말라리아 모기의 2D 및 3D 염색체 페인팅

이 절차의 전반적인 목표는 물고기 실험에 직접 사용할 수 있는 단일 마이크로 절개 폴리탄 염색체에서 충분한 DNA 앰플리콘을 생산하는 것입니다. 이것은 먼저 미세 해부를 위해 특별히 설계된 멤브레인 슬라이드에 폴리탄 염색체 찌꺼기를 준비함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 레이저 미세 박리를 통해 개별 폴리탄 염색체팔을 분리하고 캡처하는 것입니다.

세 번째 단계는 미세 절개된 샘플에서 DNA를 분리하고 두 차례의 전체 게놈 증폭을 사용하여 DNA를 증폭하는 것입니다. 마지막 단계는 증폭된 DNA에 라벨을 붙이고 물고기 실험에 사용하는 것입니다. 궁극적으로 결과는 관심 영역에 대해 라벨링된 DNA를 풍부하게 형광으로 생성할 수 있습니다.

백 클론 또는 PCR 단편이 있는 물고기와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 염색체의 많은 부분을 이러한 표지된 프로브로 형광으로 칠할 수 있다는 것입니다. 또한, 염색체 페인트는 손상되지 않은 염색체 팔에서 기계적으로 분리되어 있기 때문에 염기서열을 알 필요가 없습니다. 먼저,이 경우 신선한 자동차 소음 용액에 고정 된 약 5 개의 모기의 난소에서 염색체를 분리하십시오.

염색체 확산이 양호한 것으로 확인되면 염색체는 변성에 의해 평평해진 다음 하룻밤 동안 차갑게 배양합니다. 다음 날, 염색체는 탈수되고 세척되어 미세 해부를 준비합니다. 현미해부경을 에탄올로 세척하고 장갑과 튜브를 uv로 살균하십시오.

그런 다음 텍스트 프로토콜에 제공된 2차 비디오에 따라 염색체를 미세 해부합니다. 거꾸로 된 튜브를 수용할 수 있도록 변형된 열병합 키트를 사용하여 DNA를 수집합니다. 그런 다음 컬럼을 정제하고 물로 용출합니다.

단일 염색체군의 전체 게놈 증폭에는 두 가지 경로가 있습니다. ley g 뿌리는 초기에 더 큰 수율을 제공하지만 DNA를 라벨링하기 위해 NIC 변환이 필요합니다. 게놈 플렉스 루트는 여러 차례의 복제를 허용하고 최종 결과 프로브를 직접 라벨링할 수 있는 장점입니다.

오염 물질의 증폭 가능성이 높으므로 가능한 가장 멸균 상태를 사용하십시오. 게놈 플렉스 루트의 경우 먼저, 단일 세포 WGA 4 키트가 증폭된 DNA의 첫 번째 배치를 생성하도록 합니다. 둘째, 게놈 세척 및 농축기 키트를 사용하여 DNA를 정제합니다.

TE 버퍼가 아닌 물을 사용하여 세척 DNA를 용리하는 것을 잊지 마십시오. 셋째, DNA를 구체화하고 넷째, 두 단계 모두 물고기를 위해 라벨을 붙입니다. WGA 쓰리 리amplification 키트.

DNA를 라벨링하려면 특정 비율의 뉴클레오티드와 라벨링된 DUTP를 포함하는 특수 DNTP 혼합물을 사용해야 합니다. rege 키트를 실행할 때 root는 먼저 갓 살균된 물을 사용하여 단일 셀 WGA 키트를 사용했으며 최근에는 D two 버퍼를 만들었습니다. 다음으로, NIC 변환 프로토콜에 따라 증폭된 DNA에 레이블을 지정합니다.

젤의 DNA 단편 크기를 확인하십시오. 단편은 약 200 - 500개의 염기쌍이어야 합니다. 마무리하려면 뿌리 에탄올을 사용하여 라벨 DNA를 침전시키고 샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다.

그런 다음 회수된 펠릿을 자연 건조하고 40마이크로리터의 혼성화 완충액을 추가합니다. 미리 건조되면 커버 슬립이 놓일 매니큐어의 정사각형 벽이 있는 슬라이드를 준비하여 커버 슬립에 의해 핵이 찌그러지지 않도록 합니다. 이제 크리스토퍼의 단계에서 나온 신선한 난소를 해부하고, 반쯤 무덤이 있는 암컷 모기 3마리를 해부한다.

난소를 150-250 마이크로 리터의 완충액이있는 튜브로 옮기고 튜브에 0.5 % 손가락 토인을 더합니다. 큰 박리 바늘을 사용하여 난포막을 파괴합니다. 그런 다음 5-10분 동안 튜브를 소용돌이하여 난포를 더 방해합니다.

큰 여포 조각을 긁어내고 튜브를 저속, 약 300RPM으로 500초 동안 원심분리합니다. 상등액을 새 튜브로 옮기고 부서진 여포가 들어 있는 원래 튜브에 100마이크로리터의 완충액 A를 추가합니다. 이제 눈에 보이는 조직이 작은 입자가 될 때까지 부서진 여포에 대한 핵 분리 단계를 반복합니다.

모든 초자연을 대부분 핵을 포함하고 있으므로 동일한 튜브에 모으십시오. 다음으로, 상초(supernat)가 들어 있는 튜브와 나머지 조직이 들어 있는 튜브를 스핀다운하여 보호 장치로 처리합니다. 슈퍼낫을 버리고 펠릿이 분해될 때까지 튜브에 0.1% 트리톤 와류가 있는 200마이크로리터의 완충액 A를 첨가한 다음 섭씨 4도에서 밤새 샘플을 배양합니다.

다음날, 10, 000 분당 회전수에 5 분 동안 관을 분리기, 상층액을 제거하고 PBS에 있는 4%paraform 알데히드의 200 마이크로리터를 추가하십시오. 그런 다음 열 믹서에서 튜브를 30분 동안 배양하고 450RPM으로 혼합합니다. 5, 000RPM에서 5분 동안 회전하여 고정제를 제거한 다음 슈퍼 이름을 버립니다.

그런 다음 완충액 A에 0.1% Triton을 추가하고 450RPM 원심분리기의 열 혼합기에서 튜브를 5분 동안 배양하고 셀을 다시 5분 동안 세척합니다. 5, 000 RPM에서 레이블이 지정된 프로브를 섭씨 37도로 예열할 준비가 되어 있습니다. 세포가 펠릿화되면 슈퍼 이름을 최소 20마이크로리터의 라벨링된 프로브로 교체하십시오.

농도에 대해 걱정하지 마십시오. 다음으로, 450 RPM의 Thermo mixer에서 섭씨 95도의 DNA를 10분 동안 변성시키고 지속적인 혼합으로 섭씨 80도에서 15분 동안 변성을 계속합니다. 그런 다음 온도를 섭씨 37도로 낮추고 밤새 샘플을 혼합합니다.

다음 날, 5분 동안 원심분리하여 핵을 회수합니다. 5, 000 분당 회전수 2, 655 Gs.Replace에 완충기, 0.1%tritton를 포함하는 a로 SUPERNAT를 대체하십시오. 실온에서 약 500RPM으로 교반하면서 세포를 5분 동안 세척합니다.

다른 원심분리로 세척을 제거하고 세척 과정을 두 번 더 반복합니다. 세 번째 세척을 제거한 후 DPI로 연장된 안티 페이드 한 방울로 핵을 직접 재현탁합니다. 준비된 슬라이드에 기포가 생기지 않도록 핵을 조심스럽게 옮기고 커버 슬립 게놈 플렉스와 ee를 적용하여 마무리합니다.

단일 세포 WGA 키트는 모두 모기 조직에 설명된 대로 사용되었습니다. 그 결과 생성된 DNA를 겔 전기영동으로 비교했습니다. 분명히 수율은 크게 변했으며 이는 분광학으로도 확인되었습니다.

물고기는 모기 폴리탄 염색체의 미세 해부 물질에 대해 5개의 프로브를 사용하여 수행되었습니다. 4개의 상염색체 경보는 WGA 3 키트를 사용하여 3개의 플루오로 4로 라벨링되었습니다. 3개의 R 염색체는 녹색 플루오레세인으로 표시되어 있습니다.

3개의 L 염색체는 빨간색과 노란색이 혼합되어 있습니다. 두 개의 R 염색체는 노란색이고 두 개의 L 염색체는 빨간색입니다. X 염색체는 ley G 물질의 NIC 번역과 별도의 실험을 사용하여 주황색으로 표지되어 폴리탄 염색체와 유사 분열 염색체 팔의 e 염색체 부분 사이의 대응을 확립했습니다.

염색체 페인트는 계기 염색체에 혼성화되었습니다. 두 개의 R 암은 녹색으로 표시되어 있습니다. 3개의 R 암은 분홍색이고 3개의 L 암은 주황색으로 표시되어 있습니다.

염색질은 DPI 전구 염색체에 의해 파란색으로 염색되는 것이 관찰되었습니다. X 염색체에는 18개의 S-R-D-N-A 프로브에 해당하는 빨간색 레이블이 있습니다. 중기 염색체도 발견되었습니다.

밝은 파란색으로 염색된 영역은 세포핵에 있는 단일 폴리탄 염색체의 3D 조직을 시각화하기 위해 이염색질에 해당합니다. 전체 산 물고기는 고소 변형으로 수행되었습니다. 모기, 난소 간호사 세포, 염색체 팔 영역은 폴리탄 염색체에서 명확하게 볼 수 있습니다.

마찬가지로, 뚜렷한 염색체팔 영역은 계면의 핵에서 명확하게 볼 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 오염 위험을 염두에 두고 모든 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 샘플을 오염시키는 것은 매우 쉬워 의도한 DNA의 증폭 수율이 낮습니다.