Name: 쥐의 대동맥 부비동의 동맥 경화 병변의 정량 분석 및 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-07T22:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 학습하세요 쥐 대동맥 부비동의 동맥 경화 병변을 정량 분석하고 특성화하는 방법을. 조직 절단과 파라핀 블록 제작, 염색을 통해 병변 크기와 구성을 평가할 수 있습니다. 이 기법은 심혈관 질환 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 캐나다 보건 과학 연구소(Canadian Institutes of Health Sciences)와 캐나다 당뇨병 협회(Canadian Diabetes Association)의 운영 보조금으로 지원되었습니다. DEV는 Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica(칠레 CONICYT)의 장학금으로 지원됩니다.

McMaster University Animal Research Ethics Board는 여기에 설명된 모든 절차를 사전 승인했습니다.
1. 심장과 대동맥 수확
<ol>
	<li>마우스를 마취하고 흉강을 조심스럽게 열어 심장과 근위 대동맥을 드러냅니다.
	<ol>
		<li>심장의 우심실을 직접 구두점으로 찍어 쥐에서 혈액을 추출합니다. 
		참고: 혈액은 혈장 지질 및 기타 혈액 매개 인자를 분석하는 데 저장되고 사용될 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>경추 탈구로 마우스를 안락사시킵니다.</li>
	<li>식염수 5ml로 혈관 구조를 헹굽니다. 
	참고: 이것은 좌심실에 바늘 구멍을 뚫는 것을 통한 중력 관류에 의해 이루어집니다. 배액을 허용하기 위해 오른쪽 심방에 작은 절개를 만듭니다. 혈관 구조를 헹군 후 간, 근육 및 지방 조직의 조직 샘플을 채취하여 액체 질소에서 급속 냉동하고 향후 분석을 위해 -80ºC에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>혈관 구조는 10% 중성 완충 포르말린으로 좌심실로의 중력 관류에 의해 고정됩니다. 
	참고: 관류가 시작되면 10% 중성 완충 포르말린의 흐름이 느린 드립으로 조정되어 프로세스가 1-2분이 소요됩니다. 관류가 고정된 장기 및 조직은 면역형광 또는 조직화학을 통한 단백질 발현 연구에 사용할 수 있지만 일반적으로 웨스턴 블로팅이나 유전자 발현 연구를 위한 샘플로 사용할 수 없습니다.</li>
	<li>사체에서 심장과 약 2mm의 근위 대동맥을 조심스럽게 추출합니다. 하행 대동맥을 포함한 다른 조직을 수집하여 후속 분석을 위해 저장할 수 있습니다. 
	참고: 하행 대동맥(장골 분기까지)도 죽상동맥경화증을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>상행 대동맥에 수직이 되는 방식으로 제거된 심장에 메스로 횡단 절단을 합니다. 
	참고: 이는 해부 현미경을 사용하여 촉진되며 좌우 심방의 아래쪽 끝을 연결하는 직선을 따라 절단하여 효과적으로 수행할 수 있습니다(그림 1).</li>
	<li>심장의 정점(상단) 부분을 임베딩 카세트에 보관하고 처리를 위해 중성 완충 포르말린에 담급니다.</li>
</ol>
2. 대동맥의 준비
<ol>
	<li>절개된 조직이 있는 카세트를 조직 프로세서에 놓습니다.</li>
	<li>프로세스 조직 샘플. 
	참고: 일반적으로 조직 처리기는 작업 시간과 이 프로세스와 관련된 솔루션 때문에 밤새 작동하도록 프로그래밍되어 있습니다. 샘플은 설정된 프로토콜에 따라 처리됩니다.
	<ol>
		<li>10% 중성 완충 포르말린을 42ºC에서 1시간 동안 투여합니다.</li>
		<li>10% 중성 완충 포르말린을 42ºC에서 1시간 동안 투여합니다.</li>
		<li>40ºC에서 30분 동안 70% 에탄올.</li>
		<li>40ºC에서 30분 동안 85% 에탄올.</li>
		<li>40ºC에서 45분 동안 100% 에탄올.</li>
		<li>40ºC에서 45분 동안 100% 에탄올.</li>
		<li>40ºC에서 45분 동안 100% 에탄올.</li>
		<li>40ºC에서 1시간 동안 크실렌.</li>
		<li>40ºC에서 1시간 동안 크실렌.</li>
		<li>40ºC에서 1시간 동안 크실렌.</li>
		<li>파라핀 왁스를 63ºC에서 45분 동안 사용합니다.</li>
		<li>파라핀 왁스를 63ºC에서 45분 동안 사용합니다.</li>
		<li>파라핀 왁스를 63ºC에서 45분 동안 사용합니다.</li>
		<li>파라핀 왁스를 63ºC에서 45분 동안 사용합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>파라핀 왁스를 62ºC에서 밤새 녹입니다(그림 1D-E). 조직학 주형을 채우는 데 필요한 파라핀 왁스의 그램과 준비할 블록 수를 기준으로 사용할 파라핀 왁스의 총량을 추정합니다. 
	참고: 깊은 조직학 주형은 단면화 시 더 넓은 전위 회전 각도를 제공하기 때문에 얕은 주형보다 선호됩니다. 단일 심층 조직학 주형에는 11g의 파라핀 왁스가 필요합니다.</li>
	<li>가공된 각 조직을 깊은 조직학 주형에 넣은 다음 용융된 파라핀 왁스를 부어 주형을 완전히 채웁니다(그림 1F). 라벨이 붙은 플라스틱 카세트로 금형을 덮습니다(그림 1G).</li>
	<li>채워진 주형을 얼음 위나 차가운 표면에서 냉각하여(그림 1H), 고체 블록을 만들고 주형에서 블록을 분리합니다(그림 1I-J). 
	참고: 절개된 심장을 주형에 넣을 때 심장의 안쪽 면이 주형 바닥에 닿는지 확인한 다음 녹인 파라핀으로 블록을 채우십시오. 라벨이 붙은 플라스틱 카세트는 블록을 처리할 수 있는 베이스를 제공하기 위해 응고되기 전에 금형을 덮습니다. 냉각이 완료되면 주형이 제거되고 파라핀 블록이 실온에서 무기한 보관될 수 있습니다.</li>
</ol>
3. 대동맥 절편
<ol>
	<li>심장이 있는 블록을 마이크로톰의 표본 홀더에 배치하여 내부에서 심장 상단으로 절단할 수 있도록 합니다(그림 2)</li>
	<li>마이크로톰을 조정하여 10μm의 절편 두께를 자르고 심장 절편을 진행합니다.</li>
	<li>유리 슬라이드에서 단면을 수집하고 광학 현미경으로 검사하여 위치와 방향을 결정합니다.</li>
	<li>대동맥동(aortic sinus)의 1개 또는 2개의 판막이 뚜렷해지면 필요에 따라 차단의 각도를 조정하십시오(그림 3A). 
	참고: 부비동은 첨판이 부착된 3개의 이분 판막 베이스로 나타나야 합니다. 하나 또는 두 개의 판막만 관찰되면 그에 따라 절단 각도를 조정해야 합니다.</li>
	<li>마이크로톰을 4-5μm로 절단하도록 조정하고 코팅된 유리 슬라이드의 단면을 수집합니다. 
	참고: 절차는 다양할 수 있지만, 대동맥동에서 상행 대동맥으로 올라가는 처음 10개 섹션을 레이블이 지정된 유리 슬라이드(1-10으로 표시된 슬라이드)의 상단 부분에 수집하는 체계적인 접근 방식이 권장됩니다. 후속 절편은 죽상경화성 병변이 더 이상 관찰되지 않을 때까지 동일한 패턴에 따라 수집됩니다: #11-20, #21-30, #31-40. 이러한 방식으로 죽상경화성 병변을 검사하고 상행 대동맥을 따라 정확한 위치에서 특성화할 수 있습니다. 예를 들어, 슬라이드 1은 섹션 1, 11, 21, 31, 41 및 51을 포함하고 있으며, 이는 대동맥동에서 상행 대동맥까지 죽상 경화성 병변을 나타냅니다. 병변이 큰 경우 11-20으로 표시된 추가 슬라이드를 포함하여 동일한 패턴에 따라 더 많은 원위 단면을 수집할 수 있습니다.</li>
	<li>죽상경화성 병변이 관찰되지 않을 때까지 절편을 계속 채취합니다. 
	참고: 슬라이드는 추가 분석 전에 몇 달 동안 실온에서 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>
4. 죽상경화성 병변의 염색 및 정량화
죽상경화성 병변은 다양한 기법을 사용하여 다양한 방법으로 분석할 수 있습니다. 가장 기본적인 분석에는 병변 단면적 측정이 포함됩니다. 병변 부위를 정확하게 비교하기 위해서는 병변 측정의 시작점이 샘플마다 일관되어야 합니다. 이는 방향 전환을 위해 판막 리플렛을 사용하여 촉진됩니다. 병변 부위의 정확한 식별 및 정량화를 용이하게 하기 위해 일부 단면은 hematoxylin 및 eosin으로 염색됩니다. 여기에는 지정된 시간 동안 일련의 용액에 슬라이드를 담그는 것이 포함되며, 이는 조직을 파라핀화/염색합니다.
헤마톡실린 및 에오신 염색을 위한 프로토콜:
<ol>
	<li>슬라이드를 에어 드라이어에 8분 동안 넣은 다음 크실렌에서 4×를 세탁하여 섹션을 제거하고 세척당 3분 동안</li> 분해합니다.
	<li>100% 에탄올에 슬라이드를 3× 각각 3분씩 세척합니다.</li>
	<li>3×를 70% 에탄올에 3분씩 씻은 다음 2× 50% 에탄올에 각각 3분 동안 씻습니다.</li>
	<li>증류수로 헹군 다음 Mayer의 Hematoxylin에 15분 동안 담그십시오.</li>
	<li>흐르는 수돗물로 5분 동안 씻은 다음 증류수로 5분 동안 씻습니다.</li>
	<li>Eosin Y에 1-5분 동안 담그십시오.</li>
	<li>증류수에 3× 각각 5분, 50% 에탄올 2×으로 각각 2분, 70% 에탄올 3×으로 각각 2분씩 세척합니다.</li>
	<li>100% 에탄올 3×으로 각각 2분씩 세탁한 다음 자일렌 4×으로 각각 2분 동안 세탁합니다.</li>
	<li>자일렌 기반 장착 매체를 사용하여 절편을 장착하고 광학 현미경에 장착된 디지털 카메라를 사용하여 이미지를 캡처합니다.</li>
	<li>이미징 소프트웨어를 사용하여 병변 부위를 식별하고 정량화합니다. 
	참고: 병변 부위는 대동맥동에서 40-50μm 간격으로 특정 거리에서 측정할 수 있습니다(각 절편의 두께에 따라 다름). 이러한 면적 측정 대 거리의 플롯은 죽상 경화성 병변의 프로파일을 제공합니다(그림 4). 곡선 아래 면적은 죽상경화성 병변의 총 부피의 추정치를 나타냅니다. 병변의 추가 특성화에는 괴사 부위의 측정이 포함될 수 있습니다. 진행된 병변의 괴사핵(necrotic core, nc)은 세포사멸 발포 세포(apoptotic foam cell)에 의해 형성됩니다. 실습을 통해 이는 헤마톡실린 및 에오신 염색 절편의 무세포 영역을 검사하여 결정할 수 있습니다(그림 4A). 초기 병변은 괴사가 거의 없는 경향이 있는 반면, 더 진행된 병변은 플라크 불안정성에 기여할 수 있는 괴사 부위가 증가합니다. 괴사 부위의 존재를 확인하기 위해 동일한 대동맥의 연속 단면을 검사해야 합니다.</li>
</ol>
5. 죽상경화성 병변의 추가 특성화
죽상경화성 발달 단계에 관한 구체적인 세부 사항은 특정 세포 유형 또는 마커에 대한 항체로 염색하여 결정할 수 있습니다. 파라핀 절편에 대한 면역조직화학(Immunohistochemistry)은 주변의 염색되지 않은 조직의 맥락에서 특정 세포 유형 또는 마커를 식별하는 데 사용되는 표준 기술입니다. 항원 검출은 일반적으로 양고추냉이 과산화효소 기질을 사용하여 이루어집니다.
면역형광 염색은 형광단 접합 항체를 사용하며 형광 현미경과 검출을 위한 적절한 필터가 필요합니다. 이 기술을 사용하면 두 개(또는 그 이상)의 항원을 동시에 염색할 수 있습니다.
면역조직화학 염색을 위한 일반 프로토콜:
<ol>
	<li>에어 드라이어에 슬라이드를 8분 동안 놓습니다.</li>
	<li>자일렌을 4번 바꾸어 섹션을 분리, 3분 각.</li>
	<li>100% 에탄올을 3× 3분씩 세척하여 자일렌을 제거합니다.</li>
	<li>70% 에탄올에 3× 각각 3분 동안 세척한 다음 2× 50% 에탄올에 각각 3분 동안 세척합니다.</li>
	<li>증류수로 각각 5분씩 씻은 다음 PBS에서 3×분씩 5분씩 씻습니다.</li>
	<li>항원 검색을 수행합니다. 이는 마이크로파 압력솥 및 항원 회수 용액(10mM 구연산염 완충액, pH 6.0)에서 HIER(Heat-Induced Epitope Retrieval) 방법을 사용하여 수행할 수 있습니다. 
	참고: 포르말린 고정 과정은 관심 항원을 가릴 수 있습니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, HIER은 일부 항체의 성능을 크게 향상시키지만 다른 항체에는 필요하지 않습니다. 또한 HIER 항원 회수 방법에 대한 다른 사용 가능한 대안이 있습니다.</li>
	<li>압력솥이 식을 때 슬라이드를 PBS에 15분 동안 놓습니다.</li>
	<li>30분 동안 정상 혈청(2차 항체가 유래된 것과 동일한 종에서)의 절편을 배양합니다. 슬라이드를 세척하지 마십시오 - 혈청을 배출합니다.</li>
	<li>노멀 블로킹 세럼에 희석된 1차 항체를 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
	<li>PBS 3×로 각각 5분씩 세탁합니다.</li>
	<li>PBS에 희석된 biotinylated secondary antibody로 절편을 실온에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>고추냉이 과산화효소 스트렙타비딘으로 슬라이드를 30분 동안 배양한 다음 PBS 3×로 각각 5분 동안 세척합니다.</li>
	<li>발색 반응 - 신선한 DAB(3,3'-디아미노벤지딘)에서 슬라이드를 5-30분 동안 배양합니다. 이 반응은 현미경을 사용하여 모니터링해야 합니다. 슬라이드를 수돗물로 세척하여 반응을 멈추십시오.</li>
	<li>헤마톡실린으로 1분 동안 얼룩을 카운터하고 수돗물로 5분 동안 씻은 다음 증류수 3×으로 각각 5분씩 씻습니다.</li>
	<li>슬라이드 장착을 위해 4.7-4.9단계를 반복합니다.</li>
</ol>
6. 면역형광 염색을 위한 일반 프로토콜
면역형광 염색을 위해 약간의 변경이 있는 유사한 프로토콜을 따를 수 있습니다.
<ol>
	<li>슬라이드를 에어 드라이어에 8분 동안 놓고 자일렌을 각각 3분씩 4번 교체하여 섹션을 파라핀화합니다.</li>
	<li>100% 에탄올을 3× 3분씩 세척하여 자일렌을 제거합니다.</li>
	<li>70% 에탄올에 3× 각각 3분 동안 세척한 다음 2× 50% 에탄올에 각각 3분 동안 세척합니다.</li>
	<li>증류수로 각각 5분씩 씻은 다음 PBS로 3× 각각 5분씩 씻습니다.</li>
	<li>항원 검색을 수행합니다. 이는 마이크로파 압력솥 및 항원 회수 용액(10mM 구연산염 완충액, pH 6.0)에서 HIER(Heat-Induced Epitope Retrieval) 방법을 사용하여 수행할 수 있습니다. 
	참고: 포르말린 고정 과정은 관심 항원을 가릴 수 있습니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, HIER은 일부 항체의 성능을 크게 향상시키지만 다른 항체에는 필요하지 않습니다. 또한 HIER 항원 회수 방법에 대한 다른 사용 가능한 대안이 있습니다.</li>
	<li>압력솥이 식을 때 슬라이드를 PBS에 15분 동안 놓습니다.</li>
	<li>30분 동안 정상 혈청(2차 항체가 유래된 것과 동일한 종에서)의 절편을 배양합니다. 슬라이드를 세척하지 마십시오 - 혈청을 배출합니다.</li>
	<li>노멀 블로킹 세럼에 희석된 1차 항체를 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
	<li>PBS 3×로 각각 5분씩 세탁합니다.</li>
	<li>Normal blocking serum(또는 PBS)에 희석된 2차 fluorophore-conjugated antibody를 추가합니다. 실온에서 1.5시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>PBS 3×로 각각 5분씩 세탁합니다.</li>
	<li>DAPI를 사용한 카운터 염색.</li>
	<li>PBS 3×에서 각각 5분 동안 세탁합니다.</li>
	<li>페이드 방지 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 적용합니다.</li>
</ol>

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

죽상동맥경화증은 심근경색과 뇌졸중의 주요 근본 원인인 대근육 동맥의 복잡한 만성 질환입니다. 질병 진행은 동맥벽 내의 다양한 세포 유형과 순환 혈액 세포, 지단백 입자 및 우리가 이제 막 이해하기 시작한 기타 혈액 매개 요인의 상호 작용을 포함합니다. 죽상동맥경화증의 발달 및 진행에 관한 현재 지식의 대부분은 특별히 설계된 죽상동맥경화증이 발생하기 쉬운 마우스 모델 시스템에서 수행된 연구에서 나왔습니다.
죽상동맥경화증의 마우스 모델에는 몇 가지 중요한 한계가 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 분명히, 인간 피험자와 비교하여 마우스는 혈관 크기와 표면적, 혈류, 맥박수, 혈압 및 전단 응력에 상당한 차이가 있습니다. 인간에서 대부분의 심근 경색의 직접적인 원인인 병변 파열 및 동맥 혈전증은 대부분의 죽상동맥경화증이 발생하기 쉬운 마우스 모델에서 관찰되지 않습니다. 또한, 이러한 균주에서 유전적 다양성이 일반적으로 부족하면 실험 결과의 가변성이 감소하지만 설명하기 어려운 병리에...

지난 20년 동안 식이 및/또는 유전자 조작을 통한 죽상경화증에 취약한 마우스 모델의 개발과 사용은 죽상경화성 병변 발달과 관련된 분자 및 세포 메커니즘에 대한 이해를 크게 높였습니다1-3. 죽상동맥 형성에 대한 우리의 지식과 이해의 상당 부분은 아포지단백 (Apo)-E 결핍4 마우스, 죽상경화성 병변이 자발적으로 발생하고 저밀도 지단백 수용체(LDLR) 결핍 5 죽상동맥경화증이 다이어트를 유발하는 생쥐. 이러한 모델의 중요한 장점은 통제된 식단 및 환경 조건 하에서 유전적으로 정의된 비교적 많은 수의 동물을 연구할 수 있다는 것입니다. 또한, 이러한 마우스 균주 중 일부에서 발생하는 진행성 죽상경화성 병변은 지질로 채워진 괴사 코어와 섬유성 캡을 포함하는 인간 피험자에서 관찰된 것과 매우 유사한 것으로 보입니다. 죽상동맥경화증은 이러한 마우스 모델에서 빠르게 진행되므로 지방 줄무늬에서 진행된 플라크에 이르기까지 병변 발달을 몇 주에 걸쳐 연구하는 것이 매우 가능합니다. 또한, 당뇨병6, 이상지질혈증7, 비만8, 고혈압9, 담배연기10, 좌식 환경11 등 인간의 심혈관 질환에 대한 알려진 위험 요인은 병변 발생을 더욱 가속화하는 것으로 나타났습니다.
모든 죽상동맥경화증이 앓기 쉬운 마우스 모델은 아닐지라도 대부분의 경우, 병변 발생은 대동맥동에서 먼저 감지될 수 있습니다. 발병 시간은 마우스 균주와 식단에 따라 다릅니다. 병변의 크기가 커짐에 따라 상행 대동맥을 따라 자라는 경향이 있습니다. ApoE-/- 및 LDLR-/- 마우스에서 후속 병변 발달은 대동맥궁, 하행 대동맥 및 기타 더 큰 동맥12-14의 대동맥 분기점에서 감지될 수 있습니다. Beverly Paigen 박사와 동료들은 식이요법에 의한 죽상동맥경화증의 초기 모델을 개발하는 것 외에도 쥐 모델에서 병변 측정의 표준이 된 대동맥동에서 죽상경화성 병변의 정량화를 위한 분석을 확립했습니다15. 수년에 걸쳐 이 기술은 개선되고 자세히 설명되었습니다16. 여기에서는 마우스의 죽상경화성 병변을 정량화하고 특성화하기 위한 "Paigen 방법"의 수정된 버전을 제시합니다. 특정 혈관 영역에서 정의되고 고정된 방향으로 연속 대동맥 단면을 분석하면 정확한 데이터 수집이 용이하고 다양한 치료 그룹에서 병변 발달의 변화를 정확하게 감지할 수 있습니다. 여기에 제시된 방법은 이전 기술을 기반으로 합니다. 구체적으로, 우리는 조직화학(histochemistry)과 면역조직화학(immunohistochemistry)의 조합을 사용하여 연속적인 절편을 검사함으로써 면적, 부피, 괴사 및 세포 함량 측면에서 병변의 특성화가 어떻게 가능한지 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>LDLR 결핍 마우스&nbsp;( D2.129S7(B6)-Ldlrtm1Her/J)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>stock #002207</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>조직학 금형</td><td>Ted Pella Inc</td><td>27195</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Paramat</td><td>19286-10</td><td></td></tr><tr><td>코팅 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>용매 용기</td><td>Tissue Tek II</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM22S5</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>VWR</td><td>80086-982</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>올림푸스</td><td>BX41TF</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>올림푸스</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>www.rsbweb.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>프로세서</td><td>Sakura Finetek</td><td>VIP6-A1</td><td></td></tr><tr><td>처리 카세트</td><td>VWR</td><td>18000-134</td><td></td></tr><tr><td>Preassure Cooker</td><td>Nordic Ware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰 블레이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>30-518-35</td><td></td></tr><tr><td>안티페이드 마운팅 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-4680</td><td></td></tr><tr><td>Xylene 마운팅 중간&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>Aquous 장착 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1161</td><td></td></tr><tr><td>Mac-3 anbody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553322</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 항체</td><td>Abcam</td><td>Ab6640</td><td></td></tr><tr><td>Alpha actin 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-32251</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&rsquo; s 헤마톡실린</td><td>시그마-알드리치</td><td>E4382</td><td></td></tr><tr><td>에오신 Y</td><td>시그마-알드리치</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>DAB (3,3'-디아미노벤지딘)</td><td>다코</td><td>K3468</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐의 대동맥 부비동의 동맥 경화 병변의 정량 분석​​ 및 특성

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

죽상동맥경화증은 대동맥에 생기는 질환으로 심근경색과 뇌졸중의 주요 원인입니다. 이 질병의 분자 및 세포 병태생리학 연구를 용이하게 하기 위해 여러 가지 다른 마우스 모델이 개발되었습니다. 이 원고에서는 쥐, 대동맥동, 상행 대동맥에서 죽상경화성 병변의 정량화 및 특성화를 위한 구체적인 기술을 설명합니다. 이 절차의 장점은 병변의 단면적과 총 부피를 정확하게 측정하여 여러 치료 그룹 간의 죽상경화성 진행을 비교하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 이것은 판막 첨판을 해부학적 랜드마크로 사용하고 절편 각도를 신중하게 조정함으로써 가능합니다. 또한 죽상경화성 진행을 특성화하기 시작하는 데 사용할 수 있는 기본 염색 방법에 대해서도 설명합니다. 연구자가 특별히 관심을 갖는 항원을 조사하기 위해 추가로 수정할 수 있습니다. 설명된 기술은 일반적으로 기존 및 새로 생성된 다양한 식이 및 유전자 유도 죽상 형성 모델에 적용할 수 있습니다.

5주령의 LDLR-/- 마우스에 표준 식단 또는 고지방 식단을 10주 동안 급여하였습니다. 마우스를 희생시킨 후 앞서 설명한 대로 포르말린으로 관류하였습니다. 병변 부위와 부피를 측정하기 위해 대동맥 기저부의 횡단면을 제작하고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였습니다(그림 4). 마우스에 표준 사료를 급여할 경우 동맥경화의 진행이 매우 제한적이며 15주령에도 검출되지 않을 수 있습니다. 고지방 식단은 이 모델에서 죽상동맥경화증의 발생을 유의하게 가속화하며, 괴사성 무세포 핵과 섬유성 캡을 포함하는 크고 진전된 병변의 형성을 유도합니다.
죽상경화성 병변은 병변 발달 단계를 정의하는 특정 세포 유형 및 인자의 존재 여부를 염색함으로써 추가적으로 특성화할 수 있습니다. 내막으로의 단핵구 침윤은 죽상동맥경화증 발생의 가장 초기 단계 중 하나입니다. 내막의 단핵구는 대식세포로 분화하여 세포 파편과 지질을 포식합니다. 거품세포(foam cells)로 알려진 지...

조직화학적 및 면역조직화학적 분석과 결합된 대동맥동 및 상행 대동맥의 정밀 절단을 사용하여 마우스 모델에서 죽상경화성 병변을 정량화하고 특성화하는 절차를 설명합니다.

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

이 절차의 전반적인 목표는 MI 대동맥동의 죽상경화성 병변을 특성화하고 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 적출된 심장을 해부하여 심첨부를 분리하고 대동맥동의 위치를 찾아냄으로써 수행됩니다. 그다음, 처리된 심장 심첨부를 이용하여 파라핀 블록을 제작합니다.그 후 대동맥 동(aortic sinus)을 절단하여 슬라이드에 부착합니다. 마지막으로, 조직 절편을 염색합니다. 최종적으로, 조직화학 및 면역조직화학 분석을 통해 죽상경화성 병변의 다양한 크기와 구성 성분을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.시연은 제 실험실의 대학원생인 Daniel Venga penal이 진행하겠습니다. 본 문서에 기술된 모든 절차는 McMaster University 동물연구윤리위원회의 사전 승인을 받았습니다. LDLR 이중 음성 마우스를 마취하고 혈액을 채취한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 심장을 분리하기 전 안락사시키고 고정합니다. 메스를 사용하여 상행 대동맥에 수직이 되도록 심장을 횡단 절개합니다. 심장의 심첨부 또는 상단 부분을 임베딩 카세트에 넣고 포르말린에 담급니다.그런 다음 카세트를 조직 처리기에 넣고 밤새 처리합니다. 조직학 몰드용 텍스트 프로토콜에 명시된 프로그램에 따라 파라핀 왁스를 62 °C에서 밤새 녹입니다. 처리된 각 조직을 깊은 조직학 몰드에 넣고 심장의 단면이 몰드의 바닥에 닿도록 한 다음, 녹은 파라핀 왁스를 부어 몰드를 완전히 채웁니다.라벨이 부착된 플라스틱 카세트를 사용하여 몰드를 덮습니다. 얼음이나 차가운 표면에서 몰드를 냉각시킨 후, 블록을 몰드에서 분리하여 대동맥을 절편화합니다. 심장의 내부에서 상단 방향으로 절편을 만들 수 있도록 마이크로톰의 시료 홀더에 블록을 배치합니다.마이크로톰을 10 microns로 조정하고 심장을 절편합니다. 유리 슬라이드에 절편을 수집하고 광학 현미경으로 관찰하여 위치와 방향을 결정합니다. 동(sinus)은 리플릿이 부착된 3개의 이분형 판막 기저부로 나타나야 합니다.대동맥 sinus의 판막 하나 또는 두 개가 보이기 시작하면, 필요에 따라 블록의 각도를 조절하십시오. 판막 부분에 도달하면 마이크로톰을 조정하여 4~5 µm 두께로 절단합니다. 처음 10개의 절편은 각각 개별 유리 슬라이드의 상단에 부착하고, 이후 10개씩 묶은 각 절편 그룹을 다음 위치에 순차적으로 부착하십시오.슬라이드 위에 올립니다. 죽상경화성 병변이 더 이상 관찰되지 않을 때까지 절편 수집을 계속합니다. 병변을 시각화하기 위해 헤마토실린-에오신 염색을 수행하려면, 슬라이드를 에어 드라이어에 8분 동안 넣습니다.그 다음, 자일렌을 사용하여 각 3분씩 4회 세척하여 절편의 탈파라핀 처리를 수행합니다. 슬라이드를 100% ethanol로 각 3분씩 3회 세척합니다. 이어서 70% ethanol과 50% ethanol로 세척합니다.각 3분씩 총 3회 반복합니다. 증류수로 슬라이드를 헹군 후, MA's hematin에 15분 동안 담급니다.수돗물로 5분 동안 세척하며 헹굽니다. 그 다음, eoin Y에 1~5분 동안 담근 후 증류수로 5분 동안 세척합니다.증류수로 5분씩 3회 세척하십시오. 50% ethanol로 2분씩 2회 세척하십시오. 그 다음 70% ethanol로 2분씩 3회 세척하고, 마지막으로 100% ethanol로 세척하십시오.각 2분씩 세 번 반복합니다. 그 후 세척과 자일렌 처리를 각각 2분씩 네 번 실시합니다. 자일렌 기반의 봉입제를 사용하여 절편을 봉입하고 광학 현미경으로 이미지를 캡처합니다.이미징 소프트웨어를 사용하여 병변을 식별하고 정량화합니다. 병변은 절편의 두께에 따라 40~50 micron 간격으로 대동맥 벌브(aortic sinus)로부터 특정 거리에서 측정할 수 있으며, 면역조직화학 및 면역형광 염색에 관한 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 5주령의 LDLR. Positive 마우스에 표준 식이 또는 고지방 식이를 10주 동안 급여한 후, 여기에서 보여주는 바와 같이 심장을 고정, 분리 및 절편화하였습니다.마우스에 표준 사료를 급여할 경우, 죽상경화증의 진행은 매우 제한적이며 생후 15주 차에는 검출되지 않을 수 있습니다. 이 모델에서 고지방 식단은 죽상경화증 발생을 상당히 가속화하며, 괴사성 무세포 핵과 섬유성 캡을 포함하는 크고 진행된 병변의 형성을 유도합니다. 죽상경화성 병변은 병변 발달 단계를 정의하는 특정 세포 유형 및 인자의 존재 여부를 염색함으로써 더욱 세분화하여 특성화할 수 있습니다.내막으로의 단핵구 침윤은 죽상경화증 발생의 가장 초기 단계 중 하나입니다. 단핵구는 세포 파편과 지질을 포식하는 대식세포로 분화합니다. 거품세포로 알려진 지질이 가득 찬 대식세포는 여기서 보이는 것처럼 동맥벽에 지방 줄무늬를 형성합니다.대식세포 거품세포는 F4/80 및 MAC3와 같은 특정 대식세포 마커에 대한 항체 염색을 통해 병변 발달의 모든 단계에서 검출될 수 있습니다. 혈관 평활근 세포(vSMC)는 건강한 동맥의 중막층에 국한되어 존재합니다. 진행된 병변이 발달하는 동안 vSMC는 내막으로 이동하고 증식하도록 유도됩니다.이 패널에서 볼 수 있듯이, V SMC는 발달 후 alpha actin에 대한 항체 염색을 통해 식별할 수 있습니다. 이 기술은 심혈관 질환 분야의 연구자들이 쥐 모델에서 죽상경화성 병변의 발달과 진행을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

심혈관 질환의 동물 모델에서 동맥 병변의 생체 외 분석은 고전적으로 조직학 및 면역 조직 화학 기술에 의존합니다. 이는 3차원 병변에서 2차원 측정을 제공합니다. 이 원고는 광학 투영 단층촬영을 사용하여 3차원의 정량적 분석을 위한 동맥 병변의 발생에 대해 설명합니다.

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