Name: 형광 태그 바시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을위한 방법론 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 배우세요 형광 태그가 결합된 재조합 바시니아 바이러스를 효율적으로 생성하는 모듈식 방법을. 일시적 우성 선택법을 활용하여 유전자 수정의 유연성을 높이고 바이러스 분리 효율을 개선합니다.

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이 작품은 호주 연구 위원회 연방 발견 프로젝트 보조금 #1096623 의해 지원되었다.

1. 재조합 벡터 만들기
<ol><li>N-또는 C-말단이 관심의 바이러스 유전자를 라벨에 기르는 데 필요한 150bp 길이의 상동성 영역(왼쪽 및 오른쪽 팔이라고 함)을 식별합니다(그림 1b참조).</li>
	<li>선택의 제한 부위에 의해 분리된 150 bp 좌우 팔을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 설계한다. 이 전체 시퀀스는 또한 두 번째 제한 사이트 쌍(첫 번째 쌍과 다른)에 의해 측면에 있어야 만 한 번 합성된 TDS 벡터에 통합할 수 있습니다. 서열이 원하는 삽입 부위와 프레임에 있는 제한 부위로 올리고뉴클레오티드를 설계할 때 주의하십시오.</li>
	<li>합성을 위해 올리고뉴클레오티드를 설계할 때 왼쪽팔과 오른쪽 팔 사이에 제한 부위를 통합하면, 이는 선택의 형광 태그의 열린 판독 프레임을 측면으로 하는 것과 일치해야 한다(도 1b참조). TI 제한 부위를 왼쪽 팔과 형광 태그의 시작 사이에 3개의 아미노산 링커로 사용할 수 있다.</li>
	<li>PCR에 의해 형광 태그의 양쪽에 이러한 동일한 제한 사이트를 통합합니다(그림 1c참조).</li>
	<li>합성된 조각을 TDS 벡터로 복제합니다.</li>
	<li>형광 태그를 상동성의 왼쪽 및 오른팔 영역 사이의 제한 부위를 사용하여 결과 재조합 벡터로 복제합니다(그림 1d참조).</li>
</ol>2. 재조합 바이러스 생성
<ol><li>도 2에따라, 감염의 복합성(MOI)> 1에서 혈청이 없는 매체에서 백시니아 바이러스를 가진 BS-C-1 세포의 단층을 감염한다.</li>
	<li>1 시간 감염 후, 덜벡코의 수정 독수리 매체 (DMEM)와 구조 세포 (DMEM) 및 혈청없는 매체에서 3 :1의 비율로 재조합 벡터 플라스미드 및 경질 시약의 혼합물과 트랜스펙트.</li>
	<li>24 시간 후에, 태아 소 혈청 (FBS)를 포함하는 DMEM에 있는 세포를 긁어 내고 복구하고 열린 세포를 끊고 바이러스 입자를 풀어 놓기 위하여 3개의 동결 해동 주기를 능력을 발휘합니다.</li>
	<li>10% FBS DMEM 및 GPT 선택 시약 마이코페놀산(25 μg/ml) 및 크산틴(250 μg/ml)의 액체 오버레이로 플라크 분석작업을 수행합니다.<ol>
<li>BS-C-1 세포의 단층으로 6웰 플레이트를 시드합니다.</li>
		<li>개별 플라크의 적절한 분리를 보장하기 위해 바이러스 입자를 포함하는 동결 해동 세포의 직렬 희석으로 100 % 컨웰릭 셀 단층층을 감염시킵니다.</li>
		<li>GPT 선택 시약을 함유한 DMEM을 함유한 액체 10% FBS오버레이- 진협산과 산틴은 각각 25μg/ml 및 250 μg/ml의 최종 농도로.</li>
	</ol></li>
	<li>24 시간 인큐베이션 후, 액체 오버레이를 제거하고 형광 현미경을 사용하여 TDS 벡터에서 바이러스로 mCherry를 통합하는 데 해당하는 확산 적색 형광을 나타내는 플라크를 찾습니다. 표적 유전자 및 선택된 형광 태그에 따라 태그된 유전자의 국소형 형광도 동일한 적색 플라크에서 관찰될 수 있다.</li>
	<li>피펫 팁으로 스크래핑을 하고 DMEM을 포함하는 5% FBS의 100 μl을 사용하여 각 재조합 바이러스에 대해 여러 플라크를 선택하고, 스크랩된 세포의 3라운드가 재조합 바이러스를 방출합니다.</li>
	<li>성장 매체에서 GPT 선택 시약으로 재조합 바이러스를 증폭시키기 위해 12웰 플레이트의 세포의 단층층에 동결 해동 바이러스를 함유한 DMEM을 추가한다. 성공적인 증폭을 긁어 24 시간 감염.</li>
	<li>붉은 형광을 나타내는 성공적으로 증폭 된 플라크의 플라크 분석, 다음과 같이 아가로즈 오버레이 및 GPT 선택이 이번에는 다음과 같이 수행하십시오.<ol>
<li>BS-C-1 세포의 단층으로 6웰 플레이트를 시드합니다.</li>
		<li>재조합 바이러스의 직렬 희석을 수행하고 FBS 무료 DMEM에서 바이러스의 희석이 증가함에 따라 우물을 감염시.</li>
		<li>1 시간 감염 후, 액체 매체를 제거하고 2.5 % FBS, 292 μg / ml L-글루타민, 100 U / ml 페니실린 및 100 μg / ml 연쇄 상감 시술을 포함하는 최소 필수 매체 (MEM)에서 0.5 % 아가로즈로 각각 잘 오버레이하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>감염 후 2-3일, GPT 선택 없이, 이번에는 다시 증폭하기 위해 빨간색과 선택한 형광태그의 색을 표시하는 플라크를 선택한다.</li>
	<li>선택 없이 아가로즈 오버레이로 다음 플라크 분석작업을 수행합니다.</li>
	<li>확산적 적색 형광을 잃어버린 플라크를 선택하지만 선택한 태그에 해당하는 국소형 형광을 유지합니다.</li>
	<li>mCherry 및 gpt 선택 유전자를 잃었지만 선택한 태그에 대응하는 국소형 형광을 유지한 재조합 바이러스의 순수한 재고를 얻기 위해 선택없이 플라크 정화를 계속합니다. 확인 주식은 플라크 분석에 의해 순수, 모든 플라크는 유사한 플라크 표현형을 가져야한다.</li>
	<li>바이러스 성 주식이 순수하도록 유전체 DNA의 PCR 검사를 사용합니다.<ol>
<li>삽입된 형광 유전자 자체를 증폭시키는 형광 유전자 삽입 부위및 프라이머를 측면에 있는 프라이머를 설계합니다. 이 프라이머의 다른 조합은 유전자 삽입을 검출하고 순도를 나타내는 PCR 앰플리턴을 생성합니다.</li>
		<li>BS-C-1 세포의 12웰 플레이트 단층의 한 우물에서 PCR을 선별하는 바이러스 성 주식을 증폭시한다.</li>
		<li>감염 후 24시간, 감염된 세포를 DMEM의 250 μl로 긁어냅니다.</li>
		<li>원심분리기 감염 세포(10분 당 18,000 x g, 4°C), 슈퍼나탄을 제거하고 500 μl TE(10m Tris-HCl 및 1mMM EDTA, pH 8)에서 세포 펠릿을 0.1%(v/v) SDS로 제거한다. 세포를 lyse 소용돌이.</li>
		<li>500 μl 페놀-클로로폼-이소아밀 아코홀을 넣고 섞어 넣습니다. 원심분리기 (4 분, 4 °C에 대한 18,000 x g). 상체를 가지고 반복합니다.</li>
		<li>1 ml 100% 에탄올(냉장) 및 50 μl 나트륨 아세테이트를 추가하여 상수에 에탄올 침전을 수행하여 혼합을 반전시합니다.</li>
		<li>하룻밤 -20 °C 또는 -80 °C에서 1 시간 동안 둡니다. 원심분리기(30분 동안 18,000xg, 4°C)는 모든 액체를 제거하고 침전된 DNA를 공기 건조시킬 수 있도록 합니다. 50 μl TE로 다시 중단합니다.</li>
		<li>게놈 DNA PCR 스크리닝을 위한 템플릿으로 이것을 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 하나 이상의 태그를 들고 재조합 바이러스의 세대
<ol><li>형광 재조합 바이러스와 동일한 세포 단층을 코감염하여 프로토콜 1)에서 이중 또는 삼중 표지 바이러스를 만들거나 다른 태그로 반복 절차를 만듭니다.</li>
	<li>바이러스의 플라크 표현형 또는 PCR 스크리닝에 기초하여 바이러스를 정화하여 게놈 DNA를 분리합니다.</li>
</ol>

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</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

이 기술은 형광태그바이러스 단백질을 발현하는 재조합 바이러스의 생성을 위한 효율적이고 모듈적인 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 바이러스 게놈에 대한 유일한 변화가 태그 나 마커를 추가하여 선택 마커를 남기지 않도록합니다. 동종 재조합에 필요한 짧은 팔 길이는 직접 합성을 가능하게하여 PCR 및 복제의 몇 시간 소모적인 라운드를 제거하며, mCherry 및 신진 대사 GPT 선택의 형광은 바이러스 재조합 중간체를 분리하는 데 사용됩니다. 이러한 중급자는 선택의 제거 에 따라 태그된 유전자를 가진 바이러스 또는 다시 부모 유형으로 해결할 수 있다. 형광 및 대사 선택 모두의 사용을 포함하는 유사한 방법은 이전에 설명되었다27 이 연구에서 사용되는 방법은 호동성의 짧고 합성 된 영역을 활용하지만, 관심의 태그 유전자의 형광을 이미징하여 원하는 재조합 바이러스의 식별을 허용. 이 이 이차 선택은 플라크 분석에서 충분한 형광을 생성하는 높게 발현된 바이러스 유전자를 태그하는 것에만 적용됩니다. 대안적으로, 하나는 완전한 발현 카세트의 삽입을 상상할 수 있었다, 예를 들어 강한 바이러스 성 프로모터의 형광 단백질. 이 경우 좌우 팔은 태그되는 바이러스 유전자보다는 삽입 지점을 정의할 것이다.
실험 절차 중에 도움이 입증 된 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 위에서 설명한 2.3.3 단계의 액체 오버레이는 적색/녹색 형광 플라크의 검출 및 격리에 매우 중요한 것으로 입증되었습니다. 우리는 GPT 선택 시약과 아가로즈 오버레이의 조합이 재조합 바이러스의 성장을 억제하고 그러므로 전환 후 바이러스를 증폭시키는 첫번째 단계를 위한 액체 오버레이로 전환했다고 믿습니다. 또한 왼쪽 팔 재결합으로 인한 중간체가 플라크에서 관찰되는 확산 형광을 초래할 수 있으므로 농축 및 정제를 위해 국소화된 태그 색 형광을 나타내는 형광 플라크를 선택하는 것도 중요합니다. TDS 벡터내의 mCherry 마커 유전자는 또한 gfp로대체될 수 있고, 예를 들어, 형광태그로서 mCherry의 쉬운 편입 및 선택을 가능하게 한다.
위에서 설명 한 일부 기술은 재조합 vaccinia 바이러스를 만드는 설립 된 방법에서 약간 다릅니다. 예를 들어, 재조합제를 만드는 데 사용되는 바이러스의 MOI는 일반적으로 128미만이지만, 더 높은 MOI의 사용은 이 방법에 의한 재조합 vaccinia 바이러스의 생성에 충분하였다. GPT 선택 시약의 사용은 일반적으로 선택 시약(18)을가진 세포의 사전 배양을 요구하지만, 구조 단계 사후 감염 중에 그들을 추가하는 것은 여전히 원하는 재조합의 충분한 선택을 제공, 특히 형광 선택 마커의 존재로 인해 뿐만 아니라.
앞에서 언급했듯이, 이 기술의 한계 중 하나는 이차 형광 선택 단계가 플라크 분석에서 눈으로 검출할 수 있는 수준에서 고도로 발현되는 관심의 태그된 단백질에 의존한다는 것입니다. 이없이, 그것은 단지 mCherry 형광을 전시 바이러스를 정화 할 수있을 것입니다, 그 중 적어도 50 %는 원하는 재조합 바이러스를 포함 할 것, 이는 단계에서 설명 PCR과 같은 분자 전략에 의해 식별 될 수있다 2.12 위의. 또 다른 제한은 그들의 태그의 결과로 특정 단백질의 불활성화 일 수 있습니다. 형광 태그는 돌연변이를 겪거나 시간이 지남에 따라 통과와 재조합 바이러스에 의해 절제 될 수있다. 따라서, 현미경 및 PCR에 의한 재조합 바이러스 주식의 정기적인 샘플링을 권장합니다. 마지막으로, 단일 바이러스에 통합될 수 있는 형광 태그 단백질의 수에 제한이 있을 수 있다. 이 것의 한 가지 측면은 그들 모두를 동시에 시각화 하는 기능; 사용 가능한 형광 태그의 방출 스펙트럼의 중복 특성을 감안할 때, 최소한의 스펙트럼 출혈을 보장하기 위해 신중하게 선택하는 것이 중요합니다. 또한, GFP 및 Cerulean과 같은 밀접한 관련 태그를 사용하면 재조합 게놈의 위치에 따라 둘 사이의 재결합 가능성을 열어줍니다.
이 기술의 모듈식 특성은 다른 염색 및/또는 태그 선택과의 호환성을 기반으로 형광 태그의 간단한 대체를 가능하게 합니다. 선택 가능한 마커를 절제함으로써, TDS 방법은 다양한 형광 단백질의 직렬 첨가 또는 TDS 기반 태그의 조합을 TDS 기반 유전자 삭제에 대한 Phenotypic 분석29을허용한다. 이러한 접근법의 유용성에 대한 예로, 바이러스 코어와 WV 멤브레인에 라벨을 붙이는 이중 태그형 형광 바이러스가 생성되었다. 이 바이러스를 가진 화상 진찰 연구 결과는 바이러스 복제 도중 바이러스의 운동, 형태발생 및 포장을 공부하는 것을 이용될 수 있었습니다. 아직 특징이 없는 바시니아 바이러스 성 단백질은 또한 태그및이 기술에 의해 공부 될 수있다.
Vaccinia 바이러스는 살아있는 세포 현미경 검사법에 유리한 바이러스의 많은 특성 때문에 화상 진찰 연구 결과에서 광범위하게 이용되었습니다. 형광 태그는 바이러스 게놈으로부터 발현되어, 형질 전환의 필요성을 제거하고, 감염된 동물 또는 비트랜스펙트 세포로부터 유래된 1차 세포를 쉽게 분석할 수 있게 한다. 처음에 형광 VACV는 바이러스운동의간단한 세포간 추적을 위해 사용되었지만, 최근의 접근법은 FRET연구(31),단일 바이러스 입자에서 FRAP, 프로모터 리포터33,인포탈 이미징34,구조 연구35-37을포함하는 그들의 유틸리티를 확장하였다. 이러한 모든 기술은 재조합 형광 바이러스를 만드는이 방법과 결합 된 쉽고 가까운 도달 내에있을 수 있습니다.

Vaccinia 바이러스 (VACV)는 발상 포크스 바이러스이며 천연두의 원인제인 바리올라 바이러스와 매우 관련이 있습니다. 이들 바이러스 는 모두 원숭이포와 에크로멜리아 바이러스(mousepox)1과같은 다른 주목할 만한 병원체를 포함하는 정형외과 속의 구성원이다. 정형외과바이러스는 200개 이상의 예측된 오픈 판독 프레임2,3이상을인코딩하는 대형 이중 좌초 DNA 게놈(180-220 kb)을 갖는다. 이러한 바이러스의 복제는 성숙한 바이러스 (MV)가 만들어지는 페리 핵 바이러스 공장의 형성과 MV의 하위 집합이 포장 된 바이러스 (WV)를 생성하기 위해 두 개의 추가 멤브레인을 획득하는 트랜스 골기 네트워크 (로버츠와 스미스4에의해 검토됨)를 포함한다. 정형외과 게놈은 VACV 게놈 복제의 특징이며 바이러스 DNA 폴리머라제5에의해 매개되는 높은 수준의 유전적 재조합으로 인해 유전적 조작에 매우 순종적이다. 재조합 바이러스생성은 12bp만큼 작은 동종요법을 가진 동종 재조합 및 선형 DNA 분자에 의존하여 암시니아 바이러스 감염 세포6에서재조합을 중재하기에 충분하다. 백시니아 바이러스의 형광 라벨링은 비리온 당 많은 형광 단백질의 통합을 허용하는 정형 외과 입자의 큰 크기로 인해 매우 밝은 바이러스 입자를 얻을 수 있습니다7. Vaccinia는 외국 DNA8의 큰 단편을 운반할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 또한, 경질 캡시드 대칭의 부족은 내인성 loci9로부터바이러스 성 단백질 유전자 융합을 표현할 때 유연성의 정도를 허용할 수 있다. VACV 단백질의 형광 태깅은 세포 외 수준에서 숙주 병원체 상호 작용의 연구에 귀중한 것으로 입증되었으며, 특히 바이러스 항목10,수송11-13및 형태 발생, 특히 포장 된 virions7의분야에서.
재조합 바이러스는 감쇠된 성장 표현형14,15,대사 선택16-18,또는 마커 유전자의 발현에 의해 선택될 수 있다(예를들어 X-gal19 또는 형광 단백질13,20). 여기서 우리는 형광및 신진 대사 선택의 강력한 조합을 사용하여 형광 바이러스의 선택을 설명합니다. 포크너와 모스(1990)21에의해 개발된 일시적인 지배적 선택(TDS) 벡터는 원하는 형광 태그 유전자와 함께 마커를 통합할 수 있게 한다. 대사 선택이 제거되면, 선택 유전자를 소비하는 이차 재결합 이벤트가 발생할 수 있지만 형광 태그 바이러스 단백질을 그대로 둡니다. 그림 2 아래는 실험 절차에 대한 개요를 제공합니다. 본 연구에서 활용된 선발 유전자는 mCherry 및 대장균 구아닌 인지질전달제(gpt) 유전자이며, 둘 다 합성 초기/후기 바이러스 프로모터로부터 발현되어 Cordeiro 외에서 이전에사용하였다. 22 또한, 관심의 태그 융합 단백질의 형광이 있다. 대사 선택이 제거되면 선택 가능한마커(mCherry 및 gpt)가절제되어 태그된 유전자의 형광만 남기고 올바른 재조합 바이러스의 식별을 허용합니다. 선택 마커의 절제는 여러 형광 태그를 결합 할 수있는 가능성을 제공, 우리가 동시에 여러 바이러스 단백질을 표시 할 수있는 능력과 바이러스를 만들 수 있도록. 이전 연구는 백시니아 바이러스 감염 세포 로 전염선형 및 원형 DNA 분자의 백시니아 재조합에 대한 최소한의 상동성 요구 사항을 결정했다6. 우리는 박시니아 바이러스 게놈에 의한 통합을 통해 gpt-mCherry TDS 벡터에 있는 측면 무기의 다양한 상동성 길이의 재조합 효율성을 결정하고 싶었습니다. TDS 벡터에서 100 bp의 상동성 영역이 상동성 재조합에 의해 VACV 게놈으로 재조합 된 DNA의 삽입을 표적으로 하고 중재하기에 충분하다는 것을 결정하였다(도4). 작은 homology 길이 는 또한 재조합을 가능하게 할 것이지만, 100 bp homology 길이는 신진 대사와 형광 선택으로 쉽게 확인할 수 있는 충분한 재조합 바이러스를 제공했습니다. 이 크기의 DNA 단편은 상대적으로 저렴한 비용으로 상업적으로 합성될 수 있으며 재조합 바이러스의 생성을 위한 다중 벡터의 생산을 크게 용이하게 한다. 우리는 편성 영역의 올리고 뉴클레오티드 서열의 합성 비용을 유지하면서 더 큰 재조합 주파수를 제공하기 위해 150 bp로 상동성 길이를 증가하기로 결정했습니다.

<table><tbody><tr><td>Mycophenolic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3536-50MG</td><td>0.1 N NaOH</td></tr><tr><td>xanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X0626-5G</td><td>0.1 N NaoH</td></tr><tr><td>FuGENE HD transfection 시약</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>에 용해;</td></tr><tr><td>크로마 필터 31001, 31002</td><td>올림푸스, 크로마</td><td>BX51(올림푸스)이 장착된 형광 현미경; 31001, 31002(크로마)</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

형광 태그 바시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을위한 방법론

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

형광 단백질을 가진 바이러스성 단백질의 태깅은 바이러스 호스트 상호 작용의 우리의 이해를 발전시키기 위하여 필수적인 접근이 입증되었습니다. 천연두 박멸에 사용되는 살아있는 백신인 Vaccinia 바이러스(VACV)는 큰 비리온 크기와 게놈 수준에서 설계할 수 있는 용이성으로 인해 형광형 세포 현미경 검사법을 특히 준수할 수 있습니다. 우리는 여기에 재조합 바이러스를 생성하기위한 최적화 된 프로토콜을보고합니다. 진공 복제 중 대상 동종 재조합에 대한 최소한의 요구 사항이 결정되어 구성 생성을 단순화할 수 있습니다. 이를 통해 형광 기자및 대사 선택과 함께 일시적인 지배적 선택(TDS)의 동맹을 통해 형광성 라벨 바이러스 단백질에 대한 신속하고 모듈적인 접근법을 제공할 수 있었습니다. 형광 재조합 바이러스의 생성을 간소화함으로써 바이러스 복제 중에 발생하는 바이러스 호스트 상호 작용의 여러 측면에 대한 고급 이미징 분석과 같은 다운스트림 응용 프로그램을 용이하게 할 수 있습니다.

도 1에는 이 절차에 필요한 다양한 구문이 나열되어 있는데, 이 컨던스는합성(그림 1b 및 1c)또는 복제 단계(그림1d)에의해 생성됩니다. 도 2는 선택 과정의 각 단계에 대해 묘사된 A3-GFP 재조합 VACV의 대표적인 형광 플라크 이미지를 통해 실험 절차의 개요를 제공한다. 도 3에서,내측 바이러스 코어(23)와 외부봉투(24)의일부인 바이러스 구조 단백질 A3 및 F13을 대상으로 형광 마커로 태그된 단백질을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스가 각각 도시되어 있다. 생성된 재조합 바이러스각각에 대한 바이러스 플라크 및 감염된 세포의 관측이 묘사됩니다. 그것에 homology의 70 bp 영역으로 포함하는 VACV 게놈과 벡터의 상동성 재조합의 효율은, 시험되고 결과는 도 4에묘사된다. 100 bp homology를 포함하는 벡터와의 재결합으로 만든 바이러스 성 플라크를 식별하는 상대적 성공은 대상 유전자에 상동성의 150 bp 길이 왼쪽 및 오른쪽 팔을 합성하기로 선택한 뒤에 추론했다.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1.jpg" width="400px"> 그림 1. TDS(일시적 지배적 선택) 재조합 벡터. (a)TDS 벡터와 gpt 및 mCherry 선택 마커. (b)상동성의 좌우 팔은 호모로지의 팔 사이와 측면에 있는 특정 제한 부위로 설계되었습니다. 이 방법에 사용되는 좌우 팔 사이의 제한 부위는 NotI와 BamHI였으며, NotI 사이트는 유전자와 형광 태그 사이의 링커로도 사용되고 있었다. (c)이 방법과 호환되는 형광 태그는 해당 제한 부위에 의해 측면에 있습니다. 일부 태그는 GFP (녹색 형광 단백질), RFP (적색 형광 단백질), Cerulean (ECFP에 개선, 시안 형광 단백질, 사이트 지향 돌연변이 발생25에의해) 및 미니 SOG, 조명에 EM에 의해 resolv able 제품을 만드는 GFP에서 설계된 형광 단백질26. (d)최종 TDS 재조합 벡터의 생성에 관여하는 복제 단계. 좌우 측면 팔을 포함하는 합성된 올리고뉴클레오티드는 먼저 TDS 벡터로 복제된다. 이렇게 하면 좌우 팔 사이에 통합된 제한 사이트로 복제하여 선택한 태그가 안팎으로 셔틀링될 수 있는 재조합 벡터를 제공합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2.jpg" width="500px"> 그림 2. 재조합 vaccinia 바이러스를 만드는 실험 절차의 개요. 유전 및 세포 수준에서 발생하는 이벤트는 A3-GFP 라벨형 광등 백신 바이러스의 생성 다음 단계를 요약 대표 플라크 이미지와 함께 묘사된다. (a)박시니아 바이러스에 감염된 세포는 TDS 재조합 벡터에 감염된다. (B)이 그림에서는 왼손 재조합의 결과만 묘사되고 그 예는 GFP를 선택의 형광태그로 사용한다. 오른손 재조합은 태그가 중간 단계, 즉 단계 C에서 전체 표적 유전자에 융합될 것을 제외하고는 전체 TDS 플라스미드가 유사한 방식으로 게놈으로 통합되는 결과를 낳을 것이다. 플라크 분석은 재조합 혼합과 함께 세포 단층상에서 수행되고 GPT 선택을 실시한다. (C)각각 mCherry 및 GFP 발현에 해당하는 적색 및 녹색 형광을 모두 나타내는 플라크를 골라 증폭한다. 선택이 제거되면, gpt 및 mCherry 유전자(D)의손실에 대응하는 적색 형광의 손실이 있을 것이며 독점적으로 녹색 형광을 나타내는 플라크를 골고 증폭(E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3.jpg" width="500px"> 그림 3. TDS 재조합 시스템의 대표적인 결과. 이미지는 8시간 후 해당 재조합 바이러스에 감염된 단일 세포의 이미지와 함께 48시간(a, c, e및 스케일 바 100 μm) 후 재조합 VACV 감염 세포의 전체 플라크를 묘사한다(b,b, f;스케일 바 10 μm). 비리온-국소화 단백질에 대응하는 유전자는 바이러스 입자를 시각화하기 위해 선택되었다. A3는 백시니아 비리온(a, b)및 F13(c, d)의핵심 단백질은 바이러스 봉투 단백질이다. 형광 라벨A3및 F13(e, f)를모두 가진이중 태그 바이러스도 도시된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4.jpg" width="500px"> 그림 4. 재조합 벡터와 VACV 게놈 사이의 재조합 효율성의 정량적 분석. BS-C-1 단층은 VACV에 감염되었고 VACV 게놈에 500bp, 100 bp 또는 70 bp의 상동성 영역을 포함하는 3개의 재조합 벡터로 1시간 후 감염을 감염하였다. 각 벡터에는 또한 gpt 및 mCherry 선택 유전자를 포함하는 TDS 카세트를 포함하였다. 세포는 감염 후 24시간 회수되었고, 형성된 재조합 바이러스를 방출하기 위해 용인되었다. 플라크 어설션은 GPT 선발 매체와 함께 세포 리세이트에서 수행되었고, mCherry 형광을 보여주는 플라크는 성공적인 재조합으로 계산되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5.jpg" width="500px"> 그림 5. 여러 복제 부위를 보여주는 gpt-mCherry TDS 벡터의 지도. 벡터는 이전에 설명된22및 벡터 맵은 장 랩 그룹(SCU)에서 EZ 플라스미드 맵 v1.9의 도움으로 만들어졌습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

과도 우세 선택 방법을 이용하여 동시에 형광 태그단백질을 발현하는 재조합 암시니아 바이러스의 생성을 위한 신속하고 모듈식 프로토콜이 여기에 설명되어 있다.

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

본 실험에서는 일시적 우성 선택(transient dominant selection)에 기반한 모듈식의 신속한 방법을 통해 형광 표지된 재조합 백시니아 바이러스를 생성합니다. 먼저, 합성된 최소 상동성 영역(minimal regions of homology)으로 둘러싸인 형광 태그와 대사 및 형광 선택을 위한 마커를 포함하는 재조합 벡터를 제작합니다. 이 재조합 벡터를 감염된 세포에 형질전환(transfection)하고, 대사 선택과 형광을 이용하여 재조합 바이러스를 증폭합니다. 다음으로, 대사 선택을 제거하여 마커 카세트를 절제하고, 형광 마커 선택을 통해 재조합 바이러스를 포함하는 세포를 분리합니다. 세포 단일층 상의 바이러스 플라크 결과물을 통해 형광 표지된 유전자의 특성을 가진 개별 바이러스 입자를 시각화할 수 있습니다.우리는 태그의 종류와 관계없이 반복적이고 보편적으로 사용할 수 있는 선택 방법을 이용해, 다중 유전적 변형이 이루어진 재조합 바이러스를 생성하고자 이 방법을 개발했습니다. 일시적 우성 선택(transient dominant selection)의 원리는 이전에 설명된 바 있으나, 우리는 게놈 변형 시 더 높은 유연성을 확보하기 위해 이를 더 큰 규모로 모듈 방식으로 적용하고자 했습니다. 재조합 바이러스의 플라크 스크리닝 및 분리가 까다로울 수 있으므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 재조합 바이러스의 출현 빈도가 낮을 수 있기 때문에, 바이러스를 효율적으로 회수하기 위해서는 몇 가지 독특한 방법이 필요합니다.단백질의 N-말단 또는 C-말단에 관심 있는 바이러스 유전자를 표지하십시오. 이에 따라 150 base pair 길이의 상동성 플랭킹 영역을 확인하십시오. 그런 다음, 선택한 한 쌍의 제한 효소 인식 부위로 분리된 150 base pair 길이의 좌우 암(arm)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 설계하십시오. 또한, 합성 후 TDS 벡터에 삽입할 수 있도록 첫 번째 쌍과 다른 두 번째 제한 효소 인식 부위 쌍으로 이 영역을 플랭킹하십시오. 이제 제한 효소 인식 부위가 포함된 올리고뉴클레오타이드가 원하는 삽입 부위와 프레임이 일치하도록 설계되었는지 확인하십시오. 올리고뉴클레오타이드 합성을 위해, 좌우 암 사이에 삽입된 제한 효소 인식 부위가 선택한 형광 태그의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 플랭킹하는 부위와 일치하는지 확인하십시오. PCR을 통해 형광 태그의 양측에 동일한 제한 효소 인식 부위를 도입하십시오. 합성된 단편을 TDS 벡터에 클로닝하십시오. 또한 상동성 좌우 암 영역 사이의 제한 효소 인식 부위를 사용하여 형광 태그를 생성된 재조합 벡터에 클로닝하십시오. 무혈청 배지에서 BS-C-one 세포 단층에 백시니아 바이러스를 감염시키십시오.감염 1시간 후, Dulbecco's modified eagle medium으로 세포를 회복시킵니다. 무혈청 배지에서 재조합 벡터 플라스미드와 트랜스펙션 시약을 3:1 비율로 혼합하여 트랜스펙션을 수행합니다. 24시간 후, 세포를 긁어내어 태아 송아지 혈청(fetal bovine serum)이 없는 DMEM에서 회복시킵니다. 세포를 세 차례 동결-융해(freeze-thaw) 사이클에 노출시켜 세포를 파쇄하고 바이러스 입자를 방출시킵니다. 다음으로, 개별 플라크를 적절히 분리하기 위해 100% 합류(confluent)된 BS-C-one 세포 단층에 바이러스 입자 조제물의 연속 희석액을 감염시킵니다. 10% FBS와 DMEM, GPT 선택 시약이 포함된 액체 층을 덮고 24시간 동안 배양합니다.액체 오버레이를 흡입하고 형광 현미경을 사용하여 TDS 벡터로부터 바이러스로 mCherry가 삽입되어 확산된 적색 형광을 나타내는 플라크를 찾습니다. 표적 유전자와 선택한 형광 태그에 따라, 동일한 적색 플라크 내에서 태그 유전자의 국소적 형광이 관찰될 수도 있습니다.이제 각 재조합 바이러스에 대해 여러 개의 플라크를 선택하고, 피펫 팁으로 긁어내어 100 µL의 5% FBS 함유 DMEM과 함께 세포를 Eppendorf 튜브로 옮깁니다. 긁어낸 세포를 세 차례 동결-해동하여 재조합 바이러스를 방출시킵니다.동결-해동된 바이러스가 포함된 DMEM을 12-웰 플레이트의 세포 단층에 첨가하고, 성장 배지 내의 GPT 선택 시약으로 재조합 바이러스를 증폭합니다. 그 후, 감염 24시간 후에 성공적으로 증폭된 바이러스를 긁어내어 수집합니다. 적색 형광을 나타내는 성공적으로 증폭된 플라크의 플라크 분석을 위해, 6-웰 플레이트에 BS-C-one 세포 단층을 파종합니다.재조합 바이러스를 단계 희석하고, FBS가 없는 DMEM에 희석된 바이러스를 농도별로 각 웰에 감염시킵니다. 감염 1시간 후 액체 배지를 제거하고, 각 웰에 완전 최소 필수 배지가 포함된 0.5% 아가로스를 덮어줍니다. 감염 3일 후, 적색과 선택한 형광 태그 색상이 모두 나타나는 플라크를 선택합니다.GPT 선택 없이 이들을 다시 증폭하십시오. 확산된 적색 형광은 소실되었으나, 선택한 태그에 해당하는 국소적 형광은 유지하고 있는 플라크를 선택하십시오. 선택 과정 없이 플라크 정제를 계속하여, M-cherry 및 GPT 선택 유전자는 소실되었으나 선택한 태그에 해당하는 국소적 형광은 유지하는 재조합 바이러스의 순수 스톡을 확보하십시오.모든 플라크가 유사한 플라크 표현형을 갖는 것을 목표로 플라크 분석법을 통해 스톡의 순도를 평가합니다. BS-C-one 세포 단일층에서 테스트 바이러스 스톡을 증폭시킵니다. 감염 24시간 후, 감염된 세포를 250 µL의 DMEM에 긁어 모읍니다. 감염된 세포를 원심 분리하고 상층액을 제거한 뒤, 세포 펠릿을 TE 버퍼 내 0.1% SDS 500 µL에 재부유시킵니다. 볼텍싱하여 세포를 용해합니다. 그 다음 phenol, chloroform, isoamyl alcohol 500 µL를 첨가하고 뒤집어 섞습니다. 원심 분리합니다. 상층을 회수하고 추출 과정을 반복합니다.그 다음 수성층에서 DNA를 침전시키기 위해, 차갑게 식힌 100% 에탄올 1 mL와 소듐 아세테이트 50 µL를 첨가합니다. 뒤집어서 섞은 후 샘플을 -20 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 원심분리로 DNA를 펠렛화한 후, 모든 액체를 제거하고 DNA 펠렛을 공기 건조시킨 뒤 50 µL의 TE 버퍼에 재현탁합니다. 이 게놈 DNA 템플릿을 사용하여 바이러스 삽입 여부를 PCR 스크리닝합니다. 텍스트 프로토콜에 상세히 기술된 대로 다중 태그가 포함된 재조합 바이러스를 생성합니다.이러한 재조합 백시니아 바이러스는 각각 바이러스 내부 코어와 외부 외피의 일부인 바이러스 구조 단백질 A3 및 F13을 표적으로 하는 형광 마커가 태그된 단백질을 발현합니다. 바이러스 입자를 시각화하기 위해 비리온에 위치한 단백질에 해당하는 유전자들이 선택되었습니다. A3는 백시니아 비리온의 코어 단백질이며, F13은 바이러스 외피 단백질입니다.형광 표지된 A3와 F13을 모두 가진 이중 표지 바이러스 또한 나타나 있습니다. 이중 표지 바이러스를 통해 실시간 형광 현미경 관찰이 가능합니다. 이 사례에서는 백시니아 바이러스의 내부 코어 단백질인 A3는 빨간색으로, 외부 외피 단백질인 F13은 초록색으로 표지되었습니다.바이러스 공장에서 생성되어 외피가 없는 바이러스 입자는 빨간색으로 시각화되었으며, 외피가 있는 비리온은 빨간색과 녹색 채널의 공국소화(colocalization)로 나타납니다. 재조합 벡터와 백시니아 바이러스 게놈 간의 재조합 효율을 결정하기 위해 정량 분석이 사용되었습니다. 백시니아 바이러스 게놈과 벡터의 상동 재조합 효율은 70 base pair 정도의 짧은 상동성 영역으로도 검출될 수 있습니다.이 방법은 여러 개의 형광 태그를 부착하거나 다중 유전자를 결손시킨 바이러스를 제작하는 데 사용되어 왔습니다. 이러한 바이러스들은 바이러스 감염 생애 주기 연구, 숙주 방어 체계를 무력화하는 바이러스 단백질의 역할, 그리고 숙주 신호 전달 과정과의 상호작용 연구에 활용되어 왔습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 사용되는 태그의 모듈성이 뛰어나고 원하는 재조합체를 정밀하게 분리할 수 있으며 다양한 연구 맥락에 적용 가능한 방법을 통해 재조합 백시니아 바이러스를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

methodology-for-efficient-generation-fluorescently-tagged-vaccinia

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

synaptically 연결 뉴런을 추적하는 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 관심의 세포 인구가 유전자 정의 셀 유형에서 시냅스 입력을 받고 있는지 여부를 조사하기 위해 상류 세포의 TVA의 특이성을 사용합니다.

유 전적으로 정의 된 신경 회로의 추적 바이러스

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the expansion of plaque-derived recombinant virus in adherent mammalian cells. The virus carries a fluorescent reporter in place of a virulent gene, enabling infection tracking. Infected cells are harvested for PCR verification of the genetic modification.

Expansion of Mutant Vaccinia Virus in Mammalian Cells

플레이트에서 HeLa 세포를 분리하고 성장 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM], 2 mM L-glut, 10% 소태아혈청 [FBS])로 희석하여 약 2.0 x 10⁵ cells/ml 농도로 맞춘다. 검은색 벽면과 투명한 평평한 바닥을 가진 96-well 플레이트에 웰당 100 μl(20,000 cells/well)씩 분주한다. 37 °C 인큐베이터(+ 5% CO₂)에서 세포가 합쳐질(confluent) 때까지 24시간 동안 배양한다.

형광 리포터를 이용한 백시니아 바이러스의 단계별 유전자 발현 모니터링

출처: Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. 종양 표적 면역 조절을 위한 파라믹소바이러스: Ex Vivo 설계 및 평가. J. Vis. Exp. (2019)본 영상에서는 리포좀을 사용하여 바이러스 안티게놈과 필수 헬퍼 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 생산 세포로 전달함으로써 재조합 홍역 바이러스를 생성하는 과정을 보여줍니다. 전사 및 복제된 RNA는 면역 자극 및 형광 리포터 단백질을 발현하는 바이러스 입자의 형성으로 이어집니다. 이후 형광 현미경을 사용하여 씽시튬(syncytia) 형성을 시각화함으로써 재조합 바이러스가 성공적으로 생산되었음을 확인합니다.

면역 자극 단백질을 인코딩하는 재조합 홍역 바이러스의 생성

그림 1에 따라, 무혈청 배지에서 감염 다중도(MOI) 1 초과로 BS-C-1 [Buffalo Subclone C-1 (CV-1 세포에서 유래한 원숭이 신장 상피 세포주)] 세포 단일층을 백시니아 바이러스로 감염시킨다. 감염 1시간 후, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)으로 세포를 회복시키고, 무혈청 배지에서 재조합 벡터 플라스미드와 트랜스펙션 시약의 혼합물을 3:1 비율로 트랜스펙션한다.

대사 및 형광 선택을 이용한 재조합 백시니아 바이러스 감염 세포의 식별

우리는 스펙트럼 구별 리포터 형광의 단계 - 특이 적 발현을 통해 바이러스 감염 및 유전자 발현의 실시간 측정을 가능하게하는 형광 리포터 백시 니아 바이러스의 사용을 설명한다. 우리 세부 정확하게 바이러스 복제가 저분자 저해에 응답하여 영향되는 단계를 식별하기위한 플레이트 기반 방법.

유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

여기서는 배큘로 바이러스 또는 포유류 발현 시스템, 및 초 원심 정제를 사용하여 바이러스 입자의 합성을위한 프로토콜을 제시한다. 이것은 매우 최적화 방법은 안전하고 유연하게 타겟으로 백신 바이러스 항원을 확인하는 데 사용된다.

표현과 예방 접종에 대한 바이러스 입자의 정제

백시 니아 바이러스 (VV)가 널리 생물 의학 연구 및 인간 건강의 개선에 이용되고있다. 이 문서에서는 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 VV 게놈을 편집 할 수있는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다.

간단하고 효율적인 접근 방법은 돌연변이 백시 니아 바이러스 벡터를 구축하기

칠면조 (HVT)의 herpesvirus 조류 질병의 숫자에 대 한 재조합 백신의 세대에 대 한 벡터 플랫폼으로 널리 사용 됩니다. 이 문서는 통합된 NHEJ-CRISPR/Cas9 및 Cre Lox 시스템을 사용 하 여 재조합 형 HVT 벡터화 백신의 세대에 대 한 간단 하 고 빠른 접근을 설명 합니다.

CRISPR/Cas9와 재조합 조류 Herpesvirus 벡터 생성 편집 진

이는 재조합 바이러스의 호스트 범위 선택 및 시각적 식별을 사용하여 "무소" 재조합 백시니아 바이러스를 생성하는 방법이다.

호스트 범위 및 시각적 선택을 사용하여 신속하고 원활한 재조합 Poxviruses 생성

배우세요 형광 태그가 결합된 재조합 바시니아 바이러스를 효율적으로 생성하는 모듈식 방법을. 일시적 우성 선택법을 활용하여 유전자 수정의 유연성을 높이고 바이러스 분리 효율을 개선합니다.

형광 태그 바시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을위한 방법론

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