쥐의 운동 능력과 심장 적응에 화학적으로 유도 된 난소 실패의 영향을 연구하는 방법

두 운동의 패러다임은 운동 능력과 운동 심장 적응에 폐경의 영향을 조사하기 위해 새로 개발 된 화학적으로 유도 된 폐경의 마우스 모델에서 테스트되었다.

이 절차의 전반적인 목표는 난소에서 여포 폐쇄증의 자연적인 과정을 가속화하여 난소 부전, 에스트로겐 고갈 및 폐경기와 밀접하게 유사한 상태인 비순환 여성을 초래하는 것입니다. 이는 먼저 15일에서 20일 연속으로 이산화비닐 사이클린 이산화물(VCD)에 대한 직업 화학 물질을 투여함으로써 달성되며, 이 화학 물질은 자연적인 폐쇄 과정을 가속화하여 작은 1차 및 원시 난포를 특이적으로 표적으로 삼고 파괴하는 것으로 나타났습니다. 두 번째 단계는 VCD 주사 시작 후 약 6주 후에 질 세포학을 통해 ESRA 주기와 난소 주기성을 결정하는 것입니다.

15-20일 동안 지속적인 DSTE 또는 비순환을 질 세포학에서 관찰하여 순환 상실 및 난소 부전을 확인해야 합니다. 마지막 단계는 폐경기 또는 폐경기로의 전환에 의해 영향을 받을 수 있는 자발적 케이지 휠 운동 및 심장 적응과 같은 중재를 구현하는 것입니다. 궁극적으로, 자발적인 케이지 휠 활동과 심장 적응은 폐경이 케이지 휠 활동을 감소시키는지 여부를 보여주는 데 사용됩니다.

절제술과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 절제술이 에스트로겐의 갑작스러운 고갈을 초래하는 수술 절차라는 것인데, 이는 폐경 전에서 폐경 후로의 전환 과정에서 발생하는 에스트로겐의 자연적인 점진적 손실과 다릅니다. 폐경 후 여성은 폐경 전 여성에 비해 대사 증후군 및 심혈관 질환을 포함한 관련 동반 질환에 특히 더 취약하기 때문에 이 기술의 의미는 폐경 후 여성의 대사 및 심혈관 질환 치료로 확장됩니다. 적절한 도말 기술을 실행하고 EST 주기를 식별하기 위해 주의를 기울여야 하기 때문에 질 세포학 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다.

넷, 비닐 사이클린 이산화물 또는 VCD는 섭씨 영하 20도에서 보관됩니다. 주입 프로토콜에 대한 VCD를 준비하려면 깨끗한 투여 바이알에 587 밀리리터의 VCD를 추가하고 최종 부피를 참기름 덮개로 10 밀리리터로 가져오고 파라머로 밀봉하고 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 섭씨 4도에서 최대 7일 동안 보관하십시오.

VCD 주사 프로토콜을 시작하려면 생후 2개월 동안 20일 동안 2마리의 마우스의 무게를 측정하고 주사 기간 동안 27 게이지 바늘을 사용하여 킬로그램당 160밀리그램의 용량으로 실온 VCD의 복강 내 주사를 매일 투여합니다. 비슷한 방식으로 국소 감염 가능성을 줄이기 위해 주사 부위를 번갈아 가며 시도하십시오. 주입 기간이 완료된 후 차량 용액 참기름을 킬로그램당 2.5밀리리터의 부피로 대조군 마우스에 주입합니다.

질 도말 검사를 통해 매일 esra 주기를 모니터링하십시오. 이 연구의 성공에 중요한 요인 중 하나는 세포학적 결정을 위한 고품질 질 도말 검사를 얻는 것입니다. dorsum scruff 방법을 사용하여 마우스를 제지합니다.

0.2ml의 멸균 식염수가 든 점안액을 질 구멍에 0.5cm 깊이까지 삽입합니다. 주입된 식염수를 스포이드와 3회 섞은 다음 빈 슬라이드에 한 방울을 떨어뜨립니다. 난소 부전을 검증하기 위해 100 x 등급의 표준 광학 현미경을 사용하여 각 샘플을 현미경으로 즉시 평가합니다.

이어서, VCD 유도 폐경기 마우스가 운동 실험에 사용된다. 케이지 휠 장치는 휠 회전에 의해 활성화되는 디지털 자기 카운터가 장착된 5cm 너비의 주행 표면이 있는 직경 11.5cm의 휠로 구성됩니다. 각 휠을 작동하기 전에 제조업체의 지침에 따라 케이지 휠을 테스트 보정하십시오.

주행 휠의 내경을 측정합니다. 둘레를 계산하고 이 값을 디지털 카운터에 휠 크기로 입력하여 휠을 케이지에 장착하고 휠을 밉니다. 동물 케이지의 상단 배선을 통해 서십시오.

바인더 클립으로 휠 스탠드를 케이지 배선에 고정합니다. 클립은 동물로부터 떨어진 배선 상단에 있어야 합니다. 케이지의 배선을 통해 컴퓨터 부분과 추가 케이블을 공급합니다.

여분의 케이블을 컴퓨터에 동물의 손이 닿지 않는 곳에 놓으십시오. 이것은 컴퓨터에 여분의 케이블을 고정하기 위해 케이지의 배선 위에 중간 크기의 플라스틱 계량 접시를 놓음으로써 수행할 수 있습니다. 그런 다음 디지털 자기 카운터의 컴퓨터 부분을 휠 스탠드에 부착합니다.

덕트 테이프를 사용하여 디지털 자기 카운터의 자유 자석을 컴퓨터에 대한 자석 케이블과 같은 쪽의 중앙 막대에 부착합니다. 다시 말하지만, 자석을 씹는 손상으로부터 보호할 수 있도록 충분히 테이핑합니다. 자석은 완전한 휠 회전에 대한 간섭이나 저항 없이 휠의 각 회전이 컴퓨터에 기록되도록 배치해야 합니다.

런닝 휠을 휠에 부착합니다. 휠 스탠드 포스트를 휠의 중앙 막대에 있는 장착 구멍에 삽입하여 대기하십시오. 휠이 자유롭게 회전할 수 있는지 확인하십시오.

설정은 씹는 손상에 대해 매일 모니터링하고 실험에 필요한 경우 수리해야 합니다.주어진 깔짚에서 7개월 된 C 57, 검은색 6 및 B 6 C3 F1 암컷 마우스를 운동 요법 또는 좌식 대조군에 무작위로 할당하십시오. 실험 동물은 개별적으로 어떻습니까? 47 x 26 x 14.5cm 크기의 우리에서 28일 동안 케이지 바퀴에 방해받지 않고 접근할 수 있는 통제 동물은 바퀴가 없는 우리에 함께 수용됩니다.

모든 동물에게 물과 표준 단단한 설치류 차우를 제공하십시오. 추가: 리도, 마그네틱 카운터가 제공하는 주행 거리, 총 달리기 시간에 대한 일일 값을 수동으로 기록하고, 운동 기간의 28일 동안 정확하고 일관된 값을 위해 매일 동일한 1시간 범위 내에서 거리 및 시간 값을 기록합니다. 매일 녹음한 후에는 다음 날 정확한 판독값을 보장하기 위해 자기 카운터를 지우십시오.

특정 운동 기간이 끝나면 조직 적출 전에 안락사된 동물의 체중을 기록합니다. 심장을 운동하려면 복부 쪽을 내측으로 절개하고 횡격막을 열고 심장을 빠르게 시각화합니다. 심장 기저부를 절제하고 차가운 인산염 완충 식염수에 넣어 잔여 심실 혈액을 충분히 씻어냅니다.심장의 과도한 조직을 잘라내고 심장 전체의 무게를 잰 다음 원하는 경우 액체 질소에서 급냉합니다.

추가 소비세 조직을 수집하고, 변형된 얼음, 차가운 인산염 완충 식염수로 세척한 다음, 액체 질소로 냉각된 스냅 냉동 및 isop 펜탄으로 세척합니다. 이 연구에서 난소 부전은 VCD 치료에 의해 유발되었으며 질 도말에 대한 현미경 검사로 확인되었습니다. esra 주기의 단계는 상피 세포의 비율에 의해 결정되며, PROE에서 정량화된 상피 세포 및 백혈구가 우세합니다.

여기서 화살표는 estro 세포 중 핵이 형성된 세포가 주로 핵이 없는 정량화된 편평 상피 세포임을 나타냅니다. Maestros는 백혈구가 우세한 세포 유형이 혼합된 것이 특징입니다. Diastrous는 백혈구가 지배합니다.

마우스의 에스트로 주기는 일반적으로 VCD가 주입되기 4일 전에 지속됩니다. 동물들은 15일 동안 지속적인 비참한 행동을 한 후 비순환적인 것으로 간주되었다. 이 그림은 차량 및 VCD 주입 그룹의 가장 추가 주기의 평균 길이(일)를 보여줍니다.

한 주기는 ES의 첫 번째 날부터 다음 기간의 첫 번째 날까지 측정됩니다. ES에서는 주사 시작 후 약 6주 후에 질 세포검사가 시작되었습니다. VCD 주입 동물의 ESTRO 주기가 차량 주입 동물에 비해 불규칙한 것으로 관찰되었으며, 12회의 ESTRO 주기 후 모든 VCD 주입 동물의 세포검사에서 VCD 주입 프로토콜이 완료될 때 더 이상 사이클링을 나타내지 않았으며, 난소 조직 단면의 H 및 e 염색은 대조군에 비해 VCD 처리된 난소 조직에서 상당한 위축을 나타냈습니다.

20배 배율에서 200배율로 볼 때, VCD 처리된 조직에서 원발성 및 원시 여포의 완전한 고갈이 관찰되었습니다. 차량 처리 조직과 대조적으로, VCD로 인한 난소 부전이 운동 성능에 미치는 영향을 7개월 된 VCD에서 테스트했으며 2가지 균주의 차량 처리 마우스에서 일일 케이지 휠 운동 값을 4주 운동 기간 동안 각 운동 동물의 시간과 거리에 대해 기록했습니다. 이 그림은 거리, 시간 및 속도에 대한 일일 달리기 값의 주간 평균을 보여줍니다.

차량 또는 VCD로 치료된 검은색 6개 마우스인 C 57의 경우, C 57, 검은색 6개 또는 B 6개 C3 F1 구강 긴장에서 VCD와 차량 치료 그룹 간의 일일 평균 주행 거리 및 바퀴에서 보낸 시간으로 측정한 운동 성능에서 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다. 이는 VCD에 의한 난소 부전의 영향을 나타냅니다: 자발적 케이지 휠 운동이 자발적 케이지 운동 프로토콜의 기간 후에 적어도 두 개의 구강 긴장을 초월합니다. 신체 형태 측정이 기록되었고 심장을 빠르게 절제하고 이전 관찰과 일치하게 무게를 측정했습니다.

절대 심박수 및 경골 길이로 정규화된 심박수로 측정된 케이지 휠 운동에 대한 반응으로 심장 비대가 관찰되었습니다. 절대 심박 질량 및 경골 길이 대비 심박 중량 비율은 좌식 마우스와 비교할 때 차량 및 VCD 처리 마우스에서 유의하게 더 컸지만, 대조군과 VCD 유발 난소 부전 사이에 심장 비대에서 측정 가능한 차이는 없었습니다. 자발적인 케이지 휠 운동 후 생쥐, 마지막으로, VCD 및 차량 처리 생쥐는 고강도 및 저강도 운동 능력을 모두 결정하기 위해 강제 트레드밀 달리기를 받았습니다.

고강도 프로토콜에서는 마우스가 탈진 징후를 보일 때까지 10분마다 평균 벨트 속도를 단계적으로 높였습니다. 평균적으로, 비히클 처리된 마우스의 최대 속도는 분당 26.7 플러스 마이너스 0.95 미터였고, VCD 처리 마우스의 최대 속도는 탈진 전 분당 28 플러스 마이너스 1.4 미터였다. 분당 20미터로 달리는 저강도는 지구력 능력을 분석하는 데 사용되었습니다.

평균적으로, 비히클 처리된 마우스의 최대 시간은 28.3분 플러스 마이너스 1.3분이었고, VCD 처리된 마우스의 최대 시간은 탈진 전 29.7분 플러스 마이너스 1.4분이었다. 차량과 VCD 투여군 간에 고강도 또는 저강도 운동능력에서 유의한 차이는 발견되지 않았으며, 이는 VCD에 의한 난소부전이 마우스의 운동능력에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 개발 후 이 기술은 세포, 분자 및 생리학 분야의 연구자들이 폐경기와 설치류의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 적절한 VCD 주사를 수행하고, 질 세포학을 실행하고, 생리학적 개입을 구현하는 방법을 잘 이해해야 합니다.