Name: 소성을 Glioblastoma의 마우스 모델은 뇌 실질 물리적 제약 조건을 유지하고의 intravital 두 광자 현미경에 적합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-21T15:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 배우세요 마우스 대뇌피질에 교정성 교모세포종 모델을 생성하여 생체 내 이광자 현미경으로 종양 진행을 관찰하는 방법입니다. 두개골 창을 만들고 유리창을 밀봉하여 장기간 고해상도 이미징이 가능합니다.

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저자는 따뜻하게 박사 KK Fenrich 박사 MC 감사합니다. Amoureux, P. 웨버와 도움이 토론 A. JAOUEN; M. Hocine, C. 무니, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, IBDML의 동물 시설 및 기술 지원 IBDML에서 PicSIL 이미징 플랫폼의 직원의 직원. 이 작품은 GR, 직원은 국립 드 라 공들인 (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), 연맹 문화원 국립 뒤 암 (INCA-DGOS-INSERM6038)에서 교부금에 의해 지원 된 연맹에서 장학금으로, FD 라 공들인 쉬르 르 Cerveau (FRC)을 부어 CR에 드 라 공들인 Médicale 및 Cancéropole PACA.

모든 실험 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 프랑스의 법률에 따라 11 월 24 일의 유럽 공동체위원회 지침, 1986 (86/609/EEC)을 준수 하였다. 동물에 대한 연구는 방향 Départementale 데 서비스 Vétérinaires 데 부슈 - 뒤 - 론 (라이센스 D-13-055-21)에 의해 승인 프로방스 코트 다 쥐르 N ° 14 (프로젝트 87-04122012)의 윤리위원회의 승인을 받았다 . 1. 상체 준비 <ol><li> 아가로 오스 코팅 된 배양 접시의 준비 <ol><li> 소 태아 혈청으로 보충되지 세포 배양액 100 ㎖로 아가로 오스 1g을 혼합한다. 전자 레인지 사용 (40 초 850 와트, 다음 3 × 15 초, 각 전자 세션 사이에서 솔루션을 저어) 솔루션을 끓여 완전히 아가 로스를 해소 할 수 있습니다. steri을 확보하기 위해 120 ° C에서 20 분 동안이 1 % 아가로 오스 솔루션을 압력솥. 품 질 참고 : 완전 오토 클레이브 프로토콜 전에 아가로 오스를 해산주의하십시오. 비균질성은 상체의 형성을 손상시킬 수 있습니다. </li><li> 일단 오토 클레이브에서 검색, 100 X 20mm 배양 접시에 1 % 아가로 오스 용액 10 ㎖를 붓는다. 1 % 아가로 오스 용액을 응고시킬 실온에서 페트리 접시에서 20 분을 남긴다. </li><li> 습도를 유지하기 위해, 아가 로스 상기 PBS 10 ㎖를 추가. 증발을 방지하기 위해 파라 필름으로 그들을 포장하여 아가 로스 코팅 된 배양 접시의 뚜껑을 밀봉합니다. 제대로 PBS 층 가습 경우 배양 접시는 4 ° C에서 최대 2 개월 동안 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 회전 타원체 문화 <ol><li> 단일 층으로 권장되는 매체에서 75cm 2 플라스크, 문화에서 신경 교종 세포. </li><li> 신경 교종 세포의 2 차원 단층을 함유하는 플라스크에서 수집 &quot;프리 컨디셔닝 매체」의 1.5 ml의 기준을 1 % 아가 로스 코팅 페트리 접시 중 하나에서 PBS 바꾸기의. </li><li> 신경 교종 세포의 2 차원 단층을 함유하는 플라스크에서 배지를 제거한다. </li><li> 부드럽게 PBS 10 mL로 단일 층을 씻어. </li><li> 트립신 / EDTA 용액의 0.05 %의 2 ML을 추가하고 37 ° C. 주에서 플라스크 4 분 배양 : 배양 시간은 사용 된 세포주에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 세포 현탁액을 세척, 트립신의 활동을 중지하는 문화 매체의 8 ML을 추가 참고 :.이 세포 죽음을 증가로 세포 현탁액에 공기를 세척하지 않도록주의하십시오. </li><li> 멸균 유리 병에 세포 현탁액 6 ㎖를 넣어. </li><li> 800 rpm에서 유리 병 4 분 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 제거하고 부드럽게 배지 3 ㎖의 세포 침전물을 일시 중지합니다. </li><li> 제조 된 아가로 코팅 된 배양 접시에 세포 현탁액을 시드. </li><li> 원하는 직경의 상체가 형성 될 때까지 환자가 2 ~ 3 일 전부터 시작된 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 배양 접시를 넣어. </li></ol></li></oL&gt; 2. 회전 타원체 및 창 주입 <ol><li> 분사 시스템의 제조 <ol><li> 10 분 동안 70 % 에탄올로 초음파 처리하여 깨끗한 유리 모세관 (직경 1 ㎜). 건조까지 인큐베이터 안에 물 이전 배치로 2 회 씻어. </li><li> 작은 주식을 준비하기 위해 피펫 풀러 여러 세정 된 유리 모세관을 당깁니다. </li><li> 일반적으로 300 ~ 350 ㎛, 외부 직경 250 ~ 300 μm의 내부 직경 : 원하는 크기의 경 사진 말단을 얻기 위해 조직 종이에 극한을 긁어서 뽑아 모세관의 끝을 휴식. 이 성형 과정에서 안구 졸업 미라 탑재 macroscope을 이용​​한 모세관의 직경을 제어한다. </li><li> 내경의 모세관의 외경 적합하다 플라스틱 배관의 조각을 사용하여 3 웨이 매니 폴드에 모세관의 비 경 말단을 연결한다. </li><li> 플라스틱 tubin 사용g는, 매니 폴드의 다른 두 가지 방법을 연결 25 μL 마이크로 리터 주사기 및 조직을 호환 미네랄 오일로드 1 ML의 주사기에. </li><li> 마이크로 리터 주사기 1ml의 주사기 사이의 경로를 설정하기 위해 매니 폴드 선택​​을 조정합니다. 제거 마이크로 리터 주사기의 피스톤과는 1 ㎖ 주사기의 피스톤을 눌러 새어까지 마이크로 리터 주사기로 역방향 미네랄 오일을 주입. 을 돌보는 것은 튜브에 공기 방울을 남기지 않도록하는 동안 마이크로 리터 주사기의 피스톤을 교체합니다. </li><li> 모세관은 1 ML의 주사기 사이의 경로를 설정하기 위해 매니 폴드 선택​​을 조정합니다. 튜브에 공기 방울을 남기지 않도록주의하면서 그것이 끝에서 새어까지 미네랄 오일과 모세관을 입력합니다. </li><li> 마이크로 리터 주사기와 모세관 사이의 연결을 설정하기 위해 매니 폴드 선택​​기를 조정한다. 미네랄 오일의 약 10 μl를 추방. </li><li> PBS 용액에 모세관 팁을 찍어및 마이크로 리터 주사기의 게이지를 이용하여, 모세관의 PBS의 5μL 빨아. 석유와 PBS의 메 니스 커스가 명확하게 볼 수 있습니다. </li><li> 수술 macroscope에서 맞는 3 축 미세 조작기에 모세관을 고정합니다. 이 시스템은 카메라 제어하에 주사 부위에 모세관을 대상으로 사용될 것이다. </li></ol></li><li> 회전 타원체 주입 <ol><li> 가볍게 (1-1.5 분 동안 공기 1.5 %) 유도 챔버에 아이소 플루 란을 흡입하여 마우스를 마취. </li><li> 케타민 / 자일 라진 (120 ㎎ / kg, 12 ㎎ / kg)의 혼합물을 복강 내 주사하여 동물을 마취. 마취는 종종 동물의 체온을 감소 유의. 그것은 26 ° C에서 방에 수술을 진행하고 기본 thermocontrolled 가열 패드로 동물을 따뜻하게 유지하는 것이 좋습니다. </li><li> 눈의 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 동물의 두피를 면도. </li><li> 장소귀 바, 마우스 피스를 사용하여 정위 프레임의 동물. </li><li> 포비돈 요오드 (3 % 비누, 다음 10 % 용액)로 피부를 청소합니다. </li><li> 메스와 두피의 중앙에 길이 방향으로 1 cm 긴 절개를합니다. 가위 정수리 뼈 위의 피부를 잘라 제거를 사용. </li><li> 메스의 칼날로 부드럽게 두개골 위의 골막을 제거합니다. 아낌없이 나중에 시멘트 준수를위한 거친 표면을 생성하는 뼈의 상단에 시아 노 아크릴 레이트를 적용합니다. </li><li> 4 개 mm 직경의 개두술을 생성하는 수술 macroscope에서 정수리 뼈를 뚫습니다. 아낌없이 가열을 방지하기 위해 전체 공정 중에 Pencillin (1,000 U / ㎖) 및 Streptomicin (1 ㎎ / ㎖)을 함유하는 빙냉 PBS를 추가한다. 집게와 젖은 멸균 거즈로 작은 뼈 조각을 제거합니다. 멀리 출혈을 방지하기 위해 정수리 두개골 봉합 적어도 1mm 드릴주의하십시오. </li><li> 유리 창문이 밀폐 될 개두술의 국경에서 얇은 뼈. 목표는 전자입니다뇌와 유리 사이의 최대 접촉 표면과 유리 창 nsure 저장 평면형 포지셔닝. 천천히 집게를 사용하여 뼈를 제거하고 PBS 용액으로 노출 DURA-이잖아요을 청소합니다. </li><li> , 5 mm 직경의 원형 유리 커버 슬립을 알코올로 청소하고 휴지 말립니다. 개두술의 덮개로 커버 슬립을 사용하여 뇌의 대형 평면 표면이 유리와 접촉에 들어간 것을 확인하려고합니다. 필요한 경우 커버 슬립에 더 얇은 쪽의 뼈를 제거합니다. 조심스럽게 제자리에 한 번 커버 슬립에 압력을 적용하면 뇌가 평면 압착 얻을 수있을 때까지 계속 진행합니다. </li><li> 다시 알코올로 커버 슬립을 청소 티슈로 건조, 따로 따로 저장합니다. </li><li> 26 게이지 바늘로 아직 주요 혈관을 피하는 개두술의 중심에 두라 - 이잖아요에 구멍을 만든다. 그냥 두라 - 이잖아요을 열려면이 단계의 목적으로 뇌 실질 조직입니다 손상되지 않도록해야합니다. </li><li> 조심스럽게 경질 이잖아요 위스콘신 청소출혈성 혈액을 제거하는 PBS 솔루션을 토륨. 구형 주입을 준비하는 동안 휴지 조각으로 커버. </li><li> 2.1 단계에서 제조 된 구형 사출 시스템으로, 단계 1.2에서 제조 된 배양 접시에서 모세 혈관 내경 (약 200 ~ 250 μm의) 적당한 둥근 구형을 빨아. 회전 타원체는 약 5 ㎕의 배지와 함께 와야한다. 그것은 그것의 무게에 모세관의 끝을 아래로 떨어질 것이다. </li><li> 개두술을 커버하고 분사 시스템에서 동물을 배치하는 데 사용되는 물티슈 용지를 제거합니다. </li><li> 그것은 경질 이잖아요에서 만든 구멍에 닿을 때까지 주입 피펫을 낮 춥니 다. 그 후, 250 μm의 다시 내려. 30 초를 기다립니다. </li><li> 천천히 티슈 페이퍼의 얇은 조각으로 과량의 액체를 펌핑하는 동안 마이크로 리터 주사기의 피스톤 (2-3 μL)을 사용하여 회전 타원체를 주입. 30 초를 기다린 후 부드럽게 표면을 향해 50 ㎛에 의해 주입 피펫을 올립니다. 30 초와 반복 하오 다시 기다립니다표면까지 50 ㎛의 단계로 절차를 밟아야 톤. 대기 시간은 피펫에 충실 할 것 회전 타원체의 추출을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 형광 macroscope을 사용하여 뇌의 회전 타원체의 존재를 확인합니다. </li><li> 100 ~ 300 μm의 직경에게 페트리 접시에 PBS 용액으로 가교 덱스 트란 젤 구슬을 섞는다. 1 분을 기다린 후 약간의 수화 구슬 물고기. 개두술에 인접한 뼈에 배치. </li><li> 거시적 제어에서 경질-이잖아요 개구부의 크기와 비슷한 직경을 가진 하나의 구슬을 선택합니다. 집게를 사용하여 두 개의 반쪽의 가교 덱스 트란 젤 구슬을 잘라. </li><li> 부드럽게 회전 타원체를 향해 볼록한 얼굴 주입 구멍에 가교 덱스 트란 젤 헤미 - 구슬을 넣어. 오목의 국경이 주변의 경질 이잖아요과 접촉 얻을 때까지 조심스럽게 아래로 회전 타원체를 눌러를 제거하지 않도록주의하십시오. </li><li> 유리 슬라이드에 시아 노 아크릴 레이트 접착제 한 방울을 넣어 DRO에 이쑤시개의 끝을 찍어접착제의 소량 걸리는 P. 신속 주위 접착제를 스탬핑하여 인접한 경질 교인에 가교 덱스 트란 겔 헤미 - 비드의 가장자리를 밀봉. 이쑤시개에 가교 덱스 트란 젤 헤미 구슬을 접착 방지하기 위해 신속하고 정확한 움직임을 수행하기 위해주의하십시오. 건조하면 영상을 방지하지 않을 경우 확산 방해 할 수 접착제의 과잉을 피하십시오. 접착제가 건조하고 PBS 용액으로 개두술과 주변 뼈를 청소하는 2 분을 기다립니다. </li></ol></li><li> 윈도우 주입 <ol><li> 개두술 위의 coverslip의 둘레에 5 mm 직경의를 착용 할 것 (2.2.12 참조). 커버 슬립의 가장자리는 개두술의 외부에 얇아진 두개골에 있어야합니다. 커버 슬립의 가장자리에 두라 - 교인과 얇게 뼈와 접촉해야합니다. 그것은 그렇지 않으면 흉터 조직은 광학 선명도를 개발하고 방해 할 수있는 경질-이잖아요과 유리 커버 슬립 사이의 직접 접촉을하는 것이 매우 중요합니다. </li><li> 티슈로, 일에 PBS를 흡수커버 슬립의 중앙에 작은 압력을 적용 할 때 전자의 coverslip의 가장자리는 해당 솔루션 있도록 완전히 개두술을 포함하지 않습니다. 이것은 뼈, 유리, 뇌는 관심 영역의 측면에 접착되어 있는지 확인합니다. </li><li> 부드럽게 뼈와 커버 슬립 사이의 경계에서 시아 노 아크릴 레이트를 적용하는 동안 집게로 커버 슬립의 중심에 작은 압력을 유지한다. 접착제는 자발적 PBS 용액과의 계면까지 확산된다. 해결 방법은 접착제의 소수성 주어진 장벽 역할을합니다. 씰링 분 안에 효과가 있지만 해결 될 때까지 커버 슬립을 이동하지 않도록 매우주의해야한다. 이것은 그렇지 않으면 경질 이잖아요 따라서 수술의 실패로 이어질에 시아 노 아크릴 레이트를 노출시키는 결과를 가져올 것입니다. </li><li> 접착제는 유리의 상단에 확산했을 경우가 그렇지 않은 경우 광학 선명도를 줄일 수 있으므로, 나선형의 움직임을 수행하여 마이크로 메스 블레이드를 사용하여 제거합니다. 유리 coverslip에 DURIN을 깰하지 조심g 과도한 압력에 의한 절차. </li><li> 인접한 두개골 향하여 커버 슬립의 가장자리에 치과 용 시멘트를 적용하여 유리 고정 통합. 두피까지 전체 노출 된 두개골을 포함해야합니다. 여분의 시멘트를 사용하여, 목적의 침적에 필요한 풀을 생성하는 커버 슬립 주위 측벽을 구축. 치과 용 시멘트보다 10 분에서 치료됩니다. </li></ol></li></ol> 3. 수술 후 관리 및 이미징을위한 준비 <ol><li> 수술 후 관리 <ol><li> 정위 프레임에서 마우스를 제거 Dexamethazon (0.2 ㎎ / ㎏)과 Rimadyl 골반 지역에 (5 ㎎ / ㎏) 사우스 캐롤라이나를 주입하고 따뜻한 조직 둥지 새장에 그녀를 배치합니다. </li><li> 마취의 효과가 사라 때까지 동물을 모니터링합니다. 수술 후 일반적으로 2 ~ 3 시간에, 마우스는 완전히 이동할 수 있습니다. 동물이 음식과 물에 쉽게 액세스 할 수 있는지 확인하십시오. 아가로 오스가 포함 포도당 (과 동물을 제공 아가로 오스3 %, 글루코스 3 %). </li><li> 매일 동물의 체중을 모니터링하고 수술 후 첫 10D에 Dexamethazon (0.2 ㎎ / ㎏)과 Rimadyl (5 ㎎ / ㎏) 사우스 캐롤라이나를 주입. 손실은 원래 체중의 15 %를 초과 할 때, 윤리적 고려 사항은, 마우스를 안락사. 두개 내 압력은 동물 용 모터 장애로 이어지는 종양의 크기에 따라 증가한다. 이 종속 종양 세포 라인과 다양한 지연 수술 후 발생합니다. 특별한주의가 사용한 세포주와 실험의 끝점을 특성화하기 위해주의해야한다. </li></ol></li><li> 이미징을위한 준비 <ol><li> 가볍게 유도 챔버 (1-1.5 분 동안 공기 1.5 %)에서 아이소 플루 란을 흡입하여 마우스를 마취. </li><li> 케타민 / 자일 라진 (100 ㎎ / kg, 10 ㎎ / kg)의 혼합물을 복강 내 주사하여 동물을 마취. 이러한 마취는 일반적으로 관찰 45 분 수 있습니다. 이상 촬상 세션을 수행하기 위해, 마우스를 아이소 플루 란으로의 연속 흡입하에 배치공기 (0.25-0.75 %). </li><li> 눈의 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 정위 프레임에 동물을 넣고 earbars와 두개골을 차단합니다. </li><li> 혈관을 시각화하기 위해, 형광 염료는 정맥 내 주입 될 수있다. </li><li> 윈도우가 더러워 나타나면 부드럽게 얇은 칼날과 조직의 모서리와 이물질을 제거하여 세정 될 수있다. 항상 치과 시멘트와 호환되지 않습니다하고 창 아래의 뇌를 냉각 수있는 창을 청소하기 위해 알코올을 사용하지 마십시오. </li></ol></li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이러한 접근 방식은 광학 이미징 방법의 사용이 일 주간 orthotopically 주입 된 신경 교종의 증식을 통해 모니터링 할 수있다. 같은 동물은 이후 병리의 과정에서 거의 모든 뇌 영상 기법을 실시 할 수있다; 아직 두 광자 현미경 특정 준비는 살아있는 동물의 뇌 속에있는 세포 이하의 해상도를 달성 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 우리의 프로토콜은 신경 교종 세포가 손상된 경막을 통해 중추 신경계를 남겨 둘 수있는 경우에 발생으로 오히려 추가 durally보다 뇌 실질 조직에 종양의 성장을 적용 할 수있는 장점을 제공한다. 뇌의 환경에 의해 가해지는 물리적 제약의 부재에서, 종양 세포는 실제로 그들이 실질 16에 침투 할 필요가 없습니다으로 빠르게 증식 할 수 있습니다. 이전에 발행 된 방법은 오히려 상체보다 세포 현탁액을 주입보다 더욱 문제가 있었다 이식 후 경막을 밀봉하지 않았다9,13,14. 세포 현탁액은 참으로 깊이에서 DURA-이잖아요에 피펫을 철회 할 때 각각의 세포...

glioblastoma의 multiforme의 12 개월의 평균 생존과 성인의 뇌 종양의 가장 적극적인 형태와 5 %의 5 년 생존율로 나타납니다. 임상 관리는 수술, 방사선 치료 및 자주 조합에 사용되는 화학 요법에 의존합니다. 그러나, 이러한 치료의 효과는 1-3 완화 남아있다. 지금까지 신경 종양학 연구의 대부분은 (예를 들어 4.5에 대한 참조) 만 정적 뷰를 제공 할 수있는 종양 베어링 동물의 대규모 코호트에서 수행 다른 시간 지점에서 희생 기술에 의존하고 있습니다. 의 intravital 촬상에 근거 후속 방법의 최근 개발은 신경​​ 교종 성장 및 종양 세포 및 시간 이상의 동일한 동물에 미치는 병태 미시 사이의 상호 작용을 연구한다. 이 6 지금까지 이룰 수 있었다 정보의 독점적 인 조각의 길을 엽니 다. 그 세포에서 형광 물질을 발현하는 형질 전환 동물에 사용 될 수 있습니다이 논문에서 종양 세포 및 예를 들어 신경 세포 사이의 특정한 상호 작용을 연구하는 D. 지난 10 년간의 intravital 두 광자 현미경 (7)과 (&gt; 500 DURA-이잖아요 아래 μm의) 기본적인 신경 종양학 연구와 임상 실험 쥐의 뇌의 깊은의 intravital 관찰을 수행 할 수있는 능력에 대한 8,9의 황금 표준이되었습니다 마이크로 미터 공간 해상도 10. 만성 뇌 창 (11)이 주입 orthotopical 동물 모델의 intravital 이광자 현미경을 사용하여, 동일 마우스 9,12에서 시간에 따른 종양의 진행을 수행하는 것이 가능하다. 이러한 이전에 발행 된 동물 모델의 주요 단점 중 하나는 경질 교인이 세포 현탁액 9,13,14의 주입 후 밀봉되지 않는 종양의 성장을 제어하는 물리적 제약을 모방하지 않는 것이 그러나이다. 신경 교종 세포에서 누출 될이소성 하나에 소성을 신경 교종 모델을 변환 경막 외 공간. 여기에 제시된 동물 모델은 가교 덱스 트란 젤 헤미 - 구슬과 조직을 호환 접착제로 경질-이잖아요의 밀봉 한 다음 200 ㎛의 깊이에서 대뇌 피질에있는 형광 신경 교종 세포의 회전 타원체의 주입으로 구성 . 종양의 성장은 다음의 병태 생리 학적 물리적 제약을 유지하는 뇌 실질 조직으로 제한됩니다. 종양 위에 이식 만성 유리창의 intravital 두 광자 현미경을위한 쉬운 광 액세스 할 수 있습니다. 시간이 지남 신경 교종의 성장의 후속을 수행하고 (형광 덱스 트란을 강조하는 신경과 혈관 구조와 여기)의 미세 환경과의 상호 작용을 연구 할 수 있습니다 관심의 세포에 형광 물질을 발현하는 형질 전환 동물을 사용하여.

<table><tbody><tr><td>Drill</td><td>Dremel (독일)</td><td>398</td> 모든 <td>고품질 수술용 뼈 드릴로 충분합니다</td></tr><tr><td>드릴 버 (# 1 / 4 카바이드 라운드 버)</td> <td>World Precision Instruments (미국)</td> <td>501860 (# 1 / 4)</td> <td>Harvard</td></tr><tr><td>Apparatus Tissue scissors</td>에서도 판매 <td>World Precision Instruments (미국)</td> <td>14395</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 핀셋 M5S</td><td>World Precision Instruments (미국)</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>치과 용 시멘트</td><td>GACD (미국)</td> <td>12-565 & 12-568</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate</td><td>Eleco-EFD (프랑스)</td> <td>Cyanolit 201</td><td></td></tr><tr><td>필라멘트가없는 유리 모세관</td><td>Clark Electromedical Instruments (영국)</td> <td>GC100-15</td><td></td></tr><tr><td>Microliter syringe (25 &micro; l)</td><td>Hamilton (미국)</td><td>702</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments (미국)</td><td>Kite-R</td><td></td></tr><tr><td>T derivation (3-way stopcock - Luer lock)</td><td>World Precision Instruments (미국)</td><td>14035-10</td><td></td></tr><tr><td>Stereotactic frame (마우스 어댑터)</td><td>World Precision Instruments (미국)</td><td>502063</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Warner Instruments (미국)</td><td>CS-5R (64-0700)</td><td></td></tr><tr><td>가교 덱스트란 겔 (Sephadex) G50 Coarse 100-300 &micro; m 구슬</td><td>: Sigma (독일),</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Eye ointment,</td><td>TVM (프랑스),</td> <td>Ocry-gel</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence macroscope</td><td>Leica, MZFLIII (독일),</td><td></td> <td>다른 회사에서도 판매</td></tr>, <tr><td>Two-photon microscope</td>, <td>Zeiss LSM 7MP (독일),</td><td></td> <td>다른 회사에서 판매 (Nikon, &hellip;)</td></tr> 등 다양한 공급 업체에서 구매 가능<tr><td>적외선 조정 가능한 펨토초 레이저(Ma&iuml;-Ta&iuml;)</td><td>Spectra Physics (미국)</td><td></td><td>다른 회사에서도 판매</td></tr></tbody></table>

소성을 glioblastoma의 마우스 모델은 뇌 실질 물리적 제약 조건을 유지하고의 intravital 두 광자 현미경에 적합

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

아교 모세포종의 multiforme (GBM)는 날짜에 사용할 수없는 치료 치료와 뇌 종양의 가장 적극적인 형태입니다. 이 병리의 쥐 모델은 경질 이잖아요의 절개 다음 뇌 실질에 신경 교종 세포 현탁액의 주입에 의존하고 있습니다. 세포의 intravital 두 광자 현미경에 액세스 할 수 피상적으로 주입해야하는 반면, 표면 주사는 physiopathological 조건을 요점을 되풀이하지. 실제로, 주입 관을 통해 탈출하는 대부분의 종양 세포들이 실질로부터의 기계적인 제약 조건의 부재하에 비정상적으로 빠른 확장 여분 경막 공간에 도달한다. 우리 개선 focally 교종 타원체 주입보다는 대뇌 피질의 표면층에서 신경 교종 세포의 현탁액을 주입 에서뿐만 아니라의 surroun에 접착되어 가교 덱스 트란 겔 헤미 - 비드로 주사 부위를 막힘뿐만 이루어져땡 실질 및 시아 노 아크릴 레이트와 경질 이잖아요 밀봉. 합해서 이러한 조치는 뇌 실질 내부 종양 세포의 생리 학적 팽창 및 침윤을 시행. 유리 창은 흉터 조직 발달의 부재시 주 이상의 만성 이미징을 허용하도록 두개골에 시멘트와 개두 최종적으로 닫혔다. 우리가 신경 교종 세포, 신경 세포 (예를 들어 Thy1-CFP 마우스)과 혈관 (형광 염료의 정맥 주사에 의해 강조) 사이에서 발생하는 상호 작용의 역학의 intravital으로 시각화 할 수있는 것으로 나타났습니다 형광 종양 세포를 이식 형광 형질 전환 동물을 활용 질병의 진행 중에이 광자 현미경. 최소한의 손상된 뇌 환경에서 현미경 해상도의 이미지 종양 가능성은 신경 종양학과 약물 검사의 필드를 수혜 현재 GBM 동물 모델의 개선을 나타냅니다. </p&gt;

수술 프로토콜 (도 1)이 수행되면, 동물들은 희생 될 때까지 주 동안 형광 현미경에 의해 관찰 될 수있다. 염증 반응은 1 ~ 2 주 이내에 사라 수술 후 관찰 할 수있다. 종양의 성장 형광 macroscopy 두 광자 현미경 (그림 2) 등 다양한 기술 현미경으로 관찰 할 수있다. 여기에 묘사 된 예제 이미지는 형광 macroscope 및 펨토초 펄스 적외선 파장 가변 레이저와 집 수정 20X 침수 목적 (1.0NA) 아래 동물 위치 할 수 있도록 결합 된 두 광자 현미경에 실현되었다. 종양의 개발은 시야 반사율 이미징 및 표면 형광 방출 (그림 2A-2C)를위한 비스듬한 조명을 결합 형광 macroscope를 사용하여 시간이 지남에 따라 추정되었다. 형광의 임계 쉽게 종양 영역에 대한 액세스를 제공하는 동안 superficial의 혈관은 가시 광선 이미지의 흰색 배경의 어두운 구조...

우리는 종양의 성장하는 동안 재생에 일반적으로 생물 물리학 적 제약 조건을 되풀이되었습니다의 intravital 두 광자 현미경을위한 마우스에서 대뇌 피질의 소성을 glioblastoma의 모델을 설립했다. 종양 위의 두개골을 대체 만성 유리 창에는 두 개의 광자 현미경에 의해 시간이 지남에 따라 종양의 진행을 추적 할 수 있습니다.

소성을 Glioblastoma의 마우스 모델은 뇌 실질 물리적 제약 조건을 유지하고의 intravital 두 광자 현미경에 적합

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

이 절차의 전반적인 목표는 생쥐의 대뇌 피질에서 생체 내 광학 이미징(intravital optical imaging)에 적합한 정위성 교모세포종 모델을 생성하는 것입니다. 이를 위해 먼저 두정엽 피질 위에 두개창(cranial window)을 만듭니다. 절차의 다음 단계는 교모세포종 S 스페로이드 종양을 뇌의 표층에 이식하는 것입니다.그 후 실질 조직이 도너를 밀봉하고 주입구를 막습니다. 실질 내 종양 발생 과정에서 힘을 추적하고 생물물리학적 제약 조건을 유지합니다. 마지막 단계는 흉터 조직 형성을 방지하기 위해 뇌 표면에 밀착하여 유리창을 밀봉하는 것이며, 이를 통해 이미징 시 최적의 선명도를 확보합니다.최종적으로, 생체 내 이광자 현미경을 통해 단일 세포 해상도로 교모세포종 종양의 진행, 혈관 재형성 및 세포 미세환경을 관찰할 수 있습니다. 저희는 처음에 세포 유출을 막기 위한 물리적 장벽 없이 스테로이드 자체 현탁액을 이식하려 했을 때 이 방법의 아이디어를 얻었으며, 당시 결과는 주로 비생리적인 in vitro와 유사한 외부 성장을 보였습니다. 이 방법은 교모세포종 과정 중 혈관 재형성의 역할과 세포 간 상호작용의 조절 효과와 같은 신경종양학 분야의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.스테로이드를 이식하기 위해 먼저 가스 챔버에서 생쥐를 가볍게 진정시킨 다음, 케타민과 자일라진을 복강 내 주사하여 완전히 마취합니다. 수술은 26 °C의 따뜻한 방에서 수행하며, 조절 가능한 가열 패드로 생쥐의 체온을 유지합니다. 안연고를 바르고 두피를 제모한 후, 귀 고정바와 마우스피스가 있는 정위 고정 틀에 생쥐를 적절한 위치로 고정합니다.3% 비누액과 10% 요오드 용액으로 피부를 세척합니다. 이제 가위를 사용하여 두피 중앙에 1cm 길이의 종절개를 실시합니다. 메스 날을 이용해 두정골 위의 피부를 절개하여 제거하고, 두개골 위의 골막을 조심스럽게 제거합니다.나중에 시멘트가 잘 접착될 수 있도록 골 표면에 시아노아크릴레이트를 충분히 도포하여 거친 표면을 만듭니다. 이제 수술 현미경 하에서 메스 날을 사용하여, 출혈을 방지하기 위해 두개골 봉합선에서 최소 1mm 떨어진 지점에 두정골 천공 계획을 세웁니다. 드릴링을 통해 한쪽 대뇌 반구 위의 두정골을 최종적으로 제거하는 동안, 과열을 방지하기 위해 페니실린과 스트렙토마이신이 포함된 얼음처럼 차가운 PBS를 충분히 추가합니다. 골 파편은 1분 정도마다 핀셋과

an-orthotopic-glioblastoma-mouse-model-maintaining-brain-parenchymal

Research

연구

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Medicine

의학

이 문서의 목적은 chemoradiation 연구를위한 orthotopic glioblastoma 모델의 사용을 설명하는 것입니다. 이 문서에서는 이온 주입, 세포 가공 불구하고 이동하고 intracranial 모델을 사용하여 마우스의 방사선 치료합니다.

Orthotopic 마우스 뇌종양 모델의 조합 방사선 치료

C57BL에 GL261 셀 / 6 마​​우스의 Intracranial 이식은 인간 glioblastoma multiforme의의 특징 중 많은 것들을 요점을 되풀이하다 악성 gliomas을 생산하고 있습니다. 우리는 우리가 사용할 수 있도록 안정 루시페라제 표현 GL261 세포를...

이후 3D로 Intracranial 주입 VIVO에서</emMurine Gliomas의> 발광 생물 이미징

우리는 누드 마우스 및 이후 일련의 뇌에 인간 glioblastoma multiforme의 세포의 정확한, stereotactic 주입을위한 통합 방법을...

Stereotactic Intracranial 주입 및<em&gt; 생체에</emGlioblastoma의 Multiforme의 마우스 모델 시스템에서 종양 Xenografts의&gt; 발광 생물 이미징

광택 및 강화 된 얇은 두개골 (포트) 두개골 창 glioblastoma (GBM) 세포 주입을 결합함으로써, 우리는 glioma의 개시와 길이 방향 라이브 마우스의 뇌에 주입 GBM 세포의 성장을 관찰 할 수 있습니다.

이미징 Glioma 개시<em&gt; 생체 내</em&gt; 연마하고 강화 얇은 두개골 두개골 창을 통해

이 비디오는 두개내 주사를 수행하여 쥐의 뇌에 종양 세포를 이식하는 방법을 보여줍니다.

두개내 정소성 모델: 마우스 뇌에 암세포를 이식하는 절차

출처: Clark, AJ, et al. 교모세포종에 대한 면역적격 동물 모델의 생물발광 영상. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 루시페라아제 발현 종양 세포와 루시페린을 사용하여 종양 성장을 비침습적으로 정량화하는 면역 적격 마우스 모델에서 교모세포종 진행을 추적하기 위한 생물 발광 이미징을 보여줍니다.

교모세포종에 대한 면역적격 마우스 모델의 생물발광 이미징

뇌는 잘 시험관이나 자궁외 분석으로 표시되지 않은 자질을 가진 유일한 사이트입니다. 위치 재현성과 성장 특성 정위 마우스 모델을 확실 정위 고정기구 및 저압 주사기 펌프를 사용하여 두개 내 주사로 생성 될 수있다.

만들기 해부학 적으로 정확하고 인간의 두뇌 종양의 재현 두개 내 이종 이식

여기에서 우리는 유전자 조작 마우스 모델 종양에서 파생된 세포의 두개내 주입에 의해 확립된 GBM에 대한 전임상 동소 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 인간 GBM의 질병 특징을 표시합니다. 중개 연구를 위해 마우스 뇌종양은 생체 내 MRI 및 조직병리학에 의해 추적됩니다.

다형성 교모세포종의 번역 동소 모델

우리는 마우스 모델에서 형광 표지된 산화철 나노입자를 교모세포종에 전달하는 종양 전달에 대한 이광자 현미경에 대한 새로운 접근 방식을 제시합니다.

쥐 모델에서 교모세포종의 Two-Photon Intravital Microscopy

교모세포종은 파괴적인 형태의 원발성 뇌암이며, 레이저 간질성 열 요법은 수술이 불가능한 교모세포종에 대한 기존 외과적 절제술의 유망한 대안으로 부상하고 있습니다. 이 프로토콜은 치료 효과 또는 보조 및 조합 치료를 연구하는 데 사용할 수 있는 최적화된 전임상 마우스 모델을 설명합니다.

교모세포종의 레이저 간질성 열처리 치료를 위한 면역 역량 있는 쥐 모델

배우세요 마우스 대뇌피질에 교정성 교모세포종 모델을 생성하여 생체 내 이광자 현미경으로 종양 진행을 관찰하는 방법입니다. 두개골 창을 만들고 유리창을 밀봉하여 장기간 고해상도 이미징이 가능합니다.

소성을 Glioblastoma의 마우스 모델은 뇌 실질 물리적 제약 조건을 유지하고의 intravital 두 광자 현미경에 적합

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