Name: 감자와 니코티아나 벤타미안의 농아침투 및 PVX 농병감염 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-03T19:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 학습하세요 농아침투 및 PVX 농병감염을 이용한 식물 병원체 효과자 인식 분석 방법. 이 기술은 저항성 유전자 기능 검증과 분자 식물병리학 연구에 필수적인 고처리량 기능 분석 도구입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 와게닝겐 대학 기금(WUF), 대학원생을 위한 중국 장학위원회 프로그램, NWO-VIDI 교부금 12378에 의해 부분적으로 지원됩니다.

1. 식물 재배 및 테스트 조건
<ol><li>18-22°C의 온도 범위 내에서 또는 자연 광 정권 하에서 또는 16 시간/ 8 시간 낮/밤 정권으로 제어 온실 또는 기후 챔버에서 식물을 성장하고 유지합니다. 식물을 보다 관리하기 위해 축실 가지를 제거하십시오.</li>
	<li>감자의 경우, 무라시게-스쿠그(MS) 매체(20g/L 자당, 비타민 5g/L/L MS 염, 8g/L agar, pH 5.8)를 함유한 멸균 플라스틱 항아리에 체외질을 유지하여 18°C의 기후챔버에서 16시간/8시간/1박/야간 으로 16시간/8시간 동안 온실로 이송하여 오염된 토양으로 이송한다.</li>
</ol>2. 농약침
<ol><li>식물 재료: 니코티아나 벤타미안의경우, 약 4-5주 된 종자 재배 식물을 사용하십시오. 감자의 경우 체외에서 4-5주 된 이식을 사용하십시오. 침투를 위해 젊고 건강하며 완전히 발달된 잎을 선택하십시오.</li>
	<li>
아그로바테리움 문화:<ol>
<li>YEB 배지를 미리준비합니다(표 1). 50ml 튜브를 1μl 아세토시링게오네(200mMM), 100 μl MES 버퍼(2-(N-morpholino)-에탄 설포닉산, 1M) 및 적절한 항생제로 보충한 10ml YEB 배지로 튜브를 채웁니다. 파이펫 20 μl 글리세롤 스톡은 원하는 균주의(표 2)(관심 유전자 함유)을 YEB로 한다. 동시에이 분석에서 모든 Agrobacterium 균주에 대한 문화를 시작합니다. 세포를 28°C에서 1-2일 동안 흔들어 서 200rpm에서 약 1.0의 OD600으로 배양한다.</li>
		<li>원심분리에 의해 10분 동안 3,000 x g에서 세포를 수확하십시오. 상체를 부어 신선하게 만든 MMA 배지(표 3)에서 펠릿을0.3의OD600으로 재연한다. 부드럽게 소용돌이 세포를 다시 중단합니다. 두 개의 세균성 균주의 동전 여과의 경우 배양을 1:1 비율로 혼합하십시오.</li>
		<li>침투하기 전에 1-6 시간 동안 실온에서 벤치에 문화를 둡니다. 그 동안, 식물에 침투 할 및 실험 날짜를 레이블.</li>
	</ol>
</li>
	<li>침투: 1ml 바늘없는 주사기를 사용하여 Agrobacterium 현탁액에 침투하십시오. 주사기의 현탁액이 있는 잎 패널을 주의 깊게 천천히 주입합니다(건강 및 안전상의 이유로 이 과정에서 눈 보호가 착용되어야 합니다). 각 변형에 대해 적어도 3 개의 식물에 침투합니다. 식물 당 3 개의 잎을 사용하여 삼중 으로 사용하십시오. 참고 : 일반적으로, Agrobacterium 서스펜션 의 1 ml는 N. 벤타미안의3 식물에 충분 할 수있다. 감자의 경우 Solanum 종의 잎이 침투하기가 더 어렵기 때문에 더 많은 현탁액이 필요합니다. 서스펜션의 필요한 볼륨은 솔라눔 종에 따라 달라집니다. 장갑을 교체하거나 침투 사이에 에탄올로 장갑을 살균하고 접종 다음날까지 식물에 물을 주지 않음으로써 교차 오염을 피하십시오.</li>
	<li>점수: 세포사멸 표현형이 명확할 때 침투 후 약 3일 동안 거시적 반응점수(도1). 세포사멸 표현형이 정량적인 경우 주어진기준(도 2)을사용한다. 간략하게, 세포 죽음의 거시적인 점수에 대한 비늘은 주로 침투 된 지역의 세포 사멸 비율에 달려 있습니다. 세포 사멸의 백분율은 0%(증상 없음)에서 100%(컨실런사)까지 의 척도로 묘사됩니다. 중간 반응은 클로로시스와 같은 약한 반응에서 세포 사멸의 증가 수준에 이르기까지 다양합니다. 원하는 경우 거시적 점수는 현대적인 사진 이미징 장비를 사용하여 정량적으로 평가될 수도 있습니다.</li>
</ol>3. PVX 농병 소독
<ol><li>식물 재료: N. 벤타미안의경우, 약 2-3 주 된 종자 재배 식물을 사용하십시오. 감자의 경우 체외에서약 2-3 주 된 이식을 사용하십시오. 대규모 테스트의 경우, 약간 오래 된 (4-5 주) 식물을 사용, 이 식물은 Agrobacterium 접종 반점의 높은 숫자를 수용 하기 위해 점점 더 큰 잎으로.</li>
	<li>
농균 배양:<ol>
<li>YEB 배지를 미리 준비하십시오. 10ml 튜브를 적절한 항생제로 보충한 3ml YEB로 채웁니다. 파이펫 20 μl 글리세롤 스톡은 원하는 균주의(표 2)(관심 유전자 함유)을 YEB로 한다. 동시에이 분석에서 모든 Agrobacterium 균주에 대한 문화를 시작합니다. 세포를 28°C에서 1-2일 동안 흔들어 서 200rpm에서 약 1.0의 OD600으로 배양한다.</li>
		<li>각 농균균균의 약 300 μl을 1-2일 동안 적절한 항생제로 보충하고 세포를 28°C로 배양하여 LB 고체 천기 중플레이트에 퍼뜨려 줍니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>감염: 주걱을 사용하여 접시에 있는 아그로박테리움 문화를 수집하십시오. 주걱에 Agrobacterium 문화에 나무 이쑤시개를 찍어 많은 양의 박테리아를 접종하기 위해 잎을 관통하십시오. 각 균주에 대해 적어도 3개의 식물을 접종합니다. 식물 당 3 개의 잎을 사용하여 삼중 으로 사용하십시오. 각 잎에서 각 변형에 대해 여러 예방 접종 부위를 만듭니다.</li>
	<li>점수: 접종 후 약 2주 동안 매크로 응답점수(그림 3). 처리량이 높은 화면의 경우 각 접종 지점에 대한 정성적 응답(예/아니요)을 기록합니다. 그런 다음 응답 사이트의 백분율을 계산하고 컨트롤과 비교합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+exploiting+late+blight+resistance+in+the+age+of+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).</li>
<li>Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+discovery+and+functional+analysis+of+effector+proteins+of+fungal+and+oomycete+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).</li>
<li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+genomics+accelerates+discovery+and+functional+profiling+of+potato+disease+resistance+and+Phytophthora+infestans+avirulence+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes.</a> Plos One. 3, 1-10 (2008).</li>
<li>Oh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+expression+screens+of+Phytophthora+infestans+RXLR+effectors+reveal+diverse+phenotypes%2C+including+activation+of+the+Solanum+bulbocastanum+disease+resistance+protein+Rpi-blb2%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2.</a> Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).</li>
<li>Tyler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytophthora+genome+sequences+uncover+evolutionary+origins+and+mechanisms+of+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis.</a> Science. 313, 1261-1266 (2006).</li>
<li>Haas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+and+analysis+of+the+Irish+potato+famine+pathogen+Phytophthora+infestans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans.</a> Nature. 461, 393-398 (2009).</li>
<li>Levesque, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+necrotrophic+plant+pathogen+Pythium+ultimum+reveals+original+pathogenicity+mechanisms+and+effector+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire.</a> Genome Biol. 11, 1-22 (2010).</li>
<li>Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oomycete+genomics%3A+new+insights+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Oomycete genomics: new insights and future directions.</a> FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).</li>
<li>Stassen, J. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+identification+in+the+lettuce+downy+mildew+Bremia+lactucae+by+massively+parallel+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing.</a> Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).</li>
<li>Kemen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gain+and+loss+during+evolution+of+obligate+parasitism+in+the+white+rust+pathogen+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).</li>
<li>Win, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWin%2C+J+%22Effector+biology+of+plant-associated+organisms%3A+concepts+and+perspectives%22">Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives</a>. , Cold Spring Harbor. 1-13 (2012).</li>
<li>Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+effector+biology+of+plant-associated+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).</li>
<li>Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalogue+of+the+effector+secretome+of+plant+pathogenic+oomycetes%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).</li>
<li>van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agroinfiltration+is+a+versatile+tool+that+facilitates+comparative+analyses+of+Avr9%2FCf-9-induced+and+Avr4%2FCf-4-induced+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 439-446 (2000).</li>
<li>Dangl, J. L., Jones, J. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+pathogens+and+integrated+defence+responses+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Plant pathogens and integrated defence responses to infection.</a> Nature. 411, 826-833 (2001).</li>
<li>Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+system+for+intact+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves.</a> Plant Sci. 122, 101-108 (1997).</li>
<li>Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+expression+of+oomycete+and+fungal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In planta expression of oomycete and fungal genes.</a> Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).</li>
<li>Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+expression+systems.+Oomycete+Genetics+and+Genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Diversity%2C+Interactions%2C+and+Research+Tools%22%5BJournal%5D)">In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics.</a> Diversity, Interactions, and Research Tools. Lamour, K., Kamoun, S. 23, 455-475 (2009).</li>
<li>Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenolic+recognition+profiles+of+the+Agrobacterium+tumefaciens+VirA+protein+are+broadened+by+a+high+level+of+the+sugar+binding+protein+ChvE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The phenolic recognition profiles of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein are broadened by a high level of the sugar binding protein ChvE.</a> J. Bacteriol. 180, 5632-5638 (1998).</li>
<li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+virus-induced+gene+silencing+implicates+heat+shock+protein+90+in+plant+disease+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance.</a> EMBO J. 22, 5690-5699 (2003).</li>
<li>Ma, L., Lukasik, E., Gawehns, F., Takken, F. L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+agroinfiltration+for+transient+expression+of+plant+resistance+and+fungal+effector+proteins+in+Nicotiana+benthamiana+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves.</a> Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).</li>
<li>Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., Ané, J. M., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+and+silencing%3A+A+rapid+tool+for+functional+gene+assay+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato.</a> Plos One. 4, 1-8 (2009).</li>
<li>van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ternary+transformation+system%3A+constitutive+virG+on+a+compatible+plasmid+dramatically+increases+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+enabled+the+isolation+of+the+R3a+late+blight+resistance+gene+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato.</a> Plant J. 42, 251-261 (2005).</li>
<li>Armstrong, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancestral+oomycete+locus+contains+late+blight+avirulence+gene+Avr3a%2C+encoding+a+protein+that+is+recognized+in+the+host+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+spectrum+late+blight+resistance+in+potato+differential+set+plants+MaR8+and+MaR9+is+conferred+by+multiple+stacked+R+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Theor.+Appl.+Genet%22%5BJournal%5D)">Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes.</a> Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).</li>
<li>Torto, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EST+mining+and+functional+expression+assays+identify+extracellular+effector+proteins+from+the+plant+pathogen+Phytophthora%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora.</a> Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).</li>
<li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agroinfection-based+high-throughput+screening+reveals+specific+recognition+of+INF+elicitins+in+Solanum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum.</a> Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).</li>
<li>Koncz, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoter+of+TL-DNA+gene+5+controls+the+tissue-specific+expression+of+chimeric+genes+carried+by+a+novel+type+of+agrobacterium+binary%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary.</a> Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).</li>
<li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+transformation-competent+Arabidopsis+genomic+library+in+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Technol%22%5BJournal%5D)">A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium.</a> Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).</li>
<li>Rietman, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Putting+the+Phytophthora+infestans+genome+sequence+at+work%3B+multiple+novel+avirulence+and+potato+resistance+gene+candidates+revealed+%5B+%5D%22">Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]</a>. , Wageningen University. (2011).</li>
<li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce%2C+tomato+and+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li>
<li>van engelen, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pBINPLUS+-+an+improved+plant+transformation+vector+based+on+pBIN19%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19.</a> Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).</li>
<li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATEWAYTM+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).</li>
<li>Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mini+binary+vector+series+for+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A mini binary vector series for plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).</li>
<li>Curtis, M. D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gateway+cloning+vector+set+for+high-throughput+functional+analysis+of+genes+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.</a> Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

농약과 농병과 같은 일시적인 연구는 현대 분자 식물 병리학 연구에 필수적인 효율적인 방법입니다. 몇 가지 제한에도 불구하고 이러한 방법은 플랜트에서 효율적이고 견고한 고처리량 기능 분석에 대한 수요를 충족시다.
농구침 시스템은 식물 종의 범위에서 널리 사용되는 기능 분석이다. 농약은 상호 작용하는 단백질의 동시 발현을 가진 몇몇 전간 유전자의 전달을 동일 세포로 전달하는 것을 용이하게 합니다. 이것은 일치하는 R 유전자를 표현하는 긴장으로 Avr 유전자를 표현하는 Agrobacterium 균주를 동전으로 하여 R-AVR 관계를 재구성하는 데 유리합니다. 또한 알려진 R-AVR 쌍의 경우 이러한 코인 여과를 긍정적 인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 일부 식물 유전자형에서는 변환 효율이 응답을 감지하기 위해 임계값 이하로 있을 수 있기 때문에 이러한 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 부정적인 대조를 포함하되, 예를 들어 유전자 삽입 없이 벡터를 함유하는 Agrobacterium 균주는 특정 식물 유전자형이 Agrobacterium에대한 비특이적 방어 반응을 제기하는지 여부를 결정하는 데 필수적이다. 이 기능은 감자 세균의 특정 주파수에서 발생하며 모든 솔라넘 종이 이 Agrobacterium기반 발현 시스템에 적합하지는 않습니다. 일반적으로, 농약 침투 분석은 N. 벤타미안과 대부분의 감자 유전자형에서 아주 잘 작동합니다. 이펙타로믹스 외에도, 공초점 현미경에 의한 식물 세포에서 트랜스게놈및 단백질 국소화에서 단백질의 생산과 같은 농구침 기술에 대한 다양한 잠재적 응용 이있다.
PVX 농병은 고감도 스크리닝 시스템이며 일반적으로 고처리량 스크리닝에 더 적합합니다. Agrobacterium은 지금 단지 로컬 존재 이기 때문에, 이 박테리아에 비특이적인 반응은 지금 아주 방해하지 않습니다, PVX 바이러스는 질균의 추가 퍼짐을 인수하기 때문에. 그러나, 식물은 PVX에 내성이 있거나, 극단적인 저항(ER) 반응을 탑재할 수 있으며, 이 경우 농아소독 방법이 적합하지 않다. PVX 농사감염 방법의 또 다른 제한은 관심 있는 유전자의 삽입 크기이다. 관찰된 표현형의 반응은 상처를 둘러싼 강렬한 흑괴사에서 접종 지점 근처의 희미한 괴사에 이르기까지 다양할 수 있다. N. 벤타미나와 솔라눔 종 모두에서 PVX 농소독은 농구침보다 더 민감하다는 것을 인식합니다.
다양한 테스트 된 식물 유전자형의 유전 적 배경이 몇 가지 제한이있을 수 있다는 점을 고려하여 (위 참조), 우리는 일반적으로 PVX 농가 감염 및 농생물 침투에 의해 유사한 결론을 얻을. 이러한 결과는 또한 단백질침투(29) 및 ELISA3과같은 다른 애사에서 얻은 것과 비교할 수 있다. 두 시스템의 장점과 한계를 고려하여 두 방법을 모두 사용하여 서로를 보완하거나 독립적인 결과를 확인하는 것이 좋습니다.

이펙토로믹스, 고처리량 기능유전체학 접근법은 최근 작물 식물에서내성(R)유전자를 식별하고병원균의유전자(Avr)유전자를 식별하는 강력한 도구로 부상하고 있다. R 유전자를 가진 더 많은 시간 소모적인 안정한 변환과는 대조적으로, 이펙소학 전략은 병원체 유전자 서열의 일시적인 분석에 근거를 두고 있습니다.
유전체학 시대 부터 식물 병원균의 게놈이 널리 탐구되었습니다. 예를 들어 가장 파괴적인 식물 병원균을 포함하는 oomycetes를 위해, 식물5-10과의상호 작용 도중 역할을 하는 유전자를 위해 서열의 큰 집합이 생성되고 분석되었습니다. 병원체 단백질의 한 클래스는 감염 (독성 요인)을 용이하게하거나 방어 반응 (비보렌스 인자)11-13을트리거하기 위해 숙주 세포 구조와 기능을 조작하는 이펙터를 나타낸다. R 유전자를 포함하는 식물 세포에서 Avr 유전자의 발현은 일반적으로 과민성 세포 사멸 반응 (HR)14,15의결과를 낳는다. R 및 Avr 유전자의 질문 발현에서 아그로박테리움 투메파시엔과같은 일시적인 발현 시스템을 사용하여 달성될 수 있다- 기반과도 변환(agroinfiltration)16. 이러한 일시적인 변환은 또한 바이러스 발현 시스템(agroinfection)17,18과함께 적용될 수 있다.
농구침의 경우, 가장 일반적으로 사용되는 제제는 디코 식물의 광범위한 숙주 범위 병원균인 A. tumefaciens입니다. A . tumefaciens는 종양 유도 (Ti) 플라스미드를 포함합니다. 티 플라스미드로부터 의 전DNA(T-DNA)는 박테리아의 독성 기계가 활성화된 후 식물 세포로 전이된다. 이는 상처입은 식물 세포에서 발동될 수 있으며, 약간 산성 환경에서 방출된 저분자-중량 페놀 화합물 및 단색차르에 의해19일. 독성 유전자는 주요 정맥에 의해 정의된 잎 패널로 Agrobacterium 현탁액의 침투 후에 활성화됩니다. 그런 다음 잎 패널내의 식물 세포가 T-DNA 영역에 포함된 트랜스진을 변형시키고 발현하게 됩니다.
농병은 세포를 심기 위하여 바이러스의 전좌를 중개하는 상처 접종한 Agrobacterium를기반으로 합니다. 바이러스는 그 때 Agrobacterium의부재에, 인접 한 식물 조직에 더 확산. 농가 감염의 경우 여러 식물 바이러스를 사용할 수 있습니다. RNA 바이러스는 감염된 식물에서 매우 높은 수준으로 증식할 수 있기 때문에 유전자 발현에 이상적인 벡터입니다. 식물 RNA 바이러스 중, 감자 바이러스 X (PVX)는 이펙소로믹스 스크린에 널리 사용된다. 삽입된 유전자에 대한 기능성 검사를 용이하게 하기 위해 콜리플라워 모자이크 바이러스(35S 프로모터)와 노팔린 신타제 터미네이터에 의해 측면에 있는 PVX 게놈을 포함하는 이진 벡터는 A.tumefaciens20의T-DNA로 복제되었다. T-DNA가 식물 세포로 옮겨진 후, T-DNA에 포함된 PVX 게놈은 35S 프로모터로부터 전사된다. 그런 다음 바이러스 입자가 감염된 식물에서 체계적으로 퍼지고 삽입된 유전자의 발현을 초래합니다. 이 방법은 아그로박테리움과 PVX를 기반으로 PVX 농사독이라고 합니다.
여기서 우리는 농아침투와 PVX 농소소 소독 소사 모두에 대한 예를 보여줍니다. 호스트 식물로서 우리는 감자 세균(솔라눔 섹션 Petota)을사용하며, 이펙토로믹스 접근법이 개척되어3,4의성공을 입증했습니다. 우리는 또한14,21,22의 솔라나체 식물의 모델 공장으로 유명한 니코티아나 벤타미안을사용합니다.

<table><tbody><tr><td>쇠고기 추출물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4888</td><td></td></tr><tr><td>세균 펩톤</td><td>Oxoid</td><td>LP0037</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208094</td><td></td></tr><tr><td>MS 염(비타민 제외)</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수 분말</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>아세토시링곤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>주사기 (1ml)</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Infors HT</td><td>Multitron II</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Heraeus</td><td>Multifuge 3S-R</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Eppendorf</td><td>바이오 광도계 6131</td><td></td></tr></tbody></table>

감자와 니코티아나 벤타미안의 농아침투 및 pvx 농병감염

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

농약침및 PVX 농병소는 식물에 있는 후보 유전자의 기능적 분석을 위한 2개의 능률적인 일시적인 발현 분석이다. 농구침을 위해 가장 일반적으로 사용되는 에이전트는 많은 디코트 식물 종의 병원체인 아그로박테리움 tumefaciens입니다. 이것은 농약 침전이 많은 식물 종에 적용될 수 있다는 것을 의미합니다. 여기서, 우리는 감자(솔라눔 tuberosum),관련 야생 결핵 베어링 솔라눔 종(솔라눔 섹션 Petota)과모델 식물 니코티아나 벤타미안에이러한 방법을 적용 할 때 우리의 프로토콜과 예상 결과를 제시한다. 저항성(R)또는 avirulence(Avr) 유전자와 같은단일 유전자의 기능적 분석 외에도, 농약침 분석은 단순히 R 및 Avr 전진을 동일한 세포로 전달함으로써 특정 숙주 병원체 상호 작용과 관련된 R-AVR 상호 작용을 재구성하는 데 매우 적합합니다. 그러나, 몇몇 식물 유전형은 우리가 몇몇 감자 유전자형에 대해 예를 들었던 바와 같이, Agrobacterium에비특이적인 방어 반응을 올릴 수 있습니다. 농약침과 비교하여 PVX 농약으로 AVR 활동을 감지하는 것은 기능성 스크린에서 더 민감하고, 더 높은 처리량이며, Agrobacterium에대한 비특이적 방어 응답에 덜 민감하다. 그러나 PVX에 대한 비특이적 방어가 발생할 수 있으며 바이러스유발 극단적인 저항으로 인해 응답을 놓칠 위험이 있습니다. 이러한 한계에도 불구하고, 우리의 경험에서, 농침과 PVX 농병은 서로의 결과를 확인하기 위해 동시에 사용할 수있는 적합하고 보완적인 분석입니다.

도 1은 감자 및 N. 벤타미안에서 7가지 이펙터(E1-E7)를 가진 농약침투의 대표적인 실험을 나타낸다. 세포 사멸은 침투 후 약 3 일 후에 침투된 잎 패널에 나타납니다. 세포 사멸 표현형의 범위는 대조군과 비교될 필요가 있다. PBINplus-R3a 및 pK7WG2-AVR3a를 함유한 아그로박테리움 균주 AGL1(pVirG)23의 혼합물은 양성 대조군으로사용되었고, AGL1(pVirG)은 음의 대조군으로 사용되었다. 도 1A 및 1B는 감자 유전자형 MaR8(Mastenbroek R8)26 및 N. 벤타미안나에서농약침의 좋은 예를 보여주며, 이는 농가 침투에 매우 적합합니다. 양극 대조군으로 혼입된 잎 패널에 컨실루션 세포사멸이 있으며, 음의 대조군 또는 pBINplus-R3a로 세포 사멸 반응이 발생하지 않습니다. MaR8에서, 2개의 이펙터 AVR3a(E2) 및 AVR4(E3)는 세포 사멸을 유도하고, 다른 이펙터(E1 및 E4-E7)는 그렇지 않습니다. 도 1C 및 1D는 야생 감자 솔라눔 베르타울리 483-1및 솔라눔 rechei 210-5에서 농아침투의 예를 보여 주며, 이는 농아침투 기술에 적합하지 않다. S. berthaultii 483-1에서, 잎 조직은 모든 시험된 이펙터뿐만 아니라 부정적인 통제에 비특이적 괴사를 보여줍니다. S. rechei 210-5에서, 침투된 잎 패널은 긍정적인 통제에 매우 약한 세포 죽음 반응을 보여줍니다.
도 2는 농약침에 대한 반응을 정량화하는 데 사용할 수 있는 다양한 채점 스케일을 나타낸다. 세포 사멸의 백분율은 0-100%의 척도로 묘사됩니다. 관찰된 표현형은 거시적으로 눈에 보이지 않는 증상(0%)부터 클로로시스를 표시하고 세포 사멸 수준을 증가시키는 중간 반응의 범위를 통해 컨서블세포 사멸(100%)까지 다양합니다.
도 3은 감자에서 PVX 농소염 후 대표적인 실험을 나타낸다. 일반적으로, 확장 세포 죽음은 치아 선택 접종 후에 대략 2 주 사이트에서 찾아낼 수 있습니다. 두 그림 패널에 도시된 바와 같이, 세포 사멸확대는 PGR106-CRN2(이펙터 크링클러 Crn2를 이용한 양성 대조군)로 접종된 치아 선택 부위에 존재하며, 이는 P. infestans27로부터유전자를 유도하는 일반적인 세포 사이다. 상처에 대한 사소한 반응 외에도 pGR106-empty (부정적인 대조군)로 접종 된 치아 선택 부위에서 확장 세포 사망이 지적되지 않습니다. 도 3A에서감자 유전자형 MaR3(Mastenbroek R3)를 나타내는 2개의 pGR106-이펙터(E1 및 E2)는 세포 사멸을 유도하지 않았다. 도 3B에서,야생 솔라눔 huancabambense 354-1에서 이펙터 스크리닝의 긍정적인 결과가 제시된다; 세포사멸 반응은 2개의 pGR106-이펙터(E1-E3, 유도를나타내는)(28)로관찰되었다.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1.jpg"> 그림 1. 감자와 N. 벤타미안의 농약 침투의 예. 식물 포함(A)감자 유전자형 MaR8 (마스텐 브룩 R8),(B) N. 벤타미안,(C) 솔라눔 베르타울리 483-1 및(D) 솔라눔 rechei 210-5에 침투했다 PBINplus-R3a 및 pK7WG2-AVR3a(양성 제어), AGL1(pvirG) (음의 제어), pBINplus-R3a를 함유한 아그로박테리움 균주 AGL1(pVirG) 23의 혼합물, 및 7개의 이펙터(E1-E7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2.jpg"> 그림 2. 농약 침전 반응의 정량화. 사진은 세포 사멸을 위한 대표적인 채점 척도를 보여줍니다, 0%에서 100% (confluent 세포 죽음). 중간 반응은 클로로시스와 같은 약한 반응에서 세포 사멸의 증가 수준에 이르기까지 다양합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3.jpg"> 그림 3. 감자에서 PVX 농가소의 예. 감자 유전자형 MaR3 (마스텐브룩 R3)(A)및 솔라눔 huancabambense 354-1(B)치아 선택 pGR106-CRN2 (양성 제어), pGR106-빈 (네거티브 컨트롤) 및 pGR106-E1-2 (효과) 또는 pGR106-E1-2 (효과) 또는 pGR106-E1-2 (효과) 또는 pGR106-E1-2(효과제), 또는 pGR106-E1-2(효과) 또는 pGR106-EGR1-EGR106-EGR1-EGR106-EGR1-EGR106 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1. YEB 매체
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>1 L</td>
			<td>증류H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>자당</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>쇠고기 추출물</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>세균성 펩톤</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 g</td>
			<td>효모 추출물</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ml</td>
			<td>MgSO4 (1 M)</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2. 농약 과 PVX 농업 소독에 사용되는 벡터 및 균주. 여러 이진 벡터를 사용할 수 있습니다. 아래 목록에 있는 벡터는 후보 유전자의 높은 발현을 허용하고 우리의 손에 잘 일했습니다. 우리는 N. 벤타미안에서 Agrobacterium 균주 GV3101 (pMP90)29를 사용하는 것을 선호하고 조퍼 플라스미드 pVirG (pBBR1MCS-5.virGN54D)23 감자31에더 적합한 헬머 플라스미드 pVirG를 포함하는 AGL130을 찾을 수 있습니다. 추가 균주는 N. 벤타미안을 포함하여 각종 모형 식물에 그밖 단에서 분석되었습니다 그러나 감자(32)에서는아닙니다.
<img alt="Table 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table2.jpg">
GW: 게이트웨이 버전36
표 3. MMA 매체. <img alt="Table 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table3.jpg">
pH를 5.6으로 조정합니다.

농약침과 PVX 농병은 식물에 있는 유전자의 일시적인 자궁 발현을 위한 일상적인 기능적인 분석입니다. 이 방법은 효과적인 전략 (급속한 저항 및 비열유전자 발견)에 있는 능률적인 연구및 분자 식물 병리학에 있는 현대 연구에 결정적입니다. 그들은 공장에서 강력한 고처리량 기능 분석에 대한 수요를 충족합니다.

감자와 니코티아나 벤타미안의 농아침투 및 PVX 농병감염

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

다음 실험의 전반적인 목적은 병원균의 이펙터가 식물의 저항성 단백질에 의해 인식되는지 테스트하는 것입니다. 이는 먼저 아그로박테리움 액체 배양액으로 식물 잎을 감염시키거나 PVX 아그로 감염을 통해 식물 조직 내에서 이펙터를 일시적으로 발현시킴으로써 수행됩니다. 이후 식물을 배양한 다음, 세포 사멸 여부를 판독합니다.식물 저항성 단백질이 일시적으로 발현된 결함 인자를 인식했을 때 나타나는 세포 사멸 반응을 보여주는 결과가 도출되었습니다. 분자 마커를 이용한 유전학적 연구와 같은 기존 방법과 비교하여 이러한 기술의 주요 장점은 이것이 기능적 분석법이라는 점입니다. 이는 식물 내에 저항성 유전자가 존재한다는 것뿐만 아니라, 해당 유전자가 실제로 작동하며 방어 반응이 활발하게 유도된다는 것을 보여줍니다.이러한 방법들은 두 가지 게놈 서열의 가용성을 통해 blight 저항성 및 RA 및 felons AFI 유전자를 신속하게 발견하는 것과 같은 분자 식물 병리학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 절차 시연은 감자 식물을 생성하기 위해 연구실의 박사 과정 학생인 du에 의해 수행됩니다. 18 °C의 기후 챔버에서 16시간 낮, 8시간 밤 주기로 2주 동안 shige, scoog 또는 MS 배지가 들어 있는 멸균 플라스틱 병에 in vitro 식물체를 유지합니다. 식물이 성장하여 흰 뿌리가 나오면 멸균된 토양이 담긴 화분으로 옮겨 심습니다.본 실험에 사용되는 식물은 규제된 온실 구획 내에서 4~5주 된 종자 재배 NCOA hamana와 in vitro에서 생성된 4~5주 된 감자 이식묘를 사용합니다. 아그로박테리움 배양액을 준비하기 위해, 먼저 50 milliliter 튜브에 1 mL의 acetophenone, 100 µL의 MES 및 적절한 항생제가 첨가된 10 mL의 YEB 배지를 채웁니다. 그다음, 목적 유전자를 포함하는 원하는 아그로박테리움 균주의 glycerol stock 20 µL를 YEB 배지에 피펫팅합니다.배양물을 28 °C, 200 RPM에서 1~2일 동안 OD 600이 약 1.0이 될 때까지 배양합니다. 3000 g에서 10분간 원심분리하여 세포를 수확합니다. 그다음 상층액을 따라내고 펠렛을 재현탁합니다.신선하게 제조된 MMA 배지에서 OD 600이 0.3이 될 때까지 배양합니다. 두 가지 박테리아 균주의 공동 침투(co-infiltration)를 위해 세포를 부드럽게 볼텍싱하여 재부유시킵니다. 배양액을 1:1 비율로 혼합합니다.식물에 침투시키기 전, 배양물을 실온에서 1~6시간 동안 그대로 둡니다. 그동안 보호 안경을 착용한 상태에서 침투시킬 식물에 균주와 실험 날짜를 표시합니다. 바늘이 없는 1mL 주사기를 사용하여 아그로박테리움 현탁액을 잎 패널에 조심스럽게 천천히 주입합니다.교차 오염을 방지하기 위해 식물당 최소 3개의 잎을 포함하여 최소 3그루의 식물에 주입하여 3반복 실험을 수행합니다. 침투 처리 시마다 장갑을 교체하거나 멸균하고, 다음 날까지 식물에 물을 주지 마십시오. 침투 처리 후 약 3일 뒤에 접종하며, 증상이 없는 상태를 0%로 하여 0~100% 척도로 세포 사멸 정도를 측정합니다.100%는 전면적인 세포 사멸을 나타내며, 그 중간 값들은 경화 현상부터 점진적으로 증가하는 세포 사멸 수준까지를 나타냅니다. 2~3주 된 Hamana 종자 발아 식물과 항생제가 첨가된 3 mL의 YEB 배지에서 in vitro로 배양한 2~3주 된 감자 이식묘에 PVX 아그로 감염(agro infection)을 수행합니다. 28 °C, 200 RPM에서 배양하여 OD 600이 약 1.0이 된 아그로박테리움(agrobacterium) 글리세롤 스톡 20 µL를 첨가합니다.각 아그로박테리움(agrobacterium) 균주 약 300 µL를 항생제가 포함된 LB 한천 배지에 도말하고 28 °C에서 1~2일 동안 배양합니다. 스파튤라를 사용하여 아그로박테리움을 수집한 후, 다량의 박테리아를 잎에 접종합니다.이쑤시개를 배양액에 담근 후 이를 사용하여 식물을 찌릅니다. 균주당 3개 식물, 식물당 여러 잎의 여러 위치에 잎 접종을 실시합니다. 접종 2주 후, 각 반점의 유무를 질적으로 기록하여 육안으로 점수를 매깁니다.그런 다음 반응하는 부위의 백분율을 계산하여 제시된 대조군과 비교합니다. 여기 접종 약 3일 후, end hamana 및 두 가지 감자 종인 Solenium JI 3 49-3과 CV Desiree에서의 아그로 침투(agro infiltration) 대표 결과가 있습니다. Agrobacterium 균주 AGL1 PVRG가 포함된 P bin+R3A와 PK7WG2AVR3A의 혼합물을 공동 침투시킨 잎 패널에서는 세포 사멸의 융합(confluence cell death)이 나타나는 반면, 음성 대조군인 PI+R3A 또는 PK7WG2AVR3A에서는 사멸 반응이 일어나지 않습니다. 이 그림에서는 접종 약 2주 후, n 및 두 가지 감자 종 S1Kae 3 54-1과 S micro DOUM 360-1의 PVX 아그로 감염 결과가 나타나 있습니다.양성 대조군인 PGR 1 0 6 CRN two(Phytophthora infestans의 일반적 세포 사멸 유도 유전자를 인코딩함)와 PGR 1 0 6 in one(P. infestans의 엘리시터 유전자를 인코딩함)을 접종한 부위에서는 세포 사멸이 확산되는 것이 관찰됩니다. 반면, 음성 대조군인 PGR 1 0 6 empty Well을 접종한 부위에서는 세포 사멸의 확산이 관찰되지 않습니다.이 절차를 시도할 때는 양질의 식물 재료를 배양하는 것이 중요하다는 점을 기억해야 합니다. 이 기술은 분자 식물 병리학 및 식물 육종 연구자들이 감자 및 기타 식물 종에서 오믹스 효과를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 식물에서 can 유전자의 효율적이고 견고한 고처리량 기능 분석을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

agroinfiltration-pvx-agroinfection-potato-nicotiana

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

노크를 다운 유전자 표현의에 대한 바이러스 유도된 유전자 입을 (VIGS) 메서드에 대한...

바이러스 유도 진 입을 (VIGS)에 Nicotiana benthamiana 토마토

출처: Shi, J. 외. 식물 병원체의 분비 효과자로부터 RNA 침묵 억제제의 스크리닝 및 확인. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 Nicotiana benthamiana 16c에서 RNA 침묵을 억제하는 병원체 효과 단백질을 규명하기 위한 공동 침투 분석 방식을 보여줍니다. 형광 리포터와 후보 효과기 유전자가 아그로박테리움 을 통해 식물 잎에 전달됩니다. 일반적으로 RNA 침묵은 보고자 전사체를 분해하여 형광을 감소시킵니다. 억제 효과기가 이 반응을 차단하여 형광을 보존합니다. 이 분석법은 숙주 방어를 방해하는 미생물 효과자를 빠르고 시각적으로 스크리닝하는 방법을 제공합니다.

식물 RNA 침묵을 억제하는 병원체 효과자를 선별하기 위한 공동 침윤 분석법

출처: Zhao, J., et al. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato. J. Vis. Exp. (2020).이 영상에서는 바이러스 기반 microRNA 사이런싱(VbMS)을 위해 Potato Virus X(PVX) 기반의 컨스트럭트를 인비트로(in vitro) 배양된 감자 식물에 전달하는 Agrobacterium tumefaciens의 사용법을 보여줍니다. 이 방법은 표적 microRNA의 전신적 억제를 가능하게 하여, 연구자가 관찰 가능한 표현형 변화를 통해 식물 발달 과정에서 해당 microRNA의 역할을 연구할 수 있게 합니다.

감자 식물에서 Potato Virus X 기반의 마이크로RNA 사일런싱

식물은 현재의 표현 패러다임을보다 더 확장 가능한 비용 효율적이고 안전 상업적 규모에 제약 단백질의 생산을위한 새로운 시스템을 제공합니다. 본 연구에서는, 우리는 포함하는 대상 유전자를 소개하는 간단하고 편리하면서도 확장 가능한 접근...

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

아그로 박테리아는 (담배 모자이크 바이러스 계는) 백신 항원과 치료 단백질을 생산하기 위해 신속하고 경제적 인 방식 발사 벡터를 들고있는 진공 침투에 근거 된 담배 식물에서 과도 단백질 생산. 우리는 절차를 간소화하고, 세균의 배양 조건을 최적화 호스트 종을 선택하고 RNA 침묵 억제를 공동 도입하여 대상 축적을 개선.

최적화 및 활용<em&gt; 아그로 박테 리움</em에서&gt; 매개 과도 단백질 생산<em&gt;는 담배</em

이 연구에서는 서로 다른 생산 플랫폼에서 표적 인간 재조합 단백질의 발현을 비교했습니다. 우리는 전통적인 발효기 기반 배양과 식물에 초점을 맞추고, 각 시스템의 설정을 설명하고, 보고된 결과를 기반으로 각 플랫폼의 고유한 한계와 장점을 강조했습니다.

박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석

감자에서 내인성 마이크로RNA(miRNA)를 기능적으로 특성화하기 위해 감자 바이러스 X(PVX)기반 의 미생물RNA 침묵(VbMS) 시스템에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 미RNA의 표적 모방(TM) 분자는 PVX 벡터에 통합되고 표적 miRNA 또는 miRNA 제품군을 침묵시키기 위해 감자에서 일시적으로 발현된다.

감자에서 감자 바이러스 X 기반 마이크로RNA 침묵 (VbMS)

농균 계 주사 (농업 주입) 프로토콜은 옥수수 묘목으로 여우 꼬리 모자이크 바이러스와 사탕수수 모자이크 바이러스 클론의 접종을 위해 제시된다. 이러한 방식으로 접종은 바이러스 감염, 마커 유전자의 바이러스 유발 유전자 침묵, GFP의 바이러스 과발현으로 이어집니다.

재조합 폭스테일 모자이크 바이러스와 사탕수수 모자이크 바이러스 감염 클론주사에 의해 옥수수 묘목의 직접 농경화

이 프로토콜은 식물 뿌리에 토양 매개 미생물을 접종하는 전략에 대한 자세한 요약을 제공합니다. 진균 Verticillium longisporum 및 Verticillium dahliae에 대해 예시된 세 가지 상이한 뿌리 감염 시스템이 기술된다. 잠재적 응용 분야와 가능한 다운스트림 분석이 강조되고 각 시스템에 대한 장단점이 논의됩니다.

식물 뿌리를 토양 매개 미생물로 감염시키는 접종 전략

여기에서는 대형 식물의 유전적 형질전환에 대한 생체 내 연구를 위한 국소 진공 침투를 위한 첫 번째 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론을 사용하여 우리는 처음으로 카카오의 식물의 일시적인 변형에서 Agrobacterium을 매개 하는 것을 달성했습니다.

난치성 식물의 식물 변형 을 위한 진공 강제 농업 여과: 사례 연구로서의 카카오

이 프로토콜은 생체 내 온실 조건에서 Solanum tuberosum 뿌리를 식물 기생 선충과 감염시키고 광학 현미경을 통한 뿌리 구조의 조직화학적 분석을 위해 감자 체외 형질전환 뿌리를 감염시키는 것을 설명합니다.

유도된 구조적 변화의 평가를 위한 식물 기생 선충을 사용한 감자 뿌리의 생체 내 및 체외 감염

학습하세요 농아침투 및 PVX 농병감염을 이용한 식물 병원체 효과자 인식 분석 방법. 이 기술은 저항성 유전자 기능 검증과 분자 식물병리학 연구에 필수적인 고처리량 기능 분석 도구입니다.

감자와 니코티아나 벤타미안의 농아침투 및 PVX 농병감염

더 많은 동영상 탐색