유방암의 소설 형질 전환 마우스 모델 : 아데노 바이러스 크레와 유관 상피의 대상으로 전이성 유방암의 개시

다음 실험의 전반적인 목표는 건강한 면역 체계가 있는 상태에서 결국 전이되는 유방암의 마우스 모델을 개발하는 것입니다. 이는 먼저 아데노바이러스를 발현하는 크리어(Cree)를 실험 동물의 유관 관(mammary ductal canal)에 투여함으로써 달성됩니다. 그런 다음 유선을 정기적으로 촉진하여 종양 진행을 모니터링합니다.

궁극적으로 종양 전이 및 겨드랑이 림프절로의 백혈구 침투는 유세포 분석을 통해 평가할 수 있습니다. 기존 유방 종양 모델에 비해 이 기술의 주요 장점은 성숙한 면역 체계가 있는 상태에서 발생할 수 있고 YFP 발현으로 추적할 수 있는 종양의 정확한 시작을 가능하게 한다는 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 소개 주입 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.

바늘을 올바르게 배치하려면 정확성과 연습이 필요합니다. 실험 당일, 아데노바이러스 크리어의 여덟 번째 플라크 형성 단위의 4배의 엘로쿠아를 드라이아이스에 보관하고, 바이러스를 해동하고, 실온을 설정하고, 멸균수에 충분한 3%자당과 혼합하여 최종 부피를 10마이크로리터까지 끌어올립니다. 다음으로, 34마이크로리터의 MEM과 4마이크로리터의 갓 준비한 염화칼슘을 바이러스에 부드럽게 혼합하고 용액을 실온에서 배양합니다.

15분에서 20분 후에는 배지가 흐려지면서 아데노바이러스 침전물이 형성되었음을 나타냅니다. 튜브를 부드럽게 두드려 바이러스 입자가 현탁액 전체에 고르게 분포되어 있는지 확인한 다음 바이러스 입자를 주입하여 10마이크로리터 주사기에 3마이크로리터의 바이러스를 주입합니다. 다음으로, 마취된 마우스를 깨끗한 해부 현미경의 조명이 켜진 스테이지에 등을 대고 놓습니다.

여분의 광원으로 복부를 비추고 각 젖꼭지를 둘러싼 작은 흰색 털 조각으로 왼쪽, 네 번째 또는 오른쪽 아홉 번째 서혜부 유선을 찾습니다. 이제 멸균 에탄올에 적신 면 팁 어플리케이터로 젖꼭지를 부드럽게 문지릅니다. 그런 다음 미세한 수술 겸자로 젖꼭지를 고정하고 가벼운 힘으로 위로 당깁니다.

각질 플러그를 제거하려면 집게 사이의 젖꼭지를 고정하고 끝 사이에 바늘을 부드럽게 삽입합니다. 적절한 주입 깊이를 보장하기 위해 덕트 운하를 90도 각도로 캐뉼레이션하고 바늘을 덕트 내강에 삽입한 후 바늘을 부드럽게 위로 당겨 바늘 가장자리를 따라 젖꼭지를 위로 당깁니다. 바늘이 적절하게 배치되면 주사기의 전체 내용물을 부드럽게 밀어 넣습니다.

액체가 추가됨에 따라 젖꼭지가 약간 팽창해야 합니다. 주사 후 마취에서 회복되기 시작할 때까지 마우스를 가열 패드에 다시 놓습니다. 그런 다음 동물을 깨끗한 우리에 다시 넣고 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다.

분비선의 비대와 부종을 평가하기 위해 30일째에 주입된 기억선을 촉진합니다. 5-7일마다 종양 진행을 모니터링합니다. 유선이 부어오르고 커진 것이 관찰되면 종양 성장 역학을 위해 3-4일마다 종양 부피를 측정합니다.

만져질 수 있는 종양이 성공적으로 나타나면, 적절한 주사를 확인하기 위해 트립 및 블루 주사 후 유선의 전체 마운트를 준비하거나 M 체리를 발현하는 아데노바이러스 주사 후 적절한 바이러스 준비 및 연성 상피 세포의 감염을 확인하여 유관 나무를 성공적으로 표적으로 하는 것을 시각화할 수 있습니다. F Fluxed P 53 LSLK RAs 형질전환 마우스에서 종양이 유도되면 초기 종양은 유선이 비대해지고 부풀어 오르는 40일경까지 뚜렷하게 나타나지 않습니다. 56일경부터 종양이 기하급수적으로 성장하기 시작합니다.

이 시점에서는 3일마다 종양의 양을 측정하는 것이 중요합니다. 종양 진행에 있어 정상적인 마우스 대 마우스 변동이 있기 때문에 동역학 연구를 원하는 경우 80일째까지 큰 복부 종괴가 명백해질 것이며, 그 후 종양이 동물 체중의 10% 이상을 초과하면 마우스를 안락사시켜야 합니다. 플럭스 P 53 LSL KRAS 형질전환 마우스에서 유방 종양에서 유래한 3개의 세포주에 대한 CDNA 분석은 종양이 메소텔린 사이토케라틴 8개, HER 2개의 새로운 에스트로겐 수용체 알파를 발현하는 것을 밝혔으며, 이는 인간 유방암의 세포 미세환경과 유사하며, 알파, 베타 및 감마 델타 T 세포의 침투뿐만 아니라 골수성 억제 세포 및 대식세포가 종양으로 침투하는 것이 관찰되었습니다.

겨드랑이 림프절로 배출되는 혈관 구조는 종양이 자라기 전에 충혈되기 시작하여 결국 주사가 수행된 전체 기억 조직을 둘러쌉니다. 서혜부 림프절과 겨드랑이 림프절 사이의 표재성 상복부 정맥의 명백한 충혈이 있을 것입니다. 7-8주가 지나면 종양 세포의 림프혈관 침범으로 인해 겨드랑이 림프절이 커집니다.

종양 세포의 림프혈관 침습 및 전이는 Flocked P 53 LSLK RAs 형질전환 마우스와 L-S-L-E-Y-F-P 마우스를 교차시켜 추적할 수 있습니다. 사전 매개된 절제 후, 높은 수준과 낮은 수준의 YFP를 모두 발현하는 세포가 종양에서 검출되며, 이들의 전이는 배액된 겨드랑이 림프절로 추적될 수 있습니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 적절하게 수행된다면 2-3시간 내에 20마리의 생쥐로 구성된 실험 코호트에서 수행할 수 있습니다.

이 절차에 따라 다른 종양 모델을 개발하여 추가 잠금, p 전이유전자를 가진 마우스를 사육하여 다양한 종양 유전자가 유방암의 병리학, 면역 미세환경 및 전이성 침습에 어떤 영향을 미치는지와 같은 질문에 답할 수 있습니다.