형광 태그 바시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을위한 방법론

이 실험은 일시적인 우성 선택(transient domant selection)을 기반으로 하는 신속한 모듈식 방법을 통해 형광 표지된 재조합 EO 바이러스를 생성합니다. 먼저, synthesized minimal regions of homology로 둘러싸인 형광 태그와 대사 및 형광 선택에 대한 marker를 포함하는 재조합 벡터를 생성합니다. 이 재조합 벡터를 감염된 세포로 transfection하고 대사 선택 및 형광을 사용하여 재조합 바이러스를 증폭합니다.

다음으로, 대사 선택을 제거하여 마커 카세트를 절제하고 형광 마커로 재조합 바이러스를 포함하는 세포를 분리합니다. 선택. 세포 단층의 바이러스 플라크(viral plaque)의 결과를 통해 형광 표지된 유전자의 특징인 개별 바이러스 입자를 시각화할 수 있습니다. 이 방법을 개발한 이유는 태그에 관계없이 반복적이고 보편적으로 사용할 수 있는 선별 방법을 사용하여 여러 유전자 변형이 있는 재조합 바이러스를 생성하고자 했기 때문입니다.

일시적인 우성 선택의 원리는 이전에 설명되었지만, 우리는 게놈 변형을 수행하는 데 더 많은 유연성을 제공하기 위해 더 큰 규모와 모듈식 방식으로 이를 적용하고 싶었습니다. 이 방법의 시각적 시연은 재조합 바이러스 플라크 스크리닝 및 분리가 까다로울 수 있으므로 매우 중요합니다. 빈도가 낮을 수 있으므로 바이러스의 효율적인 복구를 위해 몇 가지 고유한 방법이 필요합니다.

그래서 단백질의 N 또는 C 말단에 관심있는 바이러스 유전자로 표시되었습니다. 따라서 상동성의 150개의 염기쌍 긴 측면 영역을 식별합니다. 그런 다음 선택한 한 쌍의 제한 부위로 분리된 150개의 염기쌍 왼쪽 및 오른쪽 팔로 구성된 올리고뉴클레오티드 염기서열을 설계합니다.

또한 TDS 벡터에 통합될 수 있도록 첫 번째 쌍과 다른 두 번째 제한 부위 쌍으로 이 영역을 측면에 배치합니다. 합성이 완료되면 이제 제한 부위가 있는 올리고뉴클레오티드가 원하는 삽입 부위가 있는 프레임에 있도록 설계되었는지 확인합니다. 올리고뉴클레오티드 합성을 위해 왼팔과 오른팔 사이에 제한 부위가 통합되어 있는지 확인합니다.

선택한 형광 태그의 열린 판독 프레임 옆에 있는 것과 일치합니다. PCR에 의해 형광 태그의 양쪽에 이러한 동일한 제한 부위를 통합합니다. 합성된 단편을 TDS 벡터로 클론화합니다.

또한 왼팔과 오른팔 사이의 제한 부위를 사용하여 결과 재조합 벡터에 형광 태그를 복제합니다. 상동성의 영역. BSC one 세포의 단층을 백시니아 바이러스와 무혈청 배지로 감염시킵니다.

감염 후 1시간 후. 무혈청 배지에서 3:1의 비율로 재조합, 벡터 플라스미드 및 트랜스펙션 시약을 혼합한 ECCOs modified eagle medium transfection으로 세포를 구출합니다. 24시간 후, 소 태아 혈청이 없는 DMEM에서 세포를 긁어내고 회수합니다.

세포에 세 번의 자유 해동 주기를 적용하여 열린 세포를 부수고 바이러스 입자를 방출하여 개별 플라크를 적절하게 분리합니다. BSC one cell의 100% confluent cell monolayer를 바이러스 입자 준비의 연속 희석액으로 감염시킵니다. 액체 10%FBS 및 DMEM과 GPT 선택, 시약 및 24시간 배양으로 오버레이합니다.

액체 오버레이를 흡인하고 형광 현미경을 사용하여 플라크를 찾습니다. TDS 벡터에서 M 체리가 바이러스로 통합되는 것에 해당하는 확산성 적색 형광을 나타냅니다. 표적 유전자와 선택한 형광 태그에 따라 태그 유전자의 국소 형광이 동일한 빨간색 플라크에서 관찰될 수도 있습니다.

이제 각 재조합 바이러스에 대해 여러 플라크를 선별하기 위해 피펫 팁과 DMEM이 포함된 100마이크로리터의 5%FBS로 세포를 einor 튜브로 옮겼습니다. 긁어낸 세포를 세 차례의 동결 해동을 수행합니다. 재조합 바이러스를 방출합니다.

동결 해동 바이러스를 함유한 DMEM을 세포의 단층에 첨가합니다. 성장 배지에서 GPT 선택 시약으로 재조합 바이러스를 증폭하기 위한 12웰 플레이트에서. 그런 다음 감염 후 24 시간에 성공적으로 증폭 된 플라크의 플라크 분석을 위해 성공적인 증폭을 긁어 적색 형광 C two six를 나타내고 BSC 1 세포의 단층으로 잘 재생됩니다.

재조합 바이러스의 연속 희석을 수행하고 FBS free DME M1 감염 후 시간 동안 바이러스의 희석을 증가시켜 웰을 감염시킵니다. 액체 매체를 제거하고 감염 후 3일 후에 완전한 최소 필수 배지에 0.5%agros로 각 웰을 오버레이합니다. 빨간색과 선택한 형광 태그의 색상인 형광을 표시하는 명판을 선택합니다.

GPT를 선택하지 않고 이를 다시 증폭합니다. 확산 적색 형광을 잃었지만 선택한 태그에 해당하는 국소 형광을 유지하는 플라크를 선택합니다. M cherry 및 GPT selection 유전자를 잃었지만 선택한 태그에 해당하는 국소 형광을 유지하는 재조합 바이러스의 순수한 스톡을 얻기 위해 선택 없이 플라크 정제를 계속합니다.

유사한 플라크 표현형의 모든 플라크를 목표로 하는 플라크 분석으로 스톡의 순도를 평가합니다. BSC one cells의 단층에서 테스트 바이러스 스톡을 증폭합니다. 감염 후 24시간이 지나면 감염된 세포를 250마이크로리터의 DMEM으로 긁어내고 감염된 세포를 원심분리합니다.

supernat를 제거하고 세포 펠릿을 TE 완충 와류에서 0.1%SDS 500마이크로리터에 재현탁하여 세포를 lyce합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 페놀, 클로로포름, 이소아밀 알코올을 넣고 뒤집어 원심분리기를 혼합합니다. 상부 단계를 수확하고 추출을 반복합니다.

그런 다음 수성층에서 DNA를 침전시키기 위해 1 밀리리터의 냉각 된 100 % 에탄올과 50 마이크로 리터의 아세트산 나트륨을 첨가하십시오. 반전으로 혼합하고 샘플을 밤새 섭씨 영하 20도에 놓습니다. 원심분리로 DNA를 펠릿화한 후 모든 액체를 제거하고 DNA 펠릿을 자연 건조시켜 소생시킵니다.

50마이크로리터의 TE 버퍼에 매달아 놓습니다. 이 게놈 DNA 템플릿을 사용하여 바이러스 삽입을 위한 PCR 스크리닝을 수행할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 여러 태그가 있는 재조합 바이러스를 생성합니다.

이러한 재조합 백시니아 바이러스는 각각 내부 바이러스 코어와 외부 외피의 일부인 바이러스 구조 단백질인 A 3 및 F 13을 표적으로 하는 형광 마커로 태그된 단백질을 발현합니다. 바이러스 입자를 시각화하기 위해 virion 국소 단백질에 해당하는 유전자를 선택했습니다. A 3은 백시니아 비리온(vaccinia virion)의 핵심 단백질이고, F 13은 바이러스 외피 단백질입니다.

형광 표지된 A 3 및 F 13을 모두 가진 이중 태그 바이러스도 이중 표지된 바이러스로 실시간 형광 현미경 검사를 수행할 수 있는 것으로 나타났습니다. 이 경우, 백시니아 바이러스의 내핵 단백질입니다. 3은 빨간색으로 표시되고 외부 외피 단백질 F 13은 녹색으로 표시됩니다.

바이러스 팩토리에서 래핑되지 않은 바이러스 입자는 빨간색으로 시각화되고 래핑된 비리온은 빨간색과 녹색 채널의 공동 국소화로 표시됩니다. 재조합 벡터와 백시니아 바이러스 게놈 간의 재조합 효율을 결정하기 위해 정량 분석을 사용했습니다. 백시니아 바이러스 게놈과 벡터의 상동 재조합의 효율성은 70개의 낮은 상동성 염기쌍 영역에서도 검출할 수 있습니다.

이 방법은 여러 형광 태그 또는 여러 유전자 결실을 가진 바이러스를 만드는 데 사용되었습니다. 이는 바이러스 감염 수명 주기, 숙주 방어 시스템을 파괴하는 바이러스 단백질의 역할, 숙주 신호 전달 과정과의 상호 작용에 대한 연구에 사용되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 사용된 태그에 모듈식이고, 원하는 재조합 바이러스를 세심하게 해결하며, 다양한 연구 컨텍스트에 적용할 수 있는 방법을 사용하여 재조합 백시니아 바이러스를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.