정량 실시간 PCR을 사용하여 뇌척수액의 마이크로 RNA 프로파일

이 절차의 전반적인 목표는 정량적 PCR을 통해 뇌척수액에서 microRNA를 프로파일링하고 Gen X 전문 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하는 것입니다. 이는 먼저 뇌척수액 샘플에서 전체 RNA를 분리하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 RNA를 CDNA로 전사하기 위해 역전사를 수행하는 것입니다.

다음으로, CDNA를 742개의 고유한 염기서열에 대한 프라이머를 포함하는 384웰 플레이트에 로드된 사이버 그린 마스터 믹스와 혼합하고 Real-Time PCR을 사용하여 증폭합니다. 마지막 단계는 실시간 증폭에서 수집된 데이터를 분석하는 것입니다. 궁극적으로 결과는 접힘 변경, 컨트롤에 대한 증가 또는 감소로 표현될 수 있으며 다양한 그래픽 표현으로 시각화될 수 있습니다.

따라서 칩 어레이와 같은 기존 방법에 비해 우리 기술의 주요 장점은 우리의 방법이 매우 민감하고 최소한의 RNA를 필요로 한다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 생성되는 데이터의 양이 많고 데이터 분석을 위한 소프트웨어 사용으로 인해 어려움을 겪을 것입니다. 먼저 작업 영역과 피펫에 RNA Zap을 분사합니다.

먼저 CDNA 합성은 주형 RNA 샘플을 뉴클레아제가 없는 물로 마이크로리터당 5나노그램의 농도로 희석합니다. 다음으로, 5x 반응 버퍼를 얼음 위에 부드럽게 올려 해동합니다. 그런 다음 RNA 스파이크에 40마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가하여 시약을 재현탁하고 튜브를 소용돌이치며 15-20분 동안 얼음 위에 둡니다.

그런 다음 냉동실에서 효소를 제거하고 튜브를 튕겨 얼음 위에 올려 놓습니다. 또한 모든 시약이 해동되면 빠르게 스핀다운합니다. 5 x 반응 완충액 효소를 첨가하여 1.5 ml eph 튜브에 역전사 효소 작업 용액을 준비합니다.

표 1에 표시된 비율을 사용하여 템플릿에서 nuclease free water와 RNA spike를 혼합합니다. 다음으로, 최대 속도로 1-2초 동안 볼텍싱하여 작업 용액을 혼합합니다. 용액을 10초 동안 잠시 회전시킨 다음 작업 용액을 뉴클레아제가 없는 PCR 튜브에 분배합니다.

그런 다음 템플릿 RNA를 PCR 튜브에 직접 추가합니다. 모든 시약이 완전히 혼합되었는지 확인하기 위해 1-2초 동안 반응을 부드럽게 와류로 회전시키고 10초 동안 튜브를 회전시킵니다. PCR 기계에 샘플을 넣고 여기에 표시된 설정을 입력합니다.

그런 다음 소급 전사에 따라 프로그램을 시작합니다. CDNA는 Real-Time PCR 증폭 준비가 되어 있으며 최대 5주 동안 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다. Real-Time PCR 증폭을 시작하려면 먼저 CDNA와 PCR 마스터 믹스를 얼음에 놓습니다.

PCR 마스터 바이알을 해동하려면 바이알을 해동하는 동안 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호하십시오. 일단 와류가 녹으면, PCR 마스터는 1-2초 동안 혼합됩니다. 다음으로, 2000 마이크로 리터의 2 개의 XPCR 마스터 믹스와 1, 980 마이크로 리터의 물을 15 밀리리터 원추형 튜브에 결합하십시오.

혼합물에 20마이크로리터의 CDNA를 첨가하고 1-2초 동안 용액을 부드럽게 와류로 만듭니다. 그런 다음 냉장 원심 분리기에서 섭씨 4도에서 1분 동안 1, 500배 G로 용액을 회전시킵니다. 그런 다음 PCR 반응 혼합물을 다중 채널 피펫 저장소에 넣습니다.

플레이트 씰을 제거하기 전에 냉장 원심분리기에서 바로 사용할 수 있는 플레이트를 1, 500배 G로 잠시 회전시킵니다. 그런 다음 CD NA를 함유하는 PCR 마스터 믹스 10마이크로리터를 384웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 16채널 피펫을 사용하여 광학 밀봉 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.

마스터 믹스를 추가한 후 냉장 원심분리기에서 플레이트를 1, 500회 G로 짧게 회전시켜 용액을 웰 바닥으로 당깁니다. 샘플을 혼합하고 기포를 제거하여 실험을 일시 중지합니다. 이 시점에서 최대 24시간 동안 섭씨 4도의 빛으로부터 보호되는 장소에 반응을 보관하십시오.

다음으로, 표 2에 자세히 설명된 파라미터에 따라 Real-Time PCR 증폭 및 용융 곡선 분석을 수행합니다. 해석을 시작하려면 Roche 광 순환기에서 2차 파생 해석 방법을 선택합니다. 그런 다음 정량화 주기 또는 CQ 값을 계산합니다.

데이터를 테이블로 내보내고 텍스트 파일로 저장합니다. 그런 다음 먼저 gon 가져오기 마법사 버튼을 클릭하고 다음 창에서 시작을 클릭하여 형식 기기 및 플레이트 레이아웃 파일을 선택하여 데이터를 Gen X로 가져옵니다. 플레이트 레이아웃 엑셀 파일은 GON 웹사이트에서 다운로드할 수 있습니다.

그런 다음 패널 1을 가져오고 다음을 클릭합니다. 파일 가져오기 후에 생성된 테이블에는 이 단계에서 미리 정의된 열이 포함되고, 샘플 이름을 편집하고, 분류 열이 추가 또는 제거됩니다. 완료되면 다음을 클릭하고 데이터를 저장합니다.

그런 다음 데이터 편집기에 로드합니다.먼저 전처리 메뉴에서 INTERPLATE 보정을 선택하여 플레이트 간의 데이터를 보정하여 모든 플레이트가 동일한 매개변수를 사용하여 계산되었는지 확인합니다. 다음으로, 임계값 cycle 또는 ct보다 높은 데이터를 버리는 cutoff 값을 정의합니다. 마이크로 RNA에 CT가 3개 중 1개의 복제본에 대해 더 큰 경우 해당 판독값은 다른 두 프로브의 CT 평균으로 대체됩니다.

모든 샘플에서 유사한 CQ 값을 가진 microRNA 목록을 선택하여 참조 유전자를 정의하고 유전자 정규화를 실행합니다. 다음으로, 얻어진 참조 유전자를 사용하여 데이터를 정규화합니다. 결과 값은 델타 ct에 해당합니다.

전처리 창을 열고 유효성 검사 시트를 선택한 다음, 아래 줄의 빈 열 제거 줄에서 적용을 선택하여 비어 있는 열과 거의 비어 있는 열을 제거합니다. 원하는 유효한 데이터 비율을 선택하고 적용을 클릭합니다. 모든 샘플에 공통적인 microRNA만 비교하려면 100%를 선택합니다.

최종 MDF 파일을 Gen X에 로드하고 데이터 관리자를 열어 클러스터를 분류하고 마이크로RNA와 샘플을 히트 맵과 덴드로 그램에서 시각화합니다. 그런 다음 샘플 그룹을 선택하여 만들고 완료되면 적용을 클릭합니다. 그런 다음 제어판 창에서 실행을 클릭합니다.

히트 맵을 TIFF 또는 비트맵과 같은 원하는 형식으로 저장한 다음 필요에 따라 히트 맵을 복사하고 수정합니다. 이 그래픽 막대는 10개의 가능한 마이크로 RNA 참조 유전자를 분석하기 위해 X세대 내의 G norm 애플리케이션에서 얻었습니다. 이러한 결과는 MIR 622 및 MI 1, 266이 가장 안정적으로 발현되는 microRNA임을 나타냅니다.

여기에 표시된 상자 그림은 뇌염이 없는 HIVE와 HIV plus 그룹 내에서 통계적으로 유의한 11개의 microRNA 각각에 대한 데이터 분포를 보여줍니다. 각 열에서 플롯은 중앙값과 1사분위수 및 3사분위수를 최대값과 최소값과 함께 나타냅니다. 이 절차에 따라 모든 체액, 조직 샘플 및 배양된 세포에 대해 미네랄 프로파일링을 수행할 수 있습니다.