어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

이 절차의 전반적인 목표는 고해상도 생체 내 이미징을 위해 표준 이광자 현미경을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 레이저 조절을 포함한 현미경 정렬을 통해 수행됩니다. 다음으로, 완벽한 빔 형태와 빔 리팅 배치를 구현하기 위해 빔 멀티플렉서를 정렬합니다.

멀티빔 스캐닝의 경우, 줄무늬 조명 패턴으로 시료를 스캔하여 원본 이미지를 획득합니다. 마지막으로, 알고리즘을 적용하여 고해상도의 최종 이미지를 계산합니다. 궁극적으로, 줄무늬 조명 현미경법은 이전의 생체 내 현미경으로는 접근할 수 없었던 생쥐 림프절 내 생식 중심에서의 면역 체계 행동의 세부 사항을 보여주는 데 사용됩니다.

구조광 조명이나 국소화 현미경과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 살아있는 샘플의 매우 깊은 조직 깊이까지 적용할 수 있다는 점입니다. 레이저 빔 모양을 수정할 필요가 없으므로, 모든 다광자 현미경에 매우 간단하고 쉽게 구현할 수 있습니다. 광퇴색 수준을 최소화하고 획득 속도를 최대화하면서 최적의 해상도와 대비 품질을 달성하기 위한 다중 빔 이광자 줄무늬 조명 현미경의 구성이 여기에 제시되어 있습니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 설정을 조정하십시오. 조정을 마친 후, 빔이 프리즘 기반 펄스 압축기 끝단에 있는 진입 거울 바로 위에 위치한 거울로 다시 돌아오는지 확인하십시오. 여기서 광 경로가 설정되면, 빔은 빔 멀티플렉서로 반사됩니다.

스캐너를 끈 상태에서 다광자 현미경으로 다중 빔 스트라이프 조명을 수행하는 경우, 균일하게 형광을 띠는 시료를 스테이지 위에 놓고 레이저 빔을 시료 내부의 상단 표면 근처, 즉 대물렌즈 전면 렌즈와 가까운 곳에 초점을 맞추어 빔 멀티플렉서의 미러를 정렬하십시오.

현미경을 멀티 빔 모드로 설정하고 빔의 수와 편광을 선택하십시오. 예를 들어, 형광 슬라이드를 이미징하여 P 빔을 찾으려면 P 셔터를 열고 빔의 초점을 맞추는 동안 CCD 카메라를 연속적으로 작동시켜 빔이 중앙 위치에 있는지 확인하십시오. P 빔을 정렬할 때는 64 빔 모드로 전환하고 해당 셔터를 여십시오.

빔의 위치를 확인합니다. 1번부터 5번까지의 빔 멀티플렉서 거울을 조정하여 빔 조명 간의 거리가 동일하도록 맞춥니다. 줄무늬 조명 알고리즘은 이러한 가정을 기반으로 하므로, 균일하게 형광을 띠는 샘플을 불균일한 구조의 샘플로 교체합니다.

예를 들어, 뿌리 샘플의 Conval 영역을 채취하고 멀티빔 이미지를 스캔합니다. 이미지가 선명하고 균일하며 직선으로 나타나는지 확인하십시오. 불균질 샘플을 균질 샘플로 교체합니다.

스캔 과정을 제어하기 위해 XY 스캐너를 시작하십시오. 멀티빔 스캐닝을 위한 스트라이프 이미지 여기 패턴을 생성하려면, 빔 조사 라인에 수직 방향으로 Y 스캐너 미러를 이동시키십시오.

직사각형 스트라이프 이미지를 생성하기 위해, 여기서 블록 시프트라고 불리는 X 스캐너 미러를 이동시켜 여기에 표시된 블록 수만큼 생성된 패턴을 반복합니다. 불균질 시료를 다시 배치하고 스캐너를 마스터 트리거로 사용하십시오. 카메라를 스캐너와 동기화하여 스트라이프 이미지를 자동으로 획득 및 저장함으로써 스트라이프 이미지를 반복적으로 획득하십시오.

충분한 반복 단계 수, 이동 횟수 및 적절한 단계 길이를 선택하여 X 스캐너 거울을 서로 다른 위치로 이동시킵니다. 두 개의 연속적인 스트라이프 이미지 사이의 이동 단계는 두 개의 연속적인 빔 폭 사이의 거리를 커버해야 합니다. X 이동 값은 주어진 여기 파장에서의 가로 분해능 한계보다 낮은 값으로 설정하십시오.

예를 들어, 시프트당 X 스캐너 미러를 10단계로 사용하고 12회 또는 13회 시프트를 수행하면 최상의 공간 해상도를 얻을 수 있습니다. conval 영역 루트 슬라이드를 사용하여 conval 영역 이미지가 가장 선명해질 때까지 이 두 값을 최적화하십시오. 기존 CCD 이미지와 계산된 스트라이프 조명 이미지에 라인 프로파일 도구를 사용하십시오.

이 예시에서는 회복기 세포벽의 형광 신호인 라인 프로파일의 너비를 비교하십시오. 스캐너의 움직임에 동기화하여 각 로우 스트라이프 이미지를 획득하고, 이를 TIFF 또는 바이너리 파일 등으로 각각 저장하십시오. 고해상도 스트라이프 조명 이미지의 2차원 행렬을 생성하려면, 분석 루틴에서 로우 스트라이프 이미지 전체 세트를 행렬로 여십시오.

심부 조직에서 줄무늬 조명, 다중 빔, 다광자 현미경 관찰을 수행하기 위해, 이전에 상세히 설명한 대로 최소-최대 알고리즘 또는 푸리에 변환 기반 알고리즘 중 하나를 사용하십시오. 살아있는 생물체에서 시간에 따라 서로 다른 조직 깊이의 줄무늬 이미지를 획득하고 이전에 설명한 대로 이를 평가하여, 생식 중심, B 세포 및 여포 수지상 세포 간의 동적인 상호작용을 보여주는 고해상도 3D 영상을 생성하십시오. 유효 점 퍼짐 함수(point spread function)의 차원은 현미경의 공간 해상도에 해당합니다.

우리는 mion 림프절에서 콜라겐 섬유의 제2고조파 생성 신호 또는 515 nm에서 발광하는 100 nm 폴리스티렌 비드의 형광 신호를 획득하여 이 3차원 함수를 측정하였습니다. CCD 카메라를 이용한 필드 검출 T-P-L-S-M 및 포인트 검출 T-P-L-S-M과 같은 기존의 이광자 레이저 주사 현미경 기술과 비교하여, 당사의 다중 빔 스트라이프 조명 T-P-L-S-M을 사용하였습니다. 이러한 측정 결과, 시료 표면에서 가로 및 세로 해상도 모두 회절 이론에 의해 예측된 예상 값과 일치함이 분명하게 나타났습니다.

하지만 이미징 깊이가 깊어짐에 따라, 굴절률 변화가 심한 매질을 통과하는 여기광과 방출광의 광학 경로가 길어지면서, 사용된 설정과 관계없이 공간 분해능이 상당히 저하됩니다. 이미징 깊이에 관계없이 M-B-S-I-T-P-L-S-M을 사용함으로써, 표준 T-P-L-S-M 방식과 비교하여 횡방향 분해능은 약 20%, 축 방향 분해능은 220% 향상된 결과를 얻었습니다.

성체 생쥐의 2차 림프 기관 내 면역 반응 중 일어나는 B 세포의 클론 선택은 이들이 기억 B 세포 또는 형질 세포로 분화되는 과정의 첫 단계입니다. 이 과정에서 생식 중심 내 면역 복합체 구조 수준에서 일어나는 여포 수지상 세포와 B 세포 사이의 매우 역동적인 상호작용이 중추적인 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 고해상도 생체 내 현미경 기술을 사용해야만 이러한 세포 간 통신과 그것이 면역 반응에 미치는 영향을 분석할 수 있으며, 본 영상에서는 여포 수지상 세포에 anti CD 2135 FAB ATO five 90을 표지하여 이를 보여줍니다.

M-B-S-I-T-P-L-S-M은 팝콘 림프절의 생식 중심 내 최대 120 micron 깊이까지 면역 복합체 침착물 클러스터의 크기를 생체 내에서 시각화하고 정량화할 수 있는 가능성을 최초로 제공합니다. 이 이미지들은 기존의 PMT 기반 방식과 M-B-S-I-T-P-L-S-M으로 획득한 생식 중심 내 면역 복합체 침착물의 3D 형광 이미지를 직접 비교하여 보여줍니다. 또한, 면역 복합체 침착물과 생식 중심 B 세포 간의 상호작용을 고해상도로 구현할 수 있으며, 이제 증식, 분화 또는 세포 사멸을 위한 생체 내 기능성 프로브와 결합하여 연구할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 카메라 검출 기반 기술은 표준 광전증배관 기반 다광자 현미경에 비해 획득 속도가 약 8배 더 빠르지만, 최대 이미징 깊이는 약 25% 더 낮다는 점을 유의하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면 현미경 광로 조정, 빔 래티스 정렬, 스캐닝 파라미터 계산, 그리고 최종 고해상도 이미지를 계산하는 방법을 포함하여, 스트라이프 조명법을 사용하여 다중 폴드 현미경을 설정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이는 생체 내 심부 조직 실험을 위한 것입니다.