예쁜 꼬마 선충에 RNAi의 적용

RNA 간섭, 또는 RNAi는, 이중 좌초 RNA가 유기체에 소개되는 널리 사용되는 기술입니다, 표적 유전자 침묵의 결과로. RNA 간섭의 노벨상 수상 발견은 연구원이 그것의 기능을 결정하기 위하여 어떤 C. elegans 유전자든지 침묵하는 것을 허용했습니다. 우리는 벌레가 먹을 표적 유전자 dsRNA를 표현하는 대장균을 가진 플레이트를 첫째로 준비해서 C. elegans에 있는 RNAi를 유도할 수 있습니다. 이어서, 4번째 애벌레 단계 벌레는 RNAi 플레이트로 옮겨지고 알을 낳을 수 있다. 개발의 바람직한 단계에서 자손은 수집 및 표현형에 대한 점수.

RNAi 기술은 C. elegans에서 역유전 적 스크린, 자동화 된 높은 처리량 스크린 및 발달 과정을 연구하는 도구로 자주 사용됩니다. 이 비디오에서는 RNA 간섭의 개념을 설명하고, C. elegans에서 RNAi 기술을 사용하는 방법을 시연하고, 과학자들이 광범위한 생물학적 과정을 더 잘 이해하는 도구로 RNAi를 사용하는 방법에 대해 논의할 것입니다.

먼저 RNA 간섭이 어떻게 작동하는지 보여 드리겠습니다. C. elegans의 경우, 벌레는 침묵하고자하는 유전자에 이중 좌초 RNA 보완 코드 플라스미드로 변형 된 박테리아를 공급한다. 앞서 언급했듯이 C. 엘레간은 변형된 박테리아를 먹일 것입니다. 현재 알려지지 않은 메커니즘을 통해 dsRNA는 일단 섭취한 C. elegans 조직을 입력합니다.

일단 세포 안쪽에, 효소 Dicer는 21와 23 의 뉴클레오티드 사이 짧은 간섭 RNA, 또는 siRNA로 이중 좌초RNA를 갈라놓습니다. 다음으로, 시RNA는 RNA 유도 침묵 복합체와 연관되어 있으며, 이는 "RISC"라고도 하며, 풀려나게 된다. 이어서, siRNA/RISC 복합체는 보완적인 베이스 페어링을 통해 표적 mRNA를 결합한다. 이것은 mRNA의 저하로 이끌어 내고, 그 유전자를 무너뜨리기 위하여 이끌어 냅니다.

시술을 시작하기 전에, 관심의 이중 좌초 RNA를 표현하는 박테리아는 준비될 필요가 있다. 수천 개의 유전자에 대한 dsRNA 인코딩 플라스미드를 포함하는 박테리아의 라이브러리가 시판됩니다. 그렇지 않으면, 표적 유전자 서열은 표준 복제 기술을 사용하여 플라스미드로 복제될 필요가 있다. 플라스미드는 플라스미드를 함유한 세균성 식민지를 선택하는 데 사용될 수 있는 항생제 암피실린에 대한 내성을 위한 유전자를 함유하고 있다.

다음으로, 표준 기법을 사용하여 관심 있는 dsRNA를 이중 좌초 RNA를 발현하는 대장균 균의 (DE3) 균주로 변환합니다. 또한 빈 플라스미드로 박테리아를 대조군으로 변형시킵니다. 중요한 것은, 이러한 실험에 사용된 대장균의 균주는 RNA 폴리머라제 III가 부족하여 이중 좌초 RNA를 소화할 수 있다. 이 박테리아는 또한 플라스미드에 있는 dsRNA를 전사하는 T7 DNA 폴리머라제를 위한 IPTG 유도유전자를 포함합니다. 마지막으로, 박테리아(DE3)는 테트라사이클린과 카베니실린내성, RNA 폴리머라제 III 발현을 유지하고 원치 않는 세균성 성장을 방지한다.

12.5 μg/ml 테트라사이클린과 25 μg/ml 카베니실린을 함유한 LB 천막 판에 변형된 HT115(DE3) 박테리아를 확산시킨다. 37°C에서 하룻밤 동안 배양하고 다음날 아침 세균 성 식민지가 접시에 존재합니다. 이어서, 단일 박테리아 콜로니를 선택하고, 플라스미드를 함유한 박테리아를 선택하기 위해 100 μg/ml의 암피실린을 함유한 LB 국물 1ml에 첨가한다. 교반과 함께 37 °C에서 하룻밤 을 배양하십시오. 하룻밤 동안 인큐베이션 후, 배양에 100 μg/ml의 암피실린을 함유한 LB 국물 5ml를 첨가하고 37°C에서 4-6시간 동안 추가로 배양한다.

박테리아가 준비되면 RNAi 웜 플레이트는 먹이를 준비해야합니다. RNAi 웜 플레이트는 포함: 천, 물, 카베니실린, 웜 중간 믹스, 및 IPTG는 플라스미드에서 dsRNA를 전사하는 박테리아에서 T7 DNA 폴리머라아제를 유도한다. RNAi 웜 플레이트에 박테리아 배양 0.5 ml를 추가하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하여 박테리아 잔디를 만듭니다.

RNAi 플레이트에 웜을 추가하기 전에, 표현형의 관찰된 차이가 발달 단계의 유물이 되도록 웜의 발달 단계를 동기화하는 것이 중요하다. 개발 단계를 동기화하기 위해 먼저 백금 와이어 픽을 화염 살균합니다.

각 RNAi 플레이트에 L4 웜을 추가하고 20 °C에서 하룻밤 배양하여 젊은 계란 누워 성인이 될 수 있도록 웜 픽을 사용합니다. 다음으로, 젊은 성인을 새로운 RNAi 플레이트로 옮기고 계란이 놓여있는 동안 20 °C에서 6-8 시간 동안 배양하십시오. 모든 성인이 제거되면, 이 계란은 발달 동기화됩니다. 마지막으로, 벌레가 분석을 위한 개발 관심 단계에 도달할 때까지 RNAi 플레이트에서 성장하도록 허용하십시오.

웜을 시각화하려면 슬라이드를 4% 한천 패드로 준비해야 합니다. 첫째, 테이프 2 유리 슬라이드 라벨 테이프, 천지 패드의 균일 한 두께를 보장 하는 스페이서를 만드는. 두 스페이서와 파이프 사이에 깨끗한 유리 슬라이드를 놓고 약 150 μl의 4% 용융 된 한고를 슬라이드에 놓습니다. 용융 된 한고를 스페이서에 수직으로 추가 슬라이드로 빠르게 덮습니다. 슬라이드를 부드럽게 분리하면 한천 패드가 슬라이드 중 하나에 부착됩니다.

다음으로, 동물을 고정시키기 위해 한천 패드에 아지드 나트륨과 같은 마취제의 10 μl을 추가합니다. 플래티넘 와이어 픽을 사용하여 벌레를 마취제를 사용하여 한천 패드로 옮기고 커버 슬립을 추가합니다. 마지막으로, 현미경으로 벌레를 관찰하십시오. RNAi 유전자 녹다운을 대조군과 비교하고 크기, 발달 단계, 형태학, 형광태그 단백질의 국소화 패턴 및 기타 잠재적 표현형의 차이를 주목하십시오.

RNA 간섭의 가장 귀중한 응용 프로그램 중 하나는 쉽게 역 유전 스크린을 수행하는 기능입니다. 역 유전 화면은 유전자의 알려진 컬렉션을 쓰러 뜨리고 현상 결과를 평가하여 유전자 기능을 발견하는 접근 방식입니다. 예를 들면, 연구원은 C. elegans 게놈에 있는 거의 모든 유전자를 위해 dsRNA를 표현하는 박테리아의 라이브러리를 사용할 수 있습니다. 이 박테리아는 다중 우물 접시에 배양하고 벌레에게 공급됩니다. 그런 다음, 많은 유전자의 RNAi 녹다운의 현상 효과는 생체 내 유전자 기능에 있는 정상으로 통찰력을 주는 평가될 수 있습니다.

자동화 된 유전 화면은 매우 높은 처리량인 역 유전 화면의 유형입니다. 자동화 된 유전 화면에서, 전체 C. elegans 게놈은 세균 클론의 수천의 로봇 처리를 사용하여, 정량 분석을 위한 특수 한 계기를 사용하여 아주 쉽게 아래로 무너질 수 있습니다.

예를 들어, 항균 펩티드 유전자 nlp 29에 대한 형광 기자를 발현하는 웜은 세균성 수유를 통해 수천 개의 유전자의 RNAi 녹다운의 대상이 된다. 동시에 웜은 곰팡이 포자에 도입됩니다. 이어서, 곰팡이에 대한 항균 펩티드 반응을 평가할 수 있다.

C. elegans 발달은 RNAi를 사용하여 자주 공부됩니다. 과학자들은 RNA 간섭을 사용하여 관심있는 유전자 (또는 유전자 수집)를 무너뜨리고 유전자가 개발 및 / 또는 발달 타이밍 동안 프로세스에 미치는 영향을 정확하게 평가 할 수 있습니다. 예를 들면, RNAi 녹다운은 쓰러질 때 발달을 연기하는 유전자, 또는 기관 발달에 관련되었던 유전자를 드러낼 수 있습니다.

당신은 방금 C. elegans에서 RNA 간섭에 대한 JOVE의 소개를 보았습니다. 우리는 RNA 간섭이 어떻게 작동하는지 및 세균성 공급을 통해 C. elegans에 있는 RNA 간섭을 사용하는 방법을 검토했습니다. RNA 간섭은 자동화된 높은 처리량 스크린을 포함하여 역 유전 스크린을 위한 귀중한 공구이고, 또한 발달을 공부하기 위한 유용한 공구입니다. 시청해 주셔서 감사합니다!