Name: 정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 RNA 프로파일 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 학습하세요 정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로RNA를 프로파일링하는 방법을. RNA 분리, 역전사, 증폭 및 Gen X 소프트웨어 데이터 분석을 통해 742개의 고유 서열을 정량적으로 분석할 수 있습니다.

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정신 건강의 국립 연구소에서 : 설명이 프로젝트는 보너스 번호 R01MH079751 (F. PERUZZI PI)에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 정신 건강의 국립 연구소 또는 건강의 국립 연구소의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

다음 프로토콜은 준비 PCR 플레이트를 사용하여 CSF 및 프로필 마이크로 RNA에서 RNA를 분리하는 표준 절차를 설명합니다. 유기 상 추출은 선택 사항이며, 캐리어 RNA가 RNA의 최대 회수를 보장하는 동안 추출 시료에 첨가되어 있습니다. 결과적으로, RNA를 정량화 할 필요가 없다. cDNA를가 (약 2 시간) 전날 합성하면 전반적으로, 6 ~ 8 판의 평균 하루에 실행할 수 있습니다. 모든 샘플은 프로파일 및 소프트웨어에로드 된 경우 데이터의 분석을 수행한다. 비교를위한 샘플 / 개 또는 그들의 조합의 수에 따라, 데이터 분석은 하나에서 여러 시간에 필요할 수도있다. 1. RNA 추출 RNA 추출이, CSF 샘플에서 수행 된 저장 분석까지 분량 씩 -80 ° C에 냉동. 이 절차 mirVana 파리 격리 키트 제조업체의 악기에 따라 사용총 RNA의 분리를위한 ctions. 작은 RNA 종에 대한 농축이 키트와 함께 가능하지만,이 단계가 완료되지 않고 RNA 추출 절차는 총 RNA의 분리 단계 이후에 종료,주의하시기 바랍니다. (다른 상업적으로 이용 가능한 RNA 분리 키트 등) mirVana 파리 분리 키트는 유기 추출을 필요로하지 않지만 또한,이 절차에 대한 프로토콜은 아래에서 확인할 수 있습니다. RNA 추출을위한 프로토콜은 두 단계로 구성 1.1. 유기 추출 (mirVana 파리 RNA 추출 키트를 사용하는 경우에는 필요하지 않음) 1.2.2. 총 RNA 분리 1.1. 유기 추출 1.1.1. 시약 준비 <ol><li> 솔루션을 변성 2 배 2 - 머 캅토 에탄올 375 μl를 추가하고, 4 ℃에서 저장 </li></ol> 1.1.2. CSF를 준비 <ol><li> RNA 추출하기 전에 얼음에 CSF의 모든 나누어지는 해동. 부드럽게 0.5 해동 CSF의 ML과에 MS2의 RNA 캐리어의 1 μg을 추가혼합. 유기 추출 생략하면 MS2 캐리어 아래 1.2.2.1에 설명 된 샘플 종래 RNA 분리에 첨가되므로주의. </li><li> CSF에 실온에서 2 배 변성 용액 0.5 ㎖를 혼합한다. </li><li> CSF 플러스 2 배 변성 용액에 클로로포름 : 산 - 페놀의 1 ML을 추가 클로로포름,하지 혼합물의 상단에 자리 잡고 수성 버퍼 : 산 - 페놀을 포함하는 아래 단계를 철회해야합니다. 클로로포름이 시약을 사용하여 작업 할 때 독 및 자극을 사용 장갑 등 개인 보호 장비 페놀을 포함 또한, 산 - 페놀이 있습니다. </li><li> 30 ~ 60 초 혼합하는 소용돌이. 편의를 위해 샘플의 2 ㎖는 / 솔루션 / 산 변성 페놀 : 클로로포름의 혼합을 두 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 나누어집니다. </li><li> 실온에서 최대 속도에서 5 분 (10,000 ×)에 대한 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 낮은 단계 또는 계면을 방해하지 않고 수성 (위) 단계를 제거하고로 전송신선한 관. 복구 볼륨을합니다. </li></ol> 1.2. RNA 분리 그것은 전용 피펫 세트 벤치 및 RNA 샘플을 처리하기위한 랙을 가지고하는 것이 좋습니다. 작업 영역과 도구의 RNase 보내 겠 스프레이를 사용하여 오염을 제거하고 이전에 각 실험을 쳐있다. 1.2.1. 시약을 준비한다 : <ol><li> miRNA의 세척 용액 1에 100 % 에탄올 21 mL를 넣고 세척 솔루션 2 / 3 ~ 40 ㎖를 100 % 에탄올. miRNA의 세척 용액 1은 잠재적으로 위험한 물질이다 guanidium 티오 시아 네이트를 포함하고 있다는 사실에 유의하시기 바랍니다. </li></ol> 1.2.2. 총 RNA 분리 <ol><li> 유기 추출에서 수상에 상온 100 % 에탄올 1.25 볼륨을 첨가하고 잘 섞는다. </li><li> 컬렉션 튜브 중 하나에 필터 카트리지를 놓습니다. </li><li> 필터 카트리지에 해물 / 에탄올 혼합물의 피펫 이하 700 μL. </li><li> 최대 30 초 동안 원심 분리기속도. 같은 필터로 연속 응용 프로그램에서 700 μl를 초과하는 혼합물을 적용합니다. 모든 원심 분리 한 후 흐름을 통해 폐기 및 세척 단계는 포집 관을 저장합니다. </li><li> 최대 속도에서 15 초 동안 필터 카트리지와 원심 분리기에 700 ㎕의 miRNA의 세척 용액 1을 적용합니다. 포집 관에서를 통해 흐름을 폐기하고 동일한 컬렉션 튜브로 필터 카트리지를 교체합니다. </li><li> 최대 속도에서 15 초 500 μL 세척 솔루션 2 / 3와 원심 분리기를 적용합니다. 포집 관에서를 통해 흐름을 폐기하고 동일한 컬렉션 튜브로 필터 카트리지를 교체합니다. 최대 속도에서 15 초 동안 두 번째 500 μL 세척 솔루션 2 / 3와 원심 분리기를 적용합니다. 포집 관에서를 통해 흐름을 폐기하고 동일한 컬렉션 튜브로 필터 카트리지를 교체합니다. 필터에서 잔여 액을 제거하기 위해 최대 속도로 1 분 동안 어셈블리를 스핀. </li><li> 신선한 컬렉션 튜브로 필터 카트리지를 전송합니다. 신청 (100) 및 무, 필터의 중심에 예열 (95 ° C)에서의 nuclease 무료 물 리터, 뚜껑을 닫습니다. RNA를 복구하기 위해 최대 속도로 30 초 동안 원심 분리기. </li><li> 용출액을 포함하는 RNA를 수집하고 이후의 응용 프로그램에 대한 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> NanoDrop의 2000C 분광 광도계를 사용하여 RNA의 1 μl를 정량화. RNA을 운반 RNA 추출시 샘플에 추가 된 경우 RNA 정량은 건너 뛸 수 있습니다. 아래에 자세히 그 경우 RNA의 8 μL는 cDNA 합성을 실시한다. </li></ol> 2. miRNA의 프로필 : QRT-PCR 프로토콜 miRNA의 프로파일에 대한 프로토콜은 두 단계로 구성 <ol><li> 첫 번째 가닥 cDNA 합성 </li><li> 실시간 PCR 증폭 </li></ol> 2.1. 첫 번째 가닥 cDNA 합성 2.1.1. 템플릿 RNA를 희석 <ol><li> 5 NG / 뉴 클레아 무료로 물을 사용 μL의 농도로 템플릿 RNA 샘플의 각을 조정합니다. 만약RNA (단계 1.2.2.9 참조) 정량화되지 않은, 다음 RNA의 8 μL는 cDNA 합성에 사용된다 </li></ol> 2.1.2. 시약 준비 <ol><li> 조심스럽게 배 반응 버퍼를 해동하고 무료 물을 클레아, 즉시 얼음에 배치합니다. </li><li> 소용돌이로 교반하여 혼합. 재현 탁 RNA 스파이크의 튜브에 40 ㎕의 클레아 무료 물을 추가하고 소용돌이로 교반하여 혼합하여, 15 ~ 20 분 동안 얼음에두고.에게 즉시 사용하기 전에, 냉장고에서 효소의 혼합을 제거 튜브를 가볍게 치면 혼합하고 얼음에 배치합니다. 모든 시약을 스핀 다운. </li></ol> 2.1.3. 역전사 반응 설치 <ol><li> 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브, 또는 동등한 RT 작업 솔루션의 필요한 금액을 준비 (비율 RNA 템플릿을 제외하고, 표 1), (최대 속도로 1 ~ 2 초) 텍싱하여 혼합, 간단하게 (스핀 다운 우리는 고정 속도, 10 초)와 미니 에펜 도르프의 원심 분리기를 사용하여 얼음에 놓습니다. 참고 UniSp6의 RNA 스파이크인은 (표 1 참조) RT 반응 전에 시료에 첨가한다. </li><li> 클레아 무료 PCR 튜브에 RT 작업 용액을 분사합니다. </li><li> 각 튜브에 템플릿 RNA를 분배. 참고 : 10 %를 초과하는 볼륨 / 피펫 및 / 또는 로봇 죽은 볼륨에 대한 각각의 시약을 계산하는 것을 기억하십시오. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 패널 I 양 (μL) </td><td> 패널 I + II 볼륨 (μL) </td></tr><tr><td> 배 반응 버퍼 </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr><tr><td> 클레아 무료 물 </td><td> 9.9 </td><td> 19.8 </td></tr><tr><td> 효소 혼합 </td><td> 2.2 </td><td> 4.4 </td></tr><tr><td> UniSp6 RNA 스파이크의 템플릿 </td><td> 1.1 </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> 템플릿 총 RNA (5 NG / μL) </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tR&gt; <tr><td> 총 양 </td><td> 22 </td><td> 44 </td></tr></tbody></table> 표 1. 전사 반응 설정 반전. </li></ol> 2.1.4. 혼합 시약을 회전 <ol><li> 모든 시약이 완전히 혼합되도록 부드러운 (1-2 초) 소용돌이로 교반하여 반응을 섞는다. 혼합 한 후, (고정 속도, 10 초 미니 에펜 도르프 원심 분리기)를 스핀 다운. </li></ol> 2.1.5. 품어 열을 비활성화 <ol><li> 다음과 같이 PCR 기계를 프로그램 : </li><li> 42 ° C에서 60 분 알을 품다 </li><li> 95 ° C에서 5 분의 역전사 효소를 열 불 활성화 </li><li> 4 ° C에 즉시 차가운 </li><li> 4 ° C에서 또는 동결에 보관 참고 : 프로토콜이 단계에서 중단 할 수있다. 희석 cDNA를 최대 오주 (최대 4 일 동안 4 ° C에서 선택적 저장소)에 -20 ° C로 유지 될 수있다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_step&quot;&gt; 2.2. 실시간 PCR 증폭 2.2.1. 실시간 PCR 시약을 준비 <ol><li> 얼음에 (단계 2.1.5에서)의 cDNA를 놓습니다. </li><li> 얼음 해동 클레아 무료 물과 PCR 마스터 믹스. 알루미늄 호일로 덮어서 빛으로부터 PCR 마스터 믹스 튜브를 보호합니다. 즉시 사용하기 전에, 미니 원심 분리기 1 ~ 2 초 텍싱하여 PCR 마스터 믹스를 혼합하고 1 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운. </li></ol> 2.2.2. SYBR 녹색 마스터 믹스, 물, 그리고 cDNA를 결합하고 PCR 플레이트에 추가 다음 절차는 튜브의 표면에 부착 된 cDNA의 낮은 농도를하지 않는 것이 좋습니다 : <ol><li> 플레이트 씰을 제거하기 전에, 간단히 1 분 1,500 XG에서 냉장 원심 분리기에 플레이트 (들)을 스핀 다운. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 2 배 PCR 마스터 믹스와 물을 결합한다. 패널 I : 2,000 μL 2X 마스터 믹스 1980 μL 물, 패널 I + II : 4,000 μL 2X 마스터 믹스와 3,960 μ, L의 물. </li><li> 20 μL의 cDNA를 (패널 I) 또는 40 μL의 cDNA를 (내가 II를 + 패널)을 추가하고 혼합한다. </li><li> 1 ~ 2 초 텍싱하여 부드럽게 혼합 1 분 1,500 XG에서 냉장 원심 분리기의 회전 속도. </li><li> 멀티 채널 피펫 저수지에서 PCR 마스터 믹스 / cDNA를 혼합 배치합니다. 당신은 멀티 채널 피펫의 길이가 저수지를 식별 할 수 있습니다. 이것은 채널에 걸쳐 동일 부피의 분취 량을 허용 충분히 높은 볼륨의 레벨을 유지한다. 이것은 지난 몇 분주으로 중요합니다. </li><li> 10 ㎕의 PCR 마스터 믹스를 분배 / cDNA를 16 채널 피펫을 사용하여 384 - 웰 플레이트의 각 웰에 섞는다. </li><li> 광학 밀봉와 플레이트를 밀봉. </li><li> 솔루션을 혼합 기포를 제거하기 위해, 냉장 원심 분리기 (1 분 1,500 XG)에서 간단히 플레이트 스핀. 참고 : 실험이 시점에서 일시 정지 될 수있다. 최대 24 시간 동안 4 ° C에서 빛으로부터 보호 반응을 저장합니다. </li></ol> 2.2.3. 실시간 PCR 표 2에 설명 된 매개 변수를 다음과 실시간 PCR 증폭과 융해 곡선 분석을 수행합니다. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 공정 단계 </td><td> 설정, 로슈 LC480 </td></tr><tr><td> 중합 효소의 활성화 / 변성 </td><td> 95 ° C에서 10 분 </td></tr><tr><td> 확대 </td><td> 증폭 45 사이클에서 95 ° C에서 10 초 60 ° C에서 1 분 램프 속도 1.6 ° C / 초 광학 읽기 </td></tr><tr><td> 용융 곡선 분석 </td><td> 예 </td></tr></tbody></table> 표 2. 로슈 LightCycler 480을 사용하여 실시간 PCR 사이클 조건. 2.3. 실시간 PCR 데이터 분석 실시간 PCR 데이터 분석, Exiqon 제넥스 프로 5.0와 함께 이루어집니다 다음 t그는 지침을 권장합니다. 제넥스 단계별 설명서에서 다운로드 할 수 있습니다 <a href="http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf">http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf</a> 데이터 분석은 세 단계로 구성 <ol><li> 데이터 가져 오기 </li><li> 데이터의 전처리 </li><li> 통계 분석 </li></ol> 2.3.1. 데이터 가져 오기 <ol><li> 로슈 LightCycler 480에서 2 차 미분 분석 방법을 선택하고 Cq와 값을 계산합니다. 데이터는 테이블로 내 보낸 텍스트 파일로 저장됩니다. </li><li> 데이터, 오픈 제넥스을 가져 Exiqon 가져 오기 마법사 버튼을 클릭하고 &quot;시작&quot;을 클릭합니다. 형식, 악기와 플레이트 레이아웃 파일을 선택하는 지침을 따르십시오. 그 플레이트 레이아웃 파일 (엑셀 파일) Exiqon 웹 사이트 (에서 다운로드 참고 <a href="http://www.exiqon.com/plate-layout-files">http://www.exiqon.com/plate-layout-files을</a> ). </li><li> IMPORT 패널은 I 및 II와 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. </li><li> 파일 가져 오기 한 후 생성 된 테이블은 사전 정의 된 열이 포함되어 있습니다. 샘플 단순 편집 할 수 및 분류 컬럼이 추가되거나이 단계에서 제거 될 수있다. 작업이 완료되어 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. </li><li> 데이터를 저장하고 데이터 편집기에로드 할 수 있습니다. </li></ol> 2.3.2. 데이터의 전처리 <ol><li> Exiqon와 제넥스에서 권장하는 여러 판을 비교할 때, 할 수있는 첫 번째 일은 사전 메뉴에서 간 판 교정을 선택하여 판 사이의 데이터를 보정하는 것입니다. </li><li> 그것은 세중 실행에 miRNA의 배열을 실행하는 것이 좋습니다. miRNA의 세 개의 복제본 중 적어도 두에없는 경우는 nonexpressed로 설정됩니다. </li><li> 사전 처리의 다음 단계에서, 상처를 출발했다. 차단 값을 정의 임계 사이클 (C의 T)이 값보다 높은과 데이터가 삭제되는 것을 나타냅니다. 뇌척수액 검체를 사용하여 본 실험에서, 컷 오프는 39로 설정 하였다. 거기efore, 세 개의 복제본의 39보다 C의 t 이상과 모든 시료는 삭제됩니다. miRNA의 한 프로브 (세 가지 중 하나의 복제)에&gt; 39 C의 t가있는 경우, 그 독서는 다른 두 프로브 C (T)의 평균으로 대체가 39 아래에 둘 다 제공됩니다. </li><li> 참조 유전자를 정의합니다. 제넥스 전문 참조 유전자를 식별하는 geNorm 및 / 또는 NormFinder을 활용하는 옵션이 있습니다. 모든 샘플에 걸쳐 유사한 Cq와 값을 가지고 geNorm 및 / 또는 NormFinder를 실행의 miRNAs의 목록을 선택합니다. 이 분석에 따르면, 여기에 제공된 예에서, 미르 - 622과 미르 - 1266 샘플에서 가장 균일 한 값을 가지고 있었다 (그림 1) 참조 유전자로 선택되었다. </li><li> 다음에, 데이터는 표준 발현 유전자를 사용하여 정규화 및 얻어진 값 ΔC의 t에 해당된다 </li><li> cDNA 합성 반응은 삼중으로 수행 된 경우,이 시점에서 값을 평균화한다. </li><li> 다시 시트의 유효성을 확인빈 거의 빈 열을 이동합니다. 전처리 창에서 선택 &quot;시트의 유효성을 검사합니다&quot;하고 제거 빈 열 라인에 적용보다. 아래 행에서 유효한 데이터의 원하는 비율을 선택하고 적용을 클릭합니다. 모든 샘플에 공통된의 miRNA를 비교하고자하는 경우 예를 들어, 100 %를 선택합니다. </li><li> 누락 된 데이터를 처리합니다. 전처리 메뉴에서 &quot;누락 된 데이터&quot;를 선택하고 누락 된 데이터를 처리 할 수​​있는 옵션 중 하나를 선택했다. 이 단계가 필요합니다. 당신이 처리되지 않은 누락 된 데이터가 포함 된 파일을로드하려고하면 제넥스는 당신에게 오류를 줄 것이다합니다. </li><li> 샘플 (제어 대 즉. 실험) 그룹의 상대 정량을 결정합니다. 집단 간의 상대 정량은 ΔΔ C의 T 방법을 사용하여 계산됩니다. 제넥스에서 사전 탭을 클릭하고 상대 정량을 선택합니다. 창에서 참조 그룹을 선택하고 적용 누르십시오. EXPR, 그래픽 표현과 / 또는 추가 통계 분석을 위해 그것을 참고ession 데이터는 로그 스케일로 변환해야합니다. 전처리 메뉴에서 LOG2을 선택합니다. </li></ol> 2.3.3. 통계 분석 제넥스 소프트웨어는 T-테스트 및 ANOVA 통계 분석 등의 폭 넓은 범위를 허용한다. <ol><li> 제넥스와 공개 데이터 관리자로 최종 MDF 파일을로드합니다. 통계적 분석이 수행되는 샘플의 정확한 샘플 또는 그룹을 선택하는 것이 중요하다. </li><li> &quot;통계&quot;를 선택하고 원하는 테스트에 해당하는 아이콘을 선택했다. </li><li> 제어판 창에서 &quot;실행&quot;을 클릭합니다. Excel 또는 MDF 파일로 결과를 저장합니다. </li></ol> 2.3.4. 발현 프로파일 다음과 같이 마이크로 RNA 샘플은, 분류, 클러스터링 및 열지도 및 계통도에 가시화 될 수있다 <ol><li> 제넥스와 공개 데이터 관리자로 최종 MDF 파일을로드합니다. 샘플이나의 miRNAs의 그룹을 선택하고 작성하려면이 창을 사용합니다. 당신이 완료되면 &quot;적용&quot;을 클릭합니다. </li> &lt;왼쪽 상단 모서리를 선택 클러스터의 리&gt;와 히트 맵 아이콘을 클릭 </li><li> 제어판 창에서 &quot;실행&quot;을 클릭합니다. 히트 맵은 TIFF 나 BMP 등의 다양한 형식으로 저장할 수 있습니다, 그것은 또한 복사하고 필요에 따라 수정 될 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

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마이크로 RNA는 번역 억제 및 / 또는 mRNA의 분해 2를 촉진하여 유전자 발현을 조절하는 작은 비 암호화 RNA를합니다. 때문에 세포가없는 조건에서 높은 안정성, 마이크로 RNA는 많은 체액에서 검출되었다. 또한, 마이크로 RNA의 서로 다른 발현 양상은 인간의 암 3-9의 다양한 단계 및 / 또는 진행과 상관 관계가있다. 고전 칩 배열하거나 최신 깊은 시퀀싱 기술을 포함한 마이크로 RNA 프로필에 사용할 수있는 여러 가지 도구가 있습니다. 그러나, 우리는 RNA를 최소한의 양을 요구하는 추가적인 장점을 갖는다 고감도의 qPCR 플랫폼 (10), (11)을 이용하기로했다. miRCURY LNA 범용 RT 마이크로 RNA PCR 프로토콜은 (40)은 전체 두 패널 배열 겨, 20 μL의 cDNA 합성 반응 당 총 RNA를 겨 (20)를 사용하도록 최적화되어 있습니다. valuabl 다룰 때 RNA의 소량을 사용하는...

마이크로 RNA는 이후 전사적으로 유전자 발현을 조절하는 RNA를 비 암호화 (길이 NT 21-23) 소규모의 가족에 속한다. 마이크로 RNA들이 비교적 안정적인 것으로 나타나는 세포 외 공간으로 분비 될 수있다. miRNA의 발현의 변화를 결정하는 miRNA의 프로파일을 수행하고 많은 양의 데이터를 처리, 생체 식별 향한 중요한 단계 일 수 있지만 위협 할 수있다. 여기, 우리는 민감한 실시간 PCR에 의한 (기타 체액에 적용) 뇌척수액에서의 miRNA 발현의 변화를 확인하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 또한 통계 분석 결과의 그래픽 표현을 포함하여, 데이터 분석을위한 소프트웨어의 사용을 설명한다. 전체 절차는 비교적 쉽고 간단하며, 프로파일 및 실시간 PCR 기계의 수를 사용할 수 있습니다, 또한 상대적으로 빨리 할 수​​있는 샘플의 수에 따라 달라집니다. 실험 부분은 처리의 정확성을 필요로384 - 웰 플레이트에 RNA와 피펫, 제넥스를 사용하여 데이터 분석 섹션 정보학 및 통계의 몇 가지 기본 지식을 필요로하는 동안.

<table><tbody><tr><td colspan="4">표 3. equipment.</td></tr><tr><td> Finnpipette Novus Multichannel Pipetter </td><td>Thermo Scientific</td><td>HH05279</td><td></td></tr><tr><td> Finntip 피펫 팁 </td><td>Thermo Scientific</td><td>9400613</td><td></td></tr><tr><td> Thermal Cycler C1000 </td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2 ml Low Profile, 투명 PCR 튜브 </td><td>Biorad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td> Flat Cap Strips </td><td>Biorad</td><td>TLS0803</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Real-Time PCR System</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 씰링 포일</td><td>Roche</td><td>04 729 757 001</td><td></td></tr><tr><td> 냉장 원심분리기 5804R </td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 스윙 버킷 로터, 4개소 </td><td>Eppendorf</td><td>A-4-44</td><td></td></tr><tr><td> 벤치탑 미니 원심분리기 </td><td>Fisher</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td> Bench-Top Vortex </td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브, 멸균 </td><td>Fisher</td><td>02-681-5</td><td></td></tr><tr><td> Matrix Reagent Reservoir, 25 ml </td><td>Thermo Scientific</td><td>8093</td><td></td></tr><tr><td> Thermomixer Confort </td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bench-Top Vortex </td><td>Velp Scientifica</td><td>F202A0173</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">표 4. 시약 목록.</td></tr><tr><td> Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns </td><td>Exiqon</td><td>203300</td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml </td><td>Exiqon</td><td>203400</td><td></td></tr><tr><td> Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free </td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td> MicroRNA 바로 사용 PCR 인간 패널(I+II) V2.R </td><td>Exiqon</td><td>203608</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA 분리 키트, 40개 분리</td><td>Ambion</td><td>AM1556 <</td><td></td></tr><tr><td>p>MS2 RNA 운반체 </td><td>Roche Applied Science</td><td> 10165948001</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올 98%</td><td>시그마 알드리치</td><td>M3148-25ml</td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 100% </td><td>Carlo Erba</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td> Nuclease free water </td><td>Qiagen</td><td>1039480</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</피></td><td></td></tr></tbody></table>

정량 실시간 pcr을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 rna 프로파일

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

<html> 마이크로 RNA (의 miRNA)는 자신의 번역 억압을 조절함으로써, 결과적으로의 mRNA에있는 사이트를 대상으로하는 RISC를 안내하여 유전자 조절의 강력한 층을 구성한다. miRNA의 발현의 변화는 모든 주요 복잡한 질병의 발달에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 최근의 연구 결과는의 miRNA가 세포 외 환경을 분비하고 높은 안정성을 순환 할 수있는 혈액 및 기타 체액을 입력 할 수 있음을 보여 주었다. 이러한 순환의 miRNA의 기능은 크게 애매 남아 있지만, 이러한 miRNA의 프로파일 배열과 같은 체계적인 높은 처리 방법은, 신경 퇴행성 질환 및 암의 여러 종류 등 여러 가지 병적 인 상태에서의 miRNA 서명의 식별로 이어질있다. 이러한 맥락에서, 뇌척수액에서의 miRNA 발현 프로파일의 식별은, 우리의 최근의 연구에보고 된, 바이오 마커 분석의 miRNAs 매력적인 후보가 있습니다. _content &quot;&gt;와 같은 마이크로 어레이와 같은 마이크로 RNA를 프로파일 링 할 수있는 몇 가지 도구가 있습니다, 정량 실시간 PCR (qPCR에), 깊은 시퀀싱. 여기에서, 우리는 정량 실시간 PCR에 의해 뇌척수액의 마이크로 RNA를 프로필에 민감한 방법을 설명합니다. 우리 Exiqon 마이크로 RNA 즉시 사용 PCR 인간의 패널을 사용하는 I와 수 II V2.R, 742 독특한 인간 마이크로 RNA의 검출. 우리는 세중 실행의 배열을 수행하고 우리가 제넥스 프로 5 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하고 분석했다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 성공적으로 세포 선 및 일차 전지, CSF, 플라즈마, 포르말린 고정 파라핀 조직의 다양한 종류의 마이크로 RNA를 프로파일했다.

이 연구 결과는 이전에 1 발표되었다. geNorm 응용 프로그램을 사용하여 후보 참조 마이크로 RNA의 분석 1은 결과를 그림. 따라서,이 마이크로 RNA, 미르 - 622 미르-1266은 표준 발현 유전자로서 식별하고, miRNA의 값을 정규화하기 위해 사용되었다. CSF의 연구를 위해 우리가 샘플의 세 그룹을했다 : HIV-(N = 10), HIVE 뇌염없이 (N = 4), 그리고 HIV + (HIV +, N = 5). 두 그룹은 HIVE 및 HIV +는, 제어 HIV-그룹과 비교 하​​였다. 통계 분석 후 (2.3.3 절) 열한 마이크로 RNA의 발현 수준이 1 통계적으로 유의. 2이 열한 마이크로 RNA의 상자 플롯을 나타내는 그림 발견, 미르-1203-1224...

우리는 뇌척수액 (CSF)에서 마이크로 RNA 프로필 실시간 PCR의 프로토콜을 설명합니다. RNA 추출 프로토콜을 제외하고, 절차는 다른 체액, 배양 된 세포 또는 조직 표본에서 추출한 RNA로 확장 될 수있다.

정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 RNA 프로파일

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

본 절차의 전반적인 목적은 정량적 PCR을 통해 뇌척수액 내 microRNA를 프로파일링하고 Gen X professional 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 뇌척수액 시료에서 총 RNA를 분리합니다. 두 번째 단계는 RNA를 cDNA로 전사하기 위해 역전사를 수행하는 것입니다.다음으로, cDNA를 742개의 고유 서열에 대한 프라이머가 포함된 384-웰 플레이트에 분주된 cyber green master mix와 혼합하고 실시간 PCR을 사용하여 증폭합니다. 마지막 단계는 실시간 증폭을 통해 획득한 데이터를 분석하는 것입니다. 최종적으로, 결과는 대조군 대비 배수 변화(fold change), 증가 또는 감소로 표현할 수 있으며, 다양한 그래픽 형태로 시각화할 수 있습니다.칩 어레이와 같은 기존 방법과 비교했을 때 본 기술의 주요 장점은 민감도가 매우 높고 최소량의 RNA만으로도 가능하다는 점입니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 생성되는 데이터의 양이 방대하고 데이터 분석 소프트웨어를 사용해야 한다는 점에서 어려움을 겪을 수 있습니다. 먼저, 작업 영역과 피펫에 RNA Zap을 분사하십시오.먼저, cDNA 합성을 위해 템플릿 RNA 샘플을 nuclease free water로 5 ng/µL 농도로 희석합니다. 다음으로, 5x 반응 버퍼를 얼음 위에 올려 천천히 해동합니다. 그런 다음, RNA spike-in에 nuclease free water 40 µL를 첨가하여 시약을 재현탁하고, 튜브를 볼텍싱한 후 얼음 위에 15~20분 동안 둡니다.다음으로, 냉동고에서 효소를 꺼내 튜브를 가볍게 쳐준 후 얼음 위에 놓습니다. 또한, 모든 시약이 해동되면 빠르게 원심 분리하여 가라앉힙니다. 5x 반응 버퍼 효소를 첨가하여 1.5 mL eph 튜브에 역전사 효소 작업 용액을 준비합니다.표 1에 명시된 비율에 따라 nuclease free water와 RNA spike in template을 혼합합니다. 다음으로, 최대 속도에서 1~2초간 볼텍싱하여 작동 용액(working solution)을 혼합합니다. 용액을 10초 동안 짧게 원심분리한 후, 작동 용액을 nuclease free PCR 튜브에 분주합니다.그 다음 템플릿 RNA를 PCR 튜브에 직접 넣습니다. 모든 시약이 충분히 섞이도록 반응액을 1~2초간 가볍게 볼텍싱하고, 튜브를 10초간 원심 분리하여 가라앉힙니다. 샘플을 PCR 기기에 넣고 여기에 표시된 설정을 입력합니다.그 다음 역전사 과정을 따르는 프로그램을 시작하십시오. cDNA는 실시간 PCR 증폭에 사용할 준비가 되었으며, -20 °C에서 최대 5주 동안 보관할 수 있습니다. 실시간 PCR 증폭을 시작하려면, 먼저 cDNA와 PCR 마스터 믹스를 얼음 위에 놓으십시오.PCR 마스터 믹스 바이알을 해동하는 동안 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호하십시오. 해동이 완료되면 PCR 마스터 믹스를 1~2초 동안 볼텍싱합니다. 다음으로, 15 mL 원심분리관(conical tube)에 2X PCR 마스터 믹스 2000 µL와 물 1,980 µL를 혼합하십시오.혼합물에 CDNA 20 µL를 첨가하고 용액을 1~2초 동안 가볍게 볼텍싱합니다. 그 다음, 4 °C의 냉장 원심분리기에서 1,500 ×g로 1분 동안 원심분리하여 용액을 가라앉힙니다. 이어서 PCR 반응 혼합액을 멀티채널 피펫 리저버에 옮깁니다.사용 준비가 된 플레이트를 냉장 원심분리기로 1,500 ×g에서 짧게 원심분리한 후 플레이트 씰을 제거합니다. 그다음 cDNA가 포함된 PCR 마스터 믹스 10 µL를 384웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 이때 16채널 피펫을 사용하며, 플레이트는 광학 밀폐 필름으로 밀봉합니다.마스터 믹스를 추가한 후, 냉장 원심분리기를 사용하여 1,500 ×g에서 짧게 원심분리하여 용액을 웰 바닥으로 내립니다. 샘플을 혼합하고 기포를 제거하여 실험을 일시 중단합니다. 이 시점에서 반응물을 빛이 차단된 4 °C 환경에 최대 24시간 동안 보관하십시오.다음으로, 표 2에 상세히 기술된 매개변수에 따라 실시간 PCR 증폭 및 융해 곡선 분석을 수행하십시오. 분석을 시작하려면 Roche light cycler에서 2차 미분 분석 방법을 선택하십시오. 그런 다음 정량 사이클 또는 CQ 값을 계산하십시오.데이터를 표로 내보낸 후 텍스트 파일로 저장하십시오. 다음으로, gon import wizard 버튼을 클릭하고 다음 창에서 start를 클릭하여 데이터를 Gen X로 가져오십시오. 그런 다음 instrument 및 plate layout 파일을 선택하십시오. Plate layout Excel 파일은 GON 웹사이트에서 다운로드할 수 있습니다.그런 다음 패널 1을 가져오고 '다음(next)'을 클릭하십시오. 파일 가져오기 후 생성된 테이블에는 사전 정의된 열이 포함되어 있으며, 이 단계에서 샘플 이름을 수정하고 분류 열을 추가하거나 제거할 수 있습니다. 완료되면 '다음(next)'을 클릭하고 데이터를 저장하십시오.그런 다음 이를 데이터 에디터로 로드합니다. 먼저, 모든 플레이트가 동일한 파라미터를 사용하여 계산되도록 전처리 메뉴에서 INTERPLATE 보정을 선택하여 플레이트 간의 데이터를 보정합니다. 다음으로, 임계 주기 또는 ct보다 높은 데이터를 제외할 컷오프 값을 정의합니다. 만약 마이크로 RNA의 CT 값이 3개의 반복 시료 중 하나에서 더 높게 나타나면, 해당 측정값은 나머지 두 프로브의 CT 평균값으로 대체됩니다.모든 샘플에서 유사한 CQ 값을 가진 microRNA 목록을 선택하여 참조 유전자를 정의하고 gene norm을 실행합니다. 그다음, 얻어진 참조 유전자를 사용하여 데이터를 정규화합니다. 결과 값은 delta ct에 해당합니다.전처리 창을 열고 시트 검증(validate sheet)을 선택한 다음, 아래 줄의 빈 열 제거(remove empty columns) 행에서 적용(Apply)을 선택하여 비어 있거나 거의 비어 있는 열을 제거하십시오. 원하는 유효 데이터 백분율을 선택하고 적용을 클릭하십시오. 모든 샘플에 공통적인 microRNA만 비교하려는 경우 100%를 선택하십시오.최종 MDF 파일을 Gen X에 로드하고 데이터 관리자를 열어 클러스터를 분류하고 히트맵과 덴드로그램에서 microRNA 및 샘플을 시각화합니다. 그런 다음 샘플 그룹을 선택하여 생성하고 완료되면 적용을 클릭합니다. 다음으로 컨트롤 패널 창에서 실행을 클릭합니다.히트맵을 TIFF 또는 비트맵과 같이 원하는 형식으로 저장한 다음, 필요에 따라 히트맵을 복사하고 수정하십시오. 이 그래픽 바는 10개의 잠재적 microRNA 참조 유전자를 분석하기 위해 Gen X 내의 G norm 애플리케이션을 통해 얻은 것입니다. 이러한 결과는 MIR 622 및 MI 1, 266이 가장 안정적으로 발현되는 microRNA임을 나타냅니다.여기에 표시된 박스 플롯은 HIVE 그룹과 뇌염이 없는 HIV 양성 그룹 내에서 통계적으로 유의미한 11가지 microRNA 각각의 데이터 분포를 보여줍니다. 각 열의 플롯은 중앙값과 제1 및 제3 사분위수, 그리고 최대값과 최소값을 나타냅니다. 이 절차에 따라 모든 체액, 조직 샘플 및 배양 세포에 대해 미네랄 프로파일링을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 사전 microRNA의 설정 및 분석 서비스를 선보일 예정 써모 과학 매트릭스 멀티채널 피펫과 수작업으로뿐만 아니라 로봇을 사용하여 QPCR위한 96 잘 배열.

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여기 샘플 제한된 양의 작업 특히, microRNA (miRNA) 표현 수준에 대해 비용과 시간 효율 높은 처리량 검사 도구로 microfluidic 플랫폼와 함께 최적화된 멀티 플렉스 반전 transcriptase 정량 PCR (qRT - PCR) 프로토콜을 설명합니다.

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정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 RNA 프로파일

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