쥐의 대동맥 부비동의 동맥 경화 병변의 정량 분석​​ 및 특성

이 절차의 전반적인 목표는 MI 대동맥동에서 죽상경화성 병변을 특성화하고 정량화하는 것입니다. 이것은 정점 부분을 분리하고 대동맥동을 찾기 위해 먼저 적출된 심장을 절개함으로써 이루어집니다. 다음으로 파라핀 블록은 심장의 처리된 정점 부분으로 준비됩니다.

그런 다음 대동맥동을 절단하여 슬라이드에 장착합니다. 마지막으로 조직 부분을 염색합니다. 궁극적으로 조직화학적 및 면역조직화학적 분석을 통해 죽상동맥경화성 병변의 다양한 크기와 구성을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 다니엘 벵가 페널(Daniel Venga penal)입니다. McMaster University Animal Research Ethics Board는 LDLR 이중 음성 마우스를 마취하고 혈액을 추출한 후 텍스트 프로토콜에 따라 심장을 분리하기 전에 안락사 및 고정하고 메스를 사용하여 상행 대동맥에 수직으로 심장을 횡단 절단한 후 여기에 설명된 모든 절차를 사전 승인했습니다. 심장의 정점 또는 윗부분을 임베딩 카세트에 넣고 포르민에 담그십시오.

그런 다음 카세트를 조직 처리기에 넣고 밤새 처리합니다. 조직학 주형에 대한 텍스트 프로토콜에 설명된 프로그램을 사용하여 섭씨 62도에서 하룻밤 사이에 파라핀 왁스를 녹입니다. 각 공정 조직을 깊은 조직학 주형에 넣고 심장의 계면이 주형 바닥에 닿도록 한 다음 용융된 파라핀 왁스를 부어 주형을 완전히 채웁니다.

라벨이 붙은 플라스틱 카세트를 사용하여 금형을 덮습니다. 얼음이나 차가운 표면에서 금형을 냉각한 후 금형에서 블록을 분리하여 대동맥을 절단합니다. 마이크로톰의 표본 홀더에 블록을 배치하여 내부에서 심장 상단을 향해 절단할 수 있도록 합니다.

마이크로톰을 10미크론으로 조정하고 심장을 절편화합니다. 유리 슬라이드에서 단면을 수집하고 광학 현미경으로 검사하여 위치와 방향을 결정합니다. 부비동은 첨판이 부착된 3개의 이분 판막 기저부로 나타나야 합니다.

대동맥동에 있는 하나 또는 두 개의 판막이 눈에 띄면 필요에 따라 블록의 각도를 조정하십시오. 밸브에 도달하면 마이크로톰을 조정하여 4-5미크론으로 자릅니다. 처음 10개 섹션을 개별 유리 슬라이드의 상단에 각각 장착한 다음 다음 위치에 10개 섹션으로 구성된 후속 그룹을 각각 장착합니다.

슬라이드에. 죽상경화성 병변이 관찰되지 않을 때까지 절편을 계속 수집합니다. 병변을 시각화하기 위해 헤마틴과 어인으로 절편을 염색하려면 슬라이드를 에어 드라이어에 8분 동안 넣습니다.

그런 다음 자일렌을 사용하여 각각 3분씩 4번 세척하여 섹션을 분리하십시오. 슬라이드를 100% 에탄올로 각각 3분씩 3회 세척합니다. 그런 다음 70% 에탄올 및 50% 에탄올.

각 3분씩 3회씩 증류수를 사용하여 슬라이드를 헹군 다음 담그십시오. MA의 헤마틴을 15분 동안 투여합니다.

씻고 달리십시오. 수돗물을 5분 동안 누릅니다. 그런 다음 1-5분 동안 eoin Y에 담근 후 5분 동안 세척하고 증류수

세척수와 증류수를 각각 5분씩 3회 세척합니다.50%에탄올을 각각 2분씩 2회 세척합니다. 그런 다음 70 % 에탄올을 2 분 동안 3 번 세척하고 100 % 에탄올을 씻습니다.

각 2분씩 3회. 그런 다음 자일렌과 자일렌을 각각 2분씩 4회 세척합니다. 크실렌 기반 장착 매체를 사용하여 섹션을 장착하고 광학 현미경으로 이미지를 캡처합니다.

이미징 소프트웨어를 사용하여 병변을 식별하고 정량화할 수 있으며, 이는 절편의 두께에 따라 40-50미크론 간격으로 대동맥동에서 특정 거리에서 확인할 수 있으며, 면역조직화학 및 면역형광 염색을 위한 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 5주 된 LDLR. 양성 마우스는 10주 동안 표준 식단 또는 고지방 식단을 먹인 후 심장을 고정, 격리 및 절단했습니다.

생쥐에게 표준 차우 식단을 먹일 때 죽상 경화성 발병은 매우 제한적이며 8 주에서 15 주에는 감지되지 않을 수 있습니다. 고지방 식단은 이 모델에서 죽상형성을 현저히 가속화하고 만성 무세포 코어와 섬유성 캡을 포함하는 큰 진행성 병변의 형성을 유도합니다. 죽상경화성 병변은 병변 발달 단계를 정의하는 특정 세포 유형 및 요인의 존재에 대한 염색으로 추가로 특성화할 수 있습니다.

인막으로의 단핵구 침투는 죽상 형성 인막의 가장 초기 사건 중 하나입니다. 단핵구는 세포 파편과 지질을 삼키는 대식세포로 분화합니다. 거품 세포(foam cell)로 알려진 지질이 충혈된 대식세포는 여기에서 볼 수 있는 동맥 벽에 지방 줄무늬를 만듭니다.

대식세포 발포세포는 F four, 80 및 MAC three와 같은 특정 대식세포 마커에 대해 항체로 염색하여 병변 발달의 모든 단계에서 검출할 수 있습니다. 혈관 평활근 세포 또는 V SMC는 건강한 동맥의 내측층에 국한되어 있습니다. VSC는 진행된 병변이 발달하는 동안 내막에서 이동하고 증식하도록 유도됩니다.

이 패널에서 볼 수 있듯이, V SMC는 개발 후 알파 액틴에 대한 항체로 염색하여 식별할 수 있습니다. 이 기술은 심혈관 질환 분야의 연구자들이 간상세포의 죽상경화성 병변의 발달과 진행을 탐구하는 데 큰 도움이 되었습니다.