단백질 A 멤브레인 흡착제 및 간소화된 워크플로우를 사용하여 키메라 인간 Fc 발현 단백질의 격리 및 특성화

이 프로시저의 전반적인 목표는 단백질 A 막 흡착제와 간소화된 워크플로우를 사용하여 chimeric human FC 발현 단백질을 효율적이고 효과적으로 분리하고 특성화하는 것입니다. 이는 먼저 0.22 micron 필터로 세포 배양 상층액을 정제함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 유동 시스템을 조립하고 단백질 A 막 흡착제를 통해 세포 배양 상층액의 관류를 시작하는 것입니다.

다음으로, 인간 FC 발현 단백질을 막 흡착제로 분리하고, 결과물인 EIT를 한외여과를 통해 농축한 후 투석을 통해 완충액 교환을 수행합니다. 마지막 단계에서는 유세포 분석법과 웨스턴 블로팅을 사용하여 농축된 단백질의 품질과 양을 결정합니다. 결과적으로, 단백질 A 막 흡착제와 효율화된 워크플로우는 단백질 A aro speed 충진 컬럼을 이용한 전통적인 친화성 크로마토그래피에 비해 처리 시간의 단축과 단백질 수율의 잠재적 증가를 보여줍니다.

따라서 컬럼 친화성 크로마토그래피와 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 멤브레인 흡수기를 통해 처리 시간을 단축하면서도 단백질의 수율을 잠재적으로 더 높일 수 있다는 점입니다. 적절한 분석 방법의 선택 또한 처리 시간을 단축할 수 있습니다. 제조업체의 지침에 따라 멤브레인 흡수기를 준비하고, 통과시키는 모든 용액이 실온 상태이며 0.22 micron 필터로 사전 여과되었는지 확인하십시오. 우선, 10 milliliter 주사기에 0.22 micron 여과된 KO's phosphate buffered saline 또는 DPBS를 채우고 공기 방울을 제거합니다.

막 흡수체 내로 공기가 유입되지 않도록 하기 위해, 사용 직전에 보관액을 제거하고 막 흡수체를 평형화시키기 위해 DPBS를 주입하십시오. 진공 구동식 0.22 micron 멸균 여과 장치를 사용하여 세포 배양 상층액을 막 흡수체에 주입하기 직전에 여과하여 단백질 A 막 흡수체를 로딩하고, 루어 락 주사기에 세포 배양 상층액을 흡입한 후 공기 방울을 모두 제거하여 재료와 장비를 준비하십시오. 먼저, 주사기를 막 흡수체의 입구에 연결하십시오.

필요한 경우 멤브레인 흡수기 출구에 유연한 튜빙을 연결하십시오. 시린지와 멤브레인 흡수기 사이에 0.22 micron 시린지 필터를 장착하십시오. 플라스크나 병을 사용하여 흡수기에서 나오는 액체를 받으십시오.

시린지 펌프를 원하는 부피 유량으로 설정하되, 제조사 권장 유량을 초과하지 마십시오. 세포 배양 상층액을 막 흡착제에 통과시켜 관류하고 통과액을 수집하십시오. 필요에 따라 시린지에 상층액을 다시 채우십시오.

필요한 경우, 실험실의 선호도에 따라 유세포 분석법(flow cytometry), 웨스턴 블로팅(western blotting) 또는 ELISA를 사용하여 통과액(flow through) 내 단백질 존재 여부를 테스트하십시오. 일반적으로 막 흡수체(membrane absorber)에서 단백질을 용출시키기 위해 통과액을 다시 흘려보낼 필요는 없습니다. 먼저 10 milliliters의 DPBS로 막 흡수체를 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거하십시오. 원하는 유속으로 막 흡수체에서 단백질을 용출시키십시오.

10 내지 15 mL의 용출 버퍼를 사용하십시오. 용출 부피의 10%에 해당하는 중화 버퍼가 담긴 튜브에 EIT를 받으십시오. 단백질을 용출한 후, 제조사의 지침에 따라 멤브레인 흡착제를 재생하십시오.

4°C에서 장기 보관하기 위해 멤브레인 흡수체를 DPBS 내 20% ethanol로 채웁니다. 모든 EIT를 10 kilodalton 분자량 컷오프 원심분리 필터 유닛에 넣습니다.

원심분리 투석 시 제조사의 지침을 따르십시오. 선택한 버퍼를 사용하여 10 kilodalton 분자량 컷오프의 소량 투석 유닛에서 잔류물을 투석하십시오. 투석된 물질에 버퍼를 추가해야 할 수도 있습니다.

단백질 침전이 우려되는 경우, 원하는 대로 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS page를 통해 선택한 젤 상에서 정제된 단백질과 FC 표준물질을 분리하십시오. 런타임을 최소화하기 위해 미니 젤을 사용하고, 정제된 단백질 밴드 신호가 FC 표준물질의 선형 신호 범위 내에 있도록 DPBS로 희석한 샘플을 포함하여 다양한 양의 정제된 단백질 샘플을 로딩하십시오. 젤 분리 후 이미지 분석 단계에서는 제조사의 지침에 따라 세미 드라이 블로터(semi-dry blotter)와 불연속 완충액 시스템을 사용하여 젤의 단백질을 폴리 불화비닐리덴(poly vinylidene fluoride) 막으로 전이시키며, 전이 시간은 일반적으로 5~10분입니다.

전이 효율을 확인하기 위해 전이 후 젤을 Kumasi로 염색합니다. 진공 보조 단백질 검출법을 사용하여 알칼라인 포스파타아제 또는 서양와사비 peroxidase가 결합된 anti FC 또는 anti IgG로 면역 블로팅을 수행합니다. 면역 블로팅 시간은 일반적으로 1시간 미만입니다.

선택한 기질과 방법을 사용하여 면역 블롯(immuno blot)을 현상합니다. 이미지 분석을 통해 정제된 단백질을 정량합니다. FC 표준품의 밴드 신호에 대해 선형 회귀 분석을 수행합니다.

R 제곱(R squared) 값이 0.90보다 크면, 직선 방정식을 사용하여 밴드 신호로부터 단백질 양을 계산하되, 필요한 경우 시료 희석 배수를 고려하십시오. 단백질 정량이 fc를 기준으로 수행되므로, 단백질과 fc 간의 분자량 차이에 따라 값을 보정하십시오. R 제곱 값이 0.90보다 작으면, 신속 웨스턴 블로팅(expedited western blotting) 절차를 반복하십시오.

마지막으로, 기능적 분석 또는 유세포 분석을 통한 FC 검출 방법을 사용하여 단백질을 검증합니다. Western blotting 또는 EISA 유세포 분석을 사용하여 초기 세포 배양 상층액 내 기능적 GAL one HFC의 존재 여부를 테스트하였으며, 이는 파란색 히스토그램으로 표시되었습니다. 여기서 빨간색으로 표시된 신선한 세포 배양 배지가 음성 대조군으로 사용되었으며, 이 히스토그램과 겹쳐진 녹색 부분은 멤브레인 흡착제가 GAL one HFC를 효율적으로 포획하고 유지했음을 나타내는 flow through입니다. GAL one HFC는 아민 기반 산성 완충액을 사용하여 분당 1 mL의 속도로 1 mL씩 멤브레인 흡착제로부터 용출되었습니다. 이후 중화된 용출 분획물들을 유세포 분석으로 테스트하여 기능적 GG one HFC의 존재 여부를 확인하였습니다. GL one HFC 신호는 음성 대조군과 거의 동일했던 용출액 1부터 순차적으로 증가하여 용출액 3에서 최대치에 도달했으며, 이후 용출액 9와 10에서는 거의 일정한 수준으로 감소하였습니다.

최종 EEU 10은 일부 흡착제 흡수제 유지로 인해 음성 대조군 신호와의 동등성에 도달하지 못했습니다. 정제된 GL one HFC의 정량 및 특성 분석은 세미-드라이 트랜스퍼(semi-dry transfer)와 진공 보조 면역 블로팅(vacuum assisted immuno blotting)으로 가속화된 웨스턴 블로팅 절차를 통해 수행되었습니다. GA one HFC 신호를 HFC 정량 표준물질과 비교함으로써, 정제된 물질의 양과 질이 모두 결정되었습니다.

GAL one HFC 및 분해된 GAL one HFC 신호는 표준 범위 내에 있었습니다. HFC 표준 밴드의 신호 강도는 존재하는 HFC의 양과 선형 관계를 보였습니다. 이미지 프로세싱을 통해 HFC를 기준으로 측정한 정제된 GAL one HFC의 농도는 450 µg/mL로 결정되었습니다.

G1HFC의 분자량을 보정합니다. 정제된 물질의 농도는 720 µg/mL였습니다. 반면, 여기에 제시된 웨스턴 블롯의 6번 및 7번 레인에는 정제된 GAL1HFC가 너무 많이 로딩되어 신호가 HFC 표준 범위를 포화하거나 초과하였으며, 이로 인해 정량이 불가능했습니다.

웨스턴 블로팅의 대안으로 쿠마시 젤 염색은 신속한 품질 관리 확인 또는 정량 방법으로 활용될 수 있습니다. 분해된 GAL one HFC 샘플에서는 약 25 kilodaltons 및 40 kilodaltons의 밴드 외에 약 10 kilodaltons의 밴드가 나타났음에 유의하십시오. 이 밴드는 웨스턴 블롯에 사용된 검출 항체와 반응하지 않는 분해된 GAL one HFC입니다.

본 영상을 시청하신 후에는 막 흡착제(membrane absorbers)를 사용하여 키메라 인간 FC 발현 단백질을 분리하는 방법과 해당 단백질들을 최소 4시간 이내에 특성화하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.