Name: 말라리아 모기의 2D 및 3D 염색체 페인팅 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 배우세요 말라리아 모기의 다염색체 팔에서 DNA를 분리·증폭하여 FISH 실험용 형광 프로브를 만드는 염색체 페인팅 기법입니다. 이 방법은 서열 정보 없이도 대형 염색체 영역을 시각화하여 세포핵 구조와 진화 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 이고르 V. 샤라호프에 국립 보건 원 1R21AI094289에서 보조금에 의해 지원되었다

1) 레이저 포획 미세 절에 대한 폴리텐 염색체 슬라이드 준비
<ol><li>25 시간 후 혈액 먹이에서 반 중력 Anopheles 여성을 해부. 난소를 약 5마리의 암컷에서 500μl으로 수정하여 24시간 동안 실온에서 신선한 변형 카노이용(100% 메탄올: 빙하 아세트산, 3:1)으로 수정합니다. 장기 저장을 위해 난소를 -20°C로 옮깁니다.</li>
	<li>염색체 슬라이드를 만들기 직전에 Carnoy의 용액 (100 % 에탄올 : 빙하 아세트산, 3 :1) 및 50 % 프로피오닉 산을 준비하십시오.</li>
	<li>자이스 1.0 PET 멤브레인 슬라이드에 카노이의 용액 한 방울에 난소 한 쌍을 놓습니다. 크기에 따라 난소를 해부 바늘로 약 2-4 부분으로 분할하고 해부 현미경의 밑에 깨끗한 슬라이드에 50% 프로피온산을 떨어뜨립니다.</li>
	<li>여포를 분리하고 해부 스테레오 현미경의 밑에 종이 타월을 사용하여 남은 조직을 제거하십시오. 여포에 50%의 프로피온산을 새로 넣고 실온에서 3-5분 동안 앉을 수 있도록 합니다.</li>
	<li>실리콘 커버슬립을 물방울 위에 놓습니다. 슬라이드를 약 1분 동안 방치하십시오.</li>
	<li>흡수성 재료로 슬라이드를 덮고(필터 용지는 이 방법에 사용됨) 연필의 지우개 면을 사용하는 동안 지우개로 반복적으로 눌러 커버슬립에 넉넉한 양의 압력을 가합니다.</li>
	<li>슬라이드 를 60°C로 가열하여 슬라이드 데노션/혼성화 시스템에서 15-20분 동안 가열하여 폴리텐 염색체를 평평하게 합니다. 산이 염색체를 더 평평하게 할 수 있도록 밤새 4 °C의 습한 챔버에 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>슬라이드를 차가운 50% 에탄올에 10분 동안 놓습니다. 커버슬립을 부드럽게 제거하고, 차가운 50% 에탄올로 10분 이상 교체합니다.</li>
	<li>탈수 슬라이드는 각각 70%, 90%, 100% 에탄올을 5분 동안 미끄러. 공기 건조 슬라이드.</li>
	<li>단일 버퍼 태블릿을 증류수 1L에 추가하여 GURR 버퍼 솔루션 의 솔루션을 준비합니다. 오토 클레이 브.</li>
	<li>Giemsa 염색 용액 1ml를 GURR 버퍼 50ml에 추가하여 지임사 용액을 준비합니다.</li>
	<li>기임사 용액에 공기 건조 슬라이드를 10분 동안 놓고 1X PBS로 3회 세척합니다. 오염을 피하기 위해 제어된 멸균 기후에서 공기 건조가 다시 미끄러지게 됩니다.</li>
</ol>2) 레이저 캡처 단일 폴리텐 염색체 암의 미세 절
이 섹션에서는 PALM MicroBeam 레이저 미세 절제 시스템과 함께 제공되는 PALMRobo 소프트웨어의 사용을 자세히 설명합니다. 
<ol><li>100 % 에탄올로 현미경을 청소하십시오. UV 크로스링커에 자외선으로 장갑과 튜브를 살균합니다.</li>
	<li>PALM MicroBeam 레이저 미세 절 현미경을 전원을 공급하고 레이저를 켭니다. 레이저 해부 제품군인 PALMRobo를 열고 필요에 따라 "전원" 및 "포커스" 설정을 구성합니다.</li>
	<li>관심의 폴리텐 염색체 팔을 검색합니다.</li>
	<li>"연필" 도구를 사용하여 선택한 영역의 윤곽을 그립니다.</li>
	<li>메뉴 모음에서 "요소 창"을 엽니다.</li>
	<li>"그려진 요소"를 선택하여 "잘라내기"를 선택했습니까?</li>
	<li>접착제 캡 튜브를 홀더에 설치하고 슬라이드 위에 배치하여 작은 간격< 크기 < 레이저 컷을 시작합니다.</li>
	<li>잘라내기 부위 내에 "투석기 선택"을 배치하여 가장자리와 염색체 사이에 공간을 남깁니다.</li>
	<li>드롭다운 옵션에서 "LPC"를 선택하고 발사를 시작합니다.</li>
	<li>"눈" 아이콘을 눌러 샘플이 캡으로 발사되었는지 확인합니다.</li>
</ol>3) 단일 미세 한 제다색 염색체 팔에서 DNA의 정제
QIAamp DNA 마이크로 키트의 지시에 따라 수집된 DNA를 방출하고 정화합니다. 3.1 단계는 반전 된 튜브를 수용하기 위해 수정되었습니다. 
<ol><li>15 μl 버퍼 ATL과 10 μl 단백질Ae K를 반전 된 튜브 (캡 내부)에 넣고 3 시간 동안 56 °C에서 배양하십시오.</li>
	<li>25 μl 버퍼 ATL, 50 μl 버퍼 AL 및 1 μl 캐리어 RNA를 추가; 혼합. 50 μl 100 % EtOH를 추가하십시오. 섞다.</li>
	<li>리세이트를 QIAamp 열로 전송; 원심 분리기. 500 μl 버퍼 AW1을 추가하여 세척; 원심 분리기. 열을 새 수집 튜브에 넣고 500 μl 버퍼 AW2를 추가합니다. 원심 분리기. 열을 새 튜브에 넣습니다. 원심 분리기는 과도한 액체를 제거합니다.</li>
	<li>컬럼을 1.5 μl 마이크로센심분리기 튜브에 넣고 20 μl의 물을 엘루트에 넣습니다. 원심 분리기.</li>
	<li>진공분리기를 사용하여 갓 발동된 DNA를 9 μl의 최종 부피로 증발시다.</li>
</ol>4) 단일 미세 한 다분색 염색체 팔에서 DNA의 증폭
단일 염색체 암의 WGA에 두 개의 서로 다른 프로토콜이 사용되었습니다. 
<ol><li>게놈플렉스 WGA를 통한 DNA 증폭 및 프로브 제제<ol>
<li>게놈플렉스 단일 세포 WGA4 키트 프로토콜을 따라 증폭된 DNA의 첫 번째 배치를 생성합니다.<ol>
<li>9 μl 샘플에 갓 준비된 Proteinase K 용액을 추가합니다. 혼합. 1 시간 동안 50 °C에서 DNA를 인큐베이션 한 다음 4 분 동안 99 °C로 가열합니다. 얼음을 유지합니다.</li>
			<li>2 μl 1X 단일 셀 라이브러리 준비 버퍼 및 라이브러리 안정화 솔루션의 1 μl을 추가; 혼합. 2 분 동안 95 °C로 샘플을 가열합니다. 얼음과 원심분리기를 식힙니다.</li>
			<li>도서관 준비 효소 의 1 μl을 추가; 혼합 및 원심 분리기. 다음과 같이 인큐베이터: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq1.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>7.5 μl 10X 증폭 마스터 믹스, 48.5 μl 물을 추가합니다. 5.0 μl WGA DNA 폴리머라제; 혼합 및 원심 분리기.</li>
			<li>다음과 같이 열주기: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq2.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>유전체 DNA 클린 및 농축기 키트를 사용하여 DNA를 정화합니다. 프로토콜은 다음과 같습니다.<ol>
<li>추가 5:1 DNA 바인딩 버퍼: DNA 샘플 (특히 2 kb 미만의 게놈 DNA용. 샘플 DNA가 2kb보다 큰 경우 2:1 비율을 사용하고 제공된 스핀 컬럼으로 옮김합니다. 원심 분리기.</li>
			<li>200 μl DNA 세척 버퍼와 원심분리기를 추가합니다. 반복 세척 단계. 그런 다음 50 μl의 물을 추가하고 DNA를 새로운 1.5 ml 튜브에 넣습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>다음과 같이 GenomePlex WGA3 증폭 키트를 사용하여 샘플 DNA를 다시 증폭시하십시오.<ol>
<li>PCR 튜브에 10 μl DNA를 추가 (키트는 DNA의 10 ng 총을 권장) 49.5 μl 물, 7.5 μl 10x 증폭 마스터 믹스, 3.0 μl 10 mMM DNTP 믹스, 5.0 μl WGA DNA 폴리머 라제. 혼합 및 원심분리기.</li>
			<li>반응에 대해 다음 프로필을 사용합니다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>-20°C에 DNA를 저장합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>다음과 같이 게놈플렉스 WGA3 증폭 키트를 사용하여 물고기에 대한 라벨 DNA:<ol>
<li>49.5 μl 물로 PCR 튜브에 10 μl DNA를 추가하여 GenomePlex WGA3 리앰프 키트에서 마스터 믹스를 만들고, 7.5 μl 10X 증폭 마스터 믹스, 3.0 μl 1 mM dNTP 믹스 (1 mM dATP, dCTP, dGTP, 0.3 μl 1 mM dTTP - 라벨이 붙은 dUTP를 사용하는 경우), 25 nM 라벨 dUTP의 1 μl , 및 5.0 μl WGA DNA 폴리머라제.</li>
			<li>반응에 대해 다음 프로필을 사용합니다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>에탄올은 3M 아세테이트 pH 5.2 및 100% 에탄올의 2-3부피의 최종 반응 부피(75 μl 반응에 대한 7.5 μl)를 1/10을 추가하여 표지된 프로브를 침전시한다. 적어도 30 분 동안 -80 °C에서 DNA 샘플을 냉각하십시오.</li>
			<li>4°C에서 10분 동안 원심분리기 샘플을 시료하여 라벨이 부착된 펠릿을 만들고 상설 및 공기 건조 펠릿을 제거합니다.</li>
			<li>다음과 같이 하이브리드화 버퍼 만들기: 0.2 g 도스네 황산염 1200 μl 디온화 폼아미드 580 μl H2O 120 μl 20X SSC</li>
			<li>40 μl의 혼성화 버퍼를 공기 건조 펠릿에 추가합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>REPLI-G 단일 세포 WGA를 통한 DNA 증폭 및 프로브 제제 및 닉 번역<ol>
<li>증폭된 DNA를 생성하기 위하여 REPLI-g 단하나 세포 WGA 키트 프로토콜을 따르십시오:<ol>
<li>버퍼 D2(1M DTT의 3μl + 33 μl 버퍼 DLB)를 준비합니다.</li>
			<li>정제된 미세 한 정제 물질의 4 μl을 3 μl 버퍼 D2와 혼합합니다. 혼합 플릭 튜브. 65 °C에서 10 분 동안 배양하십시오. 정지 용액의 3 μl을 추가합니다. 섞다.</li>
			<li>9 μl H2O, 29 μl REPLI-g 반응 버퍼, 및 2 μl의 REPLI-g DNA 폴리머라제를 샘플에 추가합니다. 30°C에서 8시간 동안 배양합니다. 3 분 동안 65 °C로 가열하여 DNA 폴리머라아제비활성화. -20°C에 DNA를 저장합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>REPLI-g 증폭 DNA를 레이블닉 번역 프로토콜을 따르십시오.<ol>
<li>다음 라벨링 믹스를 준비합니다. 증폭된 DNA 1μg 5 μl 10X DNA 폴리머라제 버퍼 5 μl 10X dNTP 5 μl 1X BSA 1 μl 1 mM 라벨 dNTP 4 μl 1 U/μl DNase I 1 μl 10 U/μl DNA 폴리머라제 I H2O ~ 50 μl</li>
			<li>2 시간 동안 15 °C에서 배양하십시오. 반응을 멈추려면 0.5 M EDTA의 2 μl을 추가합니다. 젤에서 실행하여 DNA 조각 크기를 확인합니다.</li>
			<li>4.1.4.3-4.1.4.6에서 단계 수행하여 펠릿을 침전시키고 용해합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>5) 폴리텐과 미토성 염색체 스쿼시 제제에 2D FISH
폴리텐 스쿼시 (47)와 미토성 염색체 슬라이드 (48)의준비에 FISH에 대한 자세한 프로토콜을 참조하십시오. 여기서 우리는 간단한 프로토콜을 제공합니다.
<ol><li>폴리텐 염색체 스쿼시 제제에 물고기<ol>
<li>1X PBS에서 20분 동안 1X PBS로 슬라이드를 1분 동안 1X PBS로 4% 파라포름알데히드로 슬라이드합니다.</li>
		<li>탈수 슬라이드는 에탄올 세초를 통해 슬라이드 : RT. 공기 건조 슬라이드에서 각각 50 %, 70 %, 90 %, 100 % 100 %</li>
		<li>37°C에서 혼성화 버퍼에서 프로브를 예열합니다. 10-20 μl의 프로브를 추가하여 슬라이드합니다. 커버 22 X 22 mm 커버 슬립. 파이펫 팁을 사용하여 기포를 누릅니다.</li>
		<li>10 분 동안 90 °C에서 염색체 및 프로브를 변성합니다. 고무 시멘트로 커버슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 슬라이드를 습한 챔버로 옮기고 하룻밤 사이에 39°C에서 배양합니다.</li>
		<li>슬라이드를 39°C에서 1X SSC로 20분 동안 세척합니다. 20 분 동안 RT에서 1X SSC로 슬라이드를 씻으십시오. 1X PBS에서 슬라이드를 헹구고 DAPI로 페이드 방지 연장을 추가합니다. 커버슬립으로 덮고, 시각화 전에 적어도 한 시간 동안 4°C의 슬라이드 박스에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미토성 염색체 스쿼시 제제에 대한 물고기<ol>
<li>안감비아의4번째 인스타 애벌레의 상상디스크로부터 미토성 염색체를 추출한다.</li>
		<li>FISH에 적합한 염색체 슬라이드를 준비합니다.</li>
		<li>라벨이 부착된 DNA 프로브의 2-3 μl을 튜브의 혼성화 버퍼에 넣고 파이펫팅하여 부드럽게 섞습니다.</li>
		<li>프로브 혼합물의 10 μl을 슬라이드에 바르고 22 X 22mm 커버슬립으로 덮습니다. 파이펫 팁을 사용하여 기포를 누릅니다.</li>
		<li>카운터스테인링 및 검출을 위해 DAPI를 사용하여 페이드 방지 연장을 준비에 적용하고 시각화하기 전에 적어도 한 시간 동안 어둡게 유지하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6) 전체 마운트 난소 조직에 3D 물고기
<ol><li>다음 버퍼 A 믹스를 준비합니다. 60mM KCl 15 mM NaCl 0.5 mM 스미디딘 0.15 mM 스퍼마인 2mM EDTA 0.5 mM EGTA 15m 파이프</li>
	<li>커버립의 크기에 맞게 정사각형 패턴에 매니큐어 레이어를 추가하여 핵 시각화슬라이드를 준비합니다. 이것은 미래에 커버 슬립에 배치 할 때 핵의 분쇄를 방지하기 위해 제기 표면을 만듭니다.</li>
	<li>크리스토퍼의 단계 3 여성에서 신선한 난소를 해부하고 0.5 %의 디지토닌150-250 μl 버퍼 A의 용액에 보관하십시오. 여포 보다 더 큰 해부 바늘을 실행 (0.5% digitonin와 버퍼 A튜브에서) 여포 막을 파괴하기 위해.</li>
	<li>5-10 분 동안 소용돌이가 여포를 더 방해합니다. 분당 ~500회전(RPM)의 가장 낮은 설정에서 30초 동안 큰 여포 조각과 원심분리기 튜브를 긁어냅니다. 새로운 2ml Eppendorf 튜브로 상체를 옮기고, 가시 조직이 작은 입자로 나눌 때까지 버퍼 A. 반복 단계 6.3의 100 μl을 5-7배 사이 추가합니다.</li>
	<li>2,000 RPM에서 두 튜브를 10분 동안 회전합니다. 두 튜브 모두에서 상수폐기. 참고: 두 튜브 모두 최종 핵 시각화 슬라이드를 만드는 데 사용됩니다. 수집된 상체관을 가진 관은 주로 추출한 핵을 포함해야 하며, 조직을 가진 원래 튜브는 간호사 세포에 내장된 조직과 핵의 혼합물을 포함할 것이다. 버퍼 A의 200 μl을 추가 – 0.1% 트리톤과 4 °C에서 하룻밤 배양. 원심분리기는 10,000 RPM(10,621 x G)에서 5분 동안 상주분리기를 제거합니다.</li>
	<li>PBS에 200 μl 4% 파라포름알데히드를 추가합니다. 450 RPM에서 혼합, 30 분 동안 열믹서에서 인큐베이션. 원심분리기는 5,000RPM(2,655 x G)에서 5분 동안 상설을 제거하고 상류부를 제거합니다. 버퍼 A로 0.1% 트리톤으로 5분 동안 세척하고, 써모믹서의 450 RPM에서 혼합합니다. 원심분리기는 5,000RPM(2,655G)에서 5분 동안 상복부를 제거합니다.</li>
	<li>튜브에 37°C 표지 프로브에서 미리 따뜻하게 추가합니다. 열믹서에서 95°C에서 450 RPM에서 10분 동안 혼합합니다. 계속 혼합으로 15 분 동안 80 °C에서 계속 데칭하십시오. 써모믹서에서 37°C에서 배양하고 하룻밤 사이에 450 RPM이 혼합됩니다. 원심분리기 5분 5분 5분 5,000 RPM(2,655 x G). 상부체를 제거합니다.</li>
	<li>버퍼 A로 5분 동안 0.1% 트리톤으로 세척합니다. 원심분리기 5분 5분 5분 5,000 RPM(2,655 x G). 2번 반복합니다. DAPI로 장간 페이드 방지 한 방울을 적용합니다.</li>
	<li>핵/DAPI 용액을 조심스럽게 피펫(거품 을 피하고), 슬라이드에 바르고 커버슬립으로 덮습니다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

미세 한 차분 폴리텐 염색체 샘플에서 DNA를 성공적으로 증폭하는 데 중요한 여러 단계가 있습니다. 이 프로토콜은 전체 적인 효율성을 높이고 시료와의 물리적 도구의 상호 작용을 제거하여 외국 DNA에 대한 노출을 줄이는 방법인 LCM의 사용을 사용합니다. 그러나, 외국 DNA의 증폭은 아직도 이 실험의 가장 중대한 잠재적인 함정입니다. 따라서 전체 공정 중에 오염으로부터 샘플을 보호하는 것이 필수적입니다. 슬라이드 준비 및 미세 절단계 전반에 걸쳐, 에탄올 세척 해부 바늘, 슬라이드, 커버 슬립뿐만 아니라 작업 공간에 필수적이다.  또한 사용하기 전에 모든 해당 장비 (바늘, 슬라이드, 커버립)를 UV 치료하는 것이 좋습니다.
해부 슬라이드의 멤브레인은 염색체의 확산을 매우 어렵게 만듭니다.  이 슬라이드를 만들 때 난소 (난소의 전체 쌍에 반)를 더 많이 사용하는 것이 중요합니다, 잘 확산 핵을 찾는 더 큰 기회를 제공하기 위해.  또한 슬라이드를 만들 때 신선한 조직을 사용하는 것이 좋습니다, 증폭 속도 는 조직 나이로 떨어지는 것으로 나타납니다 49 염색체 확산더 도전이된다.  마이크로 절에 대한 슬라이드의 준비는이 프로토콜에서 가장 시간이 많이 걸리는 단계입니다.  염색체는 원치 않는 물질의 우발적 인 취득을 피하기 위해 잘 확산해야합니다.  Giemsa 염색을 통해 사용자는 미세 절제를 사용하기 전에 위상 대비 현미경으로 확산 품질을 확인할 수 있습니다.
미세 절과 증폭의 조합은 작은 관심 영역에서 대부분의 무기에 이르기까지 크기의 염색체 조각을 추출하고 분석 할 수있는 기회를 제공합니다.  이 프로토콜은 사용자가 반전, 특정 우통 밴드 및 인터밴드, 텔로머릭, 센트로메릭 및 간 이종과 같은 형태학적으로 구별되는 영역에서 DNA를 얻을 수 있게 합니다. 사용자는 생성된 페인팅 프로브를 비정상적인 염색체를 검사하거나, 특정 loci에서 종 간 상동성을 연구하거나, 그대로 3D 핵에서 염색체의 공간 조직을 특성화하는 데 적용할 수 있다. 염색체 페인트를 개발하기 위해 여러 염색체 영역을 가진 반복성 DNA의 혼성화를 피하기 위해 유색성 세그먼트를 선택했습니다. 그 결과, 총 게놈 DNA 또는 C0t-1 DNA 분획과 같은 경쟁사를 사용하지 않고 팔 별 그림을 얻었습니다.
우리는 다중 증폭 키트의 효율성과 중퇴 율을 비교 리뷰를 기반으로 게놈 플렉스 WGA 및 REPLI-G 키트를 사용하기로 결정했다 40,44.  두 키트 모두 탈락률 모두에서 사용 가능한 방법 중 에서 가장 좋은 성과를 보였습니다(GenomePlex는 REPLI-g의 37.5%에 비해 12.5%의 비율을 보였습니다. 증폭된 마커의 비율(GenomePlex는 45.24% 증폭율을 보였고, 렙리-g는 30.0% 40. GenomePlex 키트는 또한 더 많은 양의 DNA를 제공하므로 여러 다운스트림 기술에 대한 더 나은 후보가되었습니다.  GenomePlex 시스템을 위한 재증폭 키트도 사용할 수 있어 DNA의 추가 증폭을 가능하게 합니다. 그러나 증폭이 완벽하지 않다는 점에 유의해야 합니다.  가능성은 성공적인 증폭 오류를 소개하거나 대상 DNA에 있는 특정 loci에 대한 편견이 있을 수 있다는 것을 남아 있습니다. 사용 가능한 게놈 증폭 방법의 최종 단편 크기를 고려하는 것이 중요합니다.  GenomePlex 조각화는 200-500 bp에 이르는 파편이 있는 라이브러리를 생성하며, REPLI-g 키트는 약 10-20 kb 크기의 조각을 생성합니다. 이 프로토콜의 의도된 다운스트림 응용 프로그램은 FISH이므로, 원하는 단편 크기와 WGA를 통해 DNA 단편을 직접 라벨로 표시하는 기능을 제공했기 때문에 GenomePlex 키트를 보다 실현 가능한 옵션으로 만듭니다. REPLI-g 증폭에 의해 생성된 긴 DNA 분자는 다운스트림 닉 번역 라벨링 반응에서 단편화되어야 합니다.
이 프로토콜은 단일 폴리텐 염색체 팔에서 DNA를 성공적으로 증폭하도록 조정되었습니다.  다른 프로토콜은 시료 7,11,28,40을 성공적으로 증폭시키기 위해 많은(일반적으로 10-30) 염색체 조각의 풀링을 필요로 한다.  다중 염색체의 풀링은 우리의 방법을 사용하여 가능하지만, 견본 오염의 증가한 가능성은 가능한 한 적은 염색체로 실험을 시작하는 의 중요성을 강조합니다. 폴리텐 염색체를 사용할 수 없는 경우, 우리의 프로토콜은 미토성 염색체에 사용하기 위해 적응될 수 있었습니다. 그러나 성공적인 FISH 11을위해 증폭되기 전에 10-15 개의 미토성 염색체를 풀기 위해 필요할 수 있습니다. 증폭 편향은 시작 템플릿 DNA 50의높은 수량으로 낮다. 폴리텐 염색체는 단일 DNA 서열의 약 512부와 2개의 상동성 DNA 서열의 1024부를 제공한다.  따라서, 미토성 염색체를 풀링하면 증폭 후 DNA 제품의 전반적인 품질을 높이는 데 도움이 될 것입니다.
이 절차는 세포 유전학 및 유전체 학 연구에서 많은 잠재적인 사용. 여기서는 염색체 페인트를 사용하여 안감비아에폴리텐과 미토틱 염색체 암의 유색세그먼트사이의 대응성을 확립했습니다. 동일한 페인팅 프로브는 An. 감비아 세포주의 세포유전학 적 특성화에 적용될 수 있다. 염색체 수의 광범위한 게놈 재배열 및 변화는 세포주 51,52의일반적인 특징이다. 전좌, 반전, 삭제 및 링 염색체와 같은 항문 재배열은 상이한 모기 세포주(53,54)에서검출되었다. 고전적인 세포 유전학 관찰 55 및 물리적 매핑 56 말라리아 모기의 진화에 있는 전쪽 무기 염색체 전좌의 발생을 입증했습니다. 따라서, 미세한 분제물질은 물고기 실험과 함께 종 간 염색체 영역의 상동성을 비교하는 데 사용될 수 있다. 우리는 성공적으로 전체 마운트 난소 간호사 세포에서 폴리텐 염색체에 2R 페인팅 프로브와 3D FISH를 수행. 이 방법은 염색체 궤적의 추적과 Anopheles의핵 아키텍처를 공부할 수 있습니다. DNA genotyping 57,58,차세대 게놈 시퀀싱 26,27,물리적 및 연계 맵 개발 및 염색체 페인팅 33,59 등의 기술은 모두 팔 및 지역 별 미세 절제로부터 혜택을 누릴 수 있다. LCM 기술을 결합하고 단일 세포 WGA를 발전시킴으로써 단일 다발성 염색체 암에서 합리적인 양의 DNA를 생산하는 효율적이고 실용적인 방법을 보여줍니다.

염색체 페인팅은 karyotype 1-5의 진화를 연구하고 형광으로 표지된 염색체 DNA 1,6-8의혼성화를 통해 세포유전학 이상을 시각화하는 데 유용한 기술이다. 이 방법은 또한 개발 9 및 병리학 (10)에서염색체 영역의 3D 역학을 연구하는 데 적용됩니다. 차분하게 표지된 염색체 페인트는 개별 미토틱 11,12,메이오틱 13,14,또는 상 간 비폴리텐(15, 16 및 폴리텐 9, 11, 17 염색체)의 시각화에 사용된다. 염색체 페인트를 얻기 위한 간단하고 견고한 프로토콜은 모기와 같은 비 모형 유기체로 이 기술을 확장하는 데 매우 유용할 것입니다. Anopheles 감비아 복합체는 말라리아를 전송하는 기능을 포함하여 행동과 적응에 있는 변화하는 7개의 형태학적으로 구별할 수 없는 모기의 단입니다.  이 모기는 그들의 벡터 용량에 있는 크게 다른 밀접하게 관련된 종의 진화를 더 잘 이해하기 위하여 훌륭한 모형 역할을 합니다.  말라리아 모기에 있는 대부분의 세포유전학 연구 결과는 잘 발달된, 높게 다원화한 염색체를 사용하여 행해졌습니다 (18에서검토된,19). 폴리텐 염색체의 판독 가능한 밴딩 패턴은 연구원이 Anopheles 감비아20에서 다형성 반전과 생태 적응 사이의 연관성을 입증할 수 있게 했습니다. 또한, 조직별 21및 종별 22개의 특징인 3D 폴리텐 염색체 조직은 An. macullipennis 복합체에서 특징지어지고 있다. 그러나, 미토성 염색체를 공부하는 것은 추가 중요한 정보를 제공할 수 있었습니다. 예를 들어, 미토성 염색체에서 관찰된 이종다형성의 높은 수준은 An. gambiae 23에서감소된 짝짓기 활동 및 다산과 상관관계가 있다. 폴리텐과 미토성 염색체 암의 유록분 세그먼트 사이의 통신은 상대적 길이를 비교하여서만 확립하기가 어려울 수 있습니다. 이는 이종 염색체의 상당 부분을 구성하지만 폴리텐 염색체(24)에서과소 대표되기 때문이다. 말라리아 모기를 위한 염색체 페인트의 가용성은 연구원이 역학적으로 중요한 곤충의 이 단에 있는 karyotypic 진화 및 염색체의 3D 역학의 분석에서 비용 그리고 시간을 실질적으로 감소시키면서, 추가 종을 포함하여 세포유전학 연구 결과를 현저하게 확장하는 것을 허용할 것입니다.
염색체의 큰 뻗어를 얻기 위하여는, 미세 절부는 염색체 보충의 관심의 특정 지역을 조작하고 격리하는 필수적인 기술이 되었습니다.  전체 게놈 증폭(WGA)과 결합하면, 마이크로절은 FISH 11,12 및 차세대 게놈 시퀀싱 25-27을포함한 강력한 다운스트림 응용 을 초래한다. 이전에는 숙련된 사용자(28)가수동으로 제어해야 하는 특수 미세 절 바늘의 사용을 요구했습니다.  레이저 포획 미세 절제(LCM)의 발전으로 단일 셀 29,30 또는 개별 염색체 31-33을 오염 위험이 줄인 분리에 더 적합한 단순화 된 도구가 생겼습니다. 이 접근법은 사용자가 단일 세포에서 발생하는 유전 이질성 및 염색체 이상을 연구할 수 있게 해주며, 대신 여러 세포를 34-36으로풀링하여 발생하는 합의 풍경대신에 발생합니다. 여러 가지 방법이 마이크로 절제에서 생성된 DNA를 증폭시키는 데 사용되었습니다.  DOP-PCR은 고반복서열의 증폭에 유용한 기술로, 메뚜기(37), 가시 장어(38)및 나일틸라피아(39)를 포함한 종으로부터 미세한 염색체를 증폭시키는 데 사용되어 왔다.   최근에는 PCR 기반 GenomePlex WGA4 단일 세포 키트및 다중 변위 증폭 기반(MDA) Repli-G 단일 세포 키트가 메뚜기 37 및 로큐스트(43)의 B 염색체 시스템을 포함하여 단일 인간 세포뿐만 아니라 염색체40-42의유전자 분석을 포함하는 실험에 귀중한 도구가 되었습니다. 이 두 키트는 각각 장점과 단점을 가지고 있지만, 다른 사용 가능한 증폭 시스템 보다 그들의 명백한 우월성은 입증 되었습니다 44.
단일 염색체 또는 염색체 세그먼트로부터 얻을 수 있는 DNA의 양은 전체 핵보다 현저히 적습니다. 따라서 단일 염색체의 미세 절, 증폭 및 후속 분석은 특히 Drosophila 또는 Anopheles와같은 작은 게놈을 가진 유기체에서 훨씬 더 도전적입니다.  비록 인간의 단일 미세 한 염색체로부터 개발 되었지만 (33 및 말벌 45),성공적인 FISH 실험필요 여러 (적어도 10-15) 과일 플라이의 미세 한 미토성 염색체(11). 그러나, 단일 염색체를 미세하게 해와 증폭시키는 능력은 (i) 상이한 염색체로부터 물질로 오염의 가능성을 감소시키고, (ii) 미세절에 필요한 염색체 제제의 수를 최소화하고, (iii) 미세분해시 샘플의 뉴클레오티드 및 구조적 다형성을 낮추는 것이 중요할 것이다. 많은 Dipteran 종에서 찾아낸 폴리텐 염색체는 DNA의 훨씬 더 높은 개시 량을 취득하는 유일한 기회를 제공합니다. 그(것)들은 또한 미토성 염색체의 사용을 통해 달성될 수 없는 더 높은 해상도 및 염색체 구조물을 제공합니다. 이 추가 된 해상도는 염색체 재배열, 크로마틴 구조 및 염색체 세그먼트를 미세 하게 하여 28,46으로시각화하는 데 중요 할 수 있습니다.
여기서 우리는 단일 폴리텐 염색체 팔에서 유색 세그먼트를 효율적으로 분리하고 DNA를 증폭시키고 말라리아 모기의 하류 FISH 응용 프로그램에서 사용하는 절차를 제시합니다.  첫째, 특별히 준비된 멤브레인 슬라이드에서 단일 염색체 암을 분리하고 추출하기 위해 LCM을 적용합니다. 둘째, WGA는 미세한 분물질로부터 DNA를 증폭시키는 데 사용된다. 셋째, 우리는 생선 실험에서 증폭된 DNA를 혼성화하여 스쿼시 제제(47),메타위상 및 상간 염색체 슬라이드(48)와3D 난소 전체 마운트 샘플을 다포텐화한다. 이 절차는 성공적으로 An. 감비아의염색체 팔에 유크로 마틴의 대부분을 페인트하기 위해 수행되었습니다.

<table><tbody><tr><td>아세트산</td><td>Fisher Scientific</td><td>A491-212</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>프로피온산&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td></td></tr><tr><td>멤브레인 슬라이드 1.0 PET</td><td>Zeiss</td><td>415190-9051-000</td><td></td></tr><tr><td>버퍼 정제 " 구르"</td><td>Life Technologies</td><td>10582-013</td><td></td></tr><tr><td>KaryoMAX Giemsa Stain</td><td>Life Technologies</td><td>10092-013</td><td></td></tr><tr><td>ThermoBrite 슬라이드 변성/하이브리드화 시스템</td><td>Abbott Molecular</td><td>30-144110</td><td></td></tr><tr><td>진공 농축기</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td></td></tr><tr><td>Spectroline 마이크로프로세서 제어 UV 가교제 XL-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific NanoDrop</td><td>Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>REPLI-g 단일 세포 키트</td><td>Qiagen</td><td>150343</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex 단일 세포 키트(WGA4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WGA4-10RXN</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex WGA 재증폭 키트(WGA3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WGA3-50RXN</td><td></td></tr><tr><td>MZ6 Leica 실체현미경</td><td>Leica</td><td>VA-OM-E194-354</td><td>다른 스테레오현미경을 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Olympus CX41 위상 현미경</td><td>Olympus</td><td>CX41RF-5</td><td>다른 위상 현미경을 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>PALM MicroBeam Laser Microdissection 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>22670000</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhardt& 알스코오; s 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>99% 포름아미드</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP227500</td><td></td></tr><tr><td>덱스트란 설페이트 나트륨 염</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>AM9765</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 안티페이드 시약 with DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td><td>Fermentas</td><td>R0141, R0151, R0161, R0171</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td><td>GE 헬스케어</td><td>PA53022, PA55022</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>DNA 중합효소 I</td><td>발효</td><td>EP0041</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>발효</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>스페르민</td><td>시그마-알드리치</td><td>S3256-1G</td><td></td></tr><tr><td>스페르미딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP3581</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마-알드리치</td><td>E0396-25G</td><td></td></tr><tr><td>파이프</td>: <td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-25G</td><td></td></tr><tr>,<td>EDTA</td><td>, Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr>, <tr><td>Digitonin,</td><td>Sigma-Aldrich</td>, <td>D141-100MG</td><td></td></tr>, <tr><td>Triton-X100</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr>, <tr><td>AdhesiveCap, 500, clear</td>, <td>Zeiss</td>, <td>415190-9211-000</td><td></td></tr>, <tr><td>QIAamp, DNA Micro Kit, (50)</td><td>Qiagen</td>: <td>56304</td><td></td></tr><tr><td>게놈 DNA 클린 및 농축기 키트</td><td>Zymo Research</td><td>D4010</td><td></td></tr><tr><td>37% 파라포름알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td></td></tr></tbody></table>

말라리아 모기의 2d 및 3d 염색체 페인팅

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

전체 암 염색체 프로브의 현장 혼성화(FISH)의 형광은 게놈 영역을 매핑하고, 염색체 재배열을 감지하고, 세포 핵에서 염색체의 3차원(3D) 조직을 연구하기 위한 강력한 기술이다. 레이저 포획 미세 절(LCM) 및 전체 게놈 증폭(WGA)의 출현은 단일 세포로부터 다량의 DNA를 얻을 수 있게 합니다. WGA 키트의 감도가 높아짐에 따라 염색체 페인트를 개발하고 염색체 조직과 비모델 유기체의 진화를 탐구하는 데 사용하게 되었습니다. 여기서, 우리는 아프리카 말라리아 모기 아노펠스 감비아의난소 간호사 세포로부터 단일 폴리텐 염색체 암의 유색세그먼트를 분리하고 증폭시키는 간단한 방법을 제시한다. 이 절차는 염색체 페인트를 얻기 위한 효율적인 플랫폼을 제공하며, 시료에 외국 DNA를 도입할 위험을 줄입니다. WGA의 사용은 재 증폭의 여러 라운드를 허용, 2D 및 3D FISH를 포함하여 여러 실험에 사용할 수있는 DNA의 높은 수량의 결과. 개발된 염색체 페인트는 안감비아에폴리텐과 미토성 염색체 암의 유록분 부분 사이의 대응을 성공적으로 확립하는 데 사용될 수 있음을 입증했다. 전반적으로, LCM과 단 염색체 WGA의 조합은 미래 세포 유전학 및 유전체 학 연구를 위한 표적 DNA의 상당한 양을 만들기 위한 능률적인 공구를 제공합니다.

그림 1에서는 이 문서에 설명된 프로토콜의 전체 흐름 에 대해 설명합니다.  사용자는 처음에 막 슬라이드에서 염색체 DNA 샘플을 미세 하게 하여 시작합니다.  미세 한 분은 추출 및 정제됩니다. 정제 된 DNA는 다음 증폭, 다시 증폭, 라벨, 다음 염색체 확산을 표시하기 위해 FISH에 사용됩니다.
LCM 프로토콜은 세 가지 전체 단계로 세분화될 수 있다: 1) 관심있는 염색체를 찾아서 절단 부위를준비(도 2A),2) 레이저(도2B)를통해 관심 있는 염색체 영역을 절단 및 촉매시키는 3) 샘플이 실제로 접착제캡(그림 2C)으로발사되는지 확인한다. An. 감비아에 수아 균주 폴리텐 염색체에 사용되는 LCM의 과정은 비디오 1에 도시된다. 비디오는 중요한 소프트웨어 기능과 팁을 포함하여 프로그램 시작의 전체 프로세스에 대해 자세히 설명합니다.
이 프로토콜에 사용되는 GenomePlex 및 REPLI-g 단일 셀 WGA 키트는 결과 제품 크기와 전체 수율에 크게 다릅니다.  도 3은 GenomePlex 및 REPLI-g 키트에 대한 겔 전기전도의 결과뿐만 아니라 나노드롭에 의한 시료의 정량화를 나타낸다.
미세 한 분은 염색체의 유체 영역을 대상으로 하는 FISH 프로브를 만드는 데 사용되었습니다.  도 4는 An. 감비아의폴리텐 염색체에 미세한 분과 물질에서 생성된 5개의 프로브의 FISH를 시연한다.  4개의 자가암은 WGA3 키트를 사용하여 3개의 형광으로 표시되었다: 3R 염색체는 녹색(형광체), 3L 염색체는 빨간색(Cy-3)과 노란색(Cy-5)의 혼합물에 있고, 2R 염색체는 노란색(Cy-5), 및 2L 염색체(Cy-5)에 있고 2L 염색체는 3L 염색체(Cy-5)에 속한다. X 염색체는 별도의 실험에서 REPLI-g 물질의 닉 번역을 사용하여 주황색(Cy-3)으로 표지되었다. 폴리텐과 미토틱 염색체 암의 유록분 부분 사이의 대응을 확립하기 위해 염색체 페인트는 An. 감비아의 상, 프로페이즈, 프로메타상 및 메타상 염색체에 혼성화되었다(그림5).  세포 핵에서 단일 폴리텐 염색체 암의 3D 조직을 시각화하기 위해, 전체 마운트 FISH는 An. 감비아 수아 균주 난소 간호사 세포(Video 2)에서 수행되었다.  뚜렷한 염색체 암 계열은 상(도5D)및 폴리텐(Video 2) 염색체를 가진 핵에서 명확하게 볼 수 있다.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> 그림 1. 염색체 페인트의 준비를 향한 실험 절차의 회로도 표현. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> 그림 2. 염색체 미세 절제의 주요 단계. A) 멤브레인을 통해 관심있는 염색체 영역의 레이저 보조 절단. B) 발사 후 구멍이 있는 멤브레인이 수행됩니다. C) 접착캡에 부착된 염색체 세그먼트를 가진 멤브레인의 촉매제 조각의 보기. 화살표는 슬라이드에 남아 있는 X 염색체의 이종로크로마틴을 나타냅니다. 별표는 슬라이드에 남아 있는 또 다른 염색체 조각을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> 그림 3. WGA 후 DNA를 보여주는 아가로즈 젤 이미지. A) WGA4 및 WGA3 GenomePlex 키트를 사용한 후 팔 3R에서 저분자량(200-500 bp) DNA. B) 리플리-g 증폭 후 팔 2L로부터 의 높은 분자량(10-20 kb) DNA. 100 bp 사다리는 왼쪽 차선에 표시됩니다. 젤 이미지 아래 표는 Nanodrop에 의해 측정된 DNA 농도를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> 그림 4. 미세 한 분체 물질에서 생성 된 4 개의 프로브를 사용하여 An. 감비아의 난소 간호사 세포에서 폴리텐 염색체의 페인팅. X 염색체는 REPLI-g 재료의 닉 번역에 의해 주황색(Cy-3)으로 표시됩니다. 2R 암은 노란색(Cy-5)으로 표시되어 있습니다. 2L 팔은 빨간색 (Cy-3); 3R 암은 녹색(형광체)으로 표시되어 있습니다. 3L 암은 빨간색(Cy-3)과 노란색(Cy-5)의 혼합물로 표시된다. 오토솜에는 WGA3 증폭 키트가 라벨이 부착되어 있습니다. 크로마틴은 파란색(DAPI)으로 염색됩니다. 염색체 이름은 텔로머 영역 근처에 배치됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> 그림 5. WGA3에 의해 표지된 미세한 분질에서 생성된 3개의 프로브를 사용하여 An. 감비아에 Mopti 균주의 애벌레 상상 디스크에서 단계(A), prophase (B), 프로메타위상(C) 및 메타상(D) 염색체의 페인팅. 2R 암은 녹색 (형광체)으로 표시됩니다. 2L 팔의 라벨이 지정되지 않습니다. 3R 암은 분홍색, 빨간색 (Cy-3)과 오렌지 (Cy-5)의 혼합물입니다. 3L 암은 주황색(Cy-5)으로 표시되어 있습니다. X 염색체에는 18S rDNA 프로브에 해당하는 빨간색 라벨이 있습니다. 크로마틴은 파란색(DAPI)으로 염색됩니다. 염색체의 밝게 얼룩진 지역은 이종으로 막트로마틴에 해당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 1. An. 감비아제 폴리텐 염색체의 LCM 프로세스. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">비디오 1을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 2. 전체 마운트 3D FISH는 An. 감비아난소 간호사 세포에서 수행됩니다. 프로브는 Cy-3(파란색으로 묘사)로 표시되어 미세한 2R 염색체 팔로 만들어졌습니다.  크로마틴은 DAPI로 염색되었으며 시안 의사 색소(라이트 블루)에 의해 묘사됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">비디오 2를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

염색체 페인팅은 세포 핵의 조직과 카요타입의 진화를 연구하는 데 유용한 방법입니다. 여기서, 우리는 이후 시상 혼성화(FISH)에서 2차원 및 3차원 형광에 사용되는 단일 폴리텐 염색체로부터 관심 있는 특정 영역을 분리하고 증폭시키는 접근법을 시연한다.

말라리아 모기의 2D 및 3D 염색체 페인팅

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

본 절차의 전반적인 목표는 어류 실험에 직접 사용할 수 있도록 단일 미세 절제 폴리텐 염색체 팔로부터 충분한 양의 DNA 증폭물을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 미세 절제를 위해 특수하게 설계된 멤브레인 슬라이드 상에서 폴리텐 염색체 압착 표본을 준비함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 레이저 미세 절제를 통해 개별 폴리텐 염색체 팔을 분리하고 포집하는 것입니다.세 번째 단계는 미세 절제된 샘플에서 DNA를 분리하고, 두 차례의 전유전체 증폭을 통해 DNA를 증폭하는 것입니다. 마지막 단계는 증폭된 DNA를 표지하여 어류 실험에 사용하는 것입니다. 궁극적으로, 이 과정을 통해 관심 영역에 대한 다량의 형광 표지 DNA를 얻을 수 있습니다.백 클론(back clones) 또는 PCR 단편을 이용한 FISH와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 이러한 표지 프로브를 사용하여 염색체의 넓은 영역을 형광으로 염색할 수 있다는 점입니다. 또한, 염색체 페인트는 온전한 염색체 팔에서 기계적으로 분리되므로 서열 정보를 알 필요가 없습니다. 먼저, 신선한 카노이즈(Carnoy) 용액으로 고정된 약 5마리 모기의 난소에서 염색체를 분리하십시오.염색체 도말 상태가 양호한 것이 확인되면, 변성 과정을 통해 염색체를 평평하게 만든 후 하룻밤 동안 저온 배양합니다. 다음 날, 미세 절단을 준비하기 위해 염색체를 탈수하고 세척합니다. 에탄올로 미세 절단 현미경을 닦고 장갑과 튜브를 uv로 멸균하십시오.그런 다음 텍스트 프로토콜에서 제공하는 보조 영상을 참고하여 염색체를 미세 절제합니다. 뒤집힌 튜브를 사용할 수 있도록 수정된 cogen 키트를 사용하여 DNA를 수집하십시오. 이어서 컬럼 정제 후 물로 용출합니다.단일 염색체 팔의 전유전체 증폭을 위한 두 가지 경로가 있습니다. ley g 경로는 초기 수율이 더 높지만, DNA 표지를 위해 NIC 번역이 필요합니다. genome plex 경로의 장점은 여러 차례의 복제가 가능하며 최종 결과 프로브를 직접 표지할 수 있다는 점입니다.오염 물질이 증폭될 가능성이 매우 높으므로 가능한 한 가장 멸균된 상태에서 진행하십시오. Genome Plex Root의 경우, 먼저 Single Cell WGA Four 키트를 사용하여 첫 번째 배치(batch)의 증폭 DNA를 생성합니다. 둘째, Genome Clean and Concentrator 키트를 사용하여 DNA를 정제합니다.세척된 DNA를 용출할 때 TE buffer가 아닌 물을 사용해야 함을 잊지 마십시오. 셋째로, DNA를 재증폭하고 넷째로 물고기용 라벨을 부착하는 두 단계를 수행하십시오. WGA three re amplification kit를 사용하십시오.DNA 라벨링에는 특정 비율의 뉴클레오타이드와 라벨링된 DUTP가 포함된 특수 DNTP 믹스를 사용해야 합니다. rege 키트를 실행할 때, root는 먼저 갓 멸균된 물과 최근에 제조한 D two 버퍼를 사용하여 단일 세포 WGA 키트를 사용했습니다. 다음으로, NIC translation 프로토콜에 따라 증폭된 DNA를 라벨링하십시오.겔에서 DNA 단편 크기를 반드시 확인하십시오. 단편의 크기는 약 200에서 500 base pair여야 합니다. 마지막으로 DNA를 에탄올 침전시키고 샘플을 4 °C에서 10분 동안 원심 분리하십시오.그 다음 회수된 펠렛을 공기 건조시키고 하이브리다이제이션 완충액 40 µL를 첨가합니다. 건조되는 동안, 커버슬립이 놓일 자리에 매니큐어로 사각형 벽을 만들어 슬라이드를 준비함으로써 커버슬립에 의해 핵이 짓눌리지 않도록 합니다. 이제 Christopher의 stage three half grave 암컷 모기에서 신선한 난소를 분리합니다.난소를 0.5% digitonin이 포함된 버퍼 150 to 250 µL가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 굵은 해부용 바늘을 사용하여 여포막을 파괴합니다. 그 다음, 튜브를 5 to 10분 동안 볼텍싱하여 여포를 더욱 분쇄합니다.큰 난포 조각들을 긁어내고 튜브를 약 500 RPM의 저속으로 30초 동안 원심분리합니다. 상층액을 새 튜브로 옮기고, 분쇄된 난포가 들어 있는 원래 튜브에 버퍼 A 100 microliters를 추가합니다. 이제 가시적인 조직이 작은 입자로 변할 때까지 분쇄된 난포에 대해 핵 분리 단계를 반복합니다.모든 상층액은 대부분 핵을 포함하고 있으므로 동일한 튜브에 수집합니다. 다음으로, 상층액이 담긴 튜브와 예비용으로 처리한 잔여 조직이 담긴 튜브를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 0.1% Triton이 포함된 버퍼 A 200 µL를 첨가한 후, 펠릿이 완전히 풀릴 때까지 튜브를 강하게 볼텍싱하고 샘플을 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 튜브를 10,000 RPM에서 5분 동안 원심 분리하고, 상층액을 제거한 뒤 PBS에 희석된 4% paraform aldehyde 200 µL를 첨가합니다. 그 후 thermo mixer에서 450 RPM으로 혼합하며 30분 동안 배양합니다. 5,000 RPM에서 5분 동안 원심 분리하여 고정액을 제거하고, 상층액을 버립니다.그 다음 0.1% Triton이 포함된 버퍼 A를 첨가하고, 서모 믹서(thermo mixer)를 이용해 450 RPM으로 5분간 인큐베이션한 후, 5,000 RPM으로 5분 더 원심분리하여 세포를 세척합니다. 37 °C로 예열한 표지 프로브(labeled probe)를 준비합니다. 세포가 펠렛(pellet)으로 형성되면, 상층액을 제거하고 최소 20 µL의 표지 프로브로 교체합니다.농도는 걱정하지 않으셔도 됩니다. 다음으로, Thermo mixer를 사용하여 95 °C에서 450 RPM으로 10분간 DNA를 변성시킨 후, 계속해서 혼합하며 80 °C에서 15분 동안 변성을 진행합니다. 그 다음 온도를 37 °C로 낮추고 샘플을 밤새 혼합 상태로 유지합니다.다음 날, 5,000 RPM(2,655 G)에서 5분간 원심분리하여 핵을 회수합니다. 상층액(SUPERNAT)을 0.1% Triton이 포함된 세척 완충액으로 교체합니다. 상온에서 약 500 RPM으로 교반하며 5분 동안 세포를 세척합니다.또 다른 원심분리를 통해 세척액을 제거하고 세척 과정을 두 번 더 반복합니다. 세 번째 세척액을 제거한 후, 즉시 DPI가 포함된 prolonged anti fade 한 방울에 핵을 재부유시킵니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 핵을 준비된 슬라이드로 조심스럽게 옮긴 후 커버슬립을 덮어 genome plex 및 ee를 수행함으로써 마무리합니다.모기 조직을 대상으로 두 종류의 단일 세포 WGA 키트를 설명서에 따라 사용하였습니다. 결과물로 얻은 DNA를 겔 전기영동으로 비교하였습니다. 수율에 뚜렷하고 상당한 차이가 있었으며, 이는 분광 분석을 통해서도 확인되었습니다.모기 다염색체(polytene chromosomes)의 미세 절단 시료를 대상으로 5개의 프로브를 사용하여 FISH를 수행하였습니다. 4개의 상염색체 알람은 WGA three 키트를 사용하여 3가지 형광색소로 표지하였습니다. 3번 R 염색체는 녹색 플루오레세인으로 표지하였습니다.세 개의 L 염색체는 빨간색과 노란색이 혼합되어 있습니다. 두 개의 R 염색체는 노란색이며, 두 개의 L 염색체는 빨간색입니다. X 염색체는 ley G 물질의 NIC 번역과 폴리텐 염색체 및 유사분열 염색체 팔의 염색질 부분 간의 대응 관계를 설정하기 위한 별도의 실험을 통해 오렌지색으로 표시되었습니다.염색체 페인트를 간기 염색체에 하이브리드화하였습니다. 2번 R 팔은 녹색으로 표시되었습니다. 3번 R 팔은 분홍색이며, 3번 L 팔은 주황색으로 표시되었습니다.DPI를 통해 염색질을 청색으로 염색하여 전기 염색체를 관찰하였습니다. X 염색체는 18 S-R-D-N-A 프로브에 해당하는 적색 라벨을 나타냅니다. 이어서 전중기 염색체를 관찰하였으며, 중기 염색체 또한 확인되었습니다.밝게 파란색으로 염색된 영역은 이질염색질(heterochromatin)에 해당하며, 이를 통해 세포핵 내 단일 다사염색체(polytan chromosome) 팔의 3D 구조를 시각화할 수 있습니다. sue 계통을 대상으로 전체 마운트(whole mount) 어류 표본 제작을 수행하였습니다. 다사염색체에서 모기 난소 영양세포의 염색체 팔 영역이 명확하게 관찰됩니다.마찬가지로, 인터페이스 상태의 핵에서 뚜렷한 염색체 팔 영역이 명확하게 관찰됩니다. 이 절차를 수행하는 동안, 오염 위험을 염두에 두고 모든 단계를 진행하는 것이 중요합니다. 샘플이 쉽게 오염될 수 있으며, 이는 의도한 DNA의 증폭 수율 저하로 이어질 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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식물 유사 키나아제의 저형성 대립유전자를 품고 있는 돌연변이 말라리아 기생충의 보상 경로 개발 이해

배우세요 말라리아 모기의 다염색체 팔에서 DNA를 분리·증폭하여 FISH 실험용 형광 프로브를 만드는 염색체 페인팅 기법입니다. 이 방법은 서열 정보 없이도 대형 염색체 영역을 시각화하여 세포핵 구조와 진화 연구에 활용됩니다.

말라리아 모기의 2D 및 3D 염색체 페인팅

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