Name: 성인 마우스 망막으로 MACS 정제 광수용체 전구체 세포의 감하 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 배우세요 MACS로 정제한 광수용체 전구체 세포를 성인 마우스 망막에 이식하는 방법을. 면역형광 현미경으로 세포 통합을 분석하여 시각 회복 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 Nrl-GFP 마우스를 제공 아난드 스와롭, 기술 지원을위한 요헨 하스, 동물 축산에 대한 신디 뵈메와 에멜리 레스만을 제공 감사드립니다.	
	이 작품은 도이치 포충스게마인샤프트(DFG): FZT 111 - 재생 치료 드레스덴 센터, CRTD 종자 보조금 프로그램, SFB 655 및 프로레티나 e.V. 재단, DIGS-BB 대학원 프로그램 드레스덴, 그리고 Fundação 파라 시엔시아 e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)

동물의 윤리적 사용 및 관리 성명서:
모든 동물 실험은 유럽 연합 및 독일 법률 (Tierschutzgesetz)에 따라 엄격하게 수행되었으며 안과 및 시력 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 성명서를 준수했습니다. 모든 동물 실험은 TU 드레스덴과 Landesdirektion 드레스덴의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었다 (승인 번호: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. 세포 절개 및 셀 정렬을 시작하기 전에
<ol><li>세 개의 15ml 반응 튜브라벨: 세척(W), 포지티브 분수(+) 및 음수분(-).</li>
</ol>2. 망막 해리
<ol><li>가위를 사용하여 PN 4 새끼를 참수하십시오.</li>
	<li>강아지의 머리를 70 % 에탄올로 헹구고 PBS에서 세척합니다.</li>
	<li>머리를 차가운 HBSS로 옮기고 눈을 방출합니다 (모든 머리에 대해이 단계를 반복하십시오). 신경을 방출하려면 눈꺼풀을 열고 시신경 부위의 곡면으로 눈을 고정시합니다. 그런 다음 시야를 조심스럽게 궤도밖으로 끌어냅니다.</li>
	<li>모든 눈을 방출 한 후 망막을 분리하십시오 : 닫힌 가위를 시신경에 도입하고 블레이드를 엽니 다. RPE /chorid 밖으로 peal. 구부러진 집게를 사용하여 렌즈와 혈관을 제거합니다.</li>
	<li>분리된 망막을 파팡 용액을 함유하는 1.5 ml 반응 튜브로 옮김(파팡 해리 키트에 의해 제공).</li>
	<li>37°C에서 수조 또는 셰이커(400rpm)에서 30-60분 동안 파팡 용액의 망막을 배양한다.<ol>
<li>망막은 파팡 용액에 배양하는 동안, 15ml 반응 튜브 (라벨 "1")에 ovomucoid 용액의 파이펫 1 ml.</li>
			<li>DNase I (10 mg/ml) + ovomucoid 용액 60 μl (키트제공) + EBSS 520 μl을 15ml 반응 튜브 (라벨 "2")에 추가합니다.</li>
		</ol>
</li>
	<li>파파인 인큐베이션 후, 부분적으로 소화된 망막을 포함하는 파팡 용액을 반응 튜브 "2"로 전달한다.</li>
	<li>불을 연마한 파이펫을 사용하여 기계적 해리(10배 상하)를 수행합니다.</li>
	<li>파이펫 반응 튜브 "1"에 단일 셀 서스펜션. 난소용액 위에 셀 서스펜션을 부드럽게 겹쳐서 2층을 생성해 보십시오.</li>
	<li>300 x g (약 1,300 rpm)에서 5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>상체를 버리고 MACS 버퍼의 500 μl에서 셀을 다시 일시 중지합니다.</li>
</ol>3. 자기 연관된 세포 분류(MACS)를 사용하여 셀 정렬
<ol><li>10 μg/ml의 최종 농도를 달성하기 위해 X μl 쥐 항 CD73 항체를 500 μl에 첨가하십시오.</li>
	<li>얼음에 5 분 인큐베이션.</li>
	<li>MACS 버퍼로 15ml 반응 튜브를 10ml로 채우고 원심분리기는 300 x g의 속도로 5 분 동안 작성합니다.</li>
	<li>상부체를 제거합니다.</li>
	<li>480 μl MACS 버퍼에서 펠릿을 다시 중단하고 염소 안티 쥐 IgG 마이크로 비드의 120 μl을 추가합니다.</li>
	<li>얼음에 15 분 인큐베이션; 동요하지 마십시오, 흔들어 또는 혼합.</li>
	<li>MACS 버퍼로 15ml 반응 튜브를 5ml로 채우고 원심분리기는 300 x g에서 5 분 동안 작성하십시오.</li>
	<li>반응 튜브가 원심 분리됨에 따라:<ol>
<li>LS 컬럼을 마그네틱 스탠드에 조정합니다.</li>
			<li>LS 열 위에 사전 분리 필터를 놓습니다.</li>
			<li>3ml MACS 버퍼로 프리분리 필터와 LS 컬럼을 수분화하고 MACS 버퍼를 세척(W) 튜브로 수집합니다.</li>
		</ol>
</li>
	<li>상부체를 제거합니다.</li>
	<li>500 μl MACS 버퍼에서 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
	<li>500 μl 셀 서스펜션을 필터에 로드한 다음 필터에 1ml MACS 버퍼를 추가하고 음극분획(-) 반응 튜브에 음극기를 수집합니다.</li>
	<li>그런 다음 컬럼에 3 x 3 ml의 MACS 버퍼를 추가하여 열에 바인딩되지 않은 셀을 씻어 내다</li>
	<li>이 9ml가 LS 컬럼을 통과하면 자기 스탠드에서 컬럼을 제거하고 양극분수(+) 반응 튜브 위에 설치합니다.</li>
	<li>LS 열에 5 ml의 MACS 버퍼를 빠르게 로드하고 LS 열에 플런저를 넣고 전체 버퍼가 열을 통과할 때까지 아래로 누릅니다.</li>
	<li>300 x g에서 5 분 동안 양성 분획을 포함하는 반응 튜브를 원심 분리합니다.</li>
	<li>상체를 제거하고 MACS 버퍼의 500 μl에서 다시 중단하고 4 °C에서 유지하십시오.</li>
	<li>공통 셀 계수 장치를 사용하여 셀의 총 양을 계산합니다.</li>
	<li>MACS 버퍼에서 2 x 105 셀/μl을 포함하는 양극 분수에서 셀 서스펜션을 준비하고 4°C에서 보관하십시오.</li>
</ol>4. 마우스 망막에 MAC 정렬 광수용체 전구체 세포의 이식
<ol><li>다음 의 모든 솔루션을 준비해야 합니다: 1ml 멸균 PBS 또는 HBSS, 10 μl DNAse I, 1-2 ml 멸균 제H2O, 4°C에서 셀 서스펜션 분획의 알리쿼트.</li>
	<li>메데토미딘 염산염(0.01 mg/10g 체중), 케타민(0.75 mg/10g 체중)의 인트라피오네 주사로 성인마우스(즉, 2-4개월)를 마취한다. 그런 다음 통증 완화를 위해 Buprenorphine (0.05 mg/kg 체중)의 피하 주사를 수행하십시오.</li>
	<li>페닐레프린 2.5%-트로피카미드 0.5% 하락으로 동공을 넓히게 한다.</li>
	<li>마우스 헤드 홀더에 마우스를 고정하고 스테레오 현미경 아래에 배치합니다.</li>
	<li>눈의 건조를 방지하기 위해 Visidic 젤 한 방울을 바르십시오.</li>
	<li>바늘에 멸균 30 G 1/2를 사용하여 clera와 각막 (각각 오라 세라타)사이의 경계에 작은 구멍을 확인합니다.</li>
	<li>다이아몬드 펜을 사용하여 일반적인 커버 슬라이드를 작은 (약 5mm x 5mm) 조각으로 자르고 각막 위에 이 조각 중 하나를 배치하여 망막의 직접 시각화를 허용합니다.</li>
	<li>미리 살균 된 마이크로 리터 주사기를 탈화 된 물로 여러 번 플러시하십시오.</li>
	<li>마이크로리터 주사기를 셀 서스펜션 1μl로 적재하고, 결막과 클era를 통해 직접 바늘을 접선으로 적재하고 망막의 비강 반의 비강에서 시각적 제어 하에 놓습니다.</li>
	<li>망막에 구멍을 부드럽게 뚫고 침전 공간에 도달할 때까지 셀 서스펜션을 적재 공간에 주입합니다.</li>
	<li>결막의 황소 분리를 관찰, 어떤 출혈없이 망막 공간의 약 1/4를 커버, 균일해야한다.</li>
	<li>주사기를 부드럽게 인출하면 망막 구멍 씰이 자동으로 밀봉됩니다.</li>
	<li>마이크로리터 주사기를 탈온화물로 여러 번 플러시합니다.</li>
	<li>헤드 홀더에서 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>메데토미딘 염산염 효과의 반전을 위해 아티파노졸 염산염을 주입하여 마우스를 깨우는 다.</li>
	<li>따뜻한 어두운 챔버 (약 25 °C)에서 일어나 시간을 위해 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>이식 후 다음 2일, 부프레노르핀(0.05 mg/kg의 체중)은 통증 완화를 위해 아침과 오후에 피하 주사에 의해 투여되어야 한다.</li>
</ol>

<ol><li>Bartsch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+cells+integrate+into+the+outer+nuclear+layer+and+differentiate+into+mature+photoreceptors+after+subretinal+transplantation+into+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice.</a> Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).</li>
<li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+repair+by+transplantation+of+photoreceptor+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors.</a> Nature. 444, 203-207 (2006).</li>
<li>Eberle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+segment+formation+of+transplanted+photoreceptor+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+and+rod+photoreceptor+transplantation+in+models+of+the+childhood+retinopathy+Leber+congenital+amaurosis+using+flow-sorted+Crx-positive+donor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).</li>
<li>Barber, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+degenerate+retina+by+photoreceptor+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).</li>
<li>Pearson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+vision+after+transplantation+of+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoration of vision after transplantation of photoreceptors.</a> Nature. , (2012).</li>
<li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+end-stage+retinal+degeneration+and+restoration+of+visual+function+by+photoreceptor+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).</li>
<li>Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+integration+of+transplanted+CD73-positive+photoreceptor+precursors+into+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).</li>
<li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD73%2C+a+novel+cell+surface+antigen+that+characterizes+retinal+photoreceptor+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).</li>
<li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+transplantation+of+photoreceptor+precursor+cells+selected+via+cell+surface+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression.</a> Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).</li>
<li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+GFP+to+newborn+rods+by+Nrl+promoter+and+temporal+expression+profiling+of+flow-sorted+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).</li>
<li>Lee, M. Y., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+%26%2334%3BThree-step+MACS%26%2334%3B%3A+a+novel+strategy+for+isolating+rare+cell+populations+in+the+absence+of+known+cell+surface+markers+from+complex+animal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Development of the &#34;Three-step MACS&#34;: a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue.</a> J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).</li>
</ol>

저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

광수용체 전구체 세포의 침전체 이식은 이러한 빛에 민감한 세포의 통합을 달성하기 위한 신뢰할 수 있는 도구를 나타내며, 이는상당수1,2에서숙주 망막으로 통합된다. 이것은 미래에 망막 퇴행성 질병의 처리를 위한 세포 치료의 설치를 허용할 지도 모릅니다6. 현재 PN 4 망막으로부터 분리된 세포의 기증자 인구는 다른 세포 유형의 혼합물이며, 이 세포는 감전 주사 후 광수용체 전구체 세포만 통합한다. CD73 기반 MAC 선별을 사용하여, 기증자 세포 현탁액 내의 광수용체의 비율은 분류되지 않은 세포 인구에 비해 야생형 숙주 망막에서 약 3배 더 높은 통합률을 허용하는 90%≈ 증가시킬 수있다. 흐름 세포측정에 비해 MACS는 빠른 선별 절차의 장점을 가지며 GMP 표준에 비교적 쉽게 적용할 수 있습니다. 이식 가능한 광수용체의 정제는 만능 줄기 세포로부터 의 체외 생성에 대한 최근의 장점에 비추어 특정 관심사이다12-14. 분화 된 만능 줄기 세포의 배양은 특정 선별 절차의 ...

시력은 인간의 주요 감각 중 하나입니다. 이러한 감각과 실명의 장애는 선진국의 장애의 주된 이유 중 하나입니다. 시력 장애 또는 실명에 대한 주된 원인은 황반 변성, 망막 색소, 콘로드 이영양증 및 기타 조건에서 관찰될 수 있으므로 광수용체 세포 손실을 특징으로 하는 망막 변성입니다. 현재까지 잃어버린 시력을 복원하는 효과적인 치료법은 제공되지 않습니다. 2006년과 2008년에 는 서로 독립적으로, 영성 야생형 마우스망막1,2로막대 광수용체 전구체 세포를 성공적으로 이식하는 두 개의 상이한 실험실을 보고하였다. 따라서, 광수용체 전구체 세포 이식의 가능성을 발생시키고 또한 퇴화 된 망막으로, 퇴화 광수용체를 대체하고 시력을 회복시킨다. 실제로, 최근에는 이식된 광수용체 전구체세포가 제대로 발달된 외부 세그먼트3,시냅스 말단과 외부 핵층2-4에위치한 둥근 세포 체와 근접한 성숙한 야생형 광수용체의 형태학적 기준을 유도하고 있으며, 뿐만 아니라, 소각 회로 신경에 기능적으로 통합할 수 있는 능력도 입증되었다. 이 전략의 주요 원리 중 하나는 산후 4일 (PN 4, PN0은 출생의 날로 정의) 젊은 마우스 망막의 사용으로, 이식을위한 다른 세포 유형의 혼합물의 결과. 미래의 치료 응용 프로그램의 배경에, 이 혼합물은 광수용체 전구체 세포에 대해 정제되어야한다. CD73은 망막8-10에서젊은 광수용체에 대한 제1 세포 표면 마커로 기재되었다. 여기서, 우리는 이러한 세포 표면 마커에 기초하여 광수용체 전구체 세포 정화 방법을 시연하고 자기 관련 세포 선별(MACS) 기술을 사용한다. MACS는 빠른 정렬 시간과 GMP 조건에 대한 쉽게 조정으로 인해 형광 활성화 셀 정렬 기술에 비해 장점이 있을 수 있습니다. 우리는 성인 야생 형 망막에서 하수 공간으로 농축 된 인구를 이식 할 때 ~ 90 % 농축 및 최대 3 배 높은 통합 률을 입증 할 수 있습니다. 따라서 MACS 기반 광수용체 전구체 세포 농축 및 피망 이식은 망막 퇴성의 치료를 위한 재생 치료 전략의 개발을 위한 신뢰할 수 있고 유망한 기술이다.

<table><tbody><tr><td>Papain Dissociation System</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>공급 DNase I은</td></tr><tr><td>정제 된 쥐 안티 마우스 CD73, 클론 TY / 23</td><td>BD Pharmingen</td><td>550738</td><td>주식 농도 0.5 mg / ml</td></tr><tr><td>염소 안티 랫 IgG MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-501</td><td>2 ml의 총 부피</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td>총 세포 수를 계산하는 데 사용</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025050</td><td>망막 해리에 사용</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>Fluka93595</td><td>총 세포 수를 계산하는 데 사용</td></tr><tr><td>Vidisic</td><td>Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Domitor</td><td>Pfizer</td><td>76579</td><td></td></tr><tr><td>케타민 10%</td> <td>비율 제약</td><td>7538843</td><td></td></tr><tr><td>안티세단</td><td>화이자</td><td>76590</td><td></td></tr><tr><td>페닐레프린 2.5%-트로피카미드 0.5%</td> <td>대학 클리닉 드레스덴 약국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>사전 분리 필터</td><td>Miltenyi</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>LS 열</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS 분리기</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>파이어 폴리시 유리 파스퇴르 피펫</td><td>브랜드</td><td>74777 20</td><td>피펫' 팁은 파이어 폴리싱 및 오토클레이브 처리되어야 합니다.</td></tr><tr><td>MACS 15 ml 튜브 랙</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-052</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수 챔버</td><td>Carl Roth</td><td>T728.1</td><td></td></tr><tr><td>멸균 15 ml 튜브</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Leica M651 MSD Leica</td><td></td><td>M651 MSD</td><td>Olympus SZX10 대신 사용할 수 있습니다. Olympus SZX10</td></tr><tr><td>Olympus SZX10</td><td></td> 대신 사용할 수 있습니다. <td>Leica M651 MSD</td><td></td></tr> <tr><td>대신 Olympus SZX10을 사용할 수 있습니다.Olympus 도립 실체 현미경 CKX41</td>, <td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 후드, Thermo Scientific MSC-Advance</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>51025411</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 반응관</td><td>Sarstedt</td><td>727706400</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 반응관</td><td>Sarstedt</td><td>72695</td><td></td></tr>, <tr><td>Eppendorf Centrifuge 5702</td><td>VWR (Eppendorf)</td><td>521-0733</td><td></td></tr><tr><td>마우스 헤드 홀더</td><td>myNeurolab</td><td>471030</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 3 30 G 1/2 in</td><td>BD Pharmingen</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 마이크로리터 주사기 5 &micro; l, 75RN</td><td>해밀턴</td><td>065-7634-01</td><td>바늘 없이 배달</td></tr><tr><td>해밀턴 RN 특수 바늘 34 G</td><td>해밀턴</td><td>065-207434</td><td>무딘, 12mm 길이</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; bingen 스프링 가위 - 5mm 블레이드 스트레이트</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 포셉스 - 티타늄 생물학</td><td>파인 사이</td>언스 도구 <td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 펜</td><td>툴-테크</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15mm x 15mm 커버 슬립</td><td>스파크</td><td>MIC3366</td><td></td></tr></tbody></table>

성인 마우스 망막으로 macs 정제 광수용체 전구체 세포의 감하 이식

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

망막의 빛 감지 세포, 즉 광수용체의 손실로 인한 시력 장애 및 실명은 선진국에서 장애의 주된 이유를 나타냅니다. 세포 이식에 의한 퇴화 광수용체의 교체는 향후 임상 적용에서 가능한 치료 옵션을 나타낸다. 실제로, 최근 전임상 연구는 산후 4일째에 신생아 마우스 망막에서 분리된 미성숙광수용체가 침전 이식 후 성인 마우스 망막에 통합될 가능성이 있음을 입증했습니다. 기증자 세포는 내과성 양극성 세포에 근접하여 내부 및 외부 세그먼트, 외부 핵 층에 위치한 둥근 세포 체, 시냅스 말기를 포함한 성숙한 광수용체 형태를 생성하였다. 실제로, 최근 보고서는 기증자 광수용체가 기능적으로 숙주 마우스의 신경 회로에 통합한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 세포 교체 접근법의 향후 임상 적용을 위해, 선택의 세포의 정제 된 현탁액을 생성하고 눈에 적절한 통합을위한 올바른 위치에 배치해야합니다. 광수용체 전구체의 농축을 위해, 선별은 기증자 세포의 유전 기자 수정을 피하기 위하여 특정 세포 표면 항원에 기초해야 합니다. 여기서 우리는 자기 관련 세포 선별(MACS) -세포 표면 마커 CD73에 기초하여 광수용체 특이기자 마우스의 신생아 망막으로부터 분리된 이식 가능한 막대 광수용체 전구체의 농축을 보여준다. 항 CD73 항체를 함유한 배양은 마이크로 비드 컨쥬게이드 이차 항체에 이어 MACS에 의한 로드 광수용체 전구체의 농축을 약 90%까지 허용하였다. 흐름 세포측정에 비해 MACS는 GMP 표준에 더 쉽게 적용할 수 있으며 많은 양의 세포를 상대적인 짧은 기간에 정렬할 수 있다는 장점이 있습니다. 성인 야생형 마우스의 하수 공간에 농축된 세포 현탁액을 주입하면 분류되지 않은 세포 현탁액에 비해 3배 더 높은 통합률을 보였습니다.

마우스 망막에 통합하는 막대 광수용체의 능력을 평가하기 위해 마우스 리포터 라인이 사용되었으며, GFP는 신경망막 류신 지퍼(Nrl, Nrl-GFP)프로모터(11)에의해 구동된다. Nrl은 항봉 광수용체세포의 특정 라벨링을 허용하는 성인기 전반에 걸쳐 E12.5에서 발현을 시작하는 로드 광수용체의 초기 마커이다.
PN 4 Nrl-GFP 새끼는 참수되었고 눈이 에클레아트되었습니다. 망막은 그 때 위에서 기술한 방법을 사용하여 격리되고 해리되었다. 결과 셀 서스펜션은 CD73 기반 MACS(그림1 및 2)를사용하여 정렬하였다. MAC 정렬 후 이 절차 에서 달성된 농축을 분석했습니다.
도 3A에도시된 바와 같이, 초기 세포 현탁액(Input)은 30.4% GFP 양성 세포를 함유하고 있다. 막대 광수용체. C...

세포 이식은 광수용체 손실을 특징으로 하는 망막 변성의 치료를 위한 전략을 나타낸다. 여기에서 우리는 이식 가능한 광수용체의 농축 및 성인 마우스로그들의 감하 이식을 위한 방법을 기술합니다.

성인 마우스 망막으로 MACS 정제 광수용체 전구체 세포의 감하 이식

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

다음 실험의 전반적인 목표는 농축된 광수용기 전구세포를 수용자 마우스의 망막으로 이식하는 것입니다. 이를 위해 먼저 어린 공여 동물의 망막 안구를 분리합니다. 두 번째 단계에서는 CD 73 기반의 자성 세포 분리법(magnetic associated cell sorting)을 통해 망막 세포 집단으로부터 출생 후 광수용기 전구세포를 분리합니다.다음으로, 수신 동물 망막으로의 통합을 촉진하기 위해 광수용체 전구세포를 수신 동물의 망막하 공간에 이식합니다. 최종적으로, 이식된 광수용체 전구세포의 통합 가능성과 거동은 면역형광 현미경법으로 분석할 수 있습니다. 이 방법은 시력 회복을 위해 이식된 광수용체가 숙주의 신경 회로에 통합될 수 있는 능력이 어느 정도인지와 같은 망막 재생 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 함의는 망막 퇴행성 질환의 치료 그 이상으로 확장됩니다. max에 의한 광수용체 전구세포의 이식 및 강화가 GMP 조건에 쉽게 적응되면, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요해집니다. 이식 단계는 습득하기 어렵기 때문에, 최대의 성공률과 재현성을 보장하려면 하망막 공간에 바늘을 정밀하게 다루고 배치하는 것이 핵심입니다. 망막을 분리하기 위해, 우선 생후 4일 된 새끼 쥐의 머리를 70% ethanol로 짧게 헹군 다음, PBS로 세척하십시오.그런 다음 머리 부분을 차가운 HBSS로 옮겨 각 눈의 각막을 핵 형성(nucleation)합니다. 먼저 눈꺼풀을 엽니다. 그런 다음 곡선 핀셋을 사용합니다.시신경 부위의 장기를 잡고 안구를 안와에서 조심스럽게 끌어냅니다. 다음으로 망막을 분리하기 위해, 닫힌 가위의 끝을 시신경에 삽입한 후 날을 벌립니다. 망막 색소 상피와 맥락막을 벗겨내고, 곡선 핀셋을 사용하여 수정체와 혈관을 제거합니다.분리된 망막을 파파인 용액이 들어 있는 1.5 milliliter 반응 튜브에 넣고, 400 RPM, 37 degrees Celsius 조건의 셰이커에서 30분에서 60분 동안 배양합니다. 망막을 배양하는 동안, '1'이라고 표시된 15 milliliter 반응 튜브에 OVO moid 용액 1 milliliter를 분주하고, '2'라고 표시된 2 milliliter 반응 튜브에 DNAs 60 microliters, OVO MOID 용액 60 microliters 및 EBSS 520 microliters를 분주합니다. 배양이 끝나면 부분적으로 소화된 망막이 포함된 파파인 용액을 반응 튜브 2로 옮긴 후, 불꽃 연마된 피펫을 사용하여 망막을 10회 반복적으로 파이펫팅합니다.단일 세포 현탁액을 1번 반응 튜브의 OVO MOID 용액 위에 조심스럽게 층을 이루어 쌓고, 상온에서 300 Gs로 5분 동안 세포 용액을 원심 분리합니다. 그 후 상층액을 제거하고 500 µL의 max buffer에 세포를 재현탁합니다. MACS로 분리하려면 먼저 세포를 10 µg/mL의 rat anti CD 73 항체와 함께 얼음 위에서 배양하십시오.5분 후, 10 milliliters의 max buffer로 세포를 세척합니다. 그다음 펠렛을 480 microliters의 max buffer에 다시 현탁하고, 120 microliters의 go anti RET IgG microbeads가 들어있는 용액에 세포를 넣은 뒤 교반, 흔듦 또는 혼합 없이 얼음 위에서 배양합니다. 15분 후, 5 milliliters의 max buffer로 세포를 세척하며, 세척하는 동안 LS column을 max magnet 위에 올리고 column 상단에 pres separation filter를 배치합니다.다음으로, 3 mL의 max buffer로 필터와 컬럼을 습윤화합니다. 세척용으로 W라고 표시한 15 mL 튜브에 buffer를 수집합니다. 세포의 원심분리가 완료되면, 펠릿을 500 µL의 max buffer로 재현탁하여 세포를 필터에 로딩합니다.세포 위에 max buffer 1 mL를 추가한 다음, 'negative'를 의미하는 minus로 표시된 15 mL 반응 튜브에 음성 분획(negative fraction)을 수집합니다. 다음으로, 컬럼을 세척하기 위해 max buffer 3 mL를 세 번 추가합니다. 이제 자성 스탠드에서 컬럼을 제거합니다.양성(+)으로 표시된 15 milliliter 반응 튜브 위에 이를 설치하십시오. 그리고 5 milliliter의 max buffer를 컬럼에 빠르게 로딩하십시오. 모든 버퍼가 컬럼을 통과하도록 내린 후, 양성 분획을 원심 분리하여 가라앉히고, 펠렛을 500 microliters의 max buffer에 재부유시키십시오.세포를 4 °C에 두고 수를 측정합니다. 그 후, 분리된 광수용체 전구세포를 이식하기 위해 세포를 4 °C로 유지하면서 max buffer를 사용하여 농도를 2 × 10⁵ cells/µL로 조정합니다. 진정된 성체 마우스의 동공에 phenyl aleventropic chaid 한 방울을 떨어뜨려 동공을 확장시킵니다. 동공이 확장되는 동안, 다이아몬드 펜을 사용하여 커버 슬라이드를 약 5 × 5 mm 크기의 조각으로 자릅니다.마우스를 실체 현미경 아래에 두고, 마우스 헤드 홀더로 동물을 고정한 다음, 건조를 방지하기 위해 각 눈에 ICIC 겔을 한 방울씩 도포합니다. 이제 30 gauge 0.5인치 바늘을 사용하여 공막과 각막 사이의 경계에 작은 구멍을 냅니다. 그런 다음 5x5 mm 커버 슬라이드 조각 하나를 각막 위에 올려 망막을 직접 관찰할 수 있도록 합니다.다음으로, 멸균된 마이크로리터 주사기를 멸균 탈이온수로 여러 번 세척한 후, 분류된 세포 현탁액 중 하나를 주사기에 채웁니다. 바늘을 결막과 공막을 통해 대각선 방향으로 삽입하여 망막의 비측 절반에 위치시킵니다. 그런 다음 망막을 통해 망막하 공간까지 조심스럽게 구멍을 뚫고 세포를 주입합니다.출혈 없이 망막 공간의 약 4분의 1을 덮는 망막의 수포성 균일 박리를 확인하십시오. 그런 다음 주사기를 천천히 뽑아 이온수로 여러 번 더 세척합니다. 마지막으로 보정기에서 마우스를 풀어줍니다.마취 효과를 되돌리기 위해 동물에게 aamaz oil hydrochloride를 주입하고, 간상 광수용체(rod photoreceptors)가 마우스 망막에 통합되는 능력을 평가하기 위해 25 °C의 어두운 챔버에서 회복하도록 합니다. 이 히스토그램에 나타난 바와 같이, GFP가 neural retina losing zipper 또는 NRL 프로모터에 의해 발현되는 마우스 리포터 라인을 사용하였습니다. 초기 망막 세포 현탁액에는 30.4%의 GFP 양성 간상 광수용체가 포함되어 있었습니다.CD 73 기반의 max sorting 후, CD 73 양성 분획에서는 GFP 양성 광수용체 전구세포가 최대 86.9%까지 농축된 것이 관찰되었습니다. 반면, CD 73 음성 분획에서는 세포의 9.9%만이 GFP 양성이었습니다. CD 73 기반의 max sorting 이후 N-R-L-G-F-P 양성 세포의 농축 또한 관찰되었습니다.in vitro 플레이팅 후, 공여 세포는 수포성으로 박리된 호스트 망막에 의해 정의된 주입 부위에 남아 호스트 망막의 외핵층으로 통합되며 성숙한 광수용기의 형태를 획득합니다. 마스터 자기 관련 세포 분류는 정확하게 수행될 경우 2시간 이내에 완료될 수 있습니다. 이 절차는 줄기세포 유래 광수용기 또는 다른 망막 줄기세포의 농축을 위해서도 조정하여 적용할 수 있습니다.망막의 세포 전환을 통한 복원 또는 구조에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 특정 항체들을 사용할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 광수용체 전구세포가 풍부한 Photomax 세포를 수용 마우스의 망막 하 공간으로 이식하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

여기에서 우리는 쥐와 생쥐에 RPE 세포 덩어리를 망막하 주입하기 위한 멀티미디어 형식의 커뮤니티 승인 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식은 망막 변성의 동물 모델에 이식할 때 이식된 RPE 세포의 구조 가능성, 안전성 프로필 및 생존 능력을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

서스펜션에 망막 색소 상피 세포를 제공하기 위해 설치류에서 망막 주사를 수행

망막 색소 상피 (RPE) 대체 전략 및 유전자 기반 치료는 여러 망막 퇴행성 조건이 고려된다. 임상 번역, 큰 눈 동물 모델은 환자에 적용 할 수있는 수술 기법을 연구해야합니다. 여기에서 우리는 다양하고 비용 효율적인 RPE 이식에 맞 망막 수술 토끼 모델을 제시한다.

토끼의 망막 수술에 대한 단계 프로토콜에 의해 단계

Subretinal 주입은 나이 관련 황 반 변성에 대 한 줄기 세포 대체 요법의 전 임상 연구에 널리 적용 되었다. 이 시각화 된 문서에서는, 우리 쥐 눈 세포를 제공 하는 트랜스 scleral 접근을 통해 덜 위험 하 고, 재현 고 정확 하 게 수정 subretinal 주입 기술을 설명 합니다.

쥐의 눈으로 인간 망막 안료 상피 세포의 트랜스 scleral Subretinal 이식에 대 한 세련 된 프로토콜의 개발

망막 색소 상피 세포 건조 연령 관련 황 반 변성의 고급 형태에 대 한 세포 보충 치료 될 수 있습니다. 이 프로토콜 지리적 위축의 눈이 큰 모델 및 질병의이 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식의 생성을 설명합니다.

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

여기서는 인간 만능줄기세포(hPSC) 유래 망막 조직을 대형 동물 모델의 망막하 공간에 이식하는 수술 기법을 제시합니다.

고양이과 거대 동물 모델에서 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 조직의 망막하 이식

비인간 영장류 (NHP)는 해부학적 및 유전적 유사성으로 인해 인간의 망막 세포 치료법을 연구하기위한 이상적인 모델입니다. 이 원고는 NHP 눈의 망막 색소 상피 세포의 피하 학적 이식 방법과 황반 조작과 관련된 수술 내 합병증을 방지하기위한 전략을 설명합니다.

퇴행성 망막 질병을 위한 비인간 영장류 모형에 있는 망막 안료 상피 이식

이 프로토콜은 망막 변성이 있거나 없는 마우스 수용자에서 수술 합병증 발생률이 낮은 망막하 세포 이식편을 안전하고 정확하게 전달하기 위한 동공 시야 유도 경공막 접근법을 제시합니다.

망막 변성 마우스 모델에서 망막하 이식편의 Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation

동결 보존 후 hESC 유래 광수용체 전구 세포의 제조 및 rd10 마우스에서 이러한 세포의 망막하 전달에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

rd10 마우스에서 인간 배아 줄기 세포 유래 광수용체 전구체의 망막하 전달

의 마우스 모델 Utero에 이식

이 수술 기법은 마우스 눈의 subretinal 공간으로 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 주입을 보여줍니다.

마우스 눈에 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 Subretinal 주입

배우세요 MACS로 정제한 광수용체 전구체 세포를 성인 마우스 망막에 이식하는 방법을. 면역형광 현미경으로 세포 통합을 분석하여 시각 회복 연구에 활용할 수 있습니다.

성인 마우스 망막으로 MACS 정제 광수용체 전구체 세포의 감하 이식

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