Name: 비타민 E-TPGS와 단일 또는 이중 에멀젼으로 형성된 PLGA 나노 입자 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 학습하세요 비타민 E-TPGS를 유화제로 사용하여 PLGA 중합체 나노입자를 조절 가능한 크기로 제조하는 방법을. 이 기술은 약물 전달 시스템 개발에 활용될 수 있습니다.

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1. 나노 입자 준비
용매 또는 용해/유화 폴리머와 관련된 모든 단계는 화학 흄 후드에서 수행해야 합니다.
<ol>
	<li>100 mg (+/- 5 mg)의 폴리(락틱-코-글리콜산) (PLGA)의 무게를 측정하고 13 mm x 100 mm 시험관에 넣습니다.</li>
	<li>1ml 용매(에틸 아세테이트(EtAc) 또는 디클로로메탄(DCM))을 유리 혈청학 피펫으로 샘플에 옮깁니다.</li>
	<li>튜브 상단을 작은 알루미늄 호일 조각으로 덮고 호일을 파라필름으로 단단히 고정하고 파라필름을 바이알의 상단 가장자리와 호일의 하단 가장자리에 단단히 감쌉니다.</li>
	<li>시험관 외부에 용매의 수준을 표시하십시오. 폴리머를 밤새 용해시키고 증발이 발생하면 다음날 추가 용매를 추가합니다. 
	참고: 폴리머는 필요한 경우 나노 입자 준비 당일에 용해될 수도 있습니다. 1.1-1.3 단계를 수행 한 다음 모든 폴리머가 완전히 용해 될 때까지 (~ 10 분) 높은 온도에서 소용돌이를 일으킵니다.</li>
	<li>초음파 측정기 옆에 다음 장비/재료로 흄 후드에 작업 영역을 준비합니다: 와류, 고무 전구가 있는 두 개의 작은 유리 파스퇴르 피펫 및 자기 교반 플레이트. 얼음물이 가득 찬 큰 비커를 초음파 측정기 아래의 스탠드에 놓습니다.</li>
	<li>마그네틱 교반 막대가 있는 200ml 유리 비커에 0.3% w/v 비타민 E-TPGS 45ml를 넣고 교반 속도를 360rpm으로 설정합니다.</li>
	<li>13mm x 100mm 유리 시험관에 0.3% w/v 비타민 E-TPGS 2ml를 추가합니다.</li>
	<li>약물 첨가 : 
	소수성 제제의 경우: 봉지재를 폴리머 용액에 직접 추가하고(시험관의 벽을 피하도록 주의) 봉지재가 균질하게 분산될 때까지 튜브를 와류로 가열합니다. 
	친수성 제제의 경우: 진행하기 전에 봉지재를 폴리머 용액으로 유화하십시오. 최대 50μl의 약물을 물 또는 완충액에 넣어 폴리머 용액 표면에 첨가합니다. 약물을 폴리머로 유화시키기 위해 잠시 초음파화합니다 (일반적으로 10 초 또는 균질한 불투명 용액을 얻기 위해 필요한 경우). 이 초음파 처리 단계는 얼음 위에서 수행해야합니다.</li>
	<li>열린 튜브 폴리머/봉지재를 와류 근처에 놓습니다. 비타민 E-TPGS가 들어있는 시험관을 수직으로 잡고 높은 소용돌이에서 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 폴리머/봉지재 용액을 적가합니다. 튜브의 측면을 피하고 폴리머 용액을 와류 유화제의 표면에 직접 떨어뜨리도록 주의하십시오. 1ml의 폴리머 용액 전체를 비타민 E-TPGS에 첨가한 후 추가로 15초 동안 용액(현재 에멀젼)을 계속 와류로 가열합니다.</li>
	<li>즉시 유화 된 폴리머를 초음파기로 옮깁니다. 시험관을 얼음물에 담근 상태로 유지하고 10초 버스트 3회(700W 초음파 처리기의 경우 40% 진폭, 프로브 팁 크기 1/8인치)로 에멀젼을 초음파 처리합니다. 에멀젼을 프로브를 위아래로 움직여 균일한 초음파 처리를 보장하고 프로브를 시험관의 측면이나 바닥에 닿지 않도록 주의하십시오. 진행하기 전에 용액이 식을 수 있도록 각 10 초 초음파 처리 사이에 일시 중지하십시오.</li>
	<li>교반 용액에서 0.3% 비타민 E-TPGS 1-2ml를 유리 파스퇴르 피펫으로 에멀젼에 첨가하면 유화 폴리머가 얇아져 더 쉽게 부어질 수 있습니다. 교반 용액에 에멀젼을 비우십시오. 이 단계를 반복하여 시험관에 남아 있는 용액을 교반 용액으로 씻어냅니다.</li>
	<li>3시간 동안 저어주면서 나노 입자가 굳어지도록 합니다. 봉지재가 빛에 민감한 경우 비커를 알루미늄 호일로 감싸고 용매 증발을 용이하게 하기 위해 상단을 열어 둘 수 있습니다.</li>
</ol>
2. 나노 입자 수집
<ol>
	<li>경화된 나노 입자를 두 개의 Oak Ridge 원심분리기 튜브(30ml 용량)로 분할하고 0.1g 이내로 균형을 맞춥니다.</li>
	<li>고정각 로터에서 17,000 x g에서 15분 동안 원심분리 나노입자를 원심분리합니다. 원심분리 시간이 길어질수록 더 작은 나노 입자를 더 많이 수집할 수 있습니다.</li>
	<li>나노 입자 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 상등액을 폐기하십시오(물을 붓거나 피펫을 제거할 수 있음). 15ml diH2O를 추가하고 수조 초음파 발생기 및/또는 볼텍서를 사용하여 나노 입자를 완전히 재현탁시킵니다.</li>
	<li>두 개의 원심분리기 튜브의 내용물을 하나로 결합하고 2.1-2.3 단계를 2배 더 반복하여 매번 30ml의 diH2O에서 총 3회 세척합니다. 마지막 펠릿 재현탁액의 유체 부피는 4-5ml. 이어야 합니다.
	이 시점에서 1:2 트레할로스:폴리머의 중량 비율이 동결 방지제로 추가될 수 있습니다(SEM 이미징을 위해 트레할로스 없이 나노 입자의 작은 분취액을 동결). 동결 과정에서 형성되는 얼음 결정은 입자 표면을 손상시키고 응집을 유도할 수 있으며, 트레할로스의 포함은 PLGA 나노 입자의 균일하고 완전한 재부유를 향상시키는 것으로 나타났습니다13.</li>
	<li>나노 입자를 미리 계량된 5ml 원심분리 튜브에 옮기고 -80°C에서 최소 30분 동안 동결합니다.</li>
	<li>얼어붙은 내용물이 녹지 않도록 빠르게 움직여 튜브의 뚜껑을 풀고 고무 밴드로 상단에 실험실 조직을 고정하여 상단을 덮습니다.**녹는 부분이 있으면 동결 건조기에 넣기 전에 다시 얼립니다.</li>
	<li>5ml 용량의 경우 72시간 동결건조합니다. 동결건조된 입자를 파라필름으로 감싼 튜브에 넣어 -80°C에서 보관하십시오.</li>
</ol>
3. 크기 조정 및 표면 형태
주사 전자 현미경
<ol>
	<li>SEM용 샘플은 이미징 당일에 준비해야 합니다. SEM 스텁에 양면 탄소 테이프 스트립을 놓습니다. 영구 마커는 나중에 참조 할 수 있도록 스텁의 금속 부분에 레이블을 지정하는 데 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>금속 주걱을 사용하여 동결건조된 소량의 나노 입자를 모아 테이프 표면에 부드럽게 펴 바릅니다. 스터브 표면을 실험실 티슈로 닦거나 압축 공기를 사용하여 느슨한 나노 입자를 제거합니다.</li>
	<li>샘플을 금-팔라듐으로 30-120초 동안 스퍼터링합니다. 스퍼터 시간이 길면 이미징을 위한 더 부드러운 표면이 생성되지만 이로 인해 미세한 표면 세부 사항이 손실될 수 있습니다.</li>
	<li>입자를 시각화하기 위한 일반적인 매개변수는 5-15mm의 작동 거리, 5-12kV의 빔 강도 및 1-3의 스폿 크기입니다. 빔 강도가 높을수록 샘플이 국부적으로 가열될 수 있으며, 이는 입자의 표면 형태를 변경합니다. 미세 입자는 100X 배율에서 관찰되고 나노 입자는 3,000X 배율에서 구별할 수 있습니다.</li>
	<li>이상적인 샘플은 스터브의 평평한 표면을 가로지르는 입자의 균일한 코팅으로 구성됩니다. 때때로, 2차 구조(플레이크 또는 구체 포함)는 동결 건조로 인해 발생할 수 있습니다. 플레이크가 테이프와 만나는 플레이크의 가장자리 또는 구의 상단에 초점을 맞추면 SEM으로 쉽게 시각화할 수 있는 입자를 찾는 데 도움이 됩니다. 입자 크기와 형태의 대표 샘플을 얻기 위해 배치당 최소 3개의 이미지를 수집합니다.</li>
</ol>

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PLGA 입자는 일반적으로 크기, 봉지재 및 표면 특성과 같은 입자 특성을 맞춤화할 수 있는 기능을 제공하는 방법인 단일 또는 이중 에멀젼에 의해 제조됩니다7. 이러한 특성 및 기타 특성은 용매 유형, 공급 비율, 유화 방법 및 유화제 유형을 포함한 많은 변수에 따라 달라집니다. 그러나 우리의 경험에 따르면 한 명의 실험자가 일관된 특성을 가진 입자를 생성하는 것이 가능합니다. 동일한 프로토콜을 사용하여 잘 훈련된 실험자는 평균 직경이 317nm±99, 342nm±112, 298nm±104, 361nm±110, 339nm±115, 360nm±123 및 364nm±110의 평균 직경을 가진 나노입자의 7개 개별 배치를 생산했습니다. 잘 훈련된 실험자의 배치를 평균화하면 평균 직경은 340nm±25이고 평균 배치 내 표준 편차는 110nm±8입니다. 첫 번째 실험자에 의해 훈련된 두 번째 실험자는 동일한 프로토콜을 사용하여 평균 직경이 328nm±138인 나노입자를 생산했습니다. 그러나 몇 달 동안 독립적으로 나노입자를 만들어 온 세 번째 실험자는 동일한 프로토콜에 따라 평균 직경이 220nm±70인 나노입자를 생산했습니다. 따라서 예상되는 직경 범위의 입자를 만드는 것이 가능하지만 이는 미묘한 실험 기술의 정확한 복제에 달려 있습니다. 배치를 풀링하면 동일한 응집체 특성을 가진 대량의 나노입자를 생산할 수 있습니다. 예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내 연구를 위해 나노입자를 표면 변형할 때 다중(최대 6개) 200mg 배치를 준비, 세척, 수집, 단일 튜브에 혼합한 다음 표면 변형을 위해 분할합니다. 이를 통해 나노입자 크기, 약물 부하, 전하 및 변형에 사용할 수 있는 표면 부위의 비율이 두 치료 그룹 간에 비교할 수 있습니다. 또 다른 예로, 관심 변수가 서로 다른 제제가 서로 다른 나노입자 배치에 로딩되는 약물 효능인 경우 약물 로딩의 가변성을 측정하고 제어하는 것이 중요합니다. 생산된 입자의 각 배치에 대해 입자 특성을 측정하고 배치 간 변동성을 제어하기 위해 실험을 설계하고 복제하는 것이 중요합니다.
유기상 및 수성상의 완전한 에멀젼은 작은 입자를 형성하는 데 중요합니다. 폴리(비닐알코올)(PVA)는 아마도 가장 일반적으로 사용되는 유화제일 것입니다. 우리와 다른 사람들은 비타민 E-TPGS9, PVA14, 스팬15 및 폴록사머16 을 포함한 다양한 유화 및 안정화제를 사용했습니다(PLGA 입자 생산에 사용되는 광범위한 제제에 대한 철저한 논의는 Wischke et al.17). 적절하게 유화된 폴리머는 균질한 유백색/불투명 용액으로 나타납니다. 불량한(또는 "깨진") 에멀젼은 거시적 이질성 또는 입도를 나타내며 튜브에서 시각적으로 구별되는 두 개의 층으로 분리될 수도 있습니다. 이것은 일반적으로 나노 입자를 형성하지 못했음을 나타냅니다. 에멀젼은 초음파 발생기로 즉시 옮겨지지 않으면 1.9 단계 후에 파손 될 수 있습니다. 이런 일이 발생하면 균질해질 때까지 다시 소용돌이치고 즉시 초음파 발생기로 진행하십시오. 초음파 처리 단계 (1.10) 이후에 분리가 발생해서는 안됩니다. 입자가 더 큰 수성 부피로 분산되면(단계 1.11) 용액은 균일하게 불투명하거나 약간 반투명해야 합니다. 입자 크기가 감소함에 따라 반투명 품질이 증가하고 매우 작은 나노입자의 경우 파란색 색조가 관찰될 수 있습니다. 입자가 약물을 캡슐화하는 경우 이 색조가 관찰되지 않을 수 있습니다. 에멀젼이 큰 수성 부피에 균일하게 분산되지 않거나 입상으로 나타나면 실험을 진행해서는 안 됩니다. 입자 펠릿의 모양과 응집력에 약간의 변화가 관찰되는 것은 정상입니다. 일부 펠릿은 가벼운 소용돌이에 재현탁될 수 있는 반면, 다른 펠릿은 몇 분의 수조 초음파 처리가 필요할 수 있습니다. 재현탁은 5분 이상 걸리지 않아야 합니다. 동결건조된 입자는 면과 같은 것부터 자유롭게 흐르는 것까지 다양한 질감을 취할 수 있습니다.
나노입자 재료로서 PLGA의 많은 장점 중 하나는 제조 공정을 최적화하여 의도한 용도에 원하는 크기의 입자를 생성할 수 있다는 것입니다. 더 큰 나노입자는 작은 나노입자보다 더 높은 비율의 소수성 약물(폴리머 중량에 비해)을 캡슐화하지만 약물 방출 동역학도 영향을 받을 수 있습니다18-20. 나노입자의 크기는 세포에 의한 입자 내재화 메커니즘과 조직 내 분포에 직접적인 영향을 미치며, 이로 인해 전달 효과에 극적인 차이가 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 단핵 식세포 시스템은 1μm보다 큰 전신 순환계에서 물질을 태그하고 제거합니다. 작은 나노입자는 더 큰 나노입자가 단단한 세포외 기질에 갇히는 뇌에 직접 주입하는 데 관심이 있을 수 있습니다. 작은 나노입자의 전달은 또한 향상된 투과 및 유지 효과를 통해 종양의 수동적 표적화를 촉진할 수 있습니다. 약물 캡슐화 효율은 특정 약물의 특성, 입자의 크기 및 유화제(즉, 물 대 용매에 대한 용해도)에 따라 크게 다릅니다. 단일 에멀젼과 이중 에멀젼은 약물 로딩 및 나노 입자 크기에도 영향을 미칩니다. 단일 에멀젼을 통한 소수성 제제의 캡슐화는 이중 에멀젼 방법에 비해 초소형 나노입자 생성에 도움이 될 수 있습니다. 우리는 독자에게 이 주제에 대한 광범위한 토론을 위해 다른 자료로 안내합니다23-28. 마지막으로, 고속 균질화를 포함한 대체 유화 방법을 사용할 수 있으며, 이러한 다른 접근법은 특정 유형의 약물 또는 약물 전달 응용 분야에 이점을 제공할 수 있습니다29.
단일 에멀젼 방법은 나노입자 특성을 변경할 수 있는 광범위한 제형 변수의 변화를 위한 기회를 제공합니다. 예를 들어, 대신 디클로로메탄(DCM)을 용매로 사용하면 일반적으로 더 넓은 크기 분포를 가진 더 큰 나노입자가 생성됩니다. 에틸 아세테이트(EtAc)는 물에 섞일 수 있기 때문에 1차 에멀젼에서 폴리머 액적의 표면 장력이 감소하여 더 작은 나노 입자를 생성합니다. DCM은 동일한 부피의 EtAc를 대체할 수 있습니다. 대체 용매 또는 용매 혼합물을 사용하여 약물 캡슐화 및 입자 특성을 최적화할 수 있습니다. 다른 제형 매개 변수도 입자 크기를 변경할 수 있습니다 : 예를 들어, 용매 부피, 용매 : 폴리머 비율, 초음파 처리 강도 또는 원심 분리 속도 / 지속 시간을 증가시키면 모두 수집 된 입자의 크기가 감소합니다. 순차적 원심분리(예: 먼저 큰 입자를 제거하기 위한 빠르고 저속 원심분리, 그 후 초소형 입자를 수집하기 위해 더 긴 스핀) 또는 필터링을 수행하여 분획 입자의 크기를 조정할 수 있습니다.
여기에서는 평균 직경이 220nm에서 1.98μm 사이인 PLGA 입자를 제조할 수 있는 제형 매개변수를 설명합니다. PLGA로 구성된 입자를 생산하는 이러한 방법은 시험관 내 또는 생체 내에서 향후 약물 전달 적용을 위해 입자 설계(크기, 봉지재 및 표면 특성)를 최적화하는 데 사용될 수 있습니다.

폴리머는 지난 수십 년 동안 표적 종양 치료1에서면역 체계 조절2에 이르기까지 다양한 응용 분야에서 점점 더 인기 있는 약물 전달 매체가 되었습니다. 폴리머 캡슐화 또는 접합 약물은 고분자 관련 약물이 분해로부터 보호되기 때문에 자유롭게 전달되는 약물보다 더 효과적인 경우가 많습니다. 이러한 보호는 생물학적 반감기가 길어지고 전신 부작용이 감소하여 효능이 향상될 수 있다는 것을 의미합니다3-5.
Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA)는 나노 스케일 전달 시스템의 이상적인 특성을 많이 나타내어 캡슐화된 제제의 장기 방출을 제공하고 젖산 및 글리콜산의 생체 적합성 제품으로 분해됩니다. PLGA에 캡슐화된 소분자, 단백질 및 핵산은 다양한 질병 응용 분야에서 향상된 활성을 입증했습니다8. 중요한 것은 재료 플랫폼이 입자를 특정 조직에 대한 표적화하거나 이미징 목적으로 사용하기 위한 리간드의 크기, 전하 및 표면 표시와 같은 기능을 쉽게 사용자 정의할 수 있다는 것입니다. PLGA는 이미 생분해성 봉합사 형태로 인체에서 사용되고 있기 때문에(예: Purasorb, Purac Biomaterials 및 Vicryl, Ethicon Inc.) 임상 번역의 잠재력이 높습니다.
오일-워터(단일) 또는 물-오일-워터(이중) 에멀젼은 PLGA를 사용하여 소수성 및 친수성 약물을 마이크로 또는 나노 형태로 캡슐화할 수 있는 한 가지 방법입니다. 간단히 말해서, PLGA는 계면 활성제 또는 안정제 (물)로 유화 된 유기상 (오일)에 용해됩니다. 소수성 약물은 유상에 직접 첨가되는 반면, 친수성 약물(물)은 입자가 형성되기 전에 폴리머 용액으로 먼저 유화될 수 있습니다. 고강도 초음파 파열은 작은 폴리머 방울의 형성을 촉진합니다. 생성된 에멀젼은 더 큰 수성 상에 첨가되고 몇 시간 동안 교반되어 용매가 증발할 수 있습니다. 경화된 나노 입자는 원심분리에 의해 수집 및 세척됩니다(그림 1).
여기에서는 에틸 아세테이트 (EtAc)를 용매로, 비타민 E-D-α-토코페롤 폴리에틸렌 글리콜 숙신산 (TPGS)을 유화제로 사용하여 단일 및 이중 에멀젼을 사용하여 PLGA 나노 입자를 만드는 기술을 설명합니다. 비타민 E-TPGS를 사용하면 유화 및 캡슐화 효율 향상을 포함하여 다른 유형의 안정화제(예: 폴리(비닐 알코올), PVA)에 비해 여러 가지 이점을 얻을 수 있습니다. 다른 그룹에서는 암세포에서 일반적으로 과발현되고 표적 세포에서 약물을 밀어냄으로써 약물 내성에 기여하는 것으로 알려진 막관통 유출 단백질인 P-gp의 억제를 포함하여 비타민 E-TPGS의 이점을 보고했습니다. 또한 주사전자현미경(SEM)을 사용하여 입자를 특성화하고 크기를 조정하는 방법을 시연하고 프로토콜 변경을 통한 크기 수정에 대한 추가 지침을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>폴리(락틱-코-글리콜산)&amp;nbsp; (PLGA)</td><td><a href="http://www.absorbables.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lactel</a></td><td>B6010-2P</td><td>고유 점도: 0.55-0.75 dl/g</td></tr><tr><td>에틸 아세테이트 (EtAc)</td><td>Sigma</td><td>270989</td><td></td></tr><tr><td>염화 메틸렌 (DCM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>비타민 E TPGS</td><td>Sigma</td><td>57668</td><td></td></tr><tr><td>폴리(비닐 알코올)</td><td></td><td></td><td>87-89% 가수분해, 30,000-70,000 Da</td></tr><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>초음파 파쇄기</td><td>Fisher Scientific</td><td>Model 705</td><td>700 W (Ultrasonicator)</td></tr><tr><td>초음파 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>1/8 in</td></tr><tr><td>볼텍스 믹서</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>다지점 교반기</td><td>Corning</td><td>MP5I</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman-Coulter</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>고정각 로터</td><td>Beckman-Coulter</td><td>50.2TI</td><td></td></tr><tr><td>수조형 초음파 세척기</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS30</td><td></td></tr><tr><td>동결 건조기</td><td>Millrock</td><td>BT85</td><td></td></tr></tbody></table>

비타민 e-tpgs와 단일 또는 이중 에멀젼으로 형성된 plga 나노 입자

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA)는 생분해성 폴리머의 지방족 폴리에스터 계열의 생체 적합성 구성원입니다. PLGA는 특히 재흡수성 봉합사 형태로 인간에게 사용할 수 있도록 이미 FDA 승인을 받았기 때문에 약물 전달 응용 분야에서 오랫동안 인기 있는 선택이었습니다. 소수성 및 친수성 약물은 단일 또는 이중 에멀젼을 통해 PLGA 입자에 캡슐화됩니다. 간단히 말해서, 약물은 중합체로 용해되거나 유기 상에서 중합체로 유화 된 다음 수성상으로 유화됩니다. 용매가 증발한 후, 입자는 동결 건조 및 장기 보관을 위해 원심분리를 통해 세척되고 수집됩니다. PLGA는 수성 환경에서 가수분해를 통해 천천히 분해되며, 캡슐화된 제제는 몇 주에서 몇 달에 걸쳐 방출됩니다. PLGA는 약물 전달에 많은 장점을 가진 물질이지만 나노 입자의 재현성 있는 형성은 어려울 수 있습니다. 상당한 변동성은 다양한 장비, 시약 배치 및 정확한 유화 방법의 사용에 의해 도입됩니다. 여기에서는 유화제 비타민 E-TPGS를 사용하여 단일 또는 이중 에멀젼에 의해 형성된 미세 입자 및 나노 입자의 형성 및 특성화를 매우 자세히 설명합니다. 입자 형태와 크기는 주사 전자 현미경(SEM)으로 결정됩니다. 당사는 다양한 유화제 농도로 생산된 나노 입자에 대한 대표적인 SEM 이미지뿐만 아니라 이미징 아티팩트 및 실패한 유화의 예를 제공합니다. 이 프로토콜은 대체 유화제(예: 폴리(비닐 알코올), PVA) 또는 용매(예: 디클로로메탄, DCM)를 사용하도록 쉽게 조정할 수 있습니다.

본 프로토콜을 사용하여 제조한 PLGA 미세입자와 나노입자의 대표적인 SEM 이미지가 그림 2a 및 2b에 나타나 있습니다. 입자는 개별적으로 분리되어 융합되지 않은 구형으로 보이며, 표면 형태가 매끄럽고 시료 전체에 걸쳐 넓은 범위의 크기 분포를 보입니다.
각 배치의 평균 직경을 결정하기 위해, ImageJ의 "measure" 기능을 사용하여 SEM 이미지에서 직접 측정값을 얻습니다. 대표성 있는 크기 분포를 얻기 위해서는 시야 내에서 무작위로 선택한 입자의 직경을 최소 150회 측정해야 합니다. 입자 배치의 평균 크기는 제형 매개변수에 따라 달라집니다. 예를 들어, Figure 2a에서는 100 mg의 PLGA 당 1 ml의 용매를 사용하고 유화상에 0.05% Vitamin E-TPGS를 사용하여 마이크로입자(평균 직경 730 nm±370)가 형성된 반면, Figure 2b에서는 200 mg의 PLGA 당 4 ml의 용매를 사용하고 소수성 약물인 camptothecin을 캡슐화하며 유화상에 0.3% Vitamin E-TPGS를 사용하여 나노입자(평균 직경 340 nm±70)가 형성되었습니다(상세 제형 매개변수는 그림 캡션에 설명되어 있습니다). 일반적으로 유화제의 농도가 높을수록 더 작은 입자가 생성되며, 유화제 농도를 0.3-0.01% 범위에서 조절함으로써 220-2,000 nm 사이의 평균 직경을 구현할 수 있습니다(Figure 3).
수율은 74-98% 범위입니다 (단일 실험자가 다양한 용매, 유화제 및 유화 조건을 사용하여 제조한 22배치의 나노입자 기준). 작은 나노입자는 원심분리와 세척 단계에서, 특히 세척 상층액을 펠렛에서 따라낼 때 쉽게 손실되므로 더 큰 크기(&gt;150 nm)의 배치에서 더 높은 수율이 관찰될 수 있습니다. 액체를 조심스럽게 피펫팅하면 이러한 문제를 방지하는 데 도움이 됩니다. 더 높은 속도로 원심분리하거나 원심분리 시간을 늘리면 초미세 분획의 나노입자 회수율이 높아지고 펠렛이 더 단단하게 압착되어 세척 단계에서의 손실이 줄어들므로 수율을 높일 수 있습니다. 본 프로토콜은 유화제로 TPGS를, 용매로 EtAc를 사용하여 입자를 제조하는 데 중점을 두었으나, 다른 용매 및 유화제 사용도 가능합니다. 일반적으로 EtAc가 DCM보다 더 작고 균일한 크기의 나노입자를 생성하는 것으로 확인되었습니다 (예: 100 mg/ml PLGA를 용매에 녹여 2 ml 0.1% TPGS로 유화시켰을 때, EtAc는 직경이 540 nm±190인 반면 DCM은 2,160 nm±1,530임). 이는 아마도 EtAc는 물과 혼합 가능하지만 DCM은 그렇지 않기 때문일 것입니다. PVA는 당사와 다른 연구 그룹에서 널리 사용해 온 대중적인 유화제입니다. 당사는 시판되는 PVA의 서로 다른 배치로 제조된 나노입자들 사이에서 변동성을 확인하였습니다. 따라서 재현성을 높이기 위해 가능하면 동일한 스톡의 PVA를 사용하는 것이 권장됩니다. 당사의 실험 결과, PVA는 TPGS보다 훨씬 더 높은 농도에서 더 효과적인 유화제로 작용함을 확인하였습니다 (예: 100 mg/ml PLGA를 DCM에 녹여 2 ml 5% PVA로 유화시켰을 때 직경이 140 nm±48임).
장비와 이미징 과정의 차이로 인해 SEM을 이용한 나노입자 특성 분석은 까다로울 수 있습니다. 따라서 입자 형성 과정의 문제점을 나타내는 형태학적 특징과 이미징 중에 부주의하게 유입된 아티팩트를 구분하는 것이 중요합니다. SEM 이미지에서는 입자의 융합(그림 4a 및 4b), 딤플 형성(그림 4c) 또는 균열(그림 4f)이 때때로 관찰됩니다. 이러한 아티팩트는 입자가 제대로 형성되지 않았음을 나타내기도 하지만(예: 그림 4a에서 유화제 농도가 너무 높아 개별 입자가 형성되지 않음), 특성 분석 방법에 의해 도입된 아티팩트의 결과일 수도 있습니다(예: 그림 4b에서는 스퍼터 코팅 중 시료가 가열되었으며, 그림 4c에서는 이미징 중 SEM 빔에 의한 국소 가열로 입자의 표면 형태가 변함). 이미징 아티팩트를 방지하려면 스퍼터 코팅 시간을 최소화하고 빔 전력을 낮게 유지해야 합니다. 스퍼터 시간이 길어질수록 더 매끄러운 형태가 관찰되지만, 이는 입자의 융합을 유발할 수 있습니다. 스퍼터 시간이 너무 짧으면 입자가 대전되어 이미지 캡처 중에 이동하므로 이미징이 어려워질 수 있습니다. 이미지를 빠르게 캡처하면 장시간의 빔 노출과 이미지 왜곡을 방지하는 데 도움이 됩니다(그림 4d 및 4e). 과도한 빔 노출은 나노입자 표면의 팽창과 균열을 초래할 수도 있습니다(그림 4f). 특성 분석 파라미터를 변경하여 형태학적 아티팩트를 최소화할 수 없다면, 이는 나노입자 자체의 실제 문제일 가능성이 있습니다. 제조 과정 중의 융합은 높은 초음파 처리 전력으로 인한 과열, 용매의 불완전한 증발, 세척 단계에서의 불완전한 재현탁 또는 동결 건조 실패로 인해 발생할 수 있습니다.
<img alt="오일 및 물 분리 과정; 초음파 처리, 증발, 수집; 동결건조 도식도." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 1"> 
그림 1. 나노입자 제작의 모식도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a>.
<img alt="나노입자 구조 (SEM) 및 크기 분포 (μm, nm), 비교 분석 차트." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 2"> 
그림 2. 단일 유화법으로 제조된 PLGA 미립자 및 나노입자의 SEM 이미지와 그에 따른 크기 분포. (A)에서는 1ml ethyl acetate에 용해된 100 mg PLGA를 2 ml의 0.05% Vitamin E-TPGS에 유화시켜 입자를 형성하고, 45 ml 0.01% Vitamin E-TPGS에서 경화시켰다. 이에 해당하는 크기 분포는 (C)에 나타나 있다. (B)에서는 4mL ethyl acetate에 용해된 200 mg PLGA와 40mg의 camptothecin을 4 ml 0.3% Vitamin E-TPGS에 유화시켜 입자를 형성하고, 90 ml 0.3% Vitamin E-TPGS에서 경화시켰다. 이에 해당하는 크기 분포는 (D)에 나타나 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지로 보려면 여기를 클릭하십시오</a>.
<img alt="입자 크기 분석; 막대 그래프와 SEM 이미지는 TPGS %가 마이크로스피어 크기에 미치는 영향을 보여줌" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 3"> 
그림 3. 유화제 농도에 따른 입자 크기 변화. Vitamin E-TPGS 농도가 증가함에 따라 나노입자의 크기가 작아졌다. 1 ml의 ethyl acetate에 용해된 100 mg의 PLGA를 (A) 0.01%, (B) 0.05%, (C) 0.1% 또는 (D) 0.3% Vitamin E-TPGS로 유화시킨 후 45 ml의 0.3% Vitamin E-TPGS에서 경화시켜 제조한 입자의 평균 직경과 해당 SEM 이미지를 나타낸다. 오차 막대는 단일 배치 내 2장의 이미지에서 측정한 200개 직경 값의 표준 편차를 나타낸다. 스케일 바는 5 μm (A-C) 및 200 nm (D)를 나타낸다.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" target="_blank">여기 를 클릭하여 더 큰 이미지 보기</a>.
<img alt="입자 형태 및 응집을 보여주는 SEM 마이크로그라프. 분말 미세구조 분석." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 4"> 
그림 4. SEM으로 관찰된 표면 형태 아티팩트. (A)에서는 샘플 전체에 걸쳐 심한 융합 및 시트 모양의 구조가 나타났다. Vitamin E-TPGS의 농도가 너무 높아(1%) 개별 입자를 형성하지 못했다. (B)에서는 샘플의 일부 영역이 융합되었으나, 특히 스퍼터 코팅에 틈이 있는 곳에서는 개별 나노입자들이 거대하게 군집을 이루고 있었다. 이러한 융합 아티팩트는 스퍼터 코팅 과정 중의 가열로 인해 발생한 것으로 판단된다. (C)에서 입자들은 처음에는 매끄럽게 보였으나, 샘플을 SEM 빔에 지속적으로 노출시킨 결과 딤플링(dimpling)과 러플링(ruffling) 현상이 나타났다. (D)는 샘플을 SEM 빔에 최소한으로 노출시켜 획득한 저해상도 이미지로, 입자들이 둥근 형태의 매끄러운 모습으로 보인다. (E)에서는 동일한 샘플을 더 오랜 시간 노출시켰으며, 원래 형태의 뚜렷한 왜곡이 관찰된다. (F)에서는 고전압 설정(12 kV)에서 빔에 장시간 노출되어 입자의 가열 및 균열이 발생했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지 보기는 여기를 클릭하십시오</a>.

우리는 비타민 E-TPGS를 유화제로 사용하여 폴리(락틱-코-글리콜산)로 구성된 나노 입자 및 마이크로 입자의 생산 및 특성화를 설명합니다. 유화제의 농도와 같은 다양한 제형 매개 변수를 통해 평균 직경이 220 nm에서 1.98 μm 인 나노 입자를 생성 할 수 있습니다.

비타민 E-TPGS와 단일 또는 이중 에멀젼으로 형성된 PLGA 나노 입자

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 크기 조절이 가능한 고분자 나노입자를 형성하는 것입니다. 이는 먼저 고분자를 유기 용매에 녹인 후 약물 또는 형광 캡슐화제를 첨가함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 유화제가 포함된 수상으로 고분자를 유화시킨 다음, 용매가 증발함에 따라 더 많은 양의 수용액 내에서 입자가 경화되도록 하는 것입니다.다음으로 입자들을 세척하고, 원심분리를 통해 수집한 후 장기 보관을 위해 동결 건조합니다. 마지막 단계는 주사 전자 현미경 또는 SEM 이미징을 통해 나노입자의 크기와 표면 형태를 분석하는 것입니다. 최종적으로, 유화제 농도를 조절함으로써 나노입자의 크기를 제어할 수 있음을 SEM을 통해 확인합니다.입자를 맞춤 제작하여 광범위한 치료제를 캡슐화하고 표적 조직에 지속적으로 전달할 수 있으므로, 이 기술의 영향은 다양한 인간 질병의 치료로 확장될 수 있습니다. 이 방법에 대한 시각적 시연은 매우 중요합니다.에멀젼이 형성되는 미묘한 방식이 생성된 입자의 특성에 상당한 영향을 미칠 수 있으므로, 유화 단계는 학습하기가 어렵습니다. 나노입자 제조를 시작하려면 약 100 mg의 polylactic co glycolic acid(PLGA로 알려짐)를 13 x 100 mm 시험관에 넣습니다. 그런 다음 유리 혈청 피펫을 사용하여 1 mL의 ethyl acetate를 샘플에 옮기고, 시험관 상단을 알루미늄 호일로 덮은 후 파라필름으로 호일을 단단히 고정합니다.용매의 증발을 방지하기 위해 파라필름을 바이알의 상단 가장자리와 호일의 하단 가장자리에 밀착하여 감싸십시오. 시험관에 용매의 높이를 표시하고 폴리머가 하룻밤 동안 용해되도록 둡니다. 다음 날, 증발이 일어난 경우 용매를 추가로 첨가하십시오.초음파 세척기 근처의 흄 후드 내에 다음 장비와 재료를 준비합니다. 볼텍스 믹서, 고무 벌브가 장착된 작은 유리 파스퇴르 피펫 2개, 그리고 마그네틱 교반기를 준비하십시오. 추가로, 초음파 세척기 아래 스탠드 위에 얼음물이 가득 담긴 큰 비커를 배치합니다.다음으로, 200 mL 유리 비커에 0.3% w/v vitamin E-TPGS 45 mL를 넣고 교반 속도를 360 RPM으로 설정합니다. 그런 다음 13 x 100 mm 유리 시험관에 0.3% w/v vitamin E-TPGS 2 mL를 넣습니다. 소수성 제제를 혼합하기 위해, 시험관 벽면에 닿지 않도록 주의하며 캡슐화제를 폴리머 용액에 직접 첨가하고, 캡슐화제가 균질하게 분산될 때까지 시험관을 볼텍싱합니다.친수성 제제의 경우, 캡슐화 물질을 폴리머 용액과 함께 유화시킵니다. 버퍼에 용해된 약물을 최대 50 µL까지 폴리머 용액 표면에 첨가합니다. 혼합물을 얼음 위에서 약 10초 동안 또는 용액이 불투명하고 균질해질 때까지 초음파 처리합니다.다음으로, vitamin E-T-P-G-S가 들어 있는 시험관을 수직으로 세운 상태에서 고속으로 볼텍싱합니다. 글라스 포스처 피펫을 볼텍싱 중인 튜브 상단에서 1~2cm 위에 유지하고, 폴리머 용액을 볼텍싱 중인 액체 표면에 천천히 한 방울씩 첨가합니다. 폴리머 용액을 모두 첨가할 때까지 피펫이 튜브의 벽면에 닿지 않도록 주의하십시오.용액을 계속해서 볼텍싱하십시오. 이제 15초 동안 유화시킵니다. 유화된 폴리머를 즉시 초음파 분쇄기로 옮기십시오.시험관을 얼음물에 담근 상태로 유지하고, 에멀젼을 10초씩 3회 나누어 초음파 처리합니다. 균일한 초음파 처리를 위해 프로브를 따라 에멀젼을 위아래로 움직이되, 프로브가 시험관의 벽면이나 바닥에 닿지 않도록 주의하십시오. 다음 단계로 넘어가기 전, 용액을 냉각시키기 위해 각 10초의 초음파 처리 사이에 5~10초 동안 중단합니다.그다음 교반 용액에서 0.3% vitamin E-T-P-G-S 1~2 mL를 유화액에 첨가합니다. 이렇게 하면 유화된 폴리머의 점도가 낮아져 붓기 쉬워지므로, 유화액을 교반 용액에 붓습니다. 시험관에 남아 있는 용액을 모두 교반 용액으로 씻어내어 옮깁니다.3시간 동안 교반하여 나노입자를 경화시킵니다. 캡슐화 물질이 빛에 민감한 경우, 비커를 알루미늄 호일로 감싸되 용매 증발을 돕기 위해 윗부분은 열어둡니다. 나노입자를 수집하려면, 나노입자 용액을 공칭 부피 30 mL인 두 개의 Oak Ridge 원심분리 튜브에 나누어 담고, 두 튜브의 무게 차이가 0.1 g 이내가 되도록 균형을 맞춥니다. 그다음 고정각 로터를 사용하여 17,000 rpm에서 15분 동안 나노입자를 원심분리합니다.RC f. 원심분리 시간을 늘리면 더 작은 크기의 나노입자를 더 높은 비율로 수집할 수 있습니다. 나노입자 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 제거하십시오.5 mL의 증류수를 첨가하고 항온수조, 교반기 및 볼텍스를 사용하여 나노입자를 완전히 현탁시킵니다. 두 원심분리 튜브의 내용물을 하나로 합치고 증류수 20 mL를 추가하여 총 부피를 30 mL로 맞춥니다. 그런 다음 원심분리 및 세척 단계를 두 번 더 반복하여 총 세 번 세척합니다.마지막 펠렛 재현탁액의 액체 부피는 4~5 mL가 되어야 합니다. SEM 이미징을 위해 텔로스-프리 나노입자의 소량 분취액을 따로 얼리고 나머지는 보관하십시오. PLGA 나노입자의 균일하고 완전한 재현탁을 위해 동결 보호제로 폴리머 대비 1~2의 중량비로 TLO를 첨가하십시오.이렇게 하면 입자 표면을 손상시키고 응집을 유발할 수 있는 얼음 결정의 형성을 방지할 수 있습니다. 나노입자를 미리 무게를 잰 5 mL 원심분리 튜브로 옮긴 후, -80 °C에서 최소 30분 동안 냉동합니다. 다음으로, 튜브의 캡을 열고 실험실용 티슈를 튜브 윗부분에 덮어 고무줄로 고정합니다.내용물이 녹을 경우를 대비하여 빠르게 이동합니다. 동결건조기에 넣기 전에 다시 냉동하고, 5 mL 샘플을 72시간 동안 동결건조합니다. 그 다음 캡을 닫고 튜브를 감싸 동결건조된 입자를 -80 °C에서 보관합니다.이미징 당일에 SEM 스텁 위에 양면 탄소 테이프 조각을 부착합니다. 나중에 참조할 수 있도록 스텁의 금속 부분에 영구 마커로 표시합니다. 금속 스패출러를 사용하여 소량의 동결 건조된 나노입자를 수집하고 테이프 표면에 조심스럽게 펴 바릅니다.실험실용 티슈로 스터브 표면을 닦아내거나 압축 공기를 사용하여 느슨하게 붙어 있는 나노입자를 제거합니다. 빔의 작동 거리 5~15 mm, 가속 전압 5~12 kV, 스폿 크기 1~3으로 입자를 시각화합니다. 빔 강도가 더 높으면 시료의 국부적 가열이 발생하여 입자의 표면 형태가 변할 수 있습니다. 마이크로입자는 100배 배율에서 관찰하며, 나노입자는 3000배 배율에서 구별할 수 있습니다.SEM으로 쉽게 시각화할 수 있는 입자를 찾기 위해 구체의 상단에 배율을 맞추고, 입자 크기와 형태의 대표성 있는 샘플을 얻기 위해 배치당 최소 3장의 이미지를 수집합니다. 이 방법을 사용하면, 매끄러운 표면 형태와 샘플 전체에 걸쳐 광범위한 크기로 분포하며 서로 융합되지 않은 개별 구체 형태로 나타나는 입자들을 단일 에멀션으로 생성할 수 있습니다. 여기에 표시된 미세 입자들의 평균 직경은 730 nanometers입니다.여기에 소수성 약물인 campin을 캡슐화하여 단일 에멀션으로 생성된 나노입자가 나타나 있습니다. 이 입자들은 평균 직경이 340 nanometers로 훨씬 더 작게 형성되었습니다. 유화제의 농도가 높을수록 더 작은 입자가 생성되었으며, 평균 직경은 2000에서 200 nanometers까지 감소했습니다.여기 SEM 이미지에서 보는 바와 같이, 유화제 농도가 0.01%에서 0.3%로 증가함에 따라 입자의 형태가 변화하였습니다. 하지만 vitamin E-T-P-G-S의 농도가 너무 높을 경우, 1% vitamin E-T-P-G-S를 사용했을 때는 개별 입자가 형성되지 않았으며, 전체 구조 전반에 걸쳐 심한 융합 및 시트 형태의 구조가 관찰되었습니다. 유화법을 통한 PLG 나노입자 제조법을 익혔다면, 표면 개질과 같은 다른 방법을 통해 특정 세포 유형이나 신체 부위와 상호작용하도록 나노입자를 설계할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 유화법을 통해 재현 가능하고 크기 조절이 가능한 입자를 형성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

plga-nanoparticles-formed-single-or-double-emulsion-with-vitamin-e

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

비타민 E-TPGS를 이용한 단일 또는 이중 에멀젼에 의해 형성된 PLGA 나노 입자

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