Name: 동물 행동하자, 깨어있는 단일 단위 레코딩을위한 Microwires의 조직 된 배열을 주입하기위한 절차 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-14T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 배우세요 뇌 목표 영역에 microwire 어레이를 정확히 이식하는 절차를 통해 신경생물학 연구에서 고해상도 단일 단위 기록을 수행하는 방법을. 이 기술은 장기간 신경 활동 데이터 수집에 필수적입니다.

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본 연구는 약물 남용에있는 국립 연구소에 의해 지원되었다 DA 006886 (MOW) 및 DA 032270 (DJB)가 부여합니다.

을 준비하고 다음 절차를 수행하는 동안 (9 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 안내서에 설명 된대로) 정성은 무균 상태를 유지하기 위해주의해야합니다. 다음 프로토콜은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드를 준수하고 기관 동물 케어 및 사용위원회, Rutgers 대학에 의해 승인되었습니다. 그것은 이후의 절차를 완료하는 데 3-6 시간이 필요합니다 것으로 추정된다. 마이크로 와이어 어레이를 주입 : <ol><li> 장소 마취하에 동물을 50 ㎎ / ㎏ 펜 토바 비탈 나트륨 (IP)을 사용하고 아트로핀 메틸 니트 레이트 10 ㎎ / ㎏을 관리 (IP; 글리코로 대체 될 수 있음) 및 0.25 mg의 페니실린 (30 U / ㎖ 임) 호흡 기능을 유지하고 감염을 방지하기 위해 였다. 참고 :이 비용 효과적이고 인체 노출을 제한하기 때문에이 이식 수술의 3-6 시간의 길이, 펜 토바 비탈 나트륨이 사용됩니다마취 (가스 마취제의 장기간 사용으로 발생할 수로) 여전히 오래 지속 마취를 제공하면서. 다른 마취제의 대체가 허용됩니다. </li><li> 마취하기 전에 꼬리 핀치 테스트를 사용하여 효과를 적용되었는지 확인합니다. </li><li> 필요에 따라, 수술 내내 마취를 유지하기 위해 케타민 히드로 클로라이드 (60 ㎎ / kg IP) 및 소듐 펜 토바 비탈 (5 ~ 10 ㎎ / kg IP)의 주사를 교대로 준다. </li><li> # 22 메스 블레이드를 사용하여 두피를 면도. </li><li> 포비돈 요오드 면도 두피를 소독. </li><li> 부피 바카 인의 피하 주사를 줘 (~ 4 주사 부위에 1 ㎎ / ㎏ SC 확산)에 로컬로 두피를 마취. 을 적용하는 국소 마취제에 대한 5 ~ 10 분을 허용합니다. </li><li> 마취 중에 수분을 유지하기 위해 눈에 안과 용 윤활제를 놓습니다. </li><li> 귀 바, 정위 장치의 코를 집게로 동물을 고정합니다. </li><li> 아이돌 마스터에 시각적 인 랜드 마크를 사용하여 (예를 들어, 수평 막대약 동물의 머리를 수준 eotaxic 프레임). 이 단계는 약 수준의 두개골을 의미한다. </li><li> 메스 홀더에 장착 된 # 11 메스 블레이드를 사용하여 두피의 중간 선을 따라 절개를합니다. 절개는 코 뼈의 뒤 부분에 그냥 귀 뒤에서 확장해야합니다. </li><li> 측면 두개골 능선과 후방 두개골 능선 모두에 도달 할 때까지 해부 주걱을 사용하여 남아있는 모든 조직의 두개골을 취소합니다. </li><li> 지혈의 수 (6 배)를 사용하여 절개 주위의 피부를 뒤로 당겨. </li><li> 모든 혈액의 두개골을 청소하고 건조 할 수 있습니다. 남은 출혈이 발생하면, 작은 소작 도구 잔류 출혈을 종료. 두개골이 깨끗하고 건조한 상태를 유지하는 것이 보장하는 것은 다음 단계에서 사용되는 치과 아크릴 영구적으로 두개골에 바인딩 할 수 있습니다. </li><li> 마크 브레 그마와 두개골 봉합의 교차점을 보간하여 람다 (그림 2D). 해부 마이크roscope 정확하게 이러한 위치를 표시 할 필요가있다. </li><li> 정위 팔에 작은 지적 항목 (예를 들어, 핀 또는 치과 드릴 비트)를 부착하고 지느러미 / 복부 (DV)를 결정하기 위해 내려 브레 그마 및 람다의 좌표입니다. </li><li> DV가 서로의 100 μM (0.1 mm) 이내 브레 그마 및 람다 좌표까지 코 클램프를 조정합니다. </li><li> 일단 수평, 전방 / 후방 (AP)을 기록 횡 / 내측 (ML) 및 DV는 노즈 클램프의 위치에 따라 브레 그마의 좌표. 수술의 나머지는이 좌표의 정밀도에 따라 달라집니다로, 정확성에 대한 좌표를 재확인. </li><li> ML과 AP는 브레 그마에 &quot;두개골 창&quot;상대 (; 그림 1 즉, 개두술)의 네 모서리 좌표를 계산하기 위해 측정 된 좌표를 사용합니다. 두개골 창은 마이크로 와이어의 배열이 전달되는을 통해 정확하게 위치 사각형입니다. </li><li> 표시하기 위해 계산 된 좌표를 사용하여두개골 창이 날카로운 정위 부속 및 만년필 용 잉크를 이용하여 두개골에 위치. 정확한 표시를 얻기 위해서는면 어플리케이터를 사용하여 마킹 공구의 선단에 잉크의 단지 소량을 적용한다. </li><li> 작은 일련의 층에서 뼈를 제거하여 두개골 창 밖으로 드릴. <ol><li> 마크가 배치 된 윈도우의 표시 모서리를 시추하여 시작합니다. </li><li> 다음에, 모서리를 연결하고, 창을 설명합니다. </li><li> 마지막으로, 명확한 뇌경막의 깊이 아래로 윤곽 내의 영역 중. 구멍이 창 위쪽에서 아래쪽으로 적절한 폭을 유지하도록 두개골의 표면 층 아래 (즉 경) 넓은해야합니다. </li></ol></li><li> 조심스럽게 두개골 창 내부에 남아있는 뼈 칩, 파편, 또는 경막을 제거하는 microforceps를 사용합니다. 재료의 이러한 비트가 저하하는 동안 배열의 무결성을 손상 수있는이 단계는 매우 중요합니다. 한 번 클리어 한 일을 계속해야합니다수술의 나머지 세균 식염수 촉촉한 전자 창. </li><li> 5 두개골 나사와 1 접지선의 두개골 (그림 1)에 표시를 놓습니다. 이 위치는 대상 뇌 영역에 따라 달라집니다. 하나의 나사가 5 두개골 뼈의 각에 배치되는 경우 headstage은 가장 안전합니다. 마이크로 와이어 어레이의 배치를 방해하지 않을 위치에 두개골 나사와 접지선을 모두 놓습니다. </li><li> 두개골의 나사 구멍을 뚫고 그 자리에 나사를 고정합니다. 나사는 3 ~ 4 스레드 (피질에 손상을 너무 깊은 있도록하거나, 이외는 나사를 사용하는 경우, 충분히 깊은 배열의 안정성을 촉진하기 위해 두개골의 두께를 통과 할 수 있지만) 표시 될 때까지 낮출 수 있어야합니다. 배치 후 나사의 스레드를 청소합니다. </li><li> 접지선의 구멍을 뚫습니다. 대상 DV 조정하고 치과 아크릴을 사용하여 장소에 와이어를 고정으로 (1 ~ 2 분 이상) 천천히 선을 낮 춥니 다. </li><li> 스레드 주위에 아크릴 추가두개골 나사. 아크릴 마르기 전에 멀리 접지선 또는 두개골 나사에서 유입 초과 시멘트를 제거합니다. / 경화 건조하는 치과 아크릴을위한 15 분을 허용합니다. </li><li> 정위 팔에 배열을 연결합니다. 배열 및이를 당당 두개골 윈도우의 경계를 통과 할 수 있도록 방향을 맞 춥니 다. </li><li> 그것은 두개골과 수준이되도록 두개골 창에 식염수를 놓습니다. 그것은 식염수에 보조개를 생성 할 때까지 배열을 낮 춥니 다. 이것은 좌표가 배열의 두개골 레벨로도 사용됩니다. 최종 DV 배열의 좌표를 계산하기 위해이 값을 사용합니다. </li><li> 그것의 최종 DV 좌표에 도달 할 때까지 천천히 배열을 낮 춥니 다. 낮추는마다 1mm를 중지하고 뇌 조직 (PEG가이면서 당분간 형태에서 와이어를 유지하는 데 사용된다 잔물결 같은 복구하고 어레이에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 저부를 용해 할 수 있도록하기 위해 몇 분 동안 기다린 등) 식염수에 녹여 천천히. </li><li> 배열은 1mm 경우최종 목표에 도달 할 때까지 멀리 대상에서, 더 천천히 내립니다. 조직을 5 분 동안 휴식을 허용하기 전에시 0.1-0.2 mm로 저하는 목표 부위뿐만 아니라 근위 시냅스 연결에서 조직을 보존하기위한 것이다. 기기를 사용할 수있는 경우, 배열의 저하 정밀도 동력 조절기를 사용하여 지원 될 수있다. </li><li> 나머지 PEG를 용해 그 자리에 microwires을 시멘트 치과 아크릴을 사용합니다. 와이어가 안전한지 확인한 다음 계속 진행하기 전에 강화하는 시멘트 15 ~ 20 분을 허용하는 시멘트의 여러 레이어를 추가합니다. 이 전선이 최종 위치에서 떠 밀어 맞지 않는다든지하는 일이 없습니다. </li><li> 치과 아크릴을 사용하여 동물의 headstage의 나머지 부분을 구축 할 수 있습니다. microwires의 두개골 나사, 접지​​ 와이어 및 커넥터를 싸는 아크릴을 사용합니다. 아크릴 모자를 진행하기 전에 충분히 강화 할 수 있습니다. </li><li> 흡수성 봉합사를 사용하여 두피 절개를 봉합하고 관리 2 ㎖ OF 수술에서 수화를 복원하는 세균 식염수 (SC). </li><li> 귀 바에서 동물을 제거하고 깨끗한 지역에 피사체를 배치합니다. 체온 조절과 운동이 회복 될 때까지 수술 후 복구하는 동안 자주 동물을 관찰한다. 마취에서 회복 후, 수술 후 회복의 나머지 부분에 대한 단일 하우징에 동물 이동합니다. </li><li> 동물에게 매일 수술 후 모니터링을 제공하고 절차에 따라 일에 관심. 7 개 더 많은 일을 허용 할 경우이 절차에서의 복구는 최적입니다. </li><li> 동물에게 Carprofen (5mg/kg)와 Enrofloxacin 담당 수의사가 권장하는 일정 기준 복구하는 동안 (5 ~ 10 ㎎ / ㎏) 또는 동등의 주사를 제공합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개 할 경쟁 금전적 이해 관계가 없습니다.

세포 외 기록은 신경 과학의 거의 모든 실험 준비에 통합 할 수있는 강력한 실험 기술을 나타냅니다. 자신의 샤프트는 (그림 5A) 뇌를 통해 자신의 목표 지역으로 통과하는 조직 배열에 이식 된 와이어를 추적 할 수 있습니다. 작은, 후 실험 병변은 스테인리스 와이어에서 작은 철의 예금을 만들 수의 noninsulated 마이크로 와이어의 끝 부분에 생성 될 때, 하나는 정확하게 솔루션을 사용 (단일 유닛이 기록 된) 비 절연 마이크로 와이어 팁의 위치를​​ 표시 할 수 있습니다 5 % 페로 시안화 칼륨 10 % 염산 (; 파란색 점도 5a 및도 5b)의. 따라서, 하나는 쉽게 뇌 내에서 전체 배열의 위치를​​ 다시 이후의 뇌 조각의 시리즈를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 상기 기술들은 좀처럼 위하여, 녹화 공간 특이성을 증가시키기 위해 면역 조직과 결합 될 수있다타겟 게재 위치를 확인하고도 단일 대상 핵 3 (그림 5B)</str...

전기 생리학 기록은 과학자가 생물 세포의 전기적 특성을 검사 할 수 있습니다. 전기 신호가 신호 전달 메커니즘 역할 중추 신경계에서, 이들 기록은 신경 기능 1-2을 이해하는데 특히 중요하다. 동물 행동의 단일 유닛 녹음하는 동안 뇌에 삽입 된 미세 전극은 시간에 활동 전위의 신경 세포의 생성에 변경 사항을 기록 할 수 있습니다. 많은 기술이 하나가 뇌의 활동을 기록 할 수 있지만, 하나의 단위 전기 생리학은 단일 신경 세포 수준에서 해상도를 허용하여 가장 정확한 방법 중 하나입니다. 공간적 특이성 높은 수준이 요구 될 때, microwires 이산 서브 핵 또는 brain3 내의 셀들의 앙상블을 대상으로 사용될 수있다. 녹음이 마이크로 수준에서 정확한으로 단일 유닛 녹음도 높은 시간 해상도에서 혜택을 누릴 수 있습니다. 그리고, 생체항적 기록은 구 심성 및 원심성 돌기, 전신 화학, 호르몬의 영향, 그리고 생리 학적 매개 변수의 자연 환경에 그대로 회로의 상호 작용을 할 수 있습니다. 신경 신호는 감각 입력, 운동 행동,인지 처리, 신경 화학 / 약학, 또는 조합에서 파생됩니다. 따라서, 감각, 모터,인지 적, 화학적 영향의 분리는 상기 영향 각각의 평가를 허용 할 수 있습니다 효과적인 우발 채무와 컨트롤을 잘 생각 실험을 필요로한다. 모두 모두, 동물 행동의 기록은 실험자가 작동 회로 내에서 여러 정보 소스의 통합을 관찰하고 회로 기능의보다 포괄적 인 모델을 도출 할 수 있습니다. 단일 유닛 녹음은 모든 실험이 알고 있어야하는 단점의 숫자에서 고통. 먼저, 기록은 수행하기 어려울 수 있습니다. 사실, 일의 특성전자 headstage 앰프와이 음반에서 공간과 시간의 특이성을 허용 이식 microwires 또한 외부 전기 신호 (즉, 전기적 &quot;노이즈&quot;)의 영향으로 기록이 취약합니다. 따라서, 전기 생리학 시스템의 문제를 해결하는 능력은 전기 생리학 원리와 장치의 잘 발달 된 기술의 이해를 필요로한다. 그것은 특정 상황에서, 세포 외 녹음에 기록 된 전기 신호가 여러 신경 신호의 합을 나타낼 수 있음을주의하는 것도 중요하다. 또한, 타겟 영역 내의 인구 액티비티 단일 유닛 활동의 일반화는 종종 타깃 영역 내의 세포 이질성의 정도에 의해 제한 (그러나 카르 4 참조) 할 수있다. 예를 들어, 전극은 다른 세포 대신에 높은 진폭 출력 뉴런을 기록 편중 될 수 있습니다. 단일 단위 기록의 해석 능력은 증가등 다른 기술과 레코딩을 결합, 이에 국한하지 않음으로써, 전기 (orthodromic 또는 antidromic), 화학 물질 (예를 들면 이온 도입 또는 디자이너 수용체) 또는 optogenetic 자극 4, 임시 신경 inactivations, 감각 검사 5, 분리 절차, 또는 면역 조직 화학 3. (프로토콜이 다른 종에 사용하기 위해 적용 할 수 있지만) 우리는 쥐의 조직 마이크로 와이어 어레이를 이식하는 데 필요한 자료와 단계를 열거 할 다음 프로토콜. 우리 실험실에서 사용되는 고정 배열의 순서와 스타일은 길이 레코딩을위한 신뢰할 수있는 입증 된 1 개월의 시간이 6 ~ 8에 대해 동일한 신경 세포의 기록을 유지 할 수 있습니다. 이 실험 자극, 신경 반응에있는 플라스틱의 변화, 또는 학습과 동기 부여의 메커니즘 phasic 반응을 조사하기위한 절차에 이상적이다.

<table><tbody><tr><td>표 1. 수술 재료 목록.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Fisher (MooreBrand)</td><td>19-898-144</td><td></td></tr><tr><td>면봉</td><td>Fisher (청교도)</td><td>S304659</td><td></td></tr><tr><td>Nembutal (Pentobarbital)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>아트로핀 메틸 질산</td><td>염 Sigma Aldrich</td><td>A0382</td><td></td></tr><tr><td>Baytril (Enrofloxacin)</td><td>Butler Shein ( 바이엘)</td><td>1040007</td><td></td></tr><tr><td>케타민 염산염</td><td>버틀러 Shein</td><td>SKU# 023061</td><td></td></tr><tr><td>베타딘(포비돈-요오드)</td><td>Fisher(Perdue)</td><td>19-066452</td><td></td></tr><tr><td>Stereotax</td><td>Kopf</td><td>모델 900</td><td></td></tr><tr><td>소작 도구</td><td>스톨팅</td><td>59017</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ445</td><td></td></tr><tr><td>치과 드릴</td><td>버팔로</td><td>37800</td><td></td></tr><tr><td>정균 식염수</td><td>Bulter Schein</td><td>8973</td><td></td></tr><tr><td>Jewlers 나사</td><td>스톨팅</td><td>51457</td><td></td></tr><tr><td>Microwire Array</td><td>Microprobes</td><td>맞춤형(유연한)</td><td></td></tr><tr><td>접지선</td><td>Omnetics</td><td>맞춤형 플러그</td><td></td></tr><tr><td>치과용 아크릴</td><td>피셔(BAS)</td><td>50-854-402</td><td></td></tr><tr><td>흡수성 봉합</td>사 <td>Fisher (Ethicon)</td><td>NC0258473</td><td></td></tr><tr><td>Puralube (안과 연고 / 윤활제)</td><td>Fisher (Henry Schein)</td> <td>008897</td><td></td></tr><tr><td>Table 2. 수술 기구 목록.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x Microbinps</td><td>George Tiemann Co.</td><td>#160-57</td><td>다용도 (예: 두개골 창의 잔해 제거)</td></tr><tr><td>2x Forceps</td><td>George Tiemann Co.</td><td>#160-93</td><td>다용도 (예: 봉합사 묶기)</td></tr><tr><td>6x Hemostats</td><td>George Tiemann Co.</td><td>#105-1125</td><td>클램프 및 개방 절개</td></tr><tr><td>1x 작은 가위</td><td>George Tiemann Co.</td><td>#105-411</td> 조직집게 1개를 <td>묶은 후 봉합</td></tr>사 <tr><td></td><td>절단 George Tiemann Co.</td><td>#105-222</td><td>봉합하는 동안 조직 유지</td></tr><tr><td>1x 바늘 홀더</td><td>George Tiemann Co.</td><td>#105-1259</td><td>봉합사 바늘</td></tr><tr><td>1x 메스 홀더 (#11 블레이드 포함)</td><td>George Tiemann Co.</td><td>#105-80 (w/ #105-71 blade)</td><td>두개골 절개</td></tr><tr><td>1x #22 메스 칼날</td><td>George Tiemann Co.</td> 제작<td>#160-381</td><td>두피 면도</td></tr><tr><td>1x 수술용 주걱</td><td>George Tiemann Co.</td><td>#160-718</td><td>두개골의 조직을 긁어내기 위해 두개골</td></tr><tr><td>기계/보석상 나사</td><td>다양한</td><td>N/A</td><td>0/80 x 1/8"</td></tr><tr><td>표 3. 전기생리학적 신호를 기록하기 위한 장비 목록.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwire Array & Connector</td><td>Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD)</td><td>N/A (어레이 특성에 따른 부품 번호)</td><td>대상 기록 영역에 두개골 이식. 어레이는 원하는 와이어 간격, 길이, etc에 따라 사용자 정의됩니다.</td></tr><tr><td>Unity-Gain Harness/Headstage</td><td>M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)</td><td>Proj 1200</td><td>신경 신호의 초기 증폭; 작은 신경 신호의 전파를 허용합니다.</td></tr><tr><td>정류자(및 유체 스위블 옵션)</td><td>Plastics One, Inc.(버지니아주 로어노크)</td><td>SL18C</td><td>프리앰프에 전기 신호를 전파하면서 동물이 자유롭게 회전할 수 있도록 합니다</td></tr>.<tr><td>프리앰프</td><td>M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)</td><td>Proj 1198</td><td>기준 전극에 대한 신경 신호를 차등적으로 증폭합니다.</td></tr><tr><td>Filter and Amplifier</td><td>M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)</td><td>Proj 1199</td><td>대역 통과 필터는 차동 증폭 신호를 추가로 증폭합니다.</td></tr><tr><td>Acquisition Computer</td><td>EnGen (애리조나주 피닉스)</td><td>N/A (Custom Build)</td><td>행동 및 신경 데이터 수집을 위한 소프트웨어 및 하드웨어를 실행합니다.</td></tr><tr><td>A/D 카드&nbsp;</td><td>데이터 번역 (매사추세츠주 말보로)</td><td>DT-3010</td>은 <td>컴퓨터 샘플링을 위해 신경 신호를 디지털화합니다.</td></tr><tr><td>디지털 I/O 카드</td><td>측정 컴퓨팅 (Norton, MA)</td><td>PCI CTR-05</td><td>동작 입력 및 출력 수집</td></tr></tbody></table>

동물 행동하자, 깨어있는 단일 단위 레코딩을위한 microwires의 조직 된 배열을 주입하기위한 절차

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

웨이크 생체 전기 생리 레코딩에서, 행동 동물은 단일 세포 수준에서 신경 신호 전달을 이해하기위한 강력한 방법을 제공한다. 이 기술은 실험자 지속적인 행동으로 기록 된 활동 전위의 상관 관계를하기 위해 시간적 지역적으로 특정 발화 패턴을 검사 할 수 있습니다. 또한, 단일 유닛 녹음은 신경 기능의 포괄적 인 설명을 생산하기 위해 다른 기술의 과다와 결합 될 수있다. 이 문서에서는, 우리는 마이크로 와이어 주입 마취 및 준비에 대해 설명합니다. 다음으로, 우리는 필요한 장비와 정확하게 표적 구조로 마이크로 와이어 어레이를 삽입하는 수술 단계를 열거. 마지막으로, 우리는 간단하게 배열의 각 전극에서 기록하는 데 사용되는 장비에 대해 설명합니다. 설명 고정 마이크로 와이어 어레이는 만성 이식에 적합하고 거의 모든 행동 preparati에 신경 데이터의 길이 녹음을 허용하는에. 우리는 마이크로 와이어의 위치뿐만 아니라 기록 된 결과의 해부학 적 특이성을 높이기 위해 면역 조직 화학 기술과 마이크로 와이어 주입을 결합하는 방법을 삼각 측량 전극 트랙을 추적에 대해 설명합니다.

전기 생리 신호를 기록이 실험에서 사용되는 장비의 목록은 표 3에서 찾을 수있다. 수술에서 회복에 따라, 단일 단위 이식 커넥터에 단위 이득 headstage를 연결하여 기록됩니다. 이 headstage은 전기 슬립 링의 사용을 통해 전기 생리학 기록의 구분없이 자유롭게 회전 할 수있는 정류자에 케이블을 통해 연결된다. 정류자이 준비의 원칙 장점 중 하나입니다 행동하는 동안 녹음하는 동안 주제를 자유롭게 이동할 수 있습니다. 신호들은 그것이 부 신호가 발생하지 않기 때문에 차동 선택된 전극의 주변 소음에 대하여 각 전극에 신호를 증폭하는 데 사용되는 프리 앰프 (10 배 증가)를 통해 공급된다. 차동 기록은 두 전압의 순간적인 차이를 증폭하는 데 사용됩니다. 두 전선은 약 동등하게 자신의 opposi을 주변 소음을 기록하고 있기 때문에테 극성 효과적으로 신경 녹음에서 주변 소음 감산 (그림 2) 수 있습니다. 마지막으로, 신호는 대역 통과 필터링합니다 (450 Hz에...

하나의 단위 전기 생리학 녹음에 사용하기 위해 microwires의 조직 배열을 주입하는 기술 문제를 안겨준다. 이 기술과 필요한 장비를 수행하는 방법이 설명되어 있습니다. 또한, 높은 공간 선택과 별개의 신경 하위 영역에서 기록하는 조직 마이크로 와이어 어레이의 유익한 사용을 설명합니다.

동물 행동하자, 깨어있는 단일 단위 레코딩을위한 Microwires의 조직 된 배열을 주입하기위한 절차

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

이 절차의 전반적인 목적은 표적 뇌 영역에 마이크로와이어 어레이를 정확하게 삽입하는 것입니다. 이를 위해 먼저 두개골 절제술을 위한 좌표를 정밀하게 측정하고 표시합니다. 절차의 두 번째 단계는 치과용 드릴을 사용하여 두개골 층을 천천히 제거함으로써 두개골 절제술을 정확하게 수행하는 것입니다.세 번째 단계는 마이크로와이어 어레이가 두개골의 경계를 정확히 통과하고 두개골과 수평이 되도록 배치하는 것입니다. 마지막 단계는 어레이가 목표 지점에 도달할 때까지 천천히 내리는 것입니다. 결과적으로, 이식된 마이크로와이어 어레이의 상태를 확인할 수 있습니다.이 절차를 사용하면 뇌의 이산적인 하위 영역을 표적으로 설정하여 높은 신경 수득률을 얻을 수 있으며, 이는 종단적 기록 전반에 걸쳐 유지될 수 있습니다. 마이크로와이어 어레이(Microwire arrays)를 단독으로 사용하거나 다른 기술과 조합하여 사용함으로써, 신경과학자들은 높은 공간적 및 시간적 특이성을 가지고 단일 뉴런의 발화 패턴을 조사할 수 있습니다. 마이크로와이어 어레이를 통한 단일 단위 기록은 뇌의 정보 처리 과정에 대한 통찰력을 제공합니다.행동 중 신경 신호를 기록하는 것은 뇌 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. 본 연구실에서는 단일 유닛 전기생리학을 이용하여 체성감각 지도 형성, 운동 학습과 같은 정상적인 과정뿐만 아니라 파킨슨병 및 약물 중독과 같은 질환 과정을 연구해 왔습니다. 생체 내 전기생리학은 숙달하는 데 수년이 걸리는 매우 전문적인 기술입니다.이 기술을 시각적으로 시연하면 수술을 적절하게 수행하는 데 필요한 시간을 단축할 수 있습니다. 펜토바르비탈(pentobarbital)로 동물을 마취한 후, 호흡 기능을 유지하고 감염을 방지하기 위해 아트로핀(atropine), 질산메틸(methyl nitrate) 및 페니실린(penicillin)을 투여합니다. 필요한 경우, 다음 단계로 진행하기 전에 꼬리 꼬집기 테스트를 통해 마취 상태를 확인하십시오.수술 전 과정 동안 마취 상태를 유지하기 위해 케타민 염산염과 펜토바르비탈 나트륨을 교대로 투여합니다. 다음으로 22번 메스 날을 사용하여 두피를 면도한 후, 포비돈성 요오드로 소독합니다. 부피바카인을 두피에 4곳 피하 주사하여 국소 마취를 실시합니다.국소 마취제가 효과를 나타낼 때까지 5~10분 정도 기다립니다. 다음으로, 눈에 안구 윤활제를 도포하고 안구 위치를 기준으로 동물을 정위 고정 장치의 이어 바(ear bar)와 노즈 클램프(nose clamp)에 고정합니다. 동물의 머리를 대략 수평 위치로 맞춥니다.그런 다음 메스를 사용하여 두피의 정중선을 따라 절개합니다. 절개 부위는 비골의 후단에서 귀 바로 뒷부분까지 이어져야 합니다. 해부용 스패튤라를 사용하여 양측 두개골 융기와 후두골 융기에 도달할 때까지 두개골에 남아 있는 모든 조직을 제거합니다.약 6개의 지혈鉗(hemostats)를 사용하여 절개 부위 주변의 피부를 젖혀 고정합니다. 그 다음 두개골에 묻은 혈액을 닦아내고, 나중에 치과용 아크릴이 잘 부착될 수 있도록 건조시킵니다. 이어서 해부 현미경을 사용하여 두개골 봉합선의 교차점을 보간함으로써 BMA와 람다(lambda) 지점을 표시합니다.치과용 드릴 비트와 같이 끝이 뾰족한 작은 도구를 정위 고정 장치(stereotaxic arm)에 부착하고 이를 내려 bgma와 lambda의 배측-복측(dorsal ventral) 좌표를 결정합니다. 그런 다음, bgma와 lambda의 DV 좌표 차이가 100 µm 이내가 될 때까지 코 클램프를 조정합니다. 수평이 맞춰지면, 코 클램프의 위치와 함께 bgma의 좌표를 기록합니다.수술 결과가 이 좌표에 달려 있으므로 좌표를 다시 한번 확인하십시오. 이제 측정된 좌표를 사용하여 bregma를 기준으로 두개골 절개술을 위한 네 모서리의 내외측 및 전후측 좌표를 계산하십시오. 계산 결과를 바탕으로 검은색 잉크를 묻힌 뾰족한 정위 고정 장치(stereotaxic attachment)를 사용하여 두개골 위에 각 모서리를 표시하십시오.이제 뼈를 얇은 층으로 나누어 제거하며 두개골 창을 천공합니다. 먼저 표시해 둔 창의 모서리 부분부터 천공하십시오. 그다음, 각 모서리를 연결하여 창의 외곽선을 따라 천공합니다.마지막으로, 윤곽선 내부 영역을 경질막 깊이까지 깨끗하게 제거합니다. 구멍은 두개골의 표층 아래로 갈수록 넓어지도록 경사지게 깎아야 합니다. 미세 핀셋을 사용하여 두개골 창 내부의 남은 골편, 파편 또는 경질막을 조심스럽게 제거합니다.이물질은 이식 과정 중 어레이의 무결성을 손상시킬 수 있으므로 이는 매우 중요합니다. 세척 후에는 박테리아 정전 식염수로 윈도우를 습하게 유지해야 합니다. 수술의 나머지 단계에서는 두개골 나사 5개와 접지선이 배치될 위치를 표시하여 이식을 시작하십시오.이상적으로는 각 나사가 서로 다른 두개골 뼈에 위치해야 합니다. 하지만 나사 위치가 어레이 배치에 방해가 되어서는 안 됩니다. 다음으로, 두개골 나사용 구멍을 뚫고 나사를 고정하십시오.나사선 3~4개가 보일 때까지 나사를 내려 두개골 두께를 충분히 관통하도록 합니다. 배치 후, 나사선을 깨끗이 닦아냅니다. 이제 접지선을 위한 구멍을 뚫고, 1~2분에 걸쳐 표적 DV 좌표로 선을 천천히 내립니다. 치과용 아크릴을 사용하여 선을 제자리에 고정합니다.다음으로, 치과용 아크릴이 굳기 전에 두개골 나사 나사산 주변에 아크릴을 추가합니다. 접지선이나 두개골 나사에 묻은 과잉 아크릴을 제거합니다. 치과용 아크릴이 건조되도록 15분 동안 둡니다.그동안 어레이를 정위 고정 장치 암(stereotaxic arm)에 부착하십시오. 어레이의 수평을 맞추고 두개골 윈도우의 범위 내로 정확하게 통과하도록 방향을 설정하십시오. 아크릴이 마르면 두개골 윈도우를 생리 식염수로 완전히 채우십시오.그 다음, 어레이를 내려 식염수에 딤플(dimple)이 생기게 합니다. 이 좌표를 어레이의 두개골 높이(skull level)로 사용합니다. 이 값을 이용하여 어레이의 최종 DV 좌표를 계산하십시오.어레이를 최종 dv까지 천천히 내립니다. 정지 위치를 조정하고 몇 분 동안 대기합니다. 어레이가 1mm씩 이동할 때마다 멸균 식염수가 어레이의 와이어 형태를 일시적으로 유지해 주는 폴리에틸렌 글리콜을 용해합니다.어레이가 타겟으로부터 1mm 거리까지 접근하면, 0.1mm 간격으로 최종 목적지까지 더 천천히 내립니다. 어레이가 제자리에 위치하면, 조직을 5분 동안 안정시킵니다. 안정화 단계 이후, 식염수를 더 투여하여 남은 펙(peg)을 녹입니다.그다음 치과용 아크릴을 사용하여 마이크로 와이어를 고정합니다. 아크릴을 여러 층으로 도포하고 15분에서 20분 동안 경화시킵니다. 이어서, 두개골 고정 나사, 접지선 및 마이크로 와이어 커넥터가 들어갈 자리를 고려하여 치과용 아크릴로 동물의 헤드 스테이지 나머지 부분을 형성합니다.수술 후 절차는 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 다음으로, 동물을 이어바에서 분리하여 깨끗한 구역으로 옮깁니다. 체온 조절 능력과 운동 능력이 회복될 때까지 동물을 빈번하게 관찰하십시오.마취에서 회복되면 동물을 개별 사육 시설로 이동시킵니다. 7일 이상 동물의 회복 상태를 모니터링하고, 담당 수의사가 권장하는 대로 carprofen과 enro. Floxacin을 주사합니다. 임플란트된 microwire array로부터 측정된 신경 방전이 행동 사건과 상관관계가 있는지 분석하였습니다.예를 들어, 동물이 코카인을 자가 투여하는 동안 32개 빈(bin)으로 나타낸 측좌핵 내 이 세포의 토닉 발화(tonic firing)를 측정하였습니다. 동물의 체내 코카인 농도가 증가함에 따라 해당 세포가 억제되는 것을 알 수 있습니다. 하지만 이후 세포는 원래의 발화율로 돌아옵니다.자가 투여 조건이 종료된 후 코카인이 투여됩니다. 이 절차를 수행할 때는 두개골 창의 정밀도를 확인하고 어레이의 정렬 상태를 검증하여 표적 정확도를 확보하는 것이 중요합니다. micro I 어레이는 특히 섬세하며, 어레이의 무결성이 적절한 삽입에 결정적이라는 점을 잊지 마십시오.단일 유닛 소거 장치를 다룰 때는 환자와 주의가 필요합니다. 기록은 면역조직화학이나 광유전학과 같은 많은 다른 기술과 결합될 수 있습니다. 이러한 조합이 적절한 행동 패러다임과 결합되면, 뇌 기능의 복잡성에 대한 깊은 통찰을 얻을 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜에서는 쥐에서 만성 electrophysiological 레코딩을위한 마이크로 드라이브 배열을 조작하는 방법을 보여줍니다.

만성에 대한 마이크로 드라이브 배열 생체내에 녹화 : 드라이브 제작

이 비디오는 여러 부위의 뇌 활동에 대한 전기 생리학적 기록을 위해 마취된 쥐를 준비하는 자세한 절차를 보여줍니다. 두개골에 접근하기 위해 두피를 절개하고, 정확한 위치에 구멍을 뚫어 전극을 설치하고 고정합니다. 그런 다음 텅스텐 마이크로 와이어 전극을 대상 위치에 삽입하여 데이터를 기록합니다.

쥐의 여러 부위에서 뇌 활동에 대한 생체 내 전기생리학적 기록

이 비디오는 무선 양방향 다채널 전극 장치를 쥐의 뇌에 이식하여 다채널 신경망을 기록하고 자극하는 절차를 보여줍니다.

쥐의 뇌에 무선 양방향 미세전극 시스템 이식

이 비디오는 국소 자기장 전위를 측정하기 위해 다중 생크 선형 실리콘 프로브를 마우스 뇌에 이식하는 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 이 절차에는 프로브를 입체 장치에 고정하고, 표적 뇌 영역에 정확하게 배치하고, 뇌에 삽입하고, 치과 시멘트로 고정하는 것이 포함됩니다. 이식 후 어셈블리는 케이스로 보호됩니다. 회복 후 이 설정을 통해 국소 자기장 전위를 기록하여 뉴런 활동에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

Multi-Shank Linear Silicon Probes를 사용하여 행동하는 마우스의 뇌 전기 활동 기록

이 비디오는 통합 마이크로 드라이브 어레이를 사용하여 쥐의 여러 뇌 영역에서 동시 전기 생리학적 기록을 보여줍니다. 기록 전극은 후각구에, 참조 전극은 전두엽 피질에, 마이크로 드라이브 어레이 전극은 해마에 배치됩니다. 쥐는 자유롭게 먹이를 찾을 수 있으며, 이식된 모든 전극의 동시 기록은 어레이를 사용하여 기록됩니다.

여러 뇌 영역의 전기생리학적 기록을 위한 마이크로 드라이브 어레이 방법

이 비디오는 전극 어셈블리를 마우스의 뇌에 이식하는 기술을 보여줍니다. 어셈블리에는 해마의 활동을 기록하기 위한 양극성 전극과 소뇌에서 기준선 활동을 얻기 위한 참조 전극이 포함되어 있습니다. 마취된 마우스를 입체성 프레임에 놓고 전극 어셈블리를 표적 뇌 영역에 이식합니다. 그런 다음 동물은 전기 생리학적 기록을 수행하기 전에 회복하도록 허용합니다.

전기생리학적 기록을 위해 마우스 뇌에 전극 어셈블리를 이식합니다.

마우스의 뇌 신호의 생체 전기 생리학 기록에 대한 마이크로 드라이브의 설계와 어셈블리가 설명되어 있습니다. 튼튼한 driveable 캐리어 미세 번들을 부착하여,이 기술은 장기적이고 안정적​​인 신경 녹음을 허용합니다. 경량 디자인은 동물 다음과 같은 드라이브 주입에 의한 제한 행위 성능을 할 수 있습니다.

깨어있는 행동을 한 쥐의 만성 신경 녹음을위한 마이크로 드라이브 배열의 건설

무선, 멀티 채널 신경 녹음 및 자유롭게 쥐 행동에 자극에 대 한 양방향 시스템 도입. 시스템은 가볍고 콤팩트, 따라서 animal´s 행동 레 퍼 토리에 최소한의 영향을 미치고. 또한,이 양방향 시스템 두뇌 활성화 패턴 및 행동 간의 인과 관계를 평가 하는 정교한 도구를 제공 합니다.

무선, Vivo에서 녹음 하 고 자유롭게 행동 하는 쥐에서 신경 활동의 자극에 대 한 양방향 인터페이스

이 작품은 일반적인 마모셋에서 마이크로 전극 어레이의 입체적, 신경외과 적 이식을 수행하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 구체적으로 자유롭게 행동하는 동물의 전기 생리학적 기록을 가능하게 하지만 이 종의 다른 유사한 신경 외과 적 개입에 쉽게 적응할 수 있습니다 (예를 들어, 약물 투여를위한 캐뉼라 또는 뇌 자극을위한 전극).

일반적인 마모셋에 있는 마이크로 전극 배열의 이식을 위한 입체 외과(칼리트릭스 jacchus)

여기서 Ti3C2 MXene 마이크로 전극 어레이를 제조하고 생체 내 신경 기록용으로 활용하는 방법을 설명합니다.

생체 내 신경 녹음을 위한 Ti3C2 MXene 마이크로 전극 어레이 의 제조

이 프로토콜은 박스 아래의 센서에서 가속 데이터를 수집하여 PPI(Prepulse Inhibition)를 평가하는 마이크로 컨트롤러 기반 동작 박스를 제공합니다. 이 데이터는 사회적으로 고립된 쥐의 감각 게이팅 결핍을 평가하며, 행동 장애에 대한 신경 생리학 연구를 발전시키기 위해 데이터를 신경 활동과 동기화하는 추가 방법을 사용합니다.

정신과 동물 모델에서 프리펄스 억제 및 신경 활동을 평가하기 위한 행동 상자 개발

배우세요 뇌 목표 영역에 microwire 어레이를 정확히 이식하는 절차를 통해 신경생물학 연구에서 고해상도 단일 단위 기록을 수행하는 방법을. 이 기술은 장기간 신경 활동 데이터 수집에 필수적입니다.

동물 행동하자, 깨어있는 단일 단위 레코딩을위한 Microwires의 조직 된 배열을 주입하기위한 절차

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