뼈 대식 세포 생산에게 골수 유래

이 절차의 전반적인 목표는 소변, 골수 유래 세포 배양에서 대식세포를 생성하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐의 뒷다리에서 골수를 추출하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 골수에 상주하는 대식세포를 제거한 다음 대식세포 분화 조건에서 골수 세포를 추가로 배양합니다.

그런 다음 골수 세포가 대식 세포로 분화하면 실험적 분석을 위해 수집 할 수 있습니다. 궁극적으로, 컨포칼 현미경 검사는 골수 유래 대식세포, 말단 산성 구획 내에서 박테리아 LPS의 국소화를 입증하는 데 사용할 수 있습니다. 대식세포, 세포주를 성장시키는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 숫자가 많기 때문에 1차 대식세포를 얻을 수 있다는 것입니다.

자체 제작 단계는 배우기 어렵고 연습이 필요하기 때문에 방법의 시각적 시연이 중요하며, 성공을 거두기 위해 안락사된 쥐의 피부를 70% 에탄올로 소독합니다. 각 뒷다리 윗부분을 절개하고 피부를 발 쪽으로 당겨 근육을 노출시킵니다. 그런 다음 뒷다리를 자르고 멸균 가위와 집게를 사용합니다.

피부를 제거하려면 5ml의 멸균 얼음이 들어 있는 35mm 페트리 접시에 다리를 넣습니다. 콜드 PBS. 뼈에 붙어 있는 피부와 근육을 모두 제거한 다음, 5ml의 얼음이 들어 있는 새로운 멸균 페트리 접시에 뼈를 옮깁니다.

차갑고 멸균된 PBS. PBS 5밀리리터로 뼈를 두 번 씻은 다음 5밀리리터의 얼음이 들어 있는 멸균 모르타르에 옮깁니다. 차갑고 멸균된 PBS.

이제 관절의 대퇴골에서 경골을 잘라내고 절굿공이를 사용하여 뼈를 부드럽게 부수십시오. 얼음처럼 차가운 15ml 튜브에 상층액을 3회 모읍니다. 그런 다음 70미크론 나일론 세포 여과기를 통해 조직 현탁액을 여과합니다.

고체 조각을 제거하려면 여과액을 회전시키고 상층액을 부드럽게 버리십시오. 세포를 원심 분리한 후에 반응을 멈추기 위하여 30 초 후에 얼음 차가운 완전한 DMEM의 20 밀리리터를 추가하고, 우리는 37 섭씨 온도의 20 밀리리터에 있는 펠릿을 현탁하고, 완전한 DMEM를 갖춘다, 그 후에 2개의 100 밀리미터 페트리 접시 사이에서 세포 현탁액을 분할한다. 섭씨 37도에서 4시간 동안 접시를 배양한 다음 상등액을 실온에서 50ml 튜브에 모읍니다.

상층액을 스핀 다운한 후, 이전에 제조된 L 9 29 세포 상등액이 보충된 완전한 DMEM 10밀리리터에 펠릿을 다시 현탁시킨 다음 40미크론 나일론 세포 스트레이너를 통해 세포를 여과합니다. 여과액을 140ml의 완전한 DMEM 및 L 9 29 세포 배지에 첨가한 다음 접시당 10ml의 세포 현탁액을 15,100mm 페트리 접시에 분배합니다. 섭씨 37도에서 3일, 이산화탄소 5%를 10ml의 완전한 DMEM과 L 9 29 상층액에서 3일 동안 배양한 후 추가로 4일 동안 세포를 배양합니다.

골수 유래 대식세포를 채취하기 위해 도립 현미경으로 세포 성장을 주기적으로 모니터링하고, 먼저 상층액을 흡인하고 폐기합니다. 그런 다음 완전한 DMEM으로 페트리 접시를 두 번 세척합니다. 다음으로, 섭씨 37도의 완전한 DMEM 5밀리리터를 넣고 고무 경찰을 사용하여 세포를 부드럽게 분리하고 골수 유래 대식세포를 50밀리리터 튜브에 모은 다음 세포를 스핀다운합니다.

Resus는 펠릿을 20ml의 완전한 DMEM에 현탁시킵니다. 마지막으로, 트라이암 블루 제외로 셀을 계산합니다. 이 방법을 사용하면 방금 설명한 바와 같이 골수에 상주하는 대식세포를 뺀 둥근 비부착 골수 세포를 분리하고 도금한 후 단 며칠 만에 많은 수의 대식세포를 얻을 수 있습니다.

이러한 대표적인 BMDM 전구체 세포를 G-M-C-S-F와 함께 배양하였다. 3일 후, 세포는 대식세포로 달라붙어 분화하기 시작했습니다. 7일 후, 골수 유래 대식세포의 합류 단층이 관찰되었습니다.

F, four, 80 및 H-L-A-D-R에 대한 유세포 분석은 골수 유래 대식세포가 골수 세포가 대식세포로 분화되는 것을 확인하는 두 마커를 모두 발현하는 것을 밝혔습니다. 골수 유래 대식세포의 PHA 산성 능력을 평가합니다. 라텍스 속도를 내재화하는 세포의 능력은 예상대로 모니터링되었습니다.

세포당 beads의 수는 endocytic potential을 평가하기 위해 시간이 지남에 따라 증가하는 것으로 확인되었습니다. 골수 유래 대식세포도 콕시엘라(Coxiella)와 공동 배양되었습니다. 빨간색의 Burnett eye LPS는 파란색의 리소좀 관련 막 단백질 1을 품고 있는 구획에 국한된 것으로 관찰되었으나 녹색의 cathepsin D는 그렇지 않았으며, 이는 LPS가 예상되는 골수 유래 대식세포로서 리소좀과 융합할 수 없는 후기 엔도솜에 존재함을 입증했습니다.

TMA Wiley eye에 의한 감염을 통해 박테리아 병원체 상호 작용을 추가로 분석했습니다. 예상대로 빨간색의 박테리아는 KPS와 D를 품고 있는 구획에 국한되지 않았으며 이는 다시 녹색으로 나타납니다. 이 대표적인 면역 블롯에서 골수 유래 대식세포 신호 전달 경로를 평가하여 골수 유래 대식세포와 조직, 분리된 대식세포가 esia coli LPS 자극에 대한 반응으로 인산화된 P 38 알파 맵 키나아제 수준을 상향 조절

이 방법은 세포 내 구획 마이크로가 국소화되는 것과 같은 세포 미생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.