Name: 전체 셀 MALDI-TOF 질량 분석은 대 식세포의 활성화의 다양한 모드를 분석 할 수있는 정확하고 빠른 방법입니다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: 배우세요 대식세포 활성화 상태를 MALDI-TOF 질량분석으로 정밀 분석하는 방법을. CD14 양성 단핵구에서 유래한 대식세포를 사이토카인 및 세균으로 자극하여 스펙트럼을 획득하고 바이오인포매틱스로 분석합니다.

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Richard Ouedraogo는 산테 부처(PHRC 2010)의 보조금으로 지원됩니다. 기술 지원을 제공해 주신 Laurent Gorvel, Christophe Flaupdrops 및 Nicolas Amstrong에게 감사드립니다.

현재 프로토콜에서는 전체 세포 MALDI-TOF 기술을 사용하여 샘플의 지문으로 간주되는 질량 스펙트럼을 얻습니다. 생물 정보학 분석을 통해 이러한 지문을 비교하고 분류할 수 있었습니다. 이 프로토콜에는 세 가지 주요 부분이 있습니다.
<ol>
	<li>생물학 견본의 준비: 다른 주작동근으로 자극된 통제 대식 세포 및 대식 세포.</li>
	<li>전체 세포 MALDI-TOF MS에 의한 기술적 복제로 각 유형의 시료 분석.</li>
	<li>원시 데이터의 생물 정보학 분석.</li>
</ol>
세포 분리 및 배양을 위한 멸균 용액을 준비합니다. 모든 시약을 준비하고 4°C에서 보관하십시오.
1. 인간 단핵구의 준비
<ol>
	<li>세포 배양 배지를 준비합니다. RPMI 1640 배지(500ml)에 인간 혈청 AB+ 또는 소 태아 혈청(FBS) 55ml와 항생제 용액(페니실린 10,000 UI/ml 및 스트렙토마이신 10,000 μg/ml, 최종 농도 페니실린 100 UI/ml 및 스트렙토마이신 100 μg/ml)을 추가합니다.
	<ol>
		<li>백혈구 농축물(leukocyte concentrates)로부터 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 분리합니다.
		<ol>
			<li>15ml Ficoll이 들어있는 50ml 튜브를 준비합니다. 혈액을 식염수로 희석합니다(vol/vol, 1/10). 앞서 설명한 바와 같이 Ficoll에 30ml 희석된 PBMC를 증착합니다26.</li>
			<li>700 x g에서 20분 동안 원심분리기 Ficoll(밀도 1.077g/ml)과 희석된 혈장 사이의 계면에서 PBMC를 회수합니다. PBMC를 배양 배지에서 희석하고 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>항-CD14 항체로 코팅된 마그네틱 비드를 사용하여 PBMC에서 CD14+ 단핵구를 준비합니다. 
		참고: 단핵구가 관찰될 때까지 제품과 세포를 4°C로 유지하십시오.
		<ol>
			<li>pH 7.2, 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 구성된 러닝 버퍼를 준비합니다.</li>
			<li>펠릿화된 PBMC(분석당 10개, 7개 세포)를 80μl의 러닝 버퍼로 부드럽게 해리합니다.</li>
			<li>PBMC에 20μl CD14 MicroBead를 첨가합니다. PBMC를 혼합하여 15분 동안 배양합니다. 5ml의 러닝 버퍼와 원심분리기로 PBMC를 300 x g에서 5분 동안 세척합니다. 펠릿화된 PBMC를 108 PBMC에 대한 500 μl의 러닝 버퍼로 부드럽게 해리합니다. 
			참고: 108 PBMCC보다 낮은 PBMC 농도에는 500 μl의 러닝 버퍼를 사용하십시오.</li>
			<li>자기 분리로 진행합니다. 
			참고: 2 x 108 PBMC보다 작은 경우에는 MS 컬럼을 사용하십시오. 2 x 108 PBMC를 초과하고 2 x 109 PBMC를 초과하는 경우 LS 컬럼을 사용합니다.</li>
			<li>프리 컬럼과 컬럼을 러닝 버퍼(MS 컬럼의 경우 500μl, LS 컬럼의 경우 3ml)로 헹굽니다. PBMC를 precolumn에 추가합니다(레이블이 지정되지 않은 셀이 열을 통과할 때까지 기다림). 러닝 버퍼(MS 컬럼의 경우 500μl, LS 컬럼의 경우 3ml)로 3회 헹굽니다. 프리 컬럼을 제거합니다.</li>
			<li>15ml 튜브에 컬럼을 놓습니다. 컬럼에 러닝 버퍼(MS 컬럼의 경우 1ml, LS 컬럼의 경우 5ml)를 추가하고 컬럼에 압력을 가하여 CD14+ 세포를 용리합니다.</li>
			<li>300 x g에서 5분 동안 용리액을 원심분리하고 상층액을 버립니다. 10ml의 배양 배지로 단핵구 펠릿을 세척합니다. 
			참고: 항-CD14 항체 및 유세포 분석(일반적으로 95% 이상)을 사용하여 단핵구 제제의 순도를 분석합니다.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>단핵구를 대식세포로 분화.
	<ol>
		<li>37°C에서 10% 인간 혈청 AB+를 함유하는 3ml의 배양 배지에서 단핵구(6웰 플레이트의 웰당10개의 6개 단핵구)를 배양합니다. 4일 후, 인간 혈청이 포함된 배양 배지를 3일 동안 10% FBS를 함유한 3ml 배양 배지로 교체합니다.</li>
		<li>유세포 분석을 통해 얻어진 세포 집단을 단핵구 유래 대식세포(MDM)로 식별합니다(그림 1 참조).
		<ol>
			<li>배양 배지를 3ml PBS로 교체합니다. 고무 경찰관과 함께 MDM을 긁어내고 MDM 서스펜션을 수집합니다. 400 x g에서 5분 동안 원심분리기 펠릿화된 MDM에 2% BSA가 함유된 PBS를 첨가하고 세포 현탁액을 부드럽게 교반합니다. 세포 농도(200ml PBS에 10개의6 MDM)를 조정하고 4°C에서 배양합니다.</li>
			<li>MDM 현탁액에 항-CD14 항체 10ml와 항-CD68 항체 10ml를 추가하고 어둠 속에서 4°C에서 20분 동안 배양합니다. 
			참고: 이러한 항체는 유세포 분석 분석과 일치하는 두 가지 다른 형광 색소로 라벨링되어야 합니다. 예를 들어, 항-CD14 항체는 피코에리트린 결합(단핵구 염색의 경우) 및 항-CD68 항체는 Alexa Fluor 647 결합(대식세포 염색의 경우)과 결합할 수 있습니다.</li>
			<li>400 x g에서 5분 동안 MDM을 원심분리기로 가열합니다. 상층액을 제거합니다. 세포 펠릿을 부드럽게 해리하고 실온에서 15분 동안 250ml 3% 파라포름알데히드(PFA)로 MDM을 배양합니다. 400 x g에서 5분 동안 PFA 고정 MDM을 원심분리기로 만듭니다. 3ml PBS와 원심분리기 MDM으로 400 x g에서 5분 동안 MDM을 세척합니다. MDM 펠릿을 400ml PBS로 부드럽게 분리합니다.</li>
			<li>단핵구(CD14를 발현하지만 CD68을 발현하지 않음)와 단핵구(CD68을 발현하지만 CD14는 발현하지 않음)의 분화를 분석합니다. 참고: 일반적으로 세포의 95% 이상이 MDM입니다.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MDM의 18시간 자극.
	<ol>
		<li>부착성 MDM의 배양 배지를 새로운 3ml 배양 배지(10% FBS 함유)로 교체합니다.</li>
		<li>M1 또는 M2 분극을 유도하려면 M1 분극의 경우 IFN-γ 및 TNF, M2 분극의 경우 IL-4와 같은 인간 재조합 사이토카인을 사용합니다. M1 대식세포는 LPS로 자극하여 얻을 수도 있습니다. 사이토카인의 원액은 -80°C에서 보존되고 LPS의 원액은 -20°C에서 보존됩니다.
		<ol>
			<li>IFN-gγ(1 mg/ml)의 원액을 배양 배지에서 1/100으로 희석하여 10 ng/ml의 희석액을 얻습니다.이 IFN-γ 희석 6 μl를 MDM에 첨가하여 최종 IFN-γ 농도 20 ng/ml를 얻습니다.</li>
			<li>TNF (1 mg/ml)의 원액을 배양 배지에서 1/100로 희석하여 10 ng/ml의 희석액을 얻습니다.이 TNF 희석액 6 μl를 MDM에 첨가하여 20 ng/ml의 최종 TNF 농도를 얻습니다.</li>
			<li>IL-4 원액(1 mg/ml)을 배양 배지에서 1/100으로 희석하여 10 ng/ml의 희석액을 얻습니다.이 IL-4 희석액 6 μl를 MDM에 첨가하여 최종 IL-4 농도 20 ng/ml를 얻습니다.</li>
			<li>LPS의 원액 3μl(1mg/ml)를 MDM에 첨가하여 1μg/ml의 최종 LPS 농도를 얻습니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>박테리아로 MDM을 자극하려면 열에 의해 죽인 박테리아를 사용하십시오. PBS로 살아있는 박테리아를 씻고 95°C에서 1시간 동안 가열합니다. Orientia tsutsugamushi (균주 Kato (CSUR R163), Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette-Guérin, BCG CIP 균주 671203) 및 Coxiella burnetii (Nine Mile in phase I)는 이러한 병원체가 대식 세포를 감염시키는 것으로 알려져 있기 때문입니다. 따라서 O. tsutsugamushi 현탁액을 109 bacteria/ml로 준비합니다. MDM에 50μl를 추가합니다. M. bovis 및 C. burnetii에 대해 동일한 단계를 반복합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MALDI-TOF MS를 위한 생물학적 시료 준비.
	<ol>
		<li>자극된 MDM을 Ca2+ 또는 Mg2+ 없이 PBS로 세척합니다(Ca2+ 또는 Mg2+가 있는 경우 세포가 응집될 수 있음). 고무 경찰관과 함께 MDM을 긁어내고 MDM 서스펜션을 수집합니다. 원심분리기 MDM. FBS 오염을 버리기 위해 400 x g에서 5분 동안 Ca2+ 또는 Mg2+ 없이 PBS에서 MDM을 다시 세척합니다.</li>
		<li>세포 농도를 조정합니다(분석당 2 x 10,6 MDM). MDM을 400 x g에서 5분 동안 원심분리기하고 상층액을 폐기합니다. Ca2+ 또는 Mg2+ 없이 20μl의 PBS에서 세포 펠릿을 수집합니다.</li>
		<li>시료를 즉시 분석하거나 분석 전에 -80°C의 PBS에 보관하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. whole-cell Maldi-TOF MS에 의한 대식세포 분석
<ol>
	<li>CHCA 매트릭스의 제조.
	<ol>
		<li>바이알에 아세토니트릴 500μl, 10% 트리플루오로아세트산 250μl, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 물 250μl를 추가합니다. 이 용액에 CHCA 10mg을 최종 농도 10mg/ml로 희석합니다. 최소 20분 동안 혼합 및 초음파 처리합니다. 
		참고: 초음파 처리는 매트릭스의 채도를 향상시키지만 이 단계는 필수는 아닙니다.</li>
		<li>13,000 x g에서 5분 동안 원심분리기 펠릿을 버리고 상층액을 보관하십시오. 
		참고: 사용 직전에 매트릭스 용액을 준비하십시오. 결정을 포함하는 매트릭스 용액은 샘플 분자의 양호한 이온화를 허용하지 않으며 이는 스펙트럼의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MALDI 강철 표적의 준비.
	<ol>
		<li>광택이 나는 강철 타겟을 뜨거운 수돗물로 적십니다. 정밀 와이프 페이퍼로 문지릅니다. 70% 에탄올을 넣고 문지릅니다. 문질러 물로 헹굽니다. 70% 에탄올을 넣고 정밀 종이로 문지릅니다.</li>
		<li>대상을 70% 에탄올에 담그고 최소 15분 동안 초음파 처리합니다. 80%에서 500μl에서 1ml의 트리플루오로아세트산으로 대상을 덮습니다. 정밀 종이로 문지르고 닦으십시오. 문지르지 말고 HPLC 물로 헹굽니다. 실온에서 대상을 건조시킵니다. 
		참고: 부적절하게 세척된 타겟은 스펙트럼의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>예금 준비.
	<ol>
		<li>균일한 침전물을 얻기 위해 깨끗한 대상을 수평이고 평평한 지지대에 놓습니다.</li>
		<li>MDM 샘플을 얼음 위에서 부드럽게 해동합니다. 참고: 빠르고 격렬한 해동은 샘플을 변경하여 스펙트럼의 품질에 영향을 줄 수 있습니다. MALDI 타겟에 1 μl(약 1 x 105 세포 포함)를 증착하기 전에 MDM을 균질화합니다(세포 현탁액을 앞뒤로 피펫팅하여 수행). 샘플에 1μl의 MALDI 매트릭스 용액을 추가합니다. 피펫과 얼룩을 섞지 마십시오. 스폿을 피펫과 혼합하면 스펙트럼의 품질이 변경됩니다. 12-16개의 샘플/분석(기술 복제)을 증착합니다.</li>
		<li>실온에서 자연 증발합니다. 참고: 증발은 점진적으로 일어나며 매트릭스/샘플 결정의 형성으로 이어집니다. 침전물은 즉시 분석하거나 분석 전 며칠 동안 (최대 2 주) 어둠 속에 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>사용자는 실험에 사용된 사이토카인 또는 열에 의해 죽은 박테리아가 자극된 대식세포의 스펙트럼 범위 내에서 피크를 제공하지 않도록 제어해야 합니다. 여기에서 사이토카인과 열에 의해 죽은 박테리아만으로는 연구 범위(0-20kDa) 내에서 어떠한 신호도 제공하지 않는지 확인했습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>질량 분석기 튜닝 및 데이터 수집.
	<ol>
		<li>샘플이 들어있는 강철 타겟을 질량 분석기에 삽입합니다.</li>
		<li>질량분석기를 구성하고 데이터 수집을 실행합니다. 데이터의 자동 수집을 위해 기본 구성을 사용합니다.</li>
		<li>참고: flexControl 소프트웨어 구성에 대한 자세한 내용은 부록/표 1에 나와 있습니다. 이는 사용하는 질량 분석기 및 소프트웨어에 따라 다를 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 생물정보학 분석
참고: 생물정보학 분석은 특정 분석 라이브러리(MALDIquant)와 함께 무료 오픈 소스 통계 분석 소프트웨어 R을 사용하여 수행되었습니다. R은 웹 사이트 <a href = "http://cran.r-project.org/">http://cran.r-project.org/ 에서 무료로 다운로드 할 수</a> 있습니다. 스크립트에 대한 자세한 설명은 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50926/50926_MALDI_Ouedraogo_JoVE.tar.gz" target="_blank">보충 자료로 제공됩니다.</a>
<ol>
	<li>원시 데이터의 로딩 및 전처리.
	<ol>
		<li>질량분석기와 연결된 컴퓨터의 원시 데이터를 여러 파일 및 폴더에 저장합니다. 모든 하위 폴더가 있는 실험의 루트 폴더를 검색합니다. 분석을 위해 루트 폴더를 PC에 복사합니다.</li>
		<li>readBrukerFlexData 및 MALDIquant 라이브러리를 사용하여 원시 데이터를 로드하고 분석합니다. 
		참고: readBrukerFlexData를 사용하면 추가 분석을 위해 질량 분석기의 원시 데이터를 R의 특정 개체로 로드할 수 있습니다. 자세한 내용은 MALDIquant 설명을 참조하십시오27.</li>
		<li>생성된 spectra. 분석
		참고: 각 스펙트럼은 각각의 질량과 강도(상대적 존재도)가 있는 피크 목록으로 구성됩니다. 농도의 제곱근을 사용하여 스펙트럼의 그래픽 시각화를 향상시킬 수 있습니다. 기준선 추정을 위해 통계량에 민감한 비선형 피크 클리핑 알고리즘을 사용하여 배경을 수정합니다27. 신호 대 잡음비 6을 사용하여 피크를 검출합니다. 질량/전하(m/z) 값이 2,000ppm 창 내에 있을 때 검출된 피크가 스펙트럼 전반에 걸쳐 유사하다는 점을 고려하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>점수 정의 및 계산. 응집(agglomeration)을 위한 와드(ward) 알고리즘과 자카드(Jaccard) 거리를 기반으로 하는 비유사성 행렬(dissimilarity matrix)이 있는 계층적 클러스터링을 사용하여 스펙트럼을 분류합니다. 
	참고: Jaccard index는 Boolean 샘플 세트 간의 유사성(즉, 피크 목록의 유무)을 측정합니다.</li>
	<li>스펙트럼과 시청의 비교.
	<ol>
		<li>원시 스펙트럼 플롯을 분석합니다. 참고: x축은 m/z 비율(Daltons)을 나타내고 y축은 강도(상대적 풍부도)를 나타냅니다.</li>
		<li>계층적 클러스터링을 통해 스펙트럼 간의 유사성을 평가합니다. 유사성(또는 발산)을 dendrogram으로 나타냅니다.</li>
		<li>가상 젤 뷰 표현의 평균으로 재현성을 평가합니다. 참고: virtual gel-view representation은 상대적 풍부도가 파란색의 강도가 증가함에 따라 색상으로 구분되는 수정된 히트맵 플롯입니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다. RO, JLM 및 CC는 "Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF"라는 국제 특허 WO 2011/154650의 발명가입니다.

이 프로토콜은 진핵 전체 세포에 대한 MALDI-TOF-MS의 사용을 설명합니다. 여기에서는 미세 환경에 대한 반응으로 대식세포의 다중 활성화 상태를 분석하여 방법의 정확성을 설명합니다.
프로토콜의 성공은 몇 가지 중요한 단계에 달려 있습니다. 첫째, 용액 오염 물질은 스펙트럼을 변경할 수 있습니다. 예를 들어, 표적에 증착하기 전에 PBS에서 세포를 세척하여 배양 배지와 혈청 단백질을 제거하는 것이 중요합니다. 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 1 x 105 세포/μl의 세포 농도도 필요합니다. 둘째, 결정화는 프로토콜의 중요한 단계입니다. 좋은 품질의 결과를 보장하려면 타겟 플레이트를 조심스럽게 세척하고 타겟에 샘플을 증착하기 전에 매트릭스를 준비해야 합니다. 매트릭스 용액 직전에 샘플을 타겟에 증착할 때 최상의 결과를 얻을 수 있습니다(타겟에 증착하기 전에 샘플을 매트릭스와 혼합하지 마십시오). 샘플과 매트릭스 용액 사이의 올바른 자발적 혼합을 위해서는 ...

MALDI-TOF MS(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry)는 생물학적 시료를 연구하는 데 널리 사용되는 질량 분석 기술입니다. 레이저 빔과 에너지 흡수 매트릭스를 사용하면 소프트 이온화 과정, 즉 대부분 단일 전하를 띤 대형 생체 분자의 증발 및 생성이 가능합니다. 이 과정을 탈착/이온화라고 하며 MALDI라는 약어를 정당화합니다. 그런 다음 이러한 이온은 전압의 인가에 의해 가속되고 TOF 분석기로 들어가 이러한 이온을 분리하고 각각의 질량을 정량화할 수 있습니다1.
MALDI-TOF MS는 생물학, 화학 및 의학에서 분자 및 바이오마커2-4를 식별하거나 proteins5,6에서 번역 후 변형을 모니터링하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 최근 여러 그룹에서 MALDI-TOF MS를 적용하여 임상 샘플에서 미생물을 식별했습니다7,8. 이 미생물 응용 분야는 이제 임상 환경에서 일상적으로 사용됩니다. 전체 세포 MALDI-TOF는 MALDI-TOF MS의 기존 응용 분야에 비해 많은 장점이 있습니다. 전체 세포를 포함하는 샘플은 직접 처리되므로 많은 양의 물질을 분별하거나 분리하는 데 시간이 많이 걸리는 단계를 피할 수 있습니다. 또한, 다양한 피크의 특성화가 필요하지 않습니다: 전체 스펙트럼은 샘플의 지문으로 간주되며, 매칭 알고리즘은 테스트된 스펙트럼을 참조 스펙트럼 데이터베이스와 비교합니다.
우리와 다른 사람들은 이 전세포 분석 기술을 진핵 세포에 적용했습니다. 많은 응용이 이 기술로부터 파생될 수 있습니다: (1) 혼합된 샘플9-11로부터 주요 세포 유형을 식별하고; (2) 시간 경과에 따른 세포 배양의 생존 가능성 평가(품질 관리 산업 응용 분야 포함)12; (3) 단일 세포 유형13의 활성화 상태를 모니터링하고; (4) 임상 샘플의 악성 변형을 평가합니다14,15.
여기에서는 사이토카인 또는 열에 의해 죽인 박테리아에 반응하는 대식세포의 다양한 편광 표현형을 탐색하기 위해 전체 세포 MALDI-TOF MS를 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 대식세포는 미생물 병원체에 대한 면역 반응에서 중추적인 역할을 합니다. 이들은 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptor)를 통해 조직 내 감염원을 감지하며, 이는 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)16와 같은 보존된 미생물 패턴을 감지할 수 있습니다. 대식세포는 T 세포와 상호 작용하여 적응 면역 반응을 일으키는 전문 항원 제시 세포입니다. T 세포는 대식세포의 살균 활성을 강화하거나 조절하는 사이토카인을 방출하여 대식세포에 영향을 미칩니다. Th1/Th2 림프구 분극과 유사하게, 염증성 대식세포, 살균성 대식세포, 종양충성 대식세포는 M2 대식세포로서 M1 대식세포와 면역조절자 대식세포로 분류되어 왔다17-19. M1이라는 용어는 인터페론(IFN)-γ 및 종양괴사인자(TNF)와 같은 I형 사이토카인 또는 LPS18,20-23과 같은 박테리아 산물에 의한 대식세포의 고전적인 활성화를 의미하며, 대체 경로(인터류킨(IL)-4, IL-10, 형질전환 성장 인자-β1)에 의해 활성화된 대식세포는 M2 대식세포로 간주됩니다19,24,25. 미세환경에 반응하는 대식세포의 높은 표현형 및 기능적 가소성으로 인해 이러한 대식세포는 MALDI-TOF MS 접근법으로 미묘한 변화를 분석하는 데 유용합니다.

전체 셀 maldi-tof 질량 분석은 대 식세포의 활성화의 다양한 모드를 분석 할 수있는 정확하고 빠른 방법입니다

Whole-cell MALDI-TOF Mass Spectrometry is an Accurate and Rapid Method to Analyze Different Modes of Macrophage Activation

MALDI-TOF는 화학 및 생화학에서 광범위하게 사용되는 질량 분석 기술입니다. 또한 분자와 바이오마커를 식별하기 위해 의학에도 적용되었습니다. 최근에는 미생물학에서 준비 또는 분별 단계 없이 임상 샘플에서 성장한 박테리아를 일상적으로 식별하기 위해 사용되고 있습니다. 우리와 다른 연구자들은 이 전체 세포 MALDI-TOF 질량 분석 기술을 진핵 세포에 성공적으로 적용했습니다. 현재 응용 분야는 세포 유형 식별에서 세포 배양 및 진단 응용 분야의 품질 관리 평가에 이르기까지 다양합니다. 여기에서는 사이토카인 또는 열에 의해 죽은 박테리아에 반응하는 대식세포의 다양한 편광 표현형을 탐색하는 데 사용하는 방법을 설명합니다. 이를 통해 대식세포의 단백질체 반응의 다양성을 대표하는 대식세포 특이적 지문을 식별할 수 있었습니다. 이 응용 프로그램은 방법의 정확성과 단순성을 보여줍니다. 여기에서 설명한 프로토콜은 병리학적 조건에서 면역 숙주 반응을 연구하는 데 유용하거나 더 넓은 진단 응용 분야로 확장될 수 있습니다.

본 프로토콜의 목적은 대식세포가 주변 미세환경에 반응하는 정도를 평가함에 있어 전세포 MALDI-TOF MS의 정확성을 입증하는 것입니다.
그림 1은 혈액 샘플로부터 자극된 대식세포를 준비하는 과정을 설명합니다. 그림 2는 유세포 분석을 통한 단핵구 및 MDM의 분석 결과를 나타냅니다. 단핵구는 CD14를 발현했지만 CD68은 발현하지 않았음에 유의하십시오(그림 1A). 반대로, MDM은 CD68을 발현했지만 CD14는 발현하지 않았습니다(그림 1B).
그림 3은 전세포 MALDI-TOF MS의 원리를 설명합니다. 세포를 매트릭스와 함께 타겟 플레이트에 도포합니다. 질량 분석기 내부에서 레이저 빔이 샘플에 여러 번(240회) 조사되어 분자의 탈착과 이온화를 유도합니다. 생성된 이온...

이 프로토콜은 진핵 세포에서 전체 세포 MALDI-TOF 질량 분석법을 사용하는 방법을 설명합니다. 여기에서는 대식세포의 미세환경에 대한 반응으로 대식세포의 다중 활성화 상태를 분석하여 이 기술의 정확성을 보여줍니다.

전체 셀 MALDI-TOF 질량 분석은 대 식세포의 활성화의 다양한 모드를 분석 할 수있는 정확하고 빠른 방법입니다

MALDI-TOF is an extensively used mass spectrometry technique in chemistry and biochemistry. It has been also applied in medicine to identify molecules and ...

이 실험에서는 전세포 MALDI 질량 분석법을 사용합니다. 대식세포의 다양한 활성화 상태를 정확하게 분석하기 위해, 먼저 CD 14 양성 단핵구로부터 대식세포를 유도한 다음 사이토카인이나 박테리아와 같은 작용제로 세포를 자극합니다. 스틸 타겟 위에서 MALDI를 통해 샘플을 분석하여 단백질을 분리하고 각 샘플에 대한 스펙트럼을 얻습니다.전세포 말로프 질량 분석법(whole cell maloff mass spectrometry)을 통해 얻은 스펙트럼의 생물정보학적 분석 결과, 특정 핑거프린트로 단일 진핵세포인 대식세포의 다양한 활성화 상태를 구별할 수 있었습니다. 유세포 분석(flow)과 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 빠르고 간편하며 비용이 저렴하다는 것입니다. 본 실험에서는 대식세포로부터 재현성 있는 스펙트럼을 얻었으며, 전세포 ov를 통해 다양한 활성화 상태가 구별됨을 보여줍니다.또한 감염에 대한 숙주 반응의 진단에 유용할 수 있는 BBMC의 스펙트럼을 얻습니다. 이 방법은 면역 세포의 활성화 상태에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 이는 예를 들어 수술 중의 추가 분석을 대체하는 개념 프로파일링과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 50 milliliter 튜브에 있는 opax에서 세포를 분리하십시오.15 mL의 혈액을 추가한 후, 식염수로 혈액을 10배 희석하십시오. 그런 다음 희석된 혈액 30 mL를 밀도 구배 용액 층 위에 분리하십시오. PBMC 링을 회수한 후, 세포를 얼음 위에 보관하십시오.펠릿화된 P BMC를 80 µL의 running buffer에 넣고 부드럽게 해리시킵니다. anti CD 14 항체가 코팅된 자성 비드 20 µL를 추가합니다. 혼합 후 15분 동안 배양합니다.5 mL의 running buffer로 한 번 세척한 후 300 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠렛 형태의 세포를 500 µL의 running buffer에 넣고 부드럽게 분산시킵니다. 자기 분리를 위해 적절한 컬럼을 선택합니다.Preco와 컬럼을 running buffer로 헹굽니다. 그 다음 pbmc를 preco에 로딩합니다. 자기장을 가하고 running buffer로 세 번 헹굽니다.사전 보정 캡을 제거하고 컬럼을 15 milliliter 튜브에 장착합니다. 러닝 버퍼를 첨가하고 컬럼에 압력을 가하여 CD 14 양성 세포를 용출합니다. 그 다음, 원심분리합니다.5분 동안 300 Gs로 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다. 단핵구 펠렛을 10 milliliters의 배양액으로 세척합니다.anti-CD 14 항체를 이용한 유세포 분석으로 단핵구 준비물의 순도를 결정하기 위해 배지 일부를 취합니다. 단핵구를 10% human serum AB positive가 포함된 3 mL의 배양액에 넣고 4일 동안 배양합니다. 그 후 배지를 10% FBS가 첨가된 RPMI로 교체하며, 유세포 분석을 통해 획득한 세포 집단이 단핵구 유래 대식세포임을 확인합니다.실험 설계에 따라 샘플을 자극합니다. 자극된 MDM을 PBS로 세척한 후, 러버 폴리스맨(rubber policeman)으로 세포를 긁어 MDM 현탁액을 수집합니다. 원심분리를 통해 세포를 펠릿화한 다음, PBS로 한 번 세척하여 FBS 잔여물을 제거합니다.원심분리를 통해 M dms를 펠릿화하고, 펠릿을 20 µL의 PBS에 재현탁합니다. 세포를 즉시 분석하거나 분석 전까지 -80 °C의 PBS에 보관하십시오. CHCA 매트릭스를 준비하려면, 바이알에 아세토니트릴 500 µL, 10% 트리플루오로아세트산 250 µL, 그리고 HPLC 등급의 물 250 µL를 넣습니다.그 다음 10 µL의 CHCA 믹스를 추가하고 매트릭스를 최소 20분 동안 초음파 처리합니다. 13,000 Gs에서 5분 동안 원심 분리한 후, 상층액은 보관하고 펠릿은 폐기합니다. 이어서, 연마된 스틸 타겟을 온수로 적신 후 정밀 백지로 닦아냅니다.70% ethanol을 가하고 RINs를 물로 문지릅니다. 그런 다음 70% ethanol을 가하고 정밀지로 문지릅니다. 대상물을 70% ethanol에 담그고 최소 15분 동안 초음파 처리합니다.대상물에 80% dry fluoro acidic acid 500 µL에서 1 mL를 도포하고, 정밀 여과지로 문지르며 닦아냅니다. 그다음 문지르지 말고 HPLC 등급의 물로 헹굽니다. 대상물을 상온에서 건조합니다.이제 MDM 샘플을 얼음 위에서 천천히 해동합니다. 피펫팅을 통해 MDM 세포 현탁액을 혼합하고, 1 µL를 MALDI 타겟에 도포합니다. 샘플 위에 MALDI 매트릭스 용액 1 µL를 추가합니다.기술적 반복 실험을 위해, 분석당 12~16개의 샘플을 분주하고 실온에서 자연 증발시킵니다. 이제 샘플이 담긴 스틸 타겟을 질량 분석기에 삽입하십시오.질량 분석기를 설정하고 데이터 수집을 수행합니다. 각 스펙트럼은 상대적 풍부도를 나타내는 질량과 강도 값이 포함된 피크 목록으로 구성됩니다. 스펙트럼의 그래픽 시각화를 개선하기 위해 강도 값의 제곱근을 사용하십시오.그런 다음 통계적으로 민감한 비선형 피크 클리핑 알고리즘을 사용하여 배경을 보정합니다. 기선 추정을 위해 6의 신호 대 잡음비를 적용하여 피크를 검출합니다. 질량 대 전하 값이 2000 PM 윈도우 내에 있을 때 검출된 피크들이 스펙트럼 전반에 걸쳐 유사한 것으로 간주합니다.본 실험에서는 혈액 샘플로부터 자극된 대식세포를 준비하였습니다. 단핵구는 CD 14는 발현하지만 CD 68은 발현하지 않는 것으로 게이팅합니다. 반대로, 단핵구 유래 대식세포는 CD 68은 발현하지만 CD 14는 발현하지 않는 것으로 식별하였습니다.이 데이터는 MALDI toff MS 결과 해석에 있어 시료 준비의 역할을 보여줍니다. 양질의 스펙트럼에는 보통 5 kDa 부근에서 주요 피크가 나타납니다. 낮은 세포 농도로 얻은 이 저품질 스펙트럼에서 알 수 있듯이, 양질의 시료를 얻기 위해서는 최소 세포 농도가 필요합니다.시료를 타겟 플레이트에 증착하기 전 매트릭스와 혼합했을 때도 유사하게 좋지 않은 결과가 얻어집니다. 여기서는 다양한 시료의 스펙트럼이 히트맵으로 표시되어 있습니다. 상대적 함량은 파란색의 강도로 색상 구분되어 있습니다.이 가상 겔 뷰(virtual gel view) 표현은 각 클래스 내 샘플들의 재현성을 보여줍니다. 계층적 군집 분석을 통한 비지도 학습 분석 결과가 도표로 요약되어 있습니다. 모든 샘플은 세 개의 서로 다른 그룹으로 군집화되었습니다.자극하지 않은 MDM, IFN Gamma 자극 MDM 또는 IL four 자극 MDM입니다. 중요한 점은 MALDI TOF 분석을 통해 M1 대식세포를 M two 대식세포 및 자극하지 않은 MDM과 구별할 수 있다는 것입니다. IFN gamma, IL four 또는 자극하지 않은 MDM의 참조 스펙트럼의 피크 표현은 각 클래스에 특이적인 피크를 보여줍니다.전세포 말로프(whole cell maloff)의 정확성을 입증하기 위해 여러 작용제(agonist)를 통해 특이적인 지문(fingerprint)을 유도할 수 있습니다. 모든 자극된 샘플의 Ms.Indeed 스펙트럼은 자극되지 않은 대식세포의 스펙트럼과 명확하게 구분되었습니다. MDM 또한 열처리로 사멸시킨 박테리아에 의해 유도된 특이적 지문을 나타냈습니다.이러한 결과는 임상 환경에서 샘플이 준비되었을 때, 순환 세포를 분석하여 감염 또는 염증성 질환에 대한 숙주 반응을 평가하기 위해 MALDI-TOF MS를 사용할 수 있다는 가설을 뒷받침합니다. 이 기술은 적절하게 수행될 경우 1시간 이내에 완료될 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 전세포 OV 질량 분석법을 통해 단핵구 세포의 활성화 상태를 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

whole-cell-maldi-tof-mass-spectrometry-is-an-accurate-rapid-method-to

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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전체 셀 MALDI-TOF 질량 분석은 대 식세포의 활성화의 다양한 모드를 분석 할 수있는 정확하고 빠른 방법입니다

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