종 MRI에 이어 유방암 뇌 전이 마우스 모델을 개발하기 위해 초음파 영상 유도 심장 내 주입

이 실험 절차의 전반적인 목표는 초음파 유도를 통해 유방암 뇌 전이 마우스 모델을 구축하고, 이를 MRI로 모니터링하는 것입니다. 이는 뇌 친화성 유방암 세포를 수집하여 좌심실에 주입함으로써 수행됩니다. 이후 초음파 유도의 도움을 받아 두개내 종양의 발달 과정을 모니터링합니다.

MRI를 사용하고 H&E 염색을 통해 전이를 확인합니다. 결과적으로 영상 유도 하의 정확한 주입은 유방암 뇌전이의 형성 및 발달 모니터링의 성공률을 유의미하게 높일 수 있습니다. 종단적 MRI를 통해 유방암의 형성 및 발달을 비침습적으로 모니터링할 수 있습니다.

모든 동물 실험 절차는 텍사스 대학교 사우스웨스턴 의료 센터의 기관동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 본 프로토콜을 위해 10% FBS, 1% glutamine, 1% penicillin-streptomycin이 함유된 DMEM 배지에서 배양한 M-D-A-M-B 2 31 B-R-G-F-P 세포를 준비하십시오. 항상 세포 상태를 모니터링하고 2~3일마다 배지를 교체하십시오. 80% confluence에 도달하면, trypsin을 처리하여 세포를 수집하십시오.

먼저, 진공 피펫을 사용하여 기존 배지를 완전히 제거합니다. 그런 다음 PBS 5 mL를 첨가하여 모든 세포가 PBS로 덮일 때까지 세포를 부드럽게 세척합니다. 이후 세척액을 제거합니다.

다음으로, 디쉬에 trypsin 1.5 milliliters를 첨가합니다. 디쉬를 가볍게 기울여 모든 세포가 trypsin으로 덮이도록 합니다. 디쉬를 37 degrees Celsius의 세포 배양기에 다시 넣습니다.

1분 동안 기다린 후, 현미경으로 세포를 관찰합니다. 세포가 둥글게 떠 있다면 분리된 것입니다. 배지 3 mL를 첨가하여 소화를 중단시키고, 세포 혼합액을 피펫으로 옮겨 원심분리 튜브에 넣습니다.

혼합물을 1,160 G에서 5분 동안 원심 분리합니다. 그 다음 진공 피펫을 사용하여 배지를 조심스럽게 제거합니다. 이어서 피펫을 이용해 5 mL의 무혈청 배지로 세포를 부드럽게 재부유시키며, 세포 펠릿이 더 이상 보이지 않고 세포 혼합물 50 µL가 균질하게 보일 때까지 수행합니다.

완전히 혼합된 후 트라이판 블루 50 µL를 추가합니다. 여러 개의 세포 계수 슬라이드에 10 µL씩 분주합니다. 그 후 세포 계수기 값을 통해 세포 수를 측정합니다.

모든 세포 수 측정값의 평균을 계산하여 사용하십시오. 이제 더 정확한 세포 현탁액을 만듭니다. 세포를 다시 원심 분리하고 무혈청 배지 100 µL당 175,000 cells가 되도록 재현탁하십시오.

그런 다음 심장 내 주사를 위해 세포를 얼음 위에 보관합니다. 본 프로토콜에서는 6~8주 된 암컷 BC nude mice를 사용하십시오. 영상 시스템에 로그인하고 트랜스듀서를 초기화합니다.

40 megahertz에서 7 0 4로 설정하십시오. 새로운 연구를 시작하고 정보 입력란을 적절히 작성하십시오. 다음으로, 마우스에 마취제를 노즈콘을 통해 투여하여 마취시키십시오.

유도 주입 과정 동안, 이미징 테이블의 온도를 37 °C로 설정하고 마우스를 앙와위 자세로 테이블에 테이프로 고정합니다. 이미징 전 초음파 겔을 37 °C로 유지한 후 마우스의 흉부에 도포합니다. 이제 트랜스듀서를 홀더에 장착하고 원하는 이미징 깊이까지 내립니다.

다음으로, 상행 대동맥을 기준점으로 삼아 좌심실이 식별될 때까지 스테이지를 이동시킨 후, 시야가 가장 선명한 위치에서 스테이지를 고정합니다. 이제 22 gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기로 냉각된 세포 혼합액 100 µL를 흡입합니다. 충전된 주사기를 주사기 마운트에 고정합니다.

그 다음 주사기를 가슴 쪽으로 이동시킵니다. 마우스에 삽입하기 전, 바늘 끝이 영상 시야 내에 들어올 때까지 조심스럽게 좌우로 움직입니다. 좌심실을 겨냥하여 바늘의 높이와 각도를 조절하고, 위치가 잡히면 신속하게 피부와 근육층을 통과하여 바늘을 좌심실 내로 삽입합니다.

초음파 영상의 안내에 따라, 좌심실에 성공적으로 삽입되었음을 나타내는 징후는 주사기로 신선한 분홍색 동맥혈이 역류하는 것입니다. 그 후 세포 혼합물을 천천히 주입하고, 바늘을 뽑은 다음, 트랜스듀서를 들어 올리고 젖은 거즈로 초음파 젤을 닦아냅니다. 이어서 테이프로 고정한 동물을 풀어주고, 예열된 패드가 있는 깨끗한 케이지로 옮깁니다.

마우스가 완전히 회복될 때까지 관찰하고, 이후 며칠 동안 매일 상태를 확인하십시오. 78 square micron의 평면 해상도를 사용하여, 직경 310 microns의 MRI 고신호 강도 병변을 식별할 수 있습니다. 본 연구의 전이 병변은 크기가 매우 작았으며 괴사와 부종이 최소였으므로, T2 강조 영상의 고신호 강도 병변은 실제 종양을 나타냈습니다.

대규모 종단적 MRI 연구를 통해 종양 성장을 생체 내에서 비침습적으로 평가할 수 있습니다. 고해상도 MRI를 통해 심장 내 주사 3주 후에 여러 개의 작은 병변을 검출할 수 있었으며, 4주 차에 이전 스캔에서 관찰되었던 병변들은 모두 크기가 커졌습니다. T2 강조 영상에서는 더 많은 새로운 병변이 나타났습니다.

H and E 염색 결과 확산성 전이 병변이 나타나거나, H and E 염색 결과 군집형 전이 병변이 나타났습니다. 종양 주변에서 확장된 혈관이 자주 관찰되었으며, 이는 비발아성 혈관신생(non sprouting angiogenesis)이 일어나고 있음을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후에는 마우스 심장의 좌심실에 초음파 영상 유도 하 바늘 주입을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.