Name: 포유류의 핵 수용체 잔류를 확인하기 위해 효모 두 하이브리드 시스템을 반전하는 리간드 및 / 또는 길항제와 상호 작용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-15T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 배우세요 효모 두 하이브리드 시스템을 활용한 Pregnane X 수용체와 케토코나졸 상호작용 분석 방법입니다. 이 기법은 핵 수용체 잔류를 확인하고 약물 내성 돌연변이를 식별하여 약물 설계에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 미국 국립보건원(NIH) 보조금 CA127231 및 Damon Runyon Foundation Clinical Investigator Award(CI 1502)(S.M)의 지원을 받았습니다. 체코 공화국 Palacky University Olomouc의 Zdenek Dvorak 교수에게 이 기술을 기관에 이식하고 프로토콜의 표준화를 논의하는 데 도움이 되는 통찰력을 제공해 주신 것에 감사드립니다.

1. 효모 벡터에서 PXR 및 SRC-1 융합의 구성
<ol>
	<li>Human PXR LBD(107-434 아미노산) 및 Human SRC-1 full length(1-1401 아미노산)의 PCR 증폭.
	<ol>
		<li>pSG5-hPXR 플라스미드8을 PXR LBD 템플릿으로 사용하고, pCMX-SRC1 플라스미드를 SRC-1 템플릿으로 사용합니다.</li>
		<li>PCR SuperMix, DNA 템플릿 및 프라이머(재료 참조)를 얼음에 보관하여 해동합니다.</li>
		<li>0.25 μg/μl DNA 템플렛 1 μl, 10 mM 프라이머 쌍 각각 2 μl, PCR SuperMix 45 μl를 추가하고 H2O를 추가하여 총 부피를 50 μl로 만듭니다.</li>
		<li>PCR을 94°C에서 2분 동안 1사이클, 94°C에서 30초 동안 20사이클, 55°C에서 30초, 72°C에서 2분 동안 설정한 다음 72°C에서 1사이클로 10분 연장을 설정합니다. 1% 아가로스 겔로 PCR 산물을 확인합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Y2H 벡터로 복제하는 PCR 산물.
	<ol>
		<li>1% 아가로스 겔에서 PCR 산물을 정제합니다. BamHI 및 SalI를 사용하여 PXR, LBD, PCR 및 Y2H 벡터 pSH2-1을 분해합니다. NotΙ 및 SalΙ를 사용하여 SRC-1 PCR 및 Y2H 벡터 pGADNOT을 분해합니다. 이를 위해 DNA 1μg, 10x 반응 완충액 3μl, 제한 효소 1μl, 마지막으로 H2O를 추가하여 총 부피를 30μl로 만듭니다.</li>
		<li>분해 샘플을 37°C 수조에 1시간 동안 넣고 1% 아가로스 젤로 실행하여 분해를 확인합니다.</li>
		<li>1% 아가로스 겔에서 분해 샘플을 정제하고, 분해된 PCR 산물 및 Y2H 벡터를 접합하고, DH5α 수용 세포로 변형합니다.</li>
		<li>콜로니를 선택하고 플라스미드 DNA를 분리합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>BamHI/SalI 분해로 pSH2-1-PXR 플라스미드 DNA를 식별하고, NotI/SalI 분해로 pGADNOT-SRC-1 플라스미드 DNA를 식별합니다. 염기서열분석을 통해 모든 양성 플라스미드 DNA를 확인합니다.</li>
</ol>
2. 효모 2 하이브리드 분석
<ol>
	<li>효모 균주를 5ml YPAD에 접종하고 지속적인 교반(30°C에서 220rpm)으로 밤새 배양합니다. 참고: Saccharomyces cerevisiae 균주는 CTY10-5d(MATa ade2 trp1-901 leu2-3,112 his3-200 ga l4-gal80- URA3::lexA-lacZ)였으며, 이는 lexA 연산자10과 통합된 GAL1-lacZ 유전자를 포함합니다. 케토코나졸에 내성이 있는 생존 가능한 효모 세포를 얻기 위해18-20 아졸 내성의 원인으로 수송체 변형을 일으키지 않는 세포를 얻기 위해 먼저 ERG3 ( erg3Δ )를 삭제한 다음 상동 재조합에 의해 ERG11 ( erg3Δ/erg11Δ) 유전자에 추가 결실을 도입하여 CTY10-5d 효모의 새로운 균주를 얻었습니다. 시공 세부 사항은 이전에 출판된 원고6 에 설명되어 있습니다.</li>
	<li>다음날(아침) 5ml YAPD에 효모(1:20)를 접종하고 배양하여 일정한 교반(30°C에서 220rpm)으로 OD600 ~0.2를 얻습니다.</li>
	<li>마이크로 원심분리기에서 2,000rpm으로 세포를 2분 동안 펠렛화하고 상등액을 버립니다. 그런 다음 펠릿을 오토클레이브 물로 두 번 세척하고 0.1M LiAc로 한 번 세척합니다.</li>
	<li>최종 세척 후, 상등액을 버리고 세포 펠렛에 다음 시약을 첨가하십시오 : 240 μl PEG 3500 50 % w / v, 36 μl 1 M LiAc, 50 μl 2 mg / ml 삶은 연어 정액 ssDNA, H2O 34 μl. 와류를 혼합하려면 1 μg pSH-PXR 및 1 μg pGADNOT-SRC-1 DNA를 첨가하고 혼합하십시오.</li>
	<li>혼합물을 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮기고, 변형을 교반하고, 30분 동안 혼합(30°C에서 220rpm)합니다. 튜브를 42°C 수조로 옮기고 추가로 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>튜브를 2,000rpm에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 고압증기멸균된 물로 펠릿을 한 번 씻으십시오.</li>
	<li>100 μl의 멸균수를 튜브에 피펫팅하고, 부드러운 손가락 두드리기와 피펫팅으로 세포를 다시 현탁시킨 다음, -His/-Leu Dropout Medium(1리터 -His/-Leu Dropout Medium당 제형: 20 g 포도당, 1.7 g YNB, 0.67 g CSM-His/-Leu, 5 g 황산암모늄, 1.5% 한천) 플레이트에 플레이트를 삽입하고 3-4일 동안 30°C에서 배양하여 형질전환체를 분리합니다.</li>
</ol>
3. X-gal 필터 어세이
<ol>
	<li>니트로셀룰로오스 멤브레인을 페트리 접시 부분 크기로 자릅니다. 방향을 표시하기 위해 니트로셀룰로오스 멤브레인에 레이블을 붙입니다.</li>
	<li>효모 군집에 미리 표시된 니트로셀룰로오스 멤브레인을 놓고 멤브레인이 플레이트 매체의 표면과 접촉하는지 확인합니다.</li>
	<li>멤브레인을 제거하고 3mm 여과지 위에 콜로니 면이 위로 향하게 놓고 멤브레인과 여과지를 -80°C에서 15분 동안 놓습니다.</li>
	<li>X-gal 솔루션을 만드십시오. 50 μl 20 mg/ml X-gal 및 15 μl β-메르캅토에탄올을 5 ml의 Z-버퍼에 추가합니다(1 L 버퍼는 16.1 g Na2HPO47H2O, 5.5 g NaH2PO4 H2O, 0.75 g KCl , 0.25 g MgSO4•7H2O 포함). Z Buffer를 4°C로 유지한 경우 이 시약을 추가하기 전에 실온에 두십시오.</li>
	<li>페트리 접시에 3mm 여과지 두 원을 놓고 5ml X-gal 용액을 담근다. 페트리 접시에서 여분의 완충액을 배출하고 콜로니 면이 위로 향하도록 니트로셀룰로오스 멤브레인을 놓습니다.</li>
	<li>뚜껑을 닫고 멤브레인이 여과지와 완전히 접촉하고 완전히 젖었는지 확인하십시오. 페트리 접시를 호일로 싸서 37°C에서 30분에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
</ol>
4. 액체 β-gal 분석
<ol>
	<li>-His/-Leu Dropout 액체 매체에서 효모를 OD600 0.7로 성장시킵니다.</li>
	<li>배지 1ml를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 3,000rpm에서 2분 동안 원심분리기를 사용합니다. 상층액을 버립니다.</li>
	<li>Z 버퍼 1ml를 추가하여 펠릿을 재현탁시키고 3,000rpm에서 다시 2분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버립니다.</li>
	<li>150μl의 Z Buffer와 2ME를 추가하여 세포 펠릿을 재현탁시키고 50μl 클로로포름과 20μl 0.1% SDS를 혼합한 다음 추가합니다. 15초 동안 샘플을 격렬하게 소용돌이칩니다.</li>
	<li>700μl의 ONPG 용액(Z 버퍼에 1mg/ml)을 추가합니다. 타이머를 설정하고 노란색이 발달할 수 있도록 충분히 오래 30°C에서 배양하고 총 반응 시간을 기록합니다.</li>
	<li>500 μl의 1 M Na2CO3 를 첨가하여 반응을 중지하고 420 nm에서 흡광도를 측정합니다. 블랭크는 700 μl ONPG 용액과 500 μl 1 M Na2CO3 입니다.</li>
</ol>
밀러 단위 계산: 밀러 단위 = (Å420*1,000)/(Å600*min*ml)
Å420 : 420 나노 미터의 흡광도 단위; Å600 : 600 나노 미터의 흡광도 단위; min: 반응 시간(분)입니다. ml: 반응 부피(ml)

<ol><li>Kliewer, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orphan+nuclear+receptor+activated+by+pregnanes+defines+a+novel+steroid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway.</a> Cell. 92 (1), 73-82 (1998).</li>
<li>Blumberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+steroid+and+xenobiotic-sensing+nuclear+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor.</a> Genes Dev. 12 (20), 3195-3205 (1998).</li>
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<li>Pondugula, S. R., Mani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnane+xenobiotic+receptor+in+cancer+pathogenesis+and+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Pregnane xenobiotic receptor in cancer pathogenesis and therapeutic response.</a> Cancer Lett. 328 (1), 1-9 (2013).</li>
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</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

수정된 Y2H 분석에서 PXR6에서 케토코나졸 상호작용에 대한 중요한 잔기를 확인했습니다. SRC-1은 공동활동제이기 때문에(그리고 pGADNot 벡터에 복제되었음), 우리는 또한 SRC-1이 pSH 벡터 시스템에 복제될 때 lacZ 발현을 활성화할 수 있는지 여부와 이것이 활성화 프로파일을 변경하거나 효모 2-하이브리드 분석의 누출에 영향을 미치는지 여부를 테스트했습니다. 재설계된 플라스미드를 사용하여 erg3Δ/erg11Δ 효모에서 2가지 하이브리드 분석을 수행했습니다. 이전과 마찬가지로, 우리는 lacZ 발현(파란색 콜로니)이 PXR 및 SRC-1로 형질전환된 erg3Δ/erg11Δ 효모 균주에서도 유도된다는 것을 보여줍니다. 그러나 빈 벡터, PXR 또는 SRC-1로 개별적으로 형질전환된 효모에서 LacZ 발현(백색 콜로니)의 유도는 없습니다(데이터는 표시되지 않음). 우리의 접근법은 기존의 구조 생물학 및/또는 단백질체 접근법에 순응할 ...

효모 2-하이브리드(Y2H) 분석은 단백질-단백질 상호 작용을 발견하는 데 널리 사용되며 최근에는 단백질-단백질 상호 작용 복합체 7, 8, 9, 10, 11을 방해하는 새로운 소분자를 발견하는 데 널리 사용됩니다. 그러나, 약물 발견 또는 "히트"에 사용되는 이 분석법의 기존 접근법은 단백질-단백질 표면 내에서 화학 화합물의 알로스테릭 상호 작용 잔류물을 검출할 수 없으며, 이는 변경될 때 여전히 상호 작용하고 변경된 잔기(11)에 대한 조사를 허용합니다. 실제로, 이러한 방법을 개발할 수 있다면 단백질-단백질 상호 작용 중단에 중요한 알로스테릭 상호 작용 잔류물의 높은 처리량 평가를 위한 다루기 쉬운 효모 시스템을 가능하게 할 것입니다. 신약 개발의 맥락에서 화합물과 단백질의 상호 작용을 확립하는 가장 직접적인 방법은 구조적 결정(예: 단백질 억제제 복합체의 결정화)을 포함합니다. 이러한 방법은 번거롭고 정교한 리소스를 사용하며 모든 단백질에 대해 구조 연구를 수행하는 것은 기술적으로 실현 가능하지 않습니다.
다루기 쉬운 유전 약물 스크리닝 시스템은 박테리아1, 2 및 포유류의 2 하이브리드와 같은 다른 모델 시스템에서 확립되었습니다. 그러나 이러한 시스템은 최적화가 필요하며 Y2H와 같은 대체 시스템은 여전히 신약 개발에서 가장 많이 테스트되었습니다. 단수 방법(13)을 사용하는 상호작용의 낮은 민감도 및 신뢰성을 포함하는 제한 사항이 있지만, 단일 Y2H 분석은 상호 작용 잔류물에 관한 특정 질문에 답하기 위해 수정될 수 있습니다. 핵 수용체 연구 분야에서, Y2H는 상호 작용하는 단백질을 정의하는 데 사용되었지만(14), 이러한 단백질 상호 작용은 리간드/길항제가 핵 수용체-단백질 복합체와 상호 작용하는 특성을 정의하는 데 거의 사용되지 않았습니다. 따라서 우리 실험실은 특히 단백질체학 기반 방법에 쉽게 순응할 수 없는 수용체 단백질에 대한 방법을 정의하는 데 노력을 집중했으며, 이는 역 Y2H 기반 발견 플랫폼을 사용하여 새로운 리간드/길항제 상호 작용 잔기를 발굴할 것입니다.
케토코나졸이 PXR과 그 활성제 SRC-1을 파괴한다는 이전 발견을 바탕으로 PXR6에서 케토코나졸 상호 작용 잔기를 정의하고 조사할 수 있는 새로운 역 Y2H 시스템을 개발했습니다. 우리의 방법은 DNA 결합 및 전사 활성화를 담당하는 분리 가능한 도메인으로 구성된 효모 GAL4 단백질의 특성을 기반으로 합니다. PXR LBD 단백질은 LexA DNA 결합 도메인(DNA-BD)에 대한 융합으로 발현되는 반면, 전장 공동 활성화제 SRC-1(스테로이드 수용체 공동 활성제 1) 단백질은 GAL4 활성화 도메인(AD)에 대한 융합으로 발현됩니다. PXR과 SRC-1 융합 단백질 간의 상호 작용은 효모 게놈에 통합된 리포터 유전자 β-LacZ를 포함하는 GAL4 결합 부위의 전사 활성화로 이어집니다. PXR 길항제인 케토코나졸은 PXR과 SRC-1의 상호작용을 방해하며, 15, 16, 17 X-gal 활성을 위해 필터에 콜로니를 염색한 후 케토코나졸의 유무에 따라 PXR과 SRC-1의 상호작용을 감지할 수 있습니다. Y2H의 원리는 그림 1에 나와 있으며 실험 절차는 그림 2에 요약되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>효모 균주 CTY10-5d erg3&Delta;/erg11&Delta;</td><td>우리 연구실</td><td></td><td>CTY10-5d 효모는 ERG3 및 ERG11 (erg3&Delta;/erg11&Delta;) 유전자6 .</td></tr><tr><td>YPD 성장 매체</td><td>BD Biosciences</td><td>630409</td><td></td></tr><tr><td>Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) w/o 아미노산 및 황산암모늄</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>CSM-His/-Leu Complete Supplement Mixture</td><td>MP Biomedicals</td><td>4250-412</td><td></td></tr><tr><td>ONPG (o-니트로페닐 &베타;-D-갈락토피라노시드).</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth (LB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Fisher</td><td>BP-1615</td><td></td></tr><tr><td>초음파 연어 정자 DNA 삶은 (10 mg/ml)</td><td>Life Technology</td><td>156-017</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>아크로스 유기물</td><td>61177</td><td></td></tr><tr><td>케토코나졸</td><td>시그마-알드리치</td><td>K1003</td><td></td></tr><tr><td>N,N-디메틸포름아미드</td><td>아크로스 유기물</td><td>326871000</td><td></td></tr><tr><td>리튬 아세테이</td>트 <td>시그마-알드리치</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>50% PEG-3350 용액, 필터 멸균</td><td>시그마-알드리치</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 멤브레인</td><td>Whatman</td><td>10402091</td><td></td></tr><tr><td>10cm 페트리 접시</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'</td> <td>우리 연구소</td><td></td><td>PXR LBD 포워드 프라이머 pSH2-1</td></tr><tr><td>5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'</td> <td>우리 연구소</td><td></td><td>PXR LBD 리버스 프라이머 for pSH2-1</td></tr><tr><td>5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGGGACAGTTCATCC -3'</td> <td>우리 연구소</td><td></td><td>SRC-1 포워드 프라이머 pGADNOT</td></tr><tr><td>5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'</td> <td>우리 실험실</td><td></td><td>SRC-1 리버스 프라이머 pGADNOT</td></tr><tr><td>플래티넘 PCR 슈퍼믹스</td><td>Invitrogen</td><td>11306-016</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>우리 실험실</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>우리 실험실</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>우리 실험실</td><td>R0189</td><td></td></tr></tbody></table>

포유류의 핵 수용체 잔류를 확인하기 위해 효모 두 하이브리드 시스템을 반전하는 리간드 및 / 또는 길항제와 상호 작용

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

약물 대사 및 염증의 중요한 조절 제로, Pregnane X 수용체 (PXR)는, 대사 및 염증 (예, 간 지방증) 1,2 연결 질병 병태 생리에서 중요한 역할을한다. PXR에 대한 효능 리간드의 식별에 많은 진전이 있었다, 그러나, 마약과 같은 길항제 및 PXR 3,4,5 그들의 결합 부위의 제한에 대한 설명이 있습니다. 중요한 장벽을 효율적으로 PXR는 1998 년에 복제 및 특징되었다는 사실에도 불구하고 길항제와 구조 연구에 대한 전체 길이의 단백질을 정화하는 무능력이다. 우리 연구소는 PXR 6 잔류 물을 결합, 길항제, 케토코나졸의를 정의하는 기반으로 소설 높은 처리량 효모 두 하이브리드 분석을 개발했다. 우리의 방법은 케토코나졸과 상호 작용 할 것으로 예상 PXR의 AF-2면에 하나의 돌연변이의 효과를 구출 할 돌연변이 라이브러리를 만드는 작업이 포함됩니다. 구조 또는 &quot;기능 획득&quot;세코ND 돌연변이 PXR에 케토코나졸의 유전 적 상호 작용과 표면 잔기 (들)에 관한 결론이 실현 가능하도록 만들어 질 수있다. 따라서, 우리는 그것의 보조 활성화, SRC-1과 상호 작용 PXR 돌연변이의 높은 처리량을 두 하이브리드 효모 화면을 개발했다. 효모는 항진균제, 케토코나졸의 연구를 수용하기 위해 수정 된이 방식을 사용하여, 우리는 케토코나졸에 바인딩 할 수 없습니다 클론 풍부한 PXR의 특정 변이를 설명 할 수 있습니다. 반대 논리에 의해, 우리는 원래의 잔류 케토코나졸과의 직접적인 상호 작용 잔류 있다는 결론을 내린다. 이 분석은 소설, 핵 수용체 길항제 표면에 결합 부위에 대한 화면으로 다루기 쉬운 유전자 분석을 나타냅니다. 이 분석은 효모뿐만 아니라 표준 구조 생물학 또는 단백체 기반 방법을 사용하여 연구 할 수없는 세포 단백질 (들)에 관계없이 세포 독성 가능성의 약물에 적용 할 수 있습니다. 잠재적 인 함정은 데이터의 해석 (보완적인 방법으로 유용), 신뢰성을 포함단일 Y2H 방법, 효모 처리 또는 효모 두 하이브리드 분석을 수행하는 전문 지식 및 분석 최적화에 ANCE.

PXR과 스테로이드 수용체 공동활성제-1(SRC-1)의 결합을 비색법으로 검출할 수 있는지 확인하기 위해 분석을 수행하였습니다. 효모는 스테롤 생산량이 상당하므로, 추가적인 외인성 리간드 없이도 효모 내 lacZ 발현이 유도될 수 있음이 이전에 밝혀진 바 있습니다. 분석 결과, PXR과 SRC-1이 형질전환된 효모 균주에서 lacZ 발현(청색 콜로니)이 유도되었으나, 공벡터(empty vector)만 또는 PXR이나 SRC-1만 개별적으로 형질전환된 효모에서는 LacZ 발현(백색 콜로니)이 유도되지 않았음을 확인하였습니다(Figure 3). 케토코나졸(25 μM)이 효모 내 PXR과 SRC-1의 상호작용을 방해하는지 판단하기 위해, 케토코나졸이 포함된 복제 플레이트를 니트로셀룰로오스와 X-gal 필터로 적신 후, 리프트(lift) 및 β-갈락토시다아제 액상 분석을 수행하였습니다. 복제 필터의 모든 콜로니가 백색으로 변한 것(이는 액상 효소 분석에서 β-갈락토시다아제 활성이 현저히 감소한 것으로도 확...

케토코나졸은 프레그난 X 수용체(PXR) 활성화에 결합하고 길항합니다. PXR 돌연변이의 효모 고처리량 스크리닝은 케토코나졸 결합을 위한 고유한 영역을 정의합니다. 이 효모 기반 유전 방법은 표면 결합 부위와 관련된 리간드와 새로운 핵 수용체 상호 작용을 발견합니다.

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

본 절차의 전반적인 목표는 Pregnan X 수용체(PXR)와 저분자 억제제인 케토코나졸(ketoconazole) 사이의 상호작용을 밝히는 효모 고처리량 이중 잡종 분석법을 설명하는 것입니다. 이는 먼저 인간 PXR 리간드 결합 도메인을 발현하는 플라스미드와 스테로이드 수용체 공활성제 1(SRC-1)을 발현하는 효모 이중 잡종 플라스미드를 구축함으로써 수행됩니다. 액체 베타-갈락토시다아제 분석을 통해 확인한 결과, 케토코나졸의 존재는 인간 PXR과 SRC-1의 상호작용을 방해합니다.케토코나졸(ketoconazole) 존재 하에 필터 상의 콜로니에 대한 비색 스크리닝과 PXR 돌연변이체의 필터 스크리닝을 병행하면, 해당 약물의 작용에 면역을 갖게 하는 돌연변이를 식별할 수 있으며, 궁극적으로 육안 검사와 액체 베타-갈락토시다제(beta galacto) 분석 결과에 의해 발현 여부를 확인할 수 있습니다. SASE 분석은 케토코나졸 존재 하에서의 PXR 활성화 변화를 보여주는 데 사용되며, 이를 통해 상호작용에 관여하는 원래의 잔기들을 식별할 수 있습니다. 본 연구자는 자신이 소속된 Dr.Manny의 실험실에서 이 방법에 대한 첫 아이디어를 얻었습니다.PXR에 대한 구조 데이터가 불충분한 상황에서, 생화학적 기법만으로는 특히 상호작용 범위가 매우 얕고 쉽게 수정할 수 없는 부위의 식별을 수행하는 데 한계가 있었습니다. 구조적 특성을 규명하기 위해, 키톤 저항성 PXR 돌연변이를 검출하는 원리를 바탕으로, 며칠 이내에 초고속 분석 방식으로 수행 가능하며 다루기 쉬운 산성 조건을 고안하였습니다.이 방법은 수용체 단백질에 대한 소분자의 결합 약물력을 파악하는 데 유용할 뿐만 아니라, 질병에서 병원성 역할을 하는 모든 단백질과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 특히, 소분자 표적 상호작용 물질을 더 잘 이해하고 설계하기 위해 결합 잔기를 조기에 확인하는 구조 생물학적 접근 방식의 한계를 극복하는 데 활용될 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 인간 PXR 리간드 결합 도메인과 전체 길이의 인간 SRC-1을 증폭하는 것으로 시작하십시오. 1% agarose 겔 전기영동을 통해 PCR 생성물을 확인하십시오.다음으로, AROS 겔에서 PCR 산물을 정제합니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 두 종류의 하이브리드 벡터와 PCR 산물을 제한효소로 처리한 후, 소화 샘플을 37 °C 항온수조에서 1시간 동안 반응시킵니다. 1% 아가로스 겔에서 소화된 샘플을 정제한 다음, 소화 및 정제된 PCR 산물과 두 하이브리드 벡터를 결합시키고, 37 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후 DH5α 컴피턴트 셀에 형질전환합니다.콜로니를 선택하고 플라스미드 DNA를 분리한 후, 제한 효소 절단을 통해 벡터와 삽입물의 존재를 확인하고, 시퀀싱을 통해 모든 양성 플라스미드 DNA를 검증합니다. 효모 균주를 5 mL의 YAPD에 접종하고 30 °C에서 220 RPM으로 일정하게 교반하며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 효모를 YAPD 5 mL에 1:20 비율로 접종하고, 일정하게 교반하며 600 nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)가 0.2가 될 때까지 배양합니다.마이크로 원심분리기를 사용하여 2000 RPM에서 2분 동안 세포를 원심분리하여 펠렛을 형성하고 상층액을 제거합니다. 그런 다음 펠렛을 오토클레이브 멸균수로 2회, 0.1 M 리튬 아세테이트(lithium acetate)로 1회 세척합니다. 마지막 세척 후 상층액을 제거하고, 텍스트 프로토콜에 나열된 형질전환 시약을 세포 펠렛에 첨가한 후 볼텍스(vortex)하여 혼합합니다.그 다음, 준비된 PXR 포함 벡터와 SRC 포함 벡터를 넣고 혼합합니다. 다시 형질전환 혼합물을 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브에 피펫으로 옮기고 30분 동안 흔들어 섞어줍니다. 튜브를 42 °C 항온수조로 옮겨 30분 동안 추가로 배양합니다.다음으로, 상층액을 제거한 후 튜브를 2000 RPM에서 2분 동안 원심분리합니다. 멸균수를 100 µL 피펫으로 튜브에 넣어 펠렛을 한 번 세척하고, 가볍게 손가락으로 톡톡 치거나 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다. 그 후, histidine과 leucine이 결핍된 dropout 배지에 세포를 도말하고 30 °C에서 3~4일 동안 배양하여 형질전환체를 분리합니다.Xga 필터 분석을 시작하려면, 페트리 접시의 10 mm 부분에 맞게 니트로셀룰로스 막을 삼각형 모양으로 자릅니다. 방향을 표시하기 위해 니트로셀룰로스 막에 라벨을 붙입니다. 표시해 둔 니트로셀룰로스 막이 플레이트 배지의 표면에 밀착되도록 하여 효모 콜로니 위에 놓습니다.막을 제거합니다. 콜로니 면이 위로 오도록 3 mm 필터 페이퍼 위에 올린 후, 막과 필터 페이퍼를 -80 °C에서 15분 동안 둡니다. 다음으로, 페트리 접시에 3 mm 필터 페이퍼 원형 두 개를 놓고 5 mL의 xal 용액으로 적십니다.페트리 접시에서 과잉 버퍼를 제거하고, 콜로니가 닿은 면이 위를 향하도록 니트로셀룰로스 막을 접시에 놓습니다. 막이 여과지와 완전히 밀착되어 전체적으로 젖어 있는지 확인하며 뚜껑을 닫습니다. 페트리 접시를 호일로 감싸고 37 °C에서 30분 동안 또는 하룻밤 동안 배양하여, 600 nm에서의 광학 밀도가 0.7이 되도록 히스티딘과 류신이 없는 액체 배지에서 효모를 성장시킵니다.1 mL의 배지를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 3000 RPM에서 2분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후, 펠렛에 1 mL의 Z buffer를 가하고 원심분리합니다. 이전과 동일하게, 세포 펠렛을 재부유시키기 위해 tumor capto ethanol이 포함된 150 µL의 Z buffer를 가합니다.그런 다음 50 µL의 클로로포름과 20 µL의 0.1% SDS를 넣고 격렬하게 섞습니다. 샘플을 15초 동안 볼텍싱합니다. 다음으로 700 µL의 ONPG 용액을 넣고, 타이머를 설정한 뒤 노란색이 나타날 때까지 30 °C에서 배양합니다.색이 발색되면 전체 반응 시간을 기록합니다. 반응을 중단시키기 위해 1 M 탄산나트륨 500 µL를 첨가합니다. 그다음 420 nm에서 흡광도를 측정합니다.마지막 단계로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Miller 단위를 계산합니다. 효모는 상당한 수준의 무균 생산(sterile production)을 하므로, 효모에서의 laxy 발현은 추가적인 외인성 리간드 없이도 유도될 수 있습니다. xal lift assay 결과, PXR 및 SRC one이 형질전환된 효모 균주에서 청색 콜로니로 시각화된 laxy 발현이 유도됨을 확인하였습니다.이는 베타-갈락토시다아제(beta-galactoside) 액체 분석에서도 확인됩니다. 하지만 빈 벡터인 PXR 단독 또는 SRC-1 단독으로 형질전환된 효모에서는 락Z(lacZ) 발현의 유도가 나타나지 않습니다. 레플리카 필터의 모든 콜로니가 흰색을 띠었으므로 케토코나졸은 효모 내 PXR과 SRC-1의 상호작용을 방해하며, 이는 액체 효소 분석을 통해 베타-갈락토시다아제 활성이 유의하게 감소한 것으로도 확인되었습니다.P XR 이중 돌연변이체에서 S rrc one을 이용해 효모 형질전환을 수행한 결과, 케토코나졸에 노출된 콜로니가 여전히 laxy 발현을 유지하고 있음이 밝혀졌습니다. 이는 동일한 PXR이 강력한 리간드에 의해 활성화될 수 있지만, 포유류 분석에서는 케토코나졸의 길항 작용에 영향을 받지 않는다는 본 연구실의 이전 연구 결과와 유사합니다. 이 영상을 시청한 후에는 정밀한 하이브리드 AC 수행 방법과 단백질의 소분자 결합 잔기 연구에 필요한 수정 사항에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 절차를 시도할 때 중요한 점은 수용체의 매우 다양한 돌연변이 라이브러리를 확보하고, 각 200개 이상의 변이체에 대해 우수한 형질전환 효율을 달성하며, 약물 처리 여부에 관계없이 필터의 거의 동일한 복제본을 제작하고, 마지막으로 nase 검출을 위해 정확한 시각적 및 화학적 검사를 수행하는 것입니다. 이 절차 이후에는 Ian 200 a Acids 단백질 pro as acids 및 iCal 도킹 상동성 모델과 같은 다른 방법들을 수행하여, 적어도 단백질 인간 세포에 적용 가능한 굴곡이 있는지, 그리고 만약 그렇다면 이러한 잔기들을 약물 표적으로 하는 모델을 만들 수 있는지와 같은 추가적인 질문에 답할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

신화는 모델 유기체 Saccharomyces cerevisiae의 표현 단백질 사이의 과도 안정적인 상호 작용의 민감한 감지 수 있습니다. 그것은 성공적으로 높은 처리량 방법으로 상호 작용하는 파트너를 식별하기 위해 외인성 및 효모 필수 막 단백질 연구에 적용되었습니다.

분할 Ubiquitin 기반 막 효모 두 하이브리드 (신화) 시스템 : 단백질 단백질 상호 작용을 확인을위한 강력한 도구

우리는 기존의 누룩 두 하이브리드 심사, 단백질 상호 작용을 식별하는 효과적인 유전자 도구를 수정했습니다. 이 수정은 현저하게, 과정을 단축 부하를 감소하고, 가장 중요한, 잘못된 반응의 수를 줄일 수 있습니다. 또한,이 방법은 재현성과 신뢰성이다.

성장 팩터 Progranulin와 상호 작용하는 단백질을 식별하기 위해 수정된 효모 - 2 하이브리드 시스템

이 비디오에서는 표적 DNA와 상호 작용하는 여러 단백질을 검출하는 변형된 효모 단일 하이브리드 분석을 시연합니다. 형질전환된 효모 세포는 리포터 유전자의 상류에 있는 표적 DNA 염기서열을 포함합니다. 또한, 그들은 전사 인자 단백질을 발현합니다. 단백질이 복합체를 형성하고 표적 DNA에 결합할 때 리포터 유전자가 발현되고 효소로 검출될 수 있습니다.

이질체 단백질 복합체-DNA 상호작용을 검출하기 위한 Modified Yeast-One 하이브리드 분석

세포 내 저장소에서 Ca2+ 방출을 매개하는 호모-테트라머 이온 채널인 리아노딘 수용체의 올리고머화는 골격근 및 심장 근육 수축에 중요합니다. 여기에서는 단백질 자가 결합을 감지하고 호모올리고머 화학량론을 결정하기 위한 상호 보완적인 in vivo 및 in vitro 방법을 제시합니다.

대한 유전 및 생화학 적 접근<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 단백질 올리고머의 평가 다음 Ryanodine 수용체 사례 연구

세균 이펙터 단백질 성공적인 감염의 확립에 중요하다. 이 프로토콜은 천연 식물 호스트에 세균 이펙터 단백질의 단백질 결합 파트너의 실험 식별을 설명합니다. 효모 두 하이브리드 화면을 통해 이러한 이펙터 상호 작용을 확인하는 분자 병원성 전략을 탈피하는 중요한 도구가되었습니다.

효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다

여기에 설명 된 수정 된 효모 하나 - 하이브리드 분석은 기능적 유전체학 연구를위한 이종 시스템에서 헤테로 머 단백질 복합체 - DNA 상호 작용을 연구하고 검증하기위한 고전적인 효모 1- 하이브리드 (Y1H) 분석법의 확장이다.

이성질체 단백질 복합체 -DNA 상호 작용 연구를위한 수정 된 효모 원 하이브리드 시스템

이 프로토콜을 식별 하 고 계량 수용 체 ligand 상호 작용 하는 데 사용할 수 있는 기자 시스템을 설정 하는 방법을 설명 합니다.

수용 체 Ligand 상호 작용을 공부 하기 위한 BW 기자 시스템

우리는 4 hydroxy tamoxifen 종속 에스트로겐 수용 체 알파 ligand 바인딩 도메인 이합체 화 활동 포유류 2 하이브리드 분석 결과 사용 하 여 분석 하는 방법을 제시.

포유류 2 하이브리드 분석 결과 사용 하 여 에스트로겐 수용 체 알파의 Ligand 바인딩 도메인 이합체 화 활동을 감지

단백질-단백질 상호 작용과 같은 생체 분자의 상호 작용은 생물학적 기능의 분자 기초입니다. 특별히 관련 상호작용이 없는 상호작용 null/손상된 돌연변이를 분리할 수 있다면, 이 상호작용의 기능을 이해하는 데 크게 도움이 될 것입니다. 이 문서에서는 interaction-null/impaired mutant를 격리하는 효율적인 방법을 제시합니다.

Yeast Two-Hybrid Assay를 사용한 상호 작용-null/손상된 돌연변이 분리

단백질 설계에는 아미노산 염기서열의 구축과 기능적 변이체를 만들기 위한 특정 모티프의 통합이 포함됩니다. 이 접근 방식은 항생제 내성 병원체와 싸우기 위한 항균 펩타이드(AMP)의 개발에 매우 중요합니다. 본 논문은 다양한 생물정보학 도구를 이용한 단백질 구축 절차를 제시합니다.

De Novo 및 In Silico 단백질 설계를 위한 I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, HADDOCK 서버 및 HEX loria 적용

배우세요 효모 두 하이브리드 시스템을 활용한 Pregnane X 수용체와 케토코나졸 상호작용 분석 방법입니다. 이 기법은 핵 수용체 잔류를 확인하고 약물 내성 돌연변이를 식별하여 약물 설계에 활용할 수 있습니다.

포유류의 핵 수용체 잔류를 확인하기 위해 효모 두 하이브리드 시스템을 반전하는 리간드 및 / 또는 길항제와 상호 작용

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