3.12: 예쁜 꼬마 선충에 RNAi의 적용

RNA 간섭(RNA interference, RNAi)은 이중 가닥 RNA를 유기체에 도입하여 표적 유전자 침묵(targeted gene silencing)을 유발하는 널리 사용되는 기술입니다. RNA 간섭에 대한 노벨상 수상의 발견으로 연구자들은 예쁜꼬마선충의 기능을 결정하기 위해 예쁜꼬마선충 유전자를 침묵시킬 수 있었다. 우리는 먼저 벌레가 먹을 표적 유전자 dsRNA를 발현하는 E. coli가 있는 플레이트를 준비함으로써 C. elegans에서 RNAi를 유도할 수 있습니다. 그런 다음 4번째 유충 단계 기생충을 RNAi 플레이트로 옮겨 알을 낳을 수 있습니다. 원하는 발달 단계에서 자손을 수집하고 표현형에 대해 점수를 매깁니다.

RNAi 기술은 예쁜꼬마선충에서 역 유전자 스크리닝, 자동화된 고처리량 스크리닝을 수행하고, 발달 과정을 연구하기 위한 도구로 자주 사용됩니다. 이 비디오에서는 RNA 간섭의 개념을 설명하고, 예쁜꼬마선충에서 RNAi 기술을 사용하는 방법을 시연하고, 과학자들이 광범위한 생물학적 과정을 더 잘 이해하기 위한 도구로 RNAi를 사용하는 방법에 대해 논의합니다.

먼저 RNA 간섭이 어떻게 작동하는지 보여주는 것으로 시작하겠습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 경우, 기생충은 박테리아를 먹여 살며, 이 박테리아는 침묵시키고자 하는 유전자를 상보하는 이중 가닥 RNA를 암호화하는 플라스미드로 형질전환되었습니다. 앞서 언급했듯이 예쁜꼬마선충은 변형된 박테리아를 먹습니다. 현재 알려지지 않은 메커니즘을 통해 dsRNA는 일단 섭취되면 예쁜꼬마선충 조직으로 들어갑니다.

일단 세포 내부로 들어가면, 효소 다이서(Dicer)는 이중 가닥 RNA를 21개에서 23개 사이의 뉴클레오티드 길이의 짧은 간섭 RNA 또는 siRNA로 절단합니다. 다음으로, siRNA는 "RISC"라고도 하는 RNA 유도 침묵 복합체와 결합하여 풀립니다. 그런 다음 siRNA/RISC 복합체는 상보적 염기쌍을 통해 타겟 mRNA에 결합합니다. 이것은 mRNA의 분해로 이어져 그 유전자를 무너뜨립니다.

절차를 시작하기 전에 관심 있는 이중 가닥 RNA를 발현하는 박테리아를 준비해야 합니다. 수천 개의 유전자에 대한 dsRNA 인코딩 플라스미드를 포함하는 박테리아 라이브러리가 상업적으로 이용 가능합니다. 그렇지 않은 경우, 표준 클로닝 기술을 사용하여 타겟 유전자 염기서열을 플라스미드로 클로닝해야 합니다. 플라스미드는 항생제인 암피실린에 대한 내성 유전자를 포함하고 있으며, 이 유전자는 플라스미드를 포함하는 박테리아 콜로니를 선택하는 데 사용할 수 있습니다.

다음으로, 표준 기술을 사용하여 관심 dsRNA를 인코딩하는 플라스미드를 이중 가닥 RNA를 발현하는 대장균 박테리아의 (DE3) 균주로 변환합니다. 또한 빈 플라스미드를 대조군으로 사용하여 박테리아를 변형시킵니다. 중요한 것은 이러한 실험에 사용된 대장균 균주에는 이중 가닥 RNA를 소화할 수 있는 RNA 중합효소 III가 없다는 것입니다. 이 박테리아는 또한 플라스미드의 dsRNA를 전사하는 T7 DNA 중합효소에 대한 IPTG 유도 유전자를 포함하고 있습니다. 마지막으로, 박테리아(DE3)는 테트라사이클린과 카르베니실린에 모두 내성이 있어 RNA 중합효소 III 발현을 유지하고 원치 않는 박테리아 성장을 방지합니다.

형질전환된 HT115(DE3) 박테리아를 12.5 μg/ml 테트라사이클린과 25 μg/ml 카르베니실린을 함유한 LB 한천 플레이트에 퍼뜨립니다. 37시에 하룻밤 부화? C와 다음날 아침 박테리아 집락이 플레이트에 존재합니다. 그런 다음 단일 박테리아 군집을 선택하고 100μg/ml의 암피실린이 함유된 LB 육수 1ml에 첨가하여 플라스미드를 함유한 박테리아를 선택합니다. 37시에 하룻밤 부화? C는 동요와 함께. 하룻밤 배양 후 암피실린 100g/ml가 함유된 LB 육수 5ml를 배양액에 추가하고 37°C에서 추가로 4-6시간 동안 배양합니다.

박테리아가 준비되면 RNAi 웜 플레이트를 먹이로 준비해야 합니다. RNAi 웜 플레이트에는 한천, 물, 카르베니실린, 웜 배지 믹스 및 IPTG가 포함되어 있어 플라스미드에서 dsRNA를 전사하는 박테리아에서 T7 DNA 중합효소를 유도합니다. RNAi 웜 플레이트에 0.5ml의 박테리아 배양을 추가하고 37 ? C, 박테리아 잔디밭 만들기.

RNAi 플레이트에 웜을 추가하기 전에 웜의 발달 단계를 동기화하여 관찰된 표현형 차이가 발달 단계의 인공물이 되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 발달 단계를 동기화하려면 먼저 백금 와이어 픽을 화염 살균합니다.

웜 픽을 사용하여 각 RNAi 플레이트에 L4 웜을 추가하고 20 ? C, 그들이 어린 알을 낳는 성인이 될 수 있도록합니다. 다음으로, 젊은 성인을 새로운 RNAi 플레이트로 옮기고 20세에 6-8시간 동안 배양합니다. C, 알을 낳는 동안. 모든 성충이 제거되면 이 난자는 발달적으로 동기화됩니다. 마지막으로, 분석을 위한 관심 발달 단계에 도달할 때까지 RNAi 플레이트에서 벌레가 자라도록 합니다.

벌레를 시각화하려면 4% 한천 패드로 슬라이드를 준비해야 합니다. 먼저 라벨링 테이프로 2개의 유리 슬라이드를 테이프로 붙여서 한천 패드의 두께를 균일하게 하는 스페이서를 만듭니다. 두 스페이서 사이에 깨끗한 유리 슬라이드를 놓고 슬라이드에 약 150μl의 4% 용융 한천을 피펫으로 주입합니다. 스페이서에 수직인 추가 슬라이드로 용융된 한천을 빠르게 덮습니다. 슬라이드를 부드럽게 분리하면 한천 패드가 슬라이드 중 하나에 부착됩니다.

다음으로, 아지드화나트륨과 같은 마취제 10μl를 한천 패드에 첨가하여 동물을 고정시킵니다. 백금 와이어 픽을 사용하여 마취제를 사용하여 웜을 한천 패드로 옮기고 커버 슬립을 추가합니다. 마지막으로 현미경으로 벌레를 관찰합니다. RNAi 유전자 knockdown을 가진 벌레를 대조군과 비교하고 크기, 발달 단계, 형태, 형광 표지 단백질의 국소화 패턴 및 기타 잠재적 표현형의 차이를 기록하십시오.

RNA 간섭의 가장 가치 있는 응용 분야 중 하나는 역 유전자 스크리닝을 쉽게 수행할 수 있는 능력입니다. 역 유전자 스크리닝(reverse genetic screen)은 알려진 유전자 컬렉션을 knockdown하고 표현형 결과를 평가하여 유전자 기능을 발견하는 접근 방식입니다. 예를 들어, 연구자들은 예쁜꼬마선충 게놈의 거의 모든 유전자에 대해 dsRNA를 발현하는 박테리아 라이브러리를 사용할 수 있습니다. 이러한 박테리아는 다중 웰 플레이트에서 배양되어 기생충에게 공급됩니다. 그런 다음 많은 유전자의 RNAi 녹다운의 표현형 효과를 평가하여 정상적인 생체 내 유전자 기능에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

자동 유전자 스크리닝은 처리량이 매우 높은 역 유전자 스크리닝의 한 유형입니다. 자동화된 유전자 스크리닝에서 전체 예쁜꼬마선충 게놈은 수천 개의 박테리아 클론을 로봇으로 처리하고 정량 분석을 위한 특수 기기를 사용하여 매우 쉽게 녹다운할 수 있습니다.

예를 들어, 항균 펩타이드 유전자 nlp 29에 대한 형질전환 형광 리포터를 발현하는 기생충은 박테리아 공급을 통해 수천 개의 유전자를 RNAi knockdown에 노출시킵니다. 동시에 벌레는 곰팡이 포자에 도입됩니다. 그런 다음 곰팡이에 대한 항균 펩타이드 반응을 평가할 수 있습니다.

C. elegans 발달은 RNAi를 사용하여 자주 연구됩니다. 과학자들은 RNA 간섭을 사용하여 관심 있는 유전자(또는 유전자 집합체)를 제거하고 해당 유전자가 발달 및/또는 발달 타이밍 동안 과정에 어떤 영향을 미치는지 정확히 평가할 수 있습니다. 예를 들어, RNAi 녹다운은 녹다운될 때 발달을 지연시키는 유전자 또는 장기 발달에 관여하는 유전자를 드러낼 수 있습니다.

당신은 방금 C. elegans에서 RNA 간섭에 대한 JOVE의 소개를 보았습니다. RNA 간섭이 어떻게 작용하는지, 그리고 박테리아 먹이를 통해 예쁜꼬마선충에서 RNA 간섭을 사용하는 방법을 검토했습니다. RNA 간섭은 자동화된 고처리량 스크리닝을 포함하여 역 유전자 스크리닝을 위한 유용한 도구이며 발달을 연구하는 데 유용한 도구이기도 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!