에 도달하면 (OD 600 = 0.6 ~ 0.8)을 1 mM의 IPTG로 유도한다. 교반하면서 30 ℃에서 2 ~ 3 시간 동안 유도를 수행합니다. </li><li> 원심 분리기 세포 (20 분 9,000 XG) 30 ㎖의 트리스 - 염산하는 20 mM, pH가 8, 염화나트륨 150 mm 단위에 resuspend. </li><li> 프랑스 언론 (10,000 PSI, 4 패스)를 사용하여 세포를 방해. 20 분 동안 9,000 XG에서 원심 분리하여 손상되지 않은 세포 봉입체를 폐기하십시오. </li><li> 100,000 XG 및 R에서 펠렛 막 1 시간30 ㎖의 비스 - 트리스 10 mM의 pH를 7.4, 글리세롤 20 % (W / V), 이미 다졸 10 mM의 NaCl을 500 mM의 각 펠렛을 esuspend. </li><li> BCA 비색 분석을 사용하여 전체 막 단백질 농도를 결정하고 그 세제 이렇게 결정된 최종 부피 2 % 도데 실 말토 사이드 (DDM)로 막은 O / N을 가용화 : 단백질 (w / w) 1:1.5이다. </li><li> 비 가용화 및 집계 자료를 폐기하는 1 시간 동안 10 만 XG에 초 원심 분리기. </li><li> 니켈 수지 (MEXA 정화) 또는 비스 - 트리스 10 mM의 pH를 7.4, 글리세롤 5 % 평형 코발트 수지 (MexB 정화)와 4 ° C에서 2 시간 동안 상층 액을 품어 (W / V), 이미 다졸 10 밀리미터, 염화나트륨 500 밀리미터, DDM 0.2 %. </li><li> 빈 열에서 수지를 붓는다. 을 통해 흐름을 수집합니다. </li><li> 다음 비스 - 트리스 10 mM의 pH를 7.4, 글리세롤 20 % (W / V), 이미 다졸 10 mM의 NaCl을 500 밀리미터, DDM 0.2 %, 비스 - 트리스 10 mM의 pH를 6, 글리세롤 25 ㎖와 50 ㎖로 수지를 세척 5 % (W / V), 이미 다졸 10 mM의 NaCl을 500 밀리미터, DDM 0.2 %. </li><li> P 용출20 ㎖ 비스 - 트리스 10 mM의 pH를 7.4, 글리세롤 5 % (W / V), 이미 다졸 300 mM의 NaCl을 500 밀리미터, DDM은 0.2 %로 rotein. </li><li> 이미 다졸없는 버퍼 평형 탈염 컬럼에 3 ㎖ 및 부하에 이르기까지 한외 여과 장치로 단백질을 집중한다. 그냥 재구성하기 전에 (아래 참조), 가용화 된 단백질 지질 및 unsolubilized 단백질을 제거하기 (20 분 10 XG)를 초 원심 분리기. 이어서 0.3 ml로 다시 농축 단백질. </li></ol></li><li> Halobacter의 salinarium에서 박테리오로돕신 <ol><li> 염화나트륨 4 M, 망초 150 밀리미터, 구연산 된 10 mM, KCl을 30 ㎜, 효모 추출물 5g / L에, 그리고 펩톤 5g / L을 함유하는 액체 성장 매체에 10 일 동안 37 ° C에서 조명 아래 Halobacter의 salinarium 세포를 성장 </li><li> 탈 이온수에 대해 투석에 의해 세포를 방해. </li><li> 30~40%에 보라색 막 (w / v)의 자당 기울기 (17 시간 동안 100,000 XG)를 정화. </li><li> 2 % octylgluc으로 막 현탁액을 가용화37 ° C (: 단백질의 비율을 2:1 (w / w) 세제에서 막을 재현 탁하기 위해 가용화를위한 볼륨)에서 24 시간 동안 oside. ε (570 NM) = 54,000 M -1 cm -1을 사용하여 가용화 BR의 농도를 추정한다. 그냥 재구성하기 전에 (아래 참조), 지질 및 unsolubilized 단백질을 제거하는 가용화 BR (20 분 10 XG)를 초 원심 분리기. 참고 : 기본 막은 자연스럽게 그래서 더 정제가 필요하지 않습니다 BR에 충실. </li></ol></li></ol> 2. Proteoliposomes의 준비 <ol><li> 리포좀 형성 : 유리 비커에 클로로포름 (25 ㎎ / ㎖)에 용해 DOPC 400 μl를 넣고 가루로 저장 콜레스테롤의 1.5 밀리그램을 추가합니다. 유리 비커에 적어도 1 시간 동안 단지 질소, 진공 스팀에서 조작하기 전에 건조. DOPC는 : 콜레스테롤 몰비는 3.3:1이다. <ol><li> 그들은 건조 후, HEPES 25 mM의 pH를 7 1 ㎖의 지질을 수화K 2 SO 4 100 ㎜, MgCl2를 2 ㎜, pyranine 2 ㎜. 서스펜션은이 단계에서 혼탁이 나타납니다. </li><li> 37 ℃에서 10 분 동안 용액을 가열 30 초 펄스, 실온에서 30 초 일시 정지 사이클 40 W에서 10 분 동안 초음파 처리. 서스펜션은이 단계에서 분명히 나타납니다. </li><li> 리포좀의 단 분산 인구를 얻으려면, 압출의 2주기를 수행하고 각주기에, 적어도 11 배 필터를 통해 리포좀 현탁액을 전달합니다. 첫번째주기를 들어 200 ㎚의 막 공극 크기를 사용하고 제 2 사이클에 대한 100 ㎚의 막 공극 크기를 사용한다. 동적 광산란 측정은 현탁액의 균질성을 확인하기 위해이 단계에서 수행 될 수있다. </li></ol></li><li> 단백질 결합 원리 : 막 단백질은 세제의 용해 효과 리포좀 덕분에 재구성 할 수 있습니다. 세제 용해 리포좀은 P의 세제 용해 막 단백질과 형성과 배양roteoliposomes 폴리스티렌 비즈 9와 세제의 신속한 제거에 의해 트리거됩니다. <ol><li> 트리톤 X-100 (최종 0.56 %)의 28 밀리그램을 추가하고 4 ° C (용해 온도는 단백질이 연구되고 적용 할 수 있습니다)에 O / N을 품어. </li><li> 가용화 된 리포좀에 세제 용해 단백질 (BR, MexB 및 MEXA)를 추가하고 4 ℃에서 15 분 알을 품다 지질 / MexB = 20, MexB / MEXA = 2.5, 지질 / BR = 30 : 다음의 비율 (W / W)에서의 가용화 리포좀 현탁액에 단백질을 추가합니다. </li><li> (정제 된 단백질을 첨가 세제를 포함한 세제의 총 중량을 고려하여 W / W,,) 세제 비율을 부드러운에서 RT에 (때문에 BR의) 어둠 속에서 5 시간을 품어 : 30:1 구슬에 폴리스티렌 비즈를 추가 교반. 이전 절차에, 메탄올, 에탄올 배양과 biobeads을 활성화하고 광범위하게 물로 씻을 것. </li><li> PD-10을 사용하여 proteoliposomes 단백질과 무료 기판을 정화HEPES 25 mM의 pH를 7, K 2 평형 탈염 열 SO 4 100 ㎜, MgCl2를 2 ㎜. </li><li> 최대 2 ~ 3 주 동안 어둠 속에서 18 ° C에서 proteoliposomes을 저장합니다. </li></ol></li><li> 자당 기울기의 재구성 효능 평가. MexB 및 BR 모두 리포좀에 재구성되어 있는지 확인하기 위해 불연속 자당 기울기에 proteoliposome 서스펜션을 정화. <ol><li> 부드럽게 자당의 5 층 구배에 proteoliposomes 정착 (60 %, 20 %, 10 %, 5 %, 2.5 %, w / v). </li><li> (최소한의 가속 및 감속 속도로) 10 XG에 17 시간 동안 초 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 다양한 그라데이션 분수 (자당의 각 층 사이, 특히 인터페이스)를 수집하고 쿠마시 염색 또는 웨스턴 블롯을 사용하여 SDS-PAGE (10 %)에이를 분석 할 수 있습니다. nonincorporated, 세제 용해 단백질의 맨 위에있는 동안 집계 된 단백질은 튜브의 하단에서 찾을 수 있습니다관. Proteoliposomes와 리포좀은 자신의 고유 밀도에 해당 자당 인터페이스에서 찾을 수 있습니다. 빈 리포솜은 proteoliposomes보다 그래디언트에서 멀리까지 복구됩니다. </li></ol></li></ol> 3. 형광 측정 <ol><li> 이중 파장 측정을 위해 허용하는 분광 (크세논 (Xe) 램프 150 W)를 사용하여 25.0 ° C에서 형광 측정을 수행합니다. 대체 조명 기간 (550 ㎚ / 550 ㎚의 여기 / 방출 파장 BR을 활성화하기 위해) 및 pyranine 형광을 측정하는 2 초 동안 455 ㎚ / 509 ㎚의 여기 / 방출 파장의 형광 측정. 5 nm의 여기 및 방출 대역폭을 설정합니다. 역방향 막 전위 ΔΨ의 형성을 방지하기 위해 50 nm의 발리 노마 이신 (Valinomycin)의 존재하에 측정을 수행한다. 참고 : 사실, BR은 양성자 펌프 때문에, 외부보다 리포좀 내부에 긍정적 인 책임이있다. 이 책임그라데이션은 K + 선택적 이온 운반체 인, 발리 노마 이신 (Valinomycin) 사용하여 삭제 할 수 있습니다. 일단 리포좀 현탁액에 첨가 발리 노마 이신 (Valinomycin), 소수성 분자로서, 리포솜 막에 삽입 수동적 K + 수송, 따라서 막 전위 ΔΨ을 방산한다. </li></ol>

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</ol>

공개 아무것도 없다.

우리는 막 단백질 수송 시금 위해 설계된 재구성 절차를 설명한다. 일단 설정되면, 단백질 재구성 절차는 매우 재현성 측정에 이르게한다. 그러나 단백질을 재구성에 대한 정확한 조건은 하나의 단백질에서 다른 다릅니다. 대부분 치료는 다음과 같은 매개 변수를 최적화주의해야합니다 : 정화 (순도 및 집계 자료의 부재)의 I) 품질, 세제 용해 단계 (수의 II)의 효율성, 낮은 CMC 세제 선호한다 그들이 얻을 쉽게 때문에 ) 제거; 세제 III) 탈착 (그것이 투석 단계와 폴리스티렌 비드의 사용을 결합하지만 이것은 탈착의 비율, 단백질의 후속 활동에 대한 중요한 매개 변수에 영향을 미칠 수있는 예를 들어 가능 심판을 [참조 15]); IV) 지질 재구성 (지질의 화학적 성질, 단백질 비율 추가적인 amphiph의 존재로 지질레스)는 다양하고 최적화해야합니다 중요한 매개 변수입니다. 또한 온도와 배양 시간이 모든 문제에 영향을 미칩니다. 품질 관리는 재구성 절차의 각 단계에 따라서 원시이다. 그것은 빠른 비파괴이며, 단지 마이크로 몰 범위의 농도에서 샘플 20 ㎕를 요구하기 때문에 이러한 관점에서, 빛의 산란이 매우 편리한 기술이다. 질적 (단백질이 실제로 리포좀 막에 포함됩니다)뿐만 아니라 정량 (얼마나 많은 단백질 한 리포좀의) : proteoliposomes가 형성되면 그것을 재구성의 체계적인 검증을 향해 길을 열기 때문에, 자당 기울기는 큰 도움도. 후자 정확하게 단백질 및 지질 농도를 측정함으로써 해결 될 것이다. 우리의 분석은 기판 자체의 적정에 의존하지 않으며, 이는 가능 인공적 수동적 확산에 대한 불안 고려 피할<html> 때문에 세포막의 소수성 분할에 분자. 분석은 모니터링 pH 변화에 대한 신뢰성 및 정량 조사로 pyranine의 속성을 이용한다. 우리의 결과는 양성자 구배 형성은 발리 노마 이신 (Valinomycin) (10)를 사용하여 실시 하였다 다른 프로 시저로 얻은 결과와 일치한다, 그러나 더 강력하고 재현성있게 구배 11. 또한, 양성자 구배 정확하게 단순히 (추가 세부 사항을 위해 Verchere 외. 12 참조) 버퍼의 농도를 변화시킴으로써 조정될 수있다. 제어 측정은 제 1 기판의 부재하에 수행되는 절차 (이는 단백질의 수동적 활동에 대한 액세스를 제공한다). 기판은 동일한 큐벳에 첨가 한 후 실제 세포막 단백질 수송 체 활성을 측정한다. 실험 진짜 비 모호, 기판 - 유도 결과로 간주 될 수 있기 때문 진정한 자산이다. 샘플을 조명하는 반응. 자동화 및 병렬화는 proteoliposome의 큰 배치를 준비 이루어져 것이다 트리거 때문에 ENT &quot;&gt; 프로토콜이 높은 매체 처리량 (예를 들어 96 - 웰 측정) 자동화에 적용 할 수 있으며, 96에서 분취 량을 디스 펜싱 - 웰 플레이트. 기판 (그리고 가능 억제제)을 첨가 할 것입니다 45 분 동안 어둠 속에서 부화 후 판은 마이크로 플레이트 리더에 조명 / pyranine 형광 측정주기를 실시 할 것입니다. 프로토콜에 대한 자세한 내용은 독자가 Verchere 등을 읽어 초대합니다. (12, 13)

완전한 막 단백질은 진핵 생물의 게놈에 인코딩 유전자의 30 %를 나타냅니다. 그들은 같은 게이트 유지 (수용체), 영양분, 이온 또는 유해 화합물 (트랜스 포터)을 운반 또는 모든 살아있는 세포 1 사이 막 이중층 (채널)에 걸쳐 투과성의 유지 등의 중추적 인 역할을 공유 할 수 있습니다. 유출은 항생제 치료 2에 대한 저항의 중심 역할을 펌프. 그람 음성 세균의 외막에 의해 보호되는 녹농균은, 유출 운송은 MexB, 내부 막에있는 유출 펌프, MEXA, 세포질 단백질과 OprM와 함께 작동 삼자 시스템으로 구성되어 있습니다 외막 채널. 세포질 내부 막 단백질은 광범위한 기질 특이성과 에너지에 의존하는 펌프 역할을합니다. 세번째는 주변 세포질 공간에 있으며, 전체 복합체를 안정화하는 것으로 생각되는 반면 외막 단백질 포린 역할 <s업&gt; 3. 이하에서, 우리는 MEXA MexB 조립체위한 기능적 어 세이의 설계에 초점을 맞춘다. 구조 정보는 대장균 4-7에서 상동 단백질 AcrB의 X-선 결정에 지난 5 년간의 감사를 통해 축적하고있다. 그것은 분명이 수송에 대한 기능 분석을 디자인하는 동적 운동 데이터를 몇 이러한 정보에 대한 중요하지만 진정한 도전 8입니다. 실제로, 막 단백질은 멤브레인 형 환경에서 유지되어야하고 폐쇄 구획 달성 될 기판의 vectorial 전송을 위해 유지되어야한다. proteoliposomes에 막 단백질의 재구성 광범위하게 (리고 레비 9 참조) 제시 및 검토되었다. 이러한 프로토콜은 리포솜 막을 가로 질러 기판을 다음 순서 인스턴스 막 단백질 활성의 모니터링을 허용. 이 경우 제한에서 발생적정 기판 vailability (형광 방사능, 등.)과 매우 자주 이러한 기질은 소수성과 관계없이 수송의 존재의 세포막을 통과하는 경향이있다는 사실에서. 다른 방법으로, 하나는 교통의 결과로 발생하는 화학 변화에 민감보고 염료의 광학적 변화를 볼 수 있습니다. 위에서 언급 한 바와 같이, 양자는 MexB를 통해 전송 전원을 공급. 따라서, 관련 옵션은 양성자 기반의 기판 이송으로 인한 산도의 변화를 수행 할 수있는 pH 민감성보고 염료의 분광 변화를 모니터하는 것입니다. 형광 염료의 선택은 기판의 소수성 성질에 따라 어떤 인공적 효과를 피한다. 추가적인 어려움 양성자 구배의 발생이다. 몇몇 프로토콜은 문헌에서 찾을 수있다. 그 중에서도 발리 노마 이신 (Valinomycin) 기술의 사용이 확대되고 있지만, 우리는 10-11을 수행하는 지루한 것으로 나타났습니다. 또한 그것은이다재현 할 수없는 그것은 되돌릴 수 없습니다. 우리는 박테리오로돕신 (BR), Halobacter의 salinarium에서 빛을 활성화 프로톤 펌프, 염성 해양 그람 음성 호기성 의무를 archaeon의 사용에 의지했다. 이 단백질은 조명에 따라, BR은 리포좀의 내부 양성자 펌프 따라서 기판 12-13을 수송하는 단백질을 필요로 (내부 산성) ΔpH를 생성, MexB와 리포좀에 coreconstituted된다.

<table><tbody><tr><td>DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93427</td><td></td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Invitrogen</td><td>V-1644</td><td></td></tr><tr><td>Pyranine (8- 하이드록시피렌-1,3,6-트리설폰산)</td><td>Invitrogen</td><td>H-348</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Dodecyl-&beta;-D-maltopyranoside)</td><td>Affymetrix</td><td>D310LA</td><td></td></tr><tr><td>Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes)Avanti</td> <td>Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 흡착제</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 크로마토그래피 빈 컬럼</td><td>Biorad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>탈염 컬럼</td><td>Bio-Rad</td><td>54805</td><td></td></tr><tr><td>동적 광 산란 기기</td><td>Wyatt Technology</td><td>DynaPro NanoStar</td><td></td></tr><tr><td>형광계 JASCO FP-6200</td><td>JASCO</td><td>6816-J002A</td><td></td></tr></tbody></table>

녹농균에서 mexab 유출 펌프의 체외 조사

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

세포막 단백질 수송을 모니터링하기위한 신뢰할 수있는 도구에 대한 신흥 과학적 필요가있다. 우리는 교통의 자신의 활동에 대한 정확한 조사를 위해 할 수있는 생체 모방 환경에서 그람 음성 세균 녹농균에서 유출 펌프의 재구성에 이르는 방법을 제시한다. 세 가지 전제 조건이 충족 : lipidic 환경, 교통의 해당 인덱스의 사용, 양성자 기울기의 세대 격실. 세포막 단백질 전달체 함께 박테리오로돕신 견고한뿐만 아니라 가역적 및 가변 인 양성자 구배를 생성하고 광 - 활성화 프로톤 펌프 리포좀으로 재구성된다. 단백질의 활성은 pyranin, pH에 의존하는 형광 프로브를 이용하여, 리포솜 내에서 발생 산도 변화로부터 추론된다. 우리는 단계별 절차 세포막 단백질 정제, 리포좀 형성, 단백질 재구성 및 전송을 설명(분석)가 해결됩니다. 그들은 특별히 RND 수송을 위해 고안된 것이지만, 기술 된 방법은 잠재적 양성자 구배 통전 다른 세포막 단백질 수송 체와 함께 사용하기 위해 적응 될 수있다.

분석은 양성자 구배가 생성되는 동안 시간의 함수로서 pyranine 형광을 모니터로 구성된다. 그 목적을 위해 샘플 (트리거 BR에 의해 따라서 양성자 펌프) 조명을 선택적으로 실시 된 후 여기 및 방출 pyranine의 파장을 이용하여 측정, 형광하는 (λ 전 = 455 nm의 및 λ EM은 509 nm의 =). 도 1은 BR에 의해 생성 된 양성자 구배 가역적임을 확인, MEXA / MexB의 부재에, 상기 분석으로 얻은 대표적인 컨트롤을 나타낸다. 산성화의 1주기 완료 후, proteoliposomes는 양성자 (양성자가 농도 구배 다음과 같은 지질 이중층에 걸쳐 천천히 수동적으로 확산) 펌핑 중지 BR에 대한 순서로 45 분 동안 어둠에 보관됩니다. 이 복구 시간 후, BR의 활성화는 단순히 다시 같은 서스펜션 조명에 의해 가능합니다. 그림 2실제 전송 측정에 해당합니다. 단백질 자유로운 리포좀과 음성 대조군은 예상대로, pH가 (도 2a 및도 2b, 오렌지 서클) 조명시 일정하다는 것을 보여준다. 그러나, 세포막에 BR을 포함 proteoliposomes, 따라서 리포좀 감소 내부의 pH와 안정된 구배가 내장되어 있습니다 (그림 2A와 2B, 보라색 사각형) 양성자 펌프 않습니다. 회색 삼각형 레드 다이아몬드 (도 2A)는 각각 존재 또는 훽스트 33342의 부재하에, BR 및 MexB 함유 proteoliposomes 내부의 pH를 나타낸다. 우리는 양성자 기울기가 부분적으로 만 MexB 카운터 수송에 의해 방출되는 기판 독립적 인 활동을 관찰합니다. 우리는 MexB의 기초 활동이 관측 때문이다. MexB의 활성에 MEXA의 효과를 시험하기 위해, MEXA은 (제 어떠한 기판의 부재에서, 재구성에 첨가 <st룽&gt; 그림 2B, 블루 다이아몬드). 다시, BR에 의해 생성 된 양성자 구배는 단지 부분적으로 소모된다. 실제 전송 측정은 매우 동일한 샘플에 구현된다. 미리, 양성자 구배는 초기화되어야하며 상기 기판은 단백질의 결합 부위에 도달하기 위해 현탁액에 첨가되어야한다. 그 목적을 위하여 현탁액을 45 분 동안 기판의 존재하에 어둠 속에서 배양한다. 후속 조명하면, 하나는 펌프에 의해 기판 운반의 결과로서, BR에 의해 생성 된 양성자 구배는 이제 완전히 MexAB (도 2B, 녹색 삼각형)에 의해 손실되는 것을 볼 수있다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1.jpg" /> . BR 조명에 의해 만들어진 양성자 기울기의 그림 1 가역성 : Pyranine 플로리다시간의 함수로서 측정 된 BR proteoliposomes의 uorescence. 0-15 분에서 BR 빛 활성화의 결과로 양성자 펌프. 15 ~ 60 분에서 proteoliposomes은 어둠 속에서 배양됩니다 intravesicular pH와 extravesicular pH가 동일 할 때까지이 시간 동안, 양자는 수동적으로 리포좀 밖으로 이동합니다. 60 ~ 75 분에서, BR은 여전히​​ 기능과 조명에 양성자 펌프. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2.jpg" /> .. 그림 2 교통 분석 : pyranine 형광, 시간의 함수 제어 리포좀 (주황색 동그라미)의 내부 A) pH가 해당 산도의 변화로 변환; 막에있는 BR (보라색 사각형)를 포함 proteoliposomes 내부의 pH, 산도 내부 훽스트 33342 (빨강 D없이 막에 BR 및 MexB를 포함 proteoliposomes의. iamonds) 훽스트 33342 (회색 삼각형) B 제어 리포좀 (주황색 동그라미)의 내부)의 pH와 막에있는 BR과 MexB를 포함 proteoliposomes 내부의 pH, 막 (보라색 사각형)에 BR을 포함 proteoliposomes 내부의 pH, 산도 내부 훽스트 33342 (블루 다이아몬드)없이 막에 BR, MexB 및 MEXA를 포함 proteoliposomes의, 훽스트 33342 (녹색 삼각형)와 막에 BR, MexB 및 MEXA를 포함 proteoliposomes 내부의 pH.

우리는 녹농균에서 유출 펌프의 체외 조사에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 리포좀 막 내에서 강력한 가역 및 조정할 수있는 양성자 기울기의 생성을 허용하고 따라서 protomotive 힘에 의해 격려하는 막 단백질에 적용 할 수 있어야한다.

녹농균에서 MexAB 유출 펌프의 체외 조사

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

이 절차의 전반적인 목표는 막 단백질의 재구성을 기반으로 한 기능 테스트를 사용하여 Pseudomonas aosa의 FLX 펌프 me AB를 조사하는 것입니다. 리포좀에서. 이것은 먼저 막 단백질을 과도하게 발현하고 정제하여 수행되며, 박테리아 막 단백질의 혼합 B 및 박테리아 로댕은 멤브레인에서 추출되고 친화성 크로마토그래피로 순수하게 정제됩니다.두 번째 단계는 건조된 지질 필름과 퓨린이 함유된 완충액을 결합하여 리포좀을 준비하는 것인데, 이는 다중암 소포를 형성합니다. 초음파 처리 후, 리포솜은 균질한 리포솜 집단을 얻기 위해 압출됩니다. 다음으로 세제 멤브레인 단백질과 폴리스티렌 비드를 리포좀 용액에 첨가합니다.세제의 소수성 꼬리는 폴리스티렌 비드에 흡수를 추가하여 멤브레인 단백질이 세제 벨트를 풀고 리포솜 멤브레인에 삽입할 수 있도록 합니다. 마지막 단계는 캡슐화되지 않은 퓨린을 제거하는 것입니다.탈염 컬럼에서 프로테아 리포좀을 실행함으로써 큰 프로테아 리포좀은 컬럼 상단에 묶여 있는 캡슐화되지 않은 퓨린보다 훨씬 빠르게 컬럼 바닥에 도달합니다. 궁극적으로 protal liposomes를 수집하고 형광을 사용하여 박테리아 옵신의 조명에서 생성된 pH 변화를 통해 Mex AB 활성을 조사합니다.Rodin Effects 펌프는 모든 항생제 계열의 광범위한 기질을 인식하고 운반하기 때문에 항생제 내성을 촉진하는 운송체이며, 멤브레인 단백질 효과에 대한 새롭고 신뢰할 수 있는 체외 활성 테스트가 시급히 필요합니다. 전송기. 실제로, 이러한 분석은 수송의 분자 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 새로운 잠재적 억제제 후보의 약리학적 스크리닝에 도움이 될 것입니다. 우리는 Pseudomona 진의 믹스, B-O-P-R-M, eFlex Perm에 중점을 둡니다.우리는 멤브레인의 단백질 구성, 기질의 벡터 수송에 필요한 폐쇄 된 구획 사용, 기질의 아드로 특성 및 믹스 AB에 필요한 단백질 구배의 생성으로 인한 인공물 효과를 피하는 굴뚝 및 다이의 미세한 쇼를 포함하여 B ffl 펌프를 혼합하기위한 효율적인 시험관 내 기능 테스트를 설계하기위한 세 가지 요구 사항을 충족하는 데 필요한 기술적 조언 및 방법을 제시합니다. 기능. 당사 분석의 강점은 재현 가능한 T, 활성화 및 가역적 프로 그래디언트를 생성하여 nstitute 박테리아 또는 리포좀 멤브레인에 AB가 혼합된 VR이라고 하는 델타 pH를 생성하는 방식입니다. BR은 aob salinium allic Marin 그람 음성, 의무적 호기성 aans의 보라색 막에서 정제 된 막 단백질입니다.조명이 켜지면 이 단백질은 단백질을 활발하게 펌핑합니다. 따라서 BR이 리포솜 내 단백질과 함께 구성되는 경우, 리포솜을 제거하면 BR로 인해 델타 pH가 생성되어 리포솜 내부의 단백질을 펌핑합니다. 순수하고 안정적인 단백질 물질의 준비는 가장 중요합니다.막 단백질 만들기 B의 정제 절차는 이전 영화 J ovy 간행물뿐만 아니라이 비디오에 수반되는 텍스트 프로토콜에서 잘 설명되었으며, 막 단백질 믹스 A의 정제에 대한 설명도 발견 될 수 있습니다 Halabach Salinium에서 박테리아 로댕을 제조하기 위해 10 일 동안 섭씨 37도의 조명 하에서 halabach salinium 세포를 성장시킵니다. 액체 성장 배지에서 탈이온수에 대해 투석하여 세포를 파괴합니다. 자주색 멤브레인을 30-40% 자당 구배로 정제합니다.다음으로, 멤브레인 현탁액을 2%octal glucocide로 가용화합니다. 섭씨 37도에서 24시간 동안 작동했습니다. 튜브를 알루미늄 호일로 싸서 빛으로부터 보호하십시오.재구성 직전에 텍스트 프로토콜에 나열된 소멸 계수를 사용하여 가용화된 박테리아 또는 도신의 농도를 추정합니다. 초원심분리기는 지질을 제거하고 단백질을 용해시키지 않기 위해 가용화 박테리아 옵신을 가용화합니다. 유리 스피커에서 리포솜을 준비하려면 분말로 저장된 콜레스테롤 1.5mg의 무게를 측정하고 유리 비커에 클로로포름에 용해된 디올 포스파티딜콜린 또는 DOPC 400마이크로리터를 첨가하고 조작 직전에 유리 비커에서 최소 1시간 동안 진공 상태에서 건조합니다.결과 DOPC 대 콜레스테롤 몰 비율은 3.3 대 1입니다. 1ml의 hebes 완충액으로 지질을 건조시킨 후 현탁액이 탁상으로 보여야 합니다. 이 단계에서 용액을 섭씨 10도에서 37분 동안 가열하고 실온에서 32번째 펄스, 32번째 일시 중지 주기를 번갈아 가며 40와트에서 32분 동안 초음파 처리하면 서스펜션이 선명하게 나타나야 합니다.이 단계에서 절차의 가장 중요한 측면은 리포좀의 단단하고 단일한 분산 현탁액을 얻는 것입니다. 이를 위해 누출이 발생하지 않도록 추가 링 장치를 설정하는 데 각별한 주의를 기울입니다. 또한 사용 후에는 장치를 매우 꼼꼼하게 청소합니다.리포좀의 mono disperse population을 얻으려면 각 cycle에 대해 두 번의 압출 사이클을 수행합니다. 리포좀 현탁액을 필터에 최소 11회 통과시킵니다. 첫 번째 사이클의 경우 200나노미터의 멤브레인 기공 크기를 사용하고 두 번째 사이클의 경우 100나노미터의 멤브레인 기공 크기를 사용합니다.이 시점에서 동적 광 산란 측정을 수행하여 현탁액의 균질성을 확인할 수 있습니다. 다음은 이 단계의 일반적인 결과입니다. 멤브레인 단백질은 세제 세제의 가용화 효과로 인해 리포좀에서 재구성될 수 있습니다.용해된 리포좀은 세제 가용화된 막 단백질과 함께 배양되고 프로테아가 형성됩니다. 리포좀은 폴리스티렌 비드로 세제를 빠르게 제거함으로써 유발됩니다. 단백질을 포함하려면 28mg의 트리튼 X 100을 넣고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.박테리아 옵신 Mex B 및 Mex A를 포함한 세제 가용화 단백질을 가용화된 리포좀에 첨가하고 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다. 이전에 활성화된 폴리스티렌 비드를 추가합니다. 꿀벌 대 세제 비율을 30:1로 추가하고 실온에서 어둠 속에서 5시간 동안 배양합니다.부드럽게 교반하면서 Hess 완충액과 평형을 이룬 PD 10 탈염 컬럼을 사용하여 protia liposomes 단백질과 유리 기질을 정제합니다. Mex B와 박테리아 옵신이 모두 리포솜에서 재구성되었는지 확인하려면 불연속 자당 구배에서 프로테아 리포좀 현탁액을 정제합니다. 프로테오솜을 자당의 5층 구배에 부드럽게 정착시킵니다.그런 다음 초분리 후 10만 G에서 17시간 동안 초원심분리기를 사용하면 응집된 단백질이 튜브 바닥에서 발견되고 통합되지 않은 세제 가용화 단백질은 튜브 상단에서 발견됩니다. 프로테아(Protea), 리포솜(liposome) 및 리포솜(liposome)은 고유 밀도에 해당하는 자당 계면에서 발견됩니다. 빈 리포좀은 prot 리포좀보다 그래디언트에서 더 위쪽으로 회수됩니다.sodium dyl sulfate로 분석하기 전에 다양한 gradient fractions를 주의 깊게 수집하십시오. kumasi 염색 또는 웨스턴 블로팅을 사용한 폴리 아크릴아미드 겔 전기영동. 분광 형광계를 사용하여 섭씨 25도에서 형광 측정을 수행하여 이중 파장 측정이 가능합니다.조명 기간을 번갈아 가며 550나노미터의 여기 및 방출 파장을 특징으로 하는 박테리아 로댕을 활성화하고 455나노미터의 여기 파장과 509나노미터의 방출 파장을 2초 동안 2초 동안 특징으로 하는 퓨린 형광 측정을 수행합니다. 여기 대역폭과 방출 대역폭을 5나노미터로 설정합니다. 역막 전위의 형성을 방지하기 위해 50나노몰 리니가 있는 상태에서 측정을 수행합니다.여기에 표시된 델타 한숨은 Mex a, Mex B가 없는 상태에서 분석으로 얻은 대표적인 대조군으로, 박테리아 막대 옵신에 의해 생성된 양성자 구배가 가역적임을 확인합니다. 산성화가 한 번 진행된 후, 오레오 리포좀은 박테리아 옵신이 양성자 펌핑을 멈출 수 있도록 45분 동안 어둠 속에 보관됩니다. 이 회복 시간이 지나면 동일한 현탁액을 비추는 것만으로도 박테리아 옵신의 활성화가 가능합니다.다시 말하지만, 실제 수송 측정은 단백질이 없는 리포좀을 사용한 음성 대조군이 예상대로 조명 시 일정한 pH를 갖는다는 것을 보여줍니다. 그러나 멤브레인에 박테리아 또는 옵신을 포함하는 프로테아 리포좀은 양성자를 펌핑합니다. 따라서 리포솜 내부의 pH가 감소하고 안정적인 그래디언트가 구축됩니다.회색 삼각형은 거짓이 있는 경우 박테리아 또는 옵신과 mex B를 포함하는 프로테아 리포좀의 내부 pH를 나타냅니다.3, 3, 3, 4, 2 염료. 빨간색 다이아몬드는 염료가 없을 때 pH를 나타내지만, 양성자 구배가 Mex B 카운터 수송에 의해 부분적으로만 소멸되는 곳에서 기질 독립적 인 활성이 관찰되며, 이는 Mex b의 활성에 대한 Mex A의 효과를 테스트하기 위해 Mex B.In 의 기초 활성에 기인합니다. Mex A는 먼저 재구성에 추가되었습니다.기질이 없는 경우에도 박테리아 옵신에 의해 생성된 양성자 구배는 부분적으로만 소멸됩니다. 실제 수송 측정은 바로 동일한 샘플에서 실현되고 양성자는 고삐 초기화되며 단백질의 결합 부위에 도달하기 위해 기질이 현탁액에 추가됩니다. 후속 조명에서 박테리아 옵신에 의해 생성된 양성자 구배가 이제 펌프에 의한 기질 이동의 결과로 Mex AB에 의해 완전히 소멸되는 것을 볼 수 있으며, 이 프로토콜을 다른 단백질에 적용하는 데 필요한 정확한 조건은 여기에 설명된 것과 다를 수 있음을 명심하는 것이 중요합니다.다음 매개변수, 정제 품질, 세제의 효율성, 세제의 가용화 단계 탈착, 지질 조성 및 지질 대 단백질 비율을 최적화하는 데 주의를 기울여야 합니다. 또한 온도 및 배양 기간은 이러한 모든 매개변수에 영향을 미치기 쉽습니다. 우리의 프로토콜은 r 및 d flix 펌프 믹스 B의 활성을 더 잘 이해할 수 있는 길을 열어줍니다.그럼에도 불구하고 r 및 d 운송업체용으로 특별히 판매된 경우 이 방법은 모든 PMF 활성화 FFL 스팸 전송기에 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜에서 우리는 가용성 단백질 세제 복합으로 표현, solubilization, 그리고 recombinantly 표현 막 단백질, MexB의 정화를 보여줍니다. MexB는 기회 세균성 병원체 녹농균에서 multidrug 저항 막 수송이다.

표현, 세제 Solubilization 및 멤브레인 전송, MexB의 Multidrug 저항 단백질의 정제

출처: Bru, J., et.al. 박테리아 떼의 타임랩스 이미징과 집단 스트레스 반응. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 군집 한천 플레이트 분석을 사용하여 녹농 균의 군집 회피 행동을 시각화하고 측정하는 방법을 보여줍니다. 통제된 조건에서 타임랩스 이미징을 위한 설정을 보여주고 항생제 유발 스트레스 신호가 이미지 분석을 통해 정량화되는 박테리아 움직임의 방향을 바꾸는 방법을 설명합니다.

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배우세요 Pseudomonas aeruginosa의 MexAB 유출 펌프를 리포솜 재구성을 통해 체외에서 기능적으로 분석하는 방법을. 이 프로토콜은 항생제 내성 메커니즘 연구와 신규 억제제 선별에 활용됩니다.

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