쥐의 운동 능력과 심장 적응에 화학적으로 유도 된 난소 실패의 영향을 연구하는 방법

이 실험 절차의 전반적인 목적은 난소 내 난포 폐쇄의 자연적인 과정을 가속화하여 난소 부전, 에스트로겐 고갈 및 비주기성 암컷 상태를 유도하는 것이며, 이는 폐경과 매우 유사한 상태입니다. 이는 먼저 15~20일 동안 연속적으로 vinyl cycline dioxide 또는 VCD라는 산업용 화학 물질을 투여함으로써 달성됩니다. VCD는 소형 일차 난포와 원시 난포의 자연적인 폐쇄 과정을 가속화하여 이들을 특이적으로 표적하고 파괴하는 것으로 알려져 있습니다. 두 번째 단계는 VCD 주사 시작 후 약 6주부터 질 세포학 검사를 통해 에스트러스 주기 및 난소 주기성을 확인하는 것입니다.

폐경 및 난소 부전을 확인하기 위해 질 세포학 검사를 통해 15~20일 동안 지속적인 발정기(dste) 또는 비주기성 상태가 관찰되어야 합니다. 마지막 단계는 자발적 케이지 휠 운동 및 심장 적응과 같이 폐경 또는 폐경 이행기에 영향을 받을 수 있는 중재를 시행하는 것입니다. 궁극적으로, 자발적 케이지 휠 활동과 심장 적응을 통해 폐경이 케이지 휠 활동을 감소시키는지 확인합니다.

기존의 절제술(ectomy)과 같은 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 절제술의 경우 수술적 절차로 인해 에스트로겐이 갑작스럽게 고갈되는 반면, 본 기술은 폐경 전에서 폐경 후로 이행되는 과정에서 발생하는 자연스럽고 점진적인 에스트로겐 감소를 모사한다는 점입니다. 폐경 후 여성은 폐경 전 여성에 비해 대사 증후군 및 이와 관련된 심혈관 질환을 포함한 동반 질환에 특히 더 취약하기 때문에, 이 기술의 함의는 폐경 후 여성의 대사 및 심혈관 질환 치료로 확장됩니다. 적절한 도말 기술을 수행하고 EST 주기를 식별하는 데 세심한 주의가 필요하여 질 세포학 단계의 습득이 어렵기 때문에, 본 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다.

넷째, vinyl cycline dioxide(VCD)는 -20 °C에서 보관합니다. 주입 프로토콜을 위해 VCD를 준비하려면, 깨끗한 투여용 바이알에 VCD 0.587 mL를 넣고 참기름으로 최종 부피를 10 mL가 되게 맞춘 후 파라필름으로 밀봉하고 부드럽게 뒤집어 섞습니다. 4 °C에서 최대 7일 동안 보관하십시오.

VCD 주입 프로토콜을 시작하려면, 생후 2개월 된 마우스 두 마리의 체중을 20일 연속으로 측정하고, 주입 기간 동안 27 gauge 바늘을 사용하여 실온 상태의 VCD를 160 milligrams per kilogram의 용량으로 매일 복강 내 주입하십시오. 국소 감염의 가능성을 줄이기 위해 주입 부위를 교대로 선택하십시오. 주입 기간이 완료되면 대조군 마우스에게는 vehicle 용액인 참기름을 2.5 milliliters per kilogram의 부피로 주입하십시오.

질 도말을 통해 매일 발정 주기를 모니터링하십시오. 본 연구의 성공을 위한 핵심 요소 중 하나는 세포학적 판정을 위해 고품질의 질 도말 표본을 얻는 것입니다. 등 피부를 잡는 스크러프법(dorsum scruff method)을 사용하여 마우스를 보정하십시오.

0.2 milliliters의 멸균 식염수가 담긴 점안기를 질 입구에 0.5 centimeters 깊이로 삽입합니다. 점안기를 이용해 주입된 식염수를 세 번 혼합한 후, 빈 슬라이드 글라스에 한 방울 떨어뜨립니다. 즉시 표준 광학 현미경을 사용하여 100 x 배율로 각 샘플을 현미경 관찰하여 난소 부전을 확인합니다.

그 후, VCD로 폐경을 유도한 마우스들을 운동 실험에 사용합니다. 케이지 휠 장치는 직경 11.5 centimeter, 러닝 표면 너비 5 centimeter의 휠로 구성되어 있으며, 휠 회전에 의해 작동하는 디지털 자기 카운터가 장착되어 있습니다. 각 휠 러닝을 시작하기 전, 제조사의 지침에 따라 케이지 휠을 테스트 및 교정하십시오.

러닝 휠의 내경을 측정하십시오. 둘레를 계산하여 이 값을 디지털 카운터의 휠 크기로 입력하십시오. 휠을 케이지에 장착하려면, 휠 스탠드를 동물 케이지의 상단 와이어 사이로 밀어 넣으십시오.

바인더 클립을 사용하여 휠 스탠드를 케이지 와이어에 고정합니다. 클립은 동물과 떨어진 와이어 상단에 위치해야 합니다. 컴퓨터 연결 부위와 여분의 케이블은 케이지 와이어 사이로 통과시켜 배치합니다.

컴퓨터와 여분의 케이블을 동물이 닿지 않는 곳에 둡니다. 케이지 배선 위에 중간 크기의 플라스틱 칭량 접시를 올려두어 컴퓨터와 여분의 케이블을 고정함으로써 이를 수행할 수 있습니다. 다음으로, 디지털 자기 카운터의 컴퓨터 부분을 휠 스탠드에 부착합니다.

덕트 테이프를 사용하여 디지털 자기 카운터의 유동 자석을 컴퓨터로 연결되는 자석 케이블과 동일한 쪽의 중앙 바에 부착합니다. 이때 자석이 씹힘 손상을 입지 않도록 충분히 테이핑하십시오. 자석은 휠의 각 회전이 간섭이나 저항 없이 기록되어 휠 회전이 완전히 이루어질 수 있는 위치에 배치되어야 합니다.

러닝 휠을 휠에 부착합니다. 휠 스탠드 포스트를 휠 중앙 바의 장착 구멍에 삽입하여 세웁니다. 휠이 자유롭게 회전할 수 있는지 확인하십시오.

장치는 갉아먹음으로 인한 손상 여부를 매일 모니터링하고, 실험에 필요한 경우 적절히 수리해야 합니다. 7개월령의 근교계 C 57, black six 및 B six C3 F1 암컷 마우스를 동일한 리터에서 무작위로 선정하여 운동군 또는 좌식 대조군에 배정합니다. 실험 동물은 47 x 26 x 14.5 cm 크기의 케이지에 개별적으로 수용하며, 28일 동안 케이지 휠에 자유롭게 접근할 수 있도록 합니다. 대조군 동물은 휠이 없는 케이지에 함께 수용합니다.

모든 동물에게 물과 표준 고형 설치류 사료를 제공합니다. 리도를 수동으로 추가하고, 마그네틱 카운터에 표시된 주행 거리와 총 주행 시간의 일일 수치를 기록합니다. 28일간의 운동 기간 동안 정확하고 일관된 값을 얻기 위해 매일 동일한 1시간 시간대 내에서 거리와 시간 값을 기록하십시오. 매일 기록을 마친 후에는 다음 날의 정확한 측정을 위해 마그네틱 카운터를 초기화합니다.

특정 운동 기간이 종료되면, 조직 수확 전 안락사시킨 동물의 체중을 기록합니다. 심장을 적출하려면 복측에 정중 절개를 가하고 횡격막을 열어 신속하게 심장을 확인합니다. 심장 기저부를 절제하여 차가운 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline)에 넣어 심실 내 잔류 혈액을 충분히 세척합니다. 심장의 과잉 조직을 제거하고 전체 심장의 무게를 측정한 후, 필요에 따라 액체 질소에 급속 냉동합니다.

추가 적출 조직을 수집하여 변형된 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수로 세척한 후, 액체 질소로 냉각된 isopentane에서 급속 동결시킵니다. 본 연구에서 난소 부전은 VCD 처리에 의해 유도되었으며, 질 도말의 현미경 검사를 통해 확인되었습니다. 발정 주기 단계는 상피 세포, 정량화된 상피 세포 및 백혈구의 비율로 결정하며, PROEs에서는 유핵 상피 세포가 우세하게 나타납니다.

여기서 화살표는 유핵 세포를 나타내며, 발정기(estro) 동안의 세포는 주로 무핵 편평상피세포로 정량화됩니다. 메스트루스(Maestros)는 백혈구가 우세한 다양한 세포 유형의 혼합으로 특징지어집니다. 디아스트루스(Diastrous)는 백혈구가 지배적입니다.

VCD 투여 전 마우스의 에스트러스 주기(estro cycle)는 보통 4일간 지속됩니다. 15일 동안 지속적인 발정휴지기(diastrous) 상태가 유지된 동물은 무주기(acyclic)로 간주되었습니다. 이 그림은 대조군(vehicle)과 VCD 투여군의 에스트러스 주기 평균 기간(일)을 보여줍니다.

한 주기는 발정기(ES) 첫날부터 다음 생리 첫날까지로 측정합니다. 질 세포학적 검사는 주사 시작 후 약 6주 뒤 ES 기간에 시작되었습니다. VCD를 주입한 동물의 발정 주기는 대조군(vehicle) 주입 동물에 비해 불규칙해지는 것이 관찰되었으며, 12회의 발정 주기가 지난 후 VCD 주입 프로토콜이 완료되었을 때 모든 VCD 주입 동물의 세포학적 검사 결과에서 더 이상 주기성이 나타나지 않았습니다. 난소 조직 횡단면의 H and e 염색 결과, 대조군에 비해 VCD 처리된 난소 조직에서 유의미한 위축이 확인되었습니다.

20배 및 200배 배율로 관찰했을 때, VCD 처리 조직에서 일차 및 원시 난포의 완전한 고갈이 관찰되었습니다. VCD로 유도된 난소 부전이 운동 성능에 미치는 영향을 테스트하기 위해, 대조군 처리 조직과 대조적으로 두 가지 계통의 7개월 된 VCD 처리 및 대조군 처리 마우스를 사용하였으며, 4주간의 운동 기간 동안 각 운동 동물의 일일 케이지 휠 운동 시간과 거리 값을 기록하였습니다. 이 그림은 거리, 시간 및 속도에 대한 일일 러닝 값의 주간 평균을 보여줍니다.

Vehicle 또는 VCD를 투여한 C 57, black six 마우스의 경우, C 57, black six 또는 B six C3 F1 마우스 계통 모두에서 VCD 투여군과 vehicle 투여군 사이에 일일 평균 주행 거리 및 휠 체류 시간으로 측정한 운동 성능의 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다. 이는 VCD로 유도된 난소 부전이 자발적 케이지 휠 운동에 미치는 영향이 자발적 케이지 운동 프로토콜 기간 이후 최소 두 가지 마우스 계통에서 공통적으로 나타남을 시사합니다. 신체 형태 측정값을 기록하고, 이전 관찰 결과와 일치하게 심장을 신속하게 적출하여 무게를 측정하였습니다.

절대 심장 무게와 경골 길이에 대비한 심장 무게의 정규화 측정을 통해 케이지 휠 운동에 반응하는 심비대가 관찰되었습니다. 비운동군과 비교했을 때 vehicle 투여군과 VCD 투여군의 절대 심장 질량 및 경골 길이 대비 심장 무게 비율이 유의하게 더 높았으나, 대조군과 VCD 유도 난소 부전군 사이의 심비대 정도에는 측정 가능한 차이가 없었습니다. 마지막으로, 자발적 케이지 휠 운동을 마친 VCD 및 vehicle 투여 쥐를 대상으로 강제 트레드밀 러닝을 실시하여 고강도 및 저강도 운동 능력을 모두 측정하였습니다.

고강도 프로토콜에서는 마우스가 탈진 징후를 보일 때까지 10분마다 벨트 속도를 단계적으로 높였습니다. 탈진 전 vehicle 투여군의 평균 최대 속도는 26.7 ± 0.95 meters per minute였으며, VCD 투여군의 평균 최대 속도는 28 ± 1.4 meters per minute였습니다. 지구력 능력을 평가하기 위해 20 meters per minute의 저강도 러닝이 사용되었습니다.

평균적으로, 대조군(vehicle) 처리 쥐의 최대 운동 시간은 탈진 전까지 28.3 ± 1.3분이었으며, VCD 처리 쥐의 최대 운동 시간은 29.7 ± 1.4분이었습니다. 대조군과 VCD 처리군 사이에 고강도 또는 저강도 운동 능력의 유의미한 차이는 발견되지 않았으며, 이는 VCD로 유도된 난소 부전이 쥐의 운동 능력에 영향을 미치지 않았음을 나타냅니다. 개발 이후, 이 기술은 세포, 분자 및 생리 과학 분야의 연구자들이 설치류에서 폐경의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청한 후, 적절한 VCD 주사 방법, 질 세포학 검사 수행 및 생리학적 중재 구현 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.