비타민 E-TPGS와 단일 또는 이중 에멀젼으로 형성된 PLGA 나노 입자

이 실험 절차의 전반적인 목적은 크기 조절이 가능한 고분자 나노입자를 형성하는 것입니다. 이는 먼저 고분자를 유기 용매에 녹인 후 약물 또는 형광 캡슐화제를 첨가함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 유화제가 포함된 수상으로 고분자를 유화시킨 다음, 용매가 증발함에 따라 더 많은 양의 수용액 내에서 입자가 경화되도록 하는 것입니다.

다음으로 입자들을 세척하고, 원심분리를 통해 수집한 후 장기 보관을 위해 동결 건조합니다. 마지막 단계는 주사 전자 현미경 또는 SEM 이미징을 통해 나노입자의 크기와 표면 형태를 분석하는 것입니다. 최종적으로, 유화제 농도를 조절함으로써 나노입자의 크기를 제어할 수 있음을 SEM을 통해 확인합니다.

입자를 맞춤 제작하여 광범위한 치료제를 캡슐화하고 표적 조직에 지속적으로 전달할 수 있으므로, 이 기술의 영향은 다양한 인간 질병의 치료로 확장될 수 있습니다. 이 방법에 대한 시각적 시연은 매우 중요합니다.

에멀젼이 형성되는 미묘한 방식이 생성된 입자의 특성에 상당한 영향을 미칠 수 있으므로, 유화 단계는 학습하기가 어렵습니다. 나노입자 제조를 시작하려면 약 100 mg의 polylactic co glycolic acid(PLGA로 알려짐)를 13 x 100 mm 시험관에 넣습니다. 그런 다음 유리 혈청 피펫을 사용하여 1 mL의 ethyl acetate를 샘플에 옮기고, 시험관 상단을 알루미늄 호일로 덮은 후 파라필름으로 호일을 단단히 고정합니다.

용매의 증발을 방지하기 위해 파라필름을 바이알의 상단 가장자리와 호일의 하단 가장자리에 밀착하여 감싸십시오. 시험관에 용매의 높이를 표시하고 폴리머가 하룻밤 동안 용해되도록 둡니다. 다음 날, 증발이 일어난 경우 용매를 추가로 첨가하십시오.

초음파 세척기 근처의 흄 후드 내에 다음 장비와 재료를 준비합니다. 볼텍스 믹서, 고무 벌브가 장착된 작은 유리 파스퇴르 피펫 2개, 그리고 마그네틱 교반기를 준비하십시오. 추가로, 초음파 세척기 아래 스탠드 위에 얼음물이 가득 담긴 큰 비커를 배치합니다.

다음으로, 200 mL 유리 비커에 0.3% w/v vitamin E-TPGS 45 mL를 넣고 교반 속도를 360 RPM으로 설정합니다. 그런 다음 13 x 100 mm 유리 시험관에 0.3% w/v vitamin E-TPGS 2 mL를 넣습니다. 소수성 제제를 혼합하기 위해, 시험관 벽면에 닿지 않도록 주의하며 캡슐화제를 폴리머 용액에 직접 첨가하고, 캡슐화제가 균질하게 분산될 때까지 시험관을 볼텍싱합니다.

친수성 제제의 경우, 캡슐화 물질을 폴리머 용액과 함께 유화시킵니다. 버퍼에 용해된 약물을 최대 50 µL까지 폴리머 용액 표면에 첨가합니다. 혼합물을 얼음 위에서 약 10초 동안 또는 용액이 불투명하고 균질해질 때까지 초음파 처리합니다.

다음으로, vitamin E-T-P-G-S가 들어 있는 시험관을 수직으로 세운 상태에서 고속으로 볼텍싱합니다. 글라스 포스처 피펫을 볼텍싱 중인 튜브 상단에서 1~2cm 위에 유지하고, 폴리머 용액을 볼텍싱 중인 액체 표면에 천천히 한 방울씩 첨가합니다. 폴리머 용액을 모두 첨가할 때까지 피펫이 튜브의 벽면에 닿지 않도록 주의하십시오.

용액을 계속해서 볼텍싱하십시오. 이제 15초 동안 유화시킵니다. 유화된 폴리머를 즉시 초음파 분쇄기로 옮기십시오.

시험관을 얼음물에 담근 상태로 유지하고, 에멀젼을 10초씩 3회 나누어 초음파 처리합니다. 균일한 초음파 처리를 위해 프로브를 따라 에멀젼을 위아래로 움직이되, 프로브가 시험관의 벽면이나 바닥에 닿지 않도록 주의하십시오. 다음 단계로 넘어가기 전, 용액을 냉각시키기 위해 각 10초의 초음파 처리 사이에 5~10초 동안 중단합니다.

그다음 교반 용액에서 0.3% vitamin E-T-P-G-S 1~2 mL를 유화액에 첨가합니다. 이렇게 하면 유화된 폴리머의 점도가 낮아져 붓기 쉬워지므로, 유화액을 교반 용액에 붓습니다. 시험관에 남아 있는 용액을 모두 교반 용액으로 씻어내어 옮깁니다.

3시간 동안 교반하여 나노입자를 경화시킵니다. 캡슐화 물질이 빛에 민감한 경우, 비커를 알루미늄 호일로 감싸되 용매 증발을 돕기 위해 윗부분은 열어둡니다. 나노입자를 수집하려면, 나노입자 용액을 공칭 부피 30 mL인 두 개의 Oak Ridge 원심분리 튜브에 나누어 담고, 두 튜브의 무게 차이가 0.1 g 이내가 되도록 균형을 맞춥니다. 그다음 고정각 로터를 사용하여 17,000 rpm에서 15분 동안 나노입자를 원심분리합니다.

RC f. 원심분리 시간을 늘리면 더 작은 크기의 나노입자를 더 높은 비율로 수집할 수 있습니다. 나노입자 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 제거하십시오.

5 mL의 증류수를 첨가하고 항온수조, 교반기 및 볼텍스를 사용하여 나노입자를 완전히 현탁시킵니다. 두 원심분리 튜브의 내용물을 하나로 합치고 증류수 20 mL를 추가하여 총 부피를 30 mL로 맞춥니다. 그런 다음 원심분리 및 세척 단계를 두 번 더 반복하여 총 세 번 세척합니다.

마지막 펠렛 재현탁액의 액체 부피는 4~5 mL가 되어야 합니다. SEM 이미징을 위해 텔로스-프리 나노입자의 소량 분취액을 따로 얼리고 나머지는 보관하십시오. PLGA 나노입자의 균일하고 완전한 재현탁을 위해 동결 보호제로 폴리머 대비 1~2의 중량비로 TLO를 첨가하십시오.

이렇게 하면 입자 표면을 손상시키고 응집을 유발할 수 있는 얼음 결정의 형성을 방지할 수 있습니다. 나노입자를 미리 무게를 잰 5 mL 원심분리 튜브로 옮긴 후, -80 °C에서 최소 30분 동안 냉동합니다. 다음으로, 튜브의 캡을 열고 실험실용 티슈를 튜브 윗부분에 덮어 고무줄로 고정합니다.

내용물이 녹을 경우를 대비하여 빠르게 이동합니다. 동결건조기에 넣기 전에 다시 냉동하고, 5 mL 샘플을 72시간 동안 동결건조합니다. 그 다음 캡을 닫고 튜브를 감싸 동결건조된 입자를 -80 °C에서 보관합니다.

이미징 당일에 SEM 스텁 위에 양면 탄소 테이프 조각을 부착합니다. 나중에 참조할 수 있도록 스텁의 금속 부분에 영구 마커로 표시합니다. 금속 스패출러를 사용하여 소량의 동결 건조된 나노입자를 수집하고 테이프 표면에 조심스럽게 펴 바릅니다.

실험실용 티슈로 스터브 표면을 닦아내거나 압축 공기를 사용하여 느슨하게 붙어 있는 나노입자를 제거합니다. 빔의 작동 거리 5~15 mm, 가속 전압 5~12 kV, 스폿 크기 1~3으로 입자를 시각화합니다. 빔 강도가 더 높으면 시료의 국부적 가열이 발생하여 입자의 표면 형태가 변할 수 있습니다. 마이크로입자는 100배 배율에서 관찰하며, 나노입자는 3000배 배율에서 구별할 수 있습니다.

SEM으로 쉽게 시각화할 수 있는 입자를 찾기 위해 구체의 상단에 배율을 맞추고, 입자 크기와 형태의 대표성 있는 샘플을 얻기 위해 배치당 최소 3장의 이미지를 수집합니다. 이 방법을 사용하면, 매끄러운 표면 형태와 샘플 전체에 걸쳐 광범위한 크기로 분포하며 서로 융합되지 않은 개별 구체 형태로 나타나는 입자들을 단일 에멀션으로 생성할 수 있습니다. 여기에 표시된 미세 입자들의 평균 직경은 730 nanometers입니다.

여기에 소수성 약물인 campin을 캡슐화하여 단일 에멀션으로 생성된 나노입자가 나타나 있습니다. 이 입자들은 평균 직경이 340 nanometers로 훨씬 더 작게 형성되었습니다. 유화제의 농도가 높을수록 더 작은 입자가 생성되었으며, 평균 직경은 2000에서 200 nanometers까지 감소했습니다.

여기 SEM 이미지에서 보는 바와 같이, 유화제 농도가 0.01%에서 0.3%로 증가함에 따라 입자의 형태가 변화하였습니다. 하지만 vitamin E-T-P-G-S의 농도가 너무 높을 경우, 1% vitamin E-T-P-G-S를 사용했을 때는 개별 입자가 형성되지 않았으며, 전체 구조 전반에 걸쳐 심한 융합 및 시트 형태의 구조가 관찰되었습니다. 유화법을 통한 PLG 나노입자 제조법을 익혔다면, 표면 개질과 같은 다른 방법을 통해 특정 세포 유형이나 신체 부위와 상호작용하도록 나노입자를 설계할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 유화법을 통해 재현 가능하고 크기 조절이 가능한 입자를 형성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.