형광 태그 바시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을위한 방법론

본 실험에서는 일시적 우성 선택(transient dominant selection)에 기반한 모듈식의 신속한 방법을 통해 형광 표지된 재조합 백시니아 바이러스를 생성합니다. 먼저, 합성된 최소 상동성 영역(minimal regions of homology)으로 둘러싸인 형광 태그와 대사 및 형광 선택을 위한 마커를 포함하는 재조합 벡터를 제작합니다. 이 재조합 벡터를 감염된 세포에 형질전환(transfection)하고, 대사 선택과 형광을 이용하여 재조합 바이러스를 증폭합니다. 다음으로, 대사 선택을 제거하여 마커 카세트를 절제하고, 형광 마커 선택을 통해 재조합 바이러스를 포함하는 세포를 분리합니다. 세포 단일층 상의 바이러스 플라크 결과물을 통해 형광 표지된 유전자의 특성을 가진 개별 바이러스 입자를 시각화할 수 있습니다.

우리는 태그의 종류와 관계없이 반복적이고 보편적으로 사용할 수 있는 선택 방법을 이용해, 다중 유전적 변형이 이루어진 재조합 바이러스를 생성하고자 이 방법을 개발했습니다. 일시적 우성 선택(transient dominant selection)의 원리는 이전에 설명된 바 있으나, 우리는 게놈 변형 시 더 높은 유연성을 확보하기 위해 이를 더 큰 규모로 모듈 방식으로 적용하고자 했습니다. 재조합 바이러스의 플라크 스크리닝 및 분리가 까다로울 수 있으므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 재조합 바이러스의 출현 빈도가 낮을 수 있기 때문에, 바이러스를 효율적으로 회수하기 위해서는 몇 가지 독특한 방법이 필요합니다.

단백질의 N-말단 또는 C-말단에 관심 있는 바이러스 유전자를 표지하십시오. 이에 따라 150 base pair 길이의 상동성 플랭킹 영역을 확인하십시오. 그런 다음, 선택한 한 쌍의 제한 효소 인식 부위로 분리된 150 base pair 길이의 좌우 암(arm)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 설계하십시오. 또한, 합성 후 TDS 벡터에 삽입할 수 있도록 첫 번째 쌍과 다른 두 번째 제한 효소 인식 부위 쌍으로 이 영역을 플랭킹하십시오. 이제 제한 효소 인식 부위가 포함된 올리고뉴클레오타이드가 원하는 삽입 부위와 프레임이 일치하도록 설계되었는지 확인하십시오. 올리고뉴클레오타이드 합성을 위해, 좌우 암 사이에 삽입된 제한 효소 인식 부위가 선택한 형광 태그의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 플랭킹하는 부위와 일치하는지 확인하십시오. PCR을 통해 형광 태그의 양측에 동일한 제한 효소 인식 부위를 도입하십시오. 합성된 단편을 TDS 벡터에 클로닝하십시오. 또한 상동성 좌우 암 영역 사이의 제한 효소 인식 부위를 사용하여 형광 태그를 생성된 재조합 벡터에 클로닝하십시오. 무혈청 배지에서 BS-C-one 세포 단층에 백시니아 바이러스를 감염시키십시오.

감염 1시간 후, Dulbecco's modified eagle medium으로 세포를 회복시킵니다. 무혈청 배지에서 재조합 벡터 플라스미드와 트랜스펙션 시약을 3:1 비율로 혼합하여 트랜스펙션을 수행합니다. 24시간 후, 세포를 긁어내어 태아 송아지 혈청(fetal bovine serum)이 없는 DMEM에서 회복시킵니다. 세포를 세 차례 동결-융해(freeze-thaw) 사이클에 노출시켜 세포를 파쇄하고 바이러스 입자를 방출시킵니다. 다음으로, 개별 플라크를 적절히 분리하기 위해 100% 합류(confluent)된 BS-C-one 세포 단층에 바이러스 입자 조제물의 연속 희석액을 감염시킵니다. 10% FBS와 DMEM, GPT 선택 시약이 포함된 액체 층을 덮고 24시간 동안 배양합니다.

액체 오버레이를 흡입하고 형광 현미경을 사용하여 TDS 벡터로부터 바이러스로 mCherry가 삽입되어 확산된 적색 형광을 나타내는 플라크를 찾습니다. 표적 유전자와 선택한 형광 태그에 따라, 동일한 적색 플라크 내에서 태그 유전자의 국소적 형광이 관찰될 수도 있습니다.

이제 각 재조합 바이러스에 대해 여러 개의 플라크를 선택하고, 피펫 팁으로 긁어내어 100 µL의 5% FBS 함유 DMEM과 함께 세포를 Eppendorf 튜브로 옮깁니다. 긁어낸 세포를 세 차례 동결-해동하여 재조합 바이러스를 방출시킵니다.

동결-해동된 바이러스가 포함된 DMEM을 12-웰 플레이트의 세포 단층에 첨가하고, 성장 배지 내의 GPT 선택 시약으로 재조합 바이러스를 증폭합니다. 그 후, 감염 24시간 후에 성공적으로 증폭된 바이러스를 긁어내어 수집합니다. 적색 형광을 나타내는 성공적으로 증폭된 플라크의 플라크 분석을 위해, 6-웰 플레이트에 BS-C-one 세포 단층을 파종합니다.

재조합 바이러스를 단계 희석하고, FBS가 없는 DMEM에 희석된 바이러스를 농도별로 각 웰에 감염시킵니다. 감염 1시간 후 액체 배지를 제거하고, 각 웰에 완전 최소 필수 배지가 포함된 0.5% 아가로스를 덮어줍니다. 감염 3일 후, 적색과 선택한 형광 태그 색상이 모두 나타나는 플라크를 선택합니다.

GPT 선택 없이 이들을 다시 증폭하십시오. 확산된 적색 형광은 소실되었으나, 선택한 태그에 해당하는 국소적 형광은 유지하고 있는 플라크를 선택하십시오. 선택 과정 없이 플라크 정제를 계속하여, M-cherry 및 GPT 선택 유전자는 소실되었으나 선택한 태그에 해당하는 국소적 형광은 유지하는 재조합 바이러스의 순수 스톡을 확보하십시오.

모든 플라크가 유사한 플라크 표현형을 갖는 것을 목표로 플라크 분석법을 통해 스톡의 순도를 평가합니다. BS-C-one 세포 단일층에서 테스트 바이러스 스톡을 증폭시킵니다. 감염 24시간 후, 감염된 세포를 250 µL의 DMEM에 긁어 모읍니다. 감염된 세포를 원심 분리하고 상층액을 제거한 뒤, 세포 펠릿을 TE 버퍼 내 0.1% SDS 500 µL에 재부유시킵니다. 볼텍싱하여 세포를 용해합니다. 그 다음 phenol, chloroform, isoamyl alcohol 500 µL를 첨가하고 뒤집어 섞습니다. 원심 분리합니다. 상층을 회수하고 추출 과정을 반복합니다.

그 다음 수성층에서 DNA를 침전시키기 위해, 차갑게 식힌 100% 에탄올 1 mL와 소듐 아세테이트 50 µL를 첨가합니다. 뒤집어서 섞은 후 샘플을 -20 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 원심분리로 DNA를 펠렛화한 후, 모든 액체를 제거하고 DNA 펠렛을 공기 건조시킨 뒤 50 µL의 TE 버퍼에 재현탁합니다. 이 게놈 DNA 템플릿을 사용하여 바이러스 삽입 여부를 PCR 스크리닝합니다. 텍스트 프로토콜에 상세히 기술된 대로 다중 태그가 포함된 재조합 바이러스를 생성합니다.

이러한 재조합 백시니아 바이러스는 각각 바이러스 내부 코어와 외부 외피의 일부인 바이러스 구조 단백질 A3 및 F13을 표적으로 하는 형광 마커가 태그된 단백질을 발현합니다. 바이러스 입자를 시각화하기 위해 비리온에 위치한 단백질에 해당하는 유전자들이 선택되었습니다. A3는 백시니아 비리온의 코어 단백질이며, F13은 바이러스 외피 단백질입니다.

형광 표지된 A3와 F13을 모두 가진 이중 표지 바이러스 또한 나타나 있습니다. 이중 표지 바이러스를 통해 실시간 형광 현미경 관찰이 가능합니다. 이 사례에서는 백시니아 바이러스의 내부 코어 단백질인 A3는 빨간색으로, 외부 외피 단백질인 F13은 초록색으로 표지되었습니다.

바이러스 공장에서 생성되어 외피가 없는 바이러스 입자는 빨간색으로 시각화되었으며, 외피가 있는 비리온은 빨간색과 녹색 채널의 공국소화(colocalization)로 나타납니다. 재조합 벡터와 백시니아 바이러스 게놈 간의 재조합 효율을 결정하기 위해 정량 분석이 사용되었습니다. 백시니아 바이러스 게놈과 벡터의 상동 재조합 효율은 70 base pair 정도의 짧은 상동성 영역으로도 검출될 수 있습니다.

이 방법은 여러 개의 형광 태그를 부착하거나 다중 유전자를 결손시킨 바이러스를 제작하는 데 사용되어 왔습니다. 이러한 바이러스들은 바이러스 감염 생애 주기 연구, 숙주 방어 체계를 무력화하는 바이러스 단백질의 역할, 그리고 숙주 신호 전달 과정과의 상호작용 연구에 활용되어 왔습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 사용되는 태그의 모듈성이 뛰어나고 원하는 재조합체를 정밀하게 분리할 수 있으며 다양한 연구 맥락에 적용 가능한 방법을 통해 재조합 백시니아 바이러스를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.