Name: 생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 학습하세요 생물 발광 영상을 이용한 Streptococcus pneumoniae 급성 폐렴 마우스 모델 실시간 감염 추적 방법을. 이 기술은 세균 독성 인자 평가와 항감염제 효능 연구에 활용됩니다.

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실험실에서 연구 SH에 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) 및 교육과 연구의 연방 교육부 (BMBF) 의료 감염 유전체학 (FKZ 0315828A)에서 교부금에 의해 지원되었다.

여기에 설명 된 동물 감염 실험 지침과 척추 동물의 사용에 대한 규제 지역 및 국제 (실험 동물 과학 협회 (FELASA)의 연맹의 예를 들면 유럽의 건강 법률)에 따라 설치를 수행해야합니다. 실험은 지역 윤리적 보드 및 기관 동물 관리위원회의 승인을 받아야합니다. S. 모든 실험 실험실이나 동물의 감염 폐렴은 클래스 II 바이오 안전성 내각에서 실시하고 있습니다. 1. 생물 발광 Pneumocococi의 감염성 주식의 준비 <ol><li> 80 ° C에서 (w / v)의 효모 추출물 및 유지 보수 20 % 글리세롤의 최종 농도 1 %로 보충 토드 휴이트 국물 재고의 폐렴 구균 문화를 준비 </li><li> 혈액 한천 플레이트에 깊은 냉동 재고 폐렴 구균 문화 소량의 플레이트와 5 % CO 2에서 37 ° C에서 10 시간 동안 박테리아를 배양한다. 티그는 혈액 한천 플레이트는 게놈에 luxABCDE 유전자 카세트의 트랜스포존 삽입 카나마이신 (150 ㎍ / ㎖)로 적절한 항생제가 포함되어 있습니다. </li><li> 10 시간의 최대 새로운 혈액 한천 접시에 신선한 식민지를 하위 재배하고 있습니다. </li><li> THY 매체는 10 % (V / V) 열 (56 ° C에서 30 분)를 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS) 폐렴 구균과 함께 보충 및 OD 0.05 ~ 600의 문화를 시작 접종한다. </li><li> 문화 OD 0.35-0.40 600에 도달 할 때까지 37 ° C에서 교반 및 5 % CO 2없이 폐렴 구균을 배양한다. 성장은 3 ~ 4 시간 정도 소요됩니다. </li><li> 10 분 동안 3,750 XG에 0.5 %의 FBS와 보충 인산염 완충 생리 식염수의 pH 7.4 (PBS)에서 발광 생물 폐렴 구균을 재현 탁 원심 분리하여 수확 폐렴 구균. </li><li> PBS/10 %의 FBS에서 원하는 농도로 접종을 조정합니다. 감염 량은 사용 된 폐렴 구균 균주와 마이크의 유전 적 배경에 따라 달라집니다전자. S.과 비강 비근 교계 CD-1 마우스를 감염 폐렴 D39 감염 량은 90 단위의 히알루로 보충 20 μL의 현탁액에 1 × 10 7 CFU로 조정해야 럭스. 이 자기 ​​분해를 트리거 때문에, 흔들거나 소용돌이 폐렴 구균하지 마십시오. </li><li> 5 % CO 2에서 37 ° C에서 하룻밤 성장 후 혈액 한천과 식민지의 열거에 10 배 희석으로 도금하여 접종 농도를 확인합니다. </li><li> 광학 영상 시스템을 이용하여 생물 발광을 측정함으로써 폐렴 구균 균액의 생물 발광을 확인한다. </li></ol> 2. 생물 발광 폐렴 구균과 비강​​ 및 마우스의 복강 내 감염 <ol><li> 급성 폐렴과 패혈증 모델 7 ~ 10 주 시대에 여성 비근 교계 마우스를 사용합니다. 이 마우스의 무게 20 ~ 30 g 인이어야한다. </li><li> 케타민 (ketamine)과 자일 라진의 복강 내 주사로 쥐를 마취. 혼합물 1.0 밀리그램을 준비100 ㎕의 멸균 0.9 %에서 케타민과 0.1 밀리그램 자일 라진 20g의 체중을 가진 마우스에 대한 (w / v)의 염화나트륨. 이것은 케타민위한 / kg 체중 50 MG 및 자일 라진 대해 5 ㎎ / kg 체중의 투여 량과 일치한다. 정확한, 마취제의 주입하기 전에 마우스의 무게를. </li><li> 복막 캐비티에 혼합물을 주입하고 마취제 행동과 동물이 narcotized 때까지 다시 케이지에 동물을 배치합니다. 마우스의 호흡이 매우 느리고 일정한 될 것입니다. 마우스는 세균 현탁액의 비강 접종 및 흡입은, 따라서 접종의 손실을 재채기가 발생하지 않도록, 완전히 narcotized해야합니다. 이것은 그들의 꼬리의 끝에서 마우스를 곤란하게하여 평가 될 수 있으며, 완전히 narcotized 마우스 응답이 결여된다. </li><li> 부드럽게 narcotized 마우스를 들고 똑바로 코 (그림 1)과 함께 손가락과 엄지 손가락 사이에 마우스를 누르고 있습니다. </li><li> 좁고 긴 팁 (젤 로더와 피펫을 사용하여팁) 마우스 26-29의 콧 구멍 (10 μL / 콧 구멍)에 여러 개의 작은 물방울 생물 발광 폐렴 구균 놓습니다. 마우스는 무의식적으로 박테리아를 흡입합니다. 똑바로 마우스 1-2 분을 잡고 마우스가 재채기 또는 접종을 유지할지 여부를 관찰합니다. </li><li> 실시간으로 감염을 모니터링하기 위해, 각각 변형 D39과 TIGR4, 1 × 10 7 7.5 × 10 7 폐렴 구균의 감염 량과 비강 7-10주 된 CD-1 마우스를 감염. 숙주 조직에 의한 흡수는없는 시스템에 대한 검출 한계가 약 1 × 106 생물 발광 박테리아이다. </li><li> 복강 쥐를 감염 (IP)을 평가하고 패혈증 마우스 감염 모델에서 폐렴 구균의 바이오 이미지 독성합니다. 변형 D39의 100 μL에 5 × 10 3 CFU를 사용하여 변형 TIGR4의 1 × 10 4. IP 경로를 사용하는 경우 마우스를 마취하지 않습니다. </li><li> PBS로 제어 마우스를 접종. <img alt="그림 1" fo:conteNT-폭 FO = &quot;5 인치&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51174/51174fig1.jpg&quot;폭 = &quot;는 500px&quot;/&gt; 그림 1. S.와 CD-1 마우스의 비강 감염 폐렴. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51174/51174fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . </li></ol> 3. 이미징 시스템을 사용하여 폐 및 혈액에 폐렴 구균 전파를 시각화 생체 내 이미징 시스템을 이용하여 실시간으로 비근 교계 CD1 암컷 마우스의 비강 감염 후 폐렴 구균의 콘텐츠 보급. <ol><li> 영상 시스템에 전환하고 preconfigurated 컴퓨터에있는 이미지 분석 소프트웨어를 시작합니다. </li><li> 촬상 시스템은 자동으로 초기화하고 CCD 카메라는 열전 활성화되기 전에 90 ° C로 냉각된다. </li><li> 설정 및 비닝 측정 마우스의 수에 의존동시에 생물 발광 신호의 강도에. 동물의 생물 발광을 모니터하는 뷰 (FOV)의 필드는 가변이며, 배율은 가슴 같은 동물의 단일 마우스 또는 부위를 측정하기 위하여 오 생쥐를 측정하기 22.5 cm의 FOV 사이의 범위, 및 3.9 cm의 FOV 또는 머리. </li><li> 정기적으로 1 분, 비닝 (binning)의 중간 정도, 22.5 cm의 FOV (세트 D)의 노출 시간을 사용합니다. 첫째, 발광 촬상 모드를 선택하고 촬상 파라미터를 설정. </li><li> 신호의 방출은 박테리아 균주 및 사용 마우스 균주, 및 마우스의 안료에 의존 할 수있다. 예를 들어, C57BL / 6 마우스를 사용하는 경우이 마우스 폐렴의 발전을 이미징 할 때 유용 할 수있는 생쥐의 가슴을 면도. </li><li> 이미지 prechosen 시간 간격으로 쥐를 감염. 최대 8 ~ 12 시간의 시간 간격으로 급성 폐렴 모델 마우스의 생물 발광을 측정합니다. observi에 의해 감염된 마우스의 복지를 모니터링자신의 외모, 행​​동, 체중의 손실의 결정을 겨. </li><li> 이전 챔버의 측정에 영상 장비의 마취 시스템의 마약 챔버에 마우스를 마취. 이소 플루 란과 산소의 혼합물의 흡입을 시작하고 마우스는 천천히 규칙적으로 숨을 쉴 때까지 기다립니다. </li><li> 시스템의 이미징 챔버로 마취 동물을 놓고 누운 위치에 마우스를 유지. 실 것입니다 다음 이미지 쥐의기도의 상단에 CCD 카메라. </li><li> 마취제를 흡입 할 수 있도록 관에에 자신의 코를 가진 동물을 놓습니다. </li><li> 가스 튜브를 통해 촬상 챔버로 이소 플루 란 마취 엔트리를 유지하도록 허용된다. </li><li> 챔버의 상단에 CCD 카메라를 활성화하려면 및 이미징 소프트웨어의 생물 발광 광학 영상을 눌러 &quot;획득&quot;을 시작합니다. 즉시 폐쇄 챔버에 쥐의 사진이 화면에 나타납니다. 1 분 후<html> 생물 발광 데이터의 오버레이를 측량하고 사진이 도시되어있다. </li><li> 이미지 오버레이 소프트웨어의 창에 표시 한 후 마취를 중지하고 다시 자신의 새장에 쥐를 넣어. </li><li> 마우스 복구를 위해 모니터링된다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51174/51174fig2.jpg" width="500px" /> 그림 2. 마취 배양 챔버에서 마취 배양 챔버와.) IVIS 스펙트럼 이미징 시스템. B) IVIS 마취 시스템. C) 마우스 각각 IVIS 마취 및 IVIS 스펙트럼 시스템을 사용하여 발광 생물 폐렴 구균에 감염된 생쥐의 모니터링 자신의 코가 마취제를 흡입과 IVIS 스펙트럼 이미징 챔버 내에 위치. D) 마우스._blank &quot;&gt; 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. </li></ol> 4. 생물 발광 S.에 감염 마우스의 생물 발광의 정량화 및 평가 폐렴 <ol><li> 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 전체 광자 (포톤 / 초)를 정량화하여 마우스 또는 마우스의 선택된 영역의 생물 발광 강도를 결정한다. </li><li> 그래프를 준비하는 Excel 데이터 시트에서 제공하는 광자 방출의 값을 사용합니다. 데이터 변이는 종종 그룹화 생쥐 내의 높기 때문에, 상이한 폐렴 구균 균주로 감염된 마우스에서의 차이를 표시하는 박스 휘스커 그래프를 생성한다. </li><li> 마우스 당 광자 또는 선택 영역의 복사 휘도의 평균 (광자 / 초 / cm 2 / SR)와 같은 대안 적 결과를 제공합니다. </li><li> 포톤 모드 ROI (관심 영역)의 측정 데이터를 정량적으로 제공된 다른 생체 내 이미징 시스템에 걸쳐 다른 비교 될 수있다생기 단위로 측정이 자동으로 계정에 카메라 설정을 (예 : 통합 시간, 비닝 (binning), F / 중지하고, 시야) 가지고 있기 때문에 RA 설정. </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

<html> 동물에서 실시한 모든 실험은 지역 당국과 윤리위원회의 승인을 받아야합니다. 생체 내 감염 실험에서 감염된 동물의 다양한 호스트 틈새에 세균 ​​부하는 다양한 시점 후 감염에서 결정되어야한다. 이러한 실험 조건 하에서 동물은 종래의 혈액, 인두, bronchoalvelar 세척, 또는 폐, 비장, 뇌 등의 장기에서 박테리아의 분리에 희생되어야한다. 호스트 틈새 당 세균 수를 계산하고 병원성 세균의 요인의 영향을 평가하기 위하여, 혈액이나 장기 세균성이어서 격리되어야하는 회수와 고체 매체에 도금. 세균 부하는 다음 CFU의 열거에 의해 정량화된다. 통계적으로 각 시점에서 특정 실험 조건 하에서 인해 마우스의 높은 숫자로 실험을 취급의 어려움에 이르게 쥐 그룹을 필요로 중요한 데이터 도달. ove_content &quot;&gt; 반대로, 실시간 및 bioimaging 방법은 시간이 덜 요구하는 방식과 각 세균에 감염된 마우스가 일정 기간에 걸쳐 여러 번 모니터링 할 수있다. 이미징 기술은 다른에서...

바이러스 나 세균에 의한 호흡기 감염은 전세계의 모든 사망의 약 삼분의 원인이 전 세계적으로 가장 일반적인 지역 사회 획득 임상 문제 중 하나가 남아있다. 키 세균 종은 헤 모필 러스 인플루엔자 및 폐렴 구균이 있습니다. 그러나 이러한 세균 종은 일반적으로 자연 호흡기 식물의 일반적인 성분이다. 따라서 세균 마차 침략 질환과 면역 상태 나 개인의 성향에 따라에 대한 특정 위험에 있습니다. 증상이 식민지는 침략적인 감염에 트리거됩니다. 폐렴 구균은 지역 사회 획득 폐렴 (CAP)과 인간의 균혈증의 가장 흔한 원인 중 하나의 주요 원인균이다. 건강한 사람의 S. 폐렴 (폐렴 구균)는 종종 그들이 비병원성 박테리아에 직면 상부 호흡기의 증상 및 무해 식민지 개척자이다뿐만 아니라, 헤 모필 러스 종으로 병원균 상주 식물의. 또는 포도상 구균 및 인간의 면역 방어 체계의 첫번째 줄. 운송 요금은 어린이에서 가장 높은 (37 %)과 3-5 (58 %) 붐비는 보육 시설 내에서 더 높은. 젊은 인구와 노인, 사업자 및 비 인두 분비물 6에서 에어로졸 전송을 통해 폐렴을 받고, 폐렴 구균 결합되는 백신 (성인 어린이와 23 가의 다당류 PPSV23에서 PCV10이나 PCV13) 중 하나를 사용하여 위험이 높은 그룹과 예방 접종에 속하지 미국 (미국)과 많은 유럽 국가 4 추천합니다. PCVs 어린이에서 가장 널리 혈청 형을 포함하는 동안 PPSV23는, 성인에 따라서 효율적으로 침습성 폐렴 구균 질환 (IPD)을 방지하는 미국과 유럽의 bacteremic 폐렴 구균 질환의 90 % ~에 대한 책임 혈청 형을 포함한다. 결과적으로, IPD 인해 백신 유형 (VT)에 redu은높은 독성의 가능성과 항생제 내성을 표시 CED하지만 nonvaccine 혈청 형은 4,7-12을 등장했습니다. 저수지 인두 유해 지역 감염을 시작하는 부비동 또는 중간 귀를 확산 폐렴 구균의 출발점입니다. 생명을 위협하는 CAP 4,13의 결과로 기관지 및 폐에기도를 통해 직접 전파 더 중요한 것은, 폐렴 구균. 폐 감염은 종종 이렇게 혈액으로 확산 병원체를 활성화하고 IPD의 원인, 조직과 장벽의 파괴와 함께 제공됩니다. CAP 및 IPD의 발생 빈도는 면역 사람의 나이 4,13의 극단에서 가장 높다. 높은 독성을 가진 병원체에 공생의 변환을 담당하는 상황이 논쟁에서 아직도있다. 그러나, 높은 독성 항생제 저항의 증가와 함께 동반 호스트 감수성과 진화 적응의 변화 외에 PNE에 중요한 영향을 미칠 것으로 제안되었다umococcal 감염 14-16. 병원체는 상피 세포 점막 친밀한 접촉을 매개 adhesins의 다양성을 부여한다. 기도 점액을 극복 한 후, 세포를 호스팅하는 폐렴 구균 준수는 세포 수용체와 표면에 노출 된 adhesins의 직접적인 상호 작용을 통해 분자에게 4,17,18 가교로서 세포 외 기질의 구성 요소 또는 혈청 단백질을 이용하여 용이하게된다. 등의 다양한 병원체 폐렴 구균은 숙주 면역 방어 메커니즘의 회피에 관련된 요소를 갖추고 있습니다. 또한, 그들은 이러한 각각 폐, 혈액 및 뇌척수액 (CSF), 5,17,19,20와 같은 다양한 호스트 milieus에 적응하는 능력이있다. 발병 기전과 염증 호스트 반응에 세균 요인의 영향은 폐렴, 균혈증의 실험 동물 모델에서 조사, 또는 21-25 뇌막염됩니다. 인간의 병원체에도 불구하고,이 모델은 우리입니다폐렴 구균 조직의 굴곡 운동, 독성 메커니즘, 또는 폐렴 구균 백신 후보의 보호도를 해독 LL 설립. 근친 마우스 종자의 유전 적 배경은 폐렴 구균에 감수성을 결정한다. CBA / CA와 SJL 생쥐는 폐렴 구균 감염 (22)에 대해 더 민감 동안 비강 폐렴 구균에 감염된 BALB / c 마우스는, 저항하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 인간 유전 배경 및 숙주 방어 메카니즘과 유사한이 감염의 결과를 결정한다는 것을 의미한다. 따라서, 더 노력이 폐렴 구균 감염에 덜 민감 쥐의 게놈에 저항 궤적을 해명 할 필요합니다. 연구 결과는 생체 내 독성 프로토콜의 변화를 이끌고있다. 대신 종종 과거에 사용 근친 BALB / c 마우스의, 매우 민감 CD-1/MF1 비근 교계 마우스 종자는 요즘 종종 기능 상실 폐렴 구균 독성의 적합성에 26-28 요인의 효과를 연구하는 데 사용됩니다. 또한, 가용성생물 발광 폐렴 구균 및 광학 이미징 기술의 감염의 실시간 생물 발광 및 bioimaging는 허용한다. 폐렴 구균에 최적화 luxABCDE 유전자 카세트 (플라스미드 폴-A 테네시 luxABCDE 4001 km의 R)는 트랜스포존 돌연변이 유발에 의한 염색체의 단일 통합 부위에 삽입되었다. 생물 발광 폐렴 구균은 독성의 적합성 요인과 다른 26,28-31 한 해부 사이트에서 자신의 전위 결핍 된 폐렴 구균 돌연변이 체의 감쇠를 평가하기 위해 사용되었다. 여기에서 우리는 쥐의 폐렴이나 패혈증 모델에서 폐렴 구균 감염의 및 bioimaging위한 프로토콜을 제공합니다. 비강 내 또는 복강 내 감염 생쥐의 증폭 및 생물 발광 폐렴 구균의 보급이 용이하게 상이한 시점에서 광학 이미징 시스템과 같은 동물을 사용하여 시간에 걸쳐 모니터링 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Todd Hewitt 국물</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>X936.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>2363.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>혈액 한천 플레이트</td><td>Oxoid, Wesel, 독일</td><td>PB5039A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>T832.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>에리스로마이신</td><td>시그마-알드리치, 타우프키르헨, 독일</td><td>E6376</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>PAA Laboratories, Coelbe, Germany</td><td>A11-151</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CD-1 마우스, 암컷</td><td>Charles River, Sulzfeld, Germany</td><td>CD1SIFE06W08W</td><td>암컷 CD-1 마우스, 6-8주 된</td></tr><tr><td>Ketamin 500 mg, 큐라메드 주사 용액</td><td>Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rompun 2%, 주사 용액</td><td>Bayer Animal Health, Monheim, Germany</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BD Plastipak 1 ml 주사기</td><td>Becton Dickinson, 하이델베르크, 독일</td><td>300015</td><td>바늘이 있는 멸균 Luer-Lok 주사기</td></tr><tr><td>젤 로더 팁</td><td>PeqLab</td><td>81-13790</td><td>M&micro; ltiFlex 팁</td></tr><tr><td>히알루로니다제</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3884-100mg</td><td>히알루로니다제 IV-S형 소 테스트</td></tr><tr><td>산소</td><td>공기 액체, D&uuml; 독일 셀도르프</td><td>M1001L50R2A001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter, Unterschlei&szlig; 하임, 독일</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>pGEM-T Easy</td><td>Promega, 만하임, 독일</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드&nbsp;</td><td>Eurofins MWG, 독일 에버스베르크</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Qiaprep Spin Midiprep 키트&nbsp;</td><td>키아겐, 힐덴, 독일</td><td>27104</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR DNA 정제 키트</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>28106</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Living Image 4.1 소프트웨어</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>XGI-8 가스 마취 시스템</td><td>캘리퍼 생명 과학/PerkinElmer, Rodgau, 독일</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IVIS 스펙트럼 이미징 시스템&nbsp;</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, 독일</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Biophotometer</td><td>Eppendorf AG, 함부르크, 독일</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

폐렴 개발의 주요 건강 문제와 선진국 중 하나이며 상당한 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다. 이 질병의 지식, 중환자 실 (ICU)의 가용성, 강력한 항균제하고 효과적인 백신의 사용의 발전에도 불구하고, 사망률은 1 높은 수준으로 유지. 폐렴 구균은 지역 사회 획득 폐렴의 주요 원인균 (CAP)입니다 인간의 균혈증의 가장 흔한 원인 중 하나. 이 병원체는 표면에 노출 된 adhesins 폐렴 및 침습성 폐렴 구균 질환 (IPD)에 기여 독성 요인의 armamentarium에 장착되어 있습니다. 세균의 적합성 또는 독성 인자의 생체 내 역할의 평가는 S.를 해결하는 것을 가장 중요합니다 폐렴 병원성 메커니즘. 폐렴, 균혈증 및 뇌막염 뮤린 모델 DIF에서 폐렴 구균 성 요인의 영향을 결정하기 위하여 사용되고감염의 단계를 ferent. 여기에서 우리는 비강 또는 생물 발광 박테리아와 복강 내 감염 후 마우스에서 실시간으로 폐렴 구균 보급에 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다. 결과는 묘화 시스템 및 첨부 된 분석 소프트웨어를 사용하여 시각 및 평가 될 수 하부 호흡기 및 혈액에서 곱셈과 폐렴 구균의 확산을 보여준다.

메티오닌의 수집 및 흡수는 자신의 호스트의 틈새 (32, 33)의 체력을 유지하기 위해 폐렴 구균에 대한 중앙 중요하다. 메티오닌 ABC 수송 단백은 SPD _ 0151 유전자 (TIGR4 : sp_0149)에 의해 D39으로 인코딩되어 MetQ 32라는 이름의. 폐렴 구균은 또한 메티오닌 생합성 효소 (-; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, 벼 및 METF Spd_0511 Spd_0510 D39)를 생산하고 있습니다. 화학적 매체에있는 메티오닌의 부족은 폐렴 구균과 유사한, 메티오닌 (32, 33)의 메티오닌 결합 단백 MetQ 장애인 이해의 부족의 성장에 영향을 미칩니다. 이 결함은 메티오닌의 고농도 첨가에 의해 복원 될 수있다. MetQ의 부족에 의해 도시로 패혈증과 폐렴의 마우스 모델에서 폐렴 구균을 감쇠 동안 마우스 식민지 실험에서 MetQ 결핍 돌연변이는 동질 야생형과 동시 감염 실험에서와 같이 독성...

폐렴 구균은 중증 지역 사회 획득 폐렴과 전 세계적으로 2 백만 이상의 죽음에 책임을 일으키는 주요 병원균이다. 적합성 또는 병독성에서 내포 세균성 요인의 영향은 생물 발광 박테리아를 이용한 급성 마우스 폐렴이나 균​​혈증 모델에서 실시간으로 모니터링 할 수있다.

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

본 절차의 전반적인 목적은 폐렴구균(streptococcus pneumonia) 감염에 의한 폐렴 또는 패혈증 모델을 실시간으로 관찰하는 것입니다. 이는 복합 배지인 THY에서 배양한 후 폐렴구균 감염 용량을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 마우스의 비강 내 또는 복강 내에 폐렴구균을 감염시키는 것입니다.마지막 단계는 총 광자 방출량을 산출하기 위해 마우스 전체 또는 마우스의 특정 선택 영역에 대한 생물 발광 강도를 정량화하는 것입니다. 최종적으로, 마우스 그룹의 생물 발광 강도는 시간에 따른 감염의 변화를 보여줍니다. 또한, 생물 발광 마우스의 개별 이미지 분석이 수행됩니다.폐나 다양한 조직의 세균 부하량을 측정하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 단 한 마리의 동물만으로도 감염 과정을 추적할 수 있다는 점입니다. 이 기술은 세균 인자와 항감염제의 효능을 평가하는 데에도 적용될 수 있으므로 기초 연구 분야까지 그 활용 범위가 확장됩니다. 이 방법은 마우스 모델에서 해당 Cox 군의 특성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.이 방법은 장기 내 세균 수 측정과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 바이오이미징 시스템의 사용법이 간단하고 이미지 준비를 위한 소프트웨어가 제공되므로 연구자들이 이 방법을 쉽게 익힐 수 있을 것입니다. 저는 바이오이미징 시스템을 처음 접했을 때, 즉시 이 방법을 bios 및 primo oxide를 이용한 감염 실험에 적용하겠다는 아이디어를 얻었습니다.동물의 특수한 취급이 필요하고 접종과 같은 핵심 단계를 설명하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시연이 매우 중요합니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 감염성 발광 폐렴구균 스톡을 준비하십시오. 그런 다음 40 milliliters의 FBS 보충 THY 배지가 들어 있는 튜브에 폐렴구균을 접종하고, OD 600이 0.08일 때 배양을 시작하십시오. 폐렴구균을 37 degrees Celsius 및 5%carbon dioxide 조건에서 교반 없이 3~4시간 동안 배양하여 배양액의 OD 600이 0.35에서 0.40에 도달하도록 하십시오.그런 다음 3,750 ×g에서 6분 동안 원심분리하여 폐렴구균을 수확합니다. 그 후 상층액을 제거하고 세균 펠릿을 재현탁합니다. 0.5% FBS가 첨가된 pH 7.4의 PBS 약 1mL에서, 10% FBS와 90 units의 hyaluronidase가 포함된 PBS 20 µL 현탁액으로 접종균을 원하는 농도로 조절합니다.폐렴구균은 자가분해를 유발할 수 있으므로 흔들거나 볼텍싱하지 마십시오. 다음으로, 광학 이미징 시스템을 사용하여 폐렴구균의 생물 발광을 확인합니다. 케타민과 자일라진을 복강 내 주사하여 7~10주령의 암컷 아웃브리드 마우스를 마취시킵니다. 꼬리를 꼬집어 마취 깊이가 적절한지 확인합니다.마우스가 완전히 마취되면, 손가락과 엄지손가락으로 마우스를 잡고 코가 위를 향하게 합니다. 그다음 길고 좁은 팁이 달린 피펫을 사용하여 생체 발광 폐렴구균 10 µL를 각 콧구멍에 떨어뜨립니다. 그러면 마우스가 비자발적으로 박테리아를 흡입하게 됩니다.마우스가 재채기를 하는지 또는 접종액을 유지하는지 관찰하기 위해 1~2분 동안 마우스를 세운 자세로 유지합니다. 완료. 마우스가 선택된 감염량을 흡입하도록 감염량의 흡입을 확실히 보장해야 합니다. 따라서 마우스는 천천히 그리고 규칙적으로 호흡해야 합니다.마우스가 재채기를 하여 감염 용량의 일부가 손실되지 않도록 주의하십시오. 접종을 성공적으로 마친 후, 나중에 식별할 수 있도록 꼬리에 표시를 하고 마우스를 새 케이지에 넣으십시오.다음으로, 패혈성 감염 모델에서 병원성을 평가하기 위해, 마취된 마우스의 복강 내에 폐렴구균 균주 100 µL를 주입합니다. 꼬리에 표시를 한 후, 대조군으로서 마우스를 케이지로 옮깁니다. 다른 마우스 그룹에는 PBS를 주입합니다.폐렴구균의 확산은 이미지 분석 소프트웨어를 통해 수행합니다. 먼저 이미징 모드를 발광(luminescent)으로 설정한 다음, 이미징 파라미터를 다음과 같이 설정하십시오. 노출 시간을 1분으로 설정합니다.중간 정도의 비닝(binning)과 22.5 centimeters의 FOV를 설정합니다. 마우스는 영상 장비의 마취 챔버 내에서 이소플루레인(isoflurane)과 산소 혼합 가스로 마취시킵니다. 마우스의 호흡이 느려지면, 코를 마취 시스템에 연결된 튜브에 삽입한 상태로 앙와위(supine position)로 영상 챔버에 배치합니다.챔버 상단의 CCD 카메라를 활성화하고 생물발광 광학 이미징을 시작하려면, 이미징 소프트웨어에서 즉시 acquire를 누르십시오. 닫힌 챔버 안에 있는 마우스의 사진이 화면에 나타납니다. 1분간 측정이 진행되면 생물발광 데이터와 사진이 중첩되어 표시됩니다.이제 노출 종료 약 20초 전에 마취를 중단하십시오. 마우스를 케이지에 다시 넣고, 케이지를 랙으로 옮기기 전에 마취에서 완전히 회복될 때까지 기다리십시오. 감염된 마우스의 외형, 행동 및 체중 변화를 모니터링함과 동시에 8~10시간마다 지속적으로 이미징을 수행하십시오.마지막으로, 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 D 39 lux 또는 동종 돌연여변이체 D 39 luxe delta MET Q를 비강 내로 감염시킨 마우스의 총 광자 방출 생물 발광 광학 영상을 정량화함으로써 시간대별 및 마우스 그룹별 생물 발광 강도를 결정합니다. 영상 촬영은 감염 24시간 후에 시작되었으며, 각 그룹의 마우스가 사망하거나 감염 후 120시간이 될 때까지 8시간마다 계속되었습니다. 10마리의 마우스 중 7마리는 심각한 질병 증상을 보이며 사망했으며, 나머지 3마리는 생물 발광을 보이지 않고 생존했습니다.두 마리의 생쥐에서 관찰되는 생물 발광 장면은 실제로는 인접한 생쥐의 강한 생물 발광으로 인한 빛 번짐 현상임에 유의하십시오. 생물 발광 야생형 D 39 lux에 성공적으로 감염된 생쥐는 감염 32시간 후 심각한 폐 감염이 발생했으며, 이는 8~16시간 이내에 패혈증으로 진행되었습니다. D 39 lux 감염 후 폐렴과 패혈증이 발생한 모든 생쥐는 감염 96시간 이내에 모두 폐사하였습니다.메티오닌 결합 지질단백질의 기능 상실은 폐렴구균의 병원성을 현저히 저하시켰습니다. 32시간 후, 감수성 D 39 lux 마우스 모두에서 감염이 나타난 것과 대조적으로, mEq 돌연변이체에 감염된 마우스 중 단 한 마리에서만 약한 폐 감염이 관찰되었습니다. 그러나 48시간 후에는 돌연변이체에 감염된 마우스에서 심각한 폐 감염이 뚜렷하게 나타났습니다.그 결과, 이 마우스들은 감염 72시간 후에 패혈증이 발생했으며, 감염 72시간 이후에 그 수가 더 많아졌으며, 이는 급성 폐렴 감염 모델에서 met Q 결핍이 폐렴구균을 약화시킨다는 것을 보여줍니다. 그룹별 마우스의 생물 발광 강도 값은 표시된 시점에 대해 나타나 있습니다. 생물 발광 플럭스의 정량 분석 결과, 감염 32시간 및 40시간 후에 야생형 감염 마우스와 met q 감염 마우스 사이에 유의미한 차이가 나타났습니다.따라서 met q의 기능 상실은 폐렴구균의 병원성을 약화시켜 침습적 감염을 유의미하게 지연시키지만, 일단 정착되면 독성 림 박테리아를 생성하지는 않습니다. 이 기술은 적절히 수행될 경우 한 시간 내에 4마리씩 10그룹의 마우스를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 본 절차를 시도할 때는 럼이 완전히 형성되어 마우스가 이를 흡입하도록 하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 약간의 약독화 및 박테리아 돌연변이와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 마우스 공동 감염과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 기술은 감염 생물학 분야의 연구자들이 생쥐 모델에서 폐렴구균성 폐렴 또는 패혈증을 탐색하고 시각화할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 생쥐에 감염을 유도하는 방법과 바이오이미징 시스템을 사용하여 폐렴구균 감염을 실시간으로 추적하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 폐렴구균과 같은 인체 병원성 박테리아를 다루는 것은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 2등급 안전 작업대(class two safety bench) 내에서 작업하는 등의 주의 사항을 준수해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

독감 바이러스에 동시 감염 asymptomatic 동안 침투 폐렴 구균 질환의 유도에 연루 요인 중...

사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

생활 동물 세균성 감염의 bioluminescence 이미징을위한 방법은 설명되어 있습니다. 병원균은 살아있는 동물에 감염 광학 온 몸이 이미징을 허용 루시페라제 표현을 수정합니다. 동물 모델은 루시페라제 표현 병원균에 감염과 질병의 발생 과정은 bioluminescence 이미징에 의해 실시간으로 시각하실 수 있습니다.

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

출처: Valentine, ME, et al. 녹농균 에서 프레임 내 유전자 결실 돌연변이체의 생성 및 간단한 감염 마우스 모델에서 독성 감쇠 테스트. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 생쥐에서 독성 및 약독화된 박테리아 균주의 생체 내 거동을 시각화하고 비교하기 위해 생물 발광을 사용하는 방법을 보여줍니다. 생물발광 박테리아 현탁액의 제조와 마우스에 대한 복강내 주사에 대해 설명합니다. 독성 균주는 전신 확산을 나타내는 반면, 약독화된 균주는 국소적으로 유지되며 희미해지는 신호로 표시된 대로 점차적으로 제거됩니다.

생물발광을 사용한 마우스의 박테리아 감염 역학 추적

출처: de Vries, C. R. 외, 만성 Pseudomonas aeruginosa 상처 감염의 지연 접종 모델. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 생체 마우스 모델에서 박테리아 감염 진행을 모니터링하는 생물발광 영상 기법을 시연합니다. luxABCDE 리포터 시스템으로 설계된 병원성 박테리아는 감염 부위에서 빛을 방출하여 대사적으로 활발한 박테리아를 시각화할 수 있게 합니다. 쥐를 시간에 따라 영상화함으로써 연구자들은 비침습적으로 감염 역학을 추적하고 생물발광 신호 강도를 정량화할 수 있습니다.

쥐 박테리아 감염의 생물발광 영상

출처: Valentine, M. E. 외, Pseudomonas aeruginosa 에서 인프레임 유전자 결실 돌연변이 생성과 감염 단순 마우스 모델에서의 병원성 감감 검사. J. Vis. Exp. (2020)이 영상은 생체 쥐 모델에서 박테리아 감염을 모니터링하기 위해 생물발광 기반 영상 기법을 시연합니다. 순차적 생물발광 및 X선 영상은 숙주 전역에 퍼진 감염을 실시간으로 시각화하고 해부학적 위치를 파악할 수 있게 합니다.

생물발광을 이용한 쥐 모델에서 박테리아 감염의 실시간 영상

여러 가지 방법 마우스에서 세균성 폐렴 모델링 문헌에 기재되어있다. 여기서, 우리는 구강 인두로 피펫 세균 접종의 흡인 (즉, 흡입)를 통해 폐렴을 유도하기위한 비 침습적, 저렴하고 빠른 방법을 설명합니다. 폐 선천성 면역 반응의 평가를위한 다운 스트림 방법도 자세히 설명되어 있습니다.

마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법

면역 능력이 있는 설치류에서 폐 감염을 확립하는 방법이 설명되어 있습니다. 숙련되면 이 방법을 빠르고 쉽게 수행하여 S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae 및 A. baumannii의 많은 분리물에서 안정적인 감염을 유도할 수 있습니다.

면역 적격 설치류에서 강력한 폐렴 모델에 대해 항균 효능을 평가하기<i&gt; S. 폐렴</i&gt;<i&gt; H. 인플루엔자</i&gt;<i&gt; K. 폐렴</i&gt;<em&gt; P. 녹농균</em&gt; 또는<em&gt;를했다. baumannii가</em

여기에 설명 된 방법은 비 침습적 bioluminescence 이미징 (BLI)을 통해 생쥐의 폐에서 IL-8 프로모터 의존 염증 활성화의 시각화 수 있습니다. 동일한 동물을 루시퍼 레이즈 리포터 구조물의 전달 시점으로부터 최대 2 개월 동안 BLI에 여러 번 투여 할 수있다.

IL-8 transiently Transgenized 마우스 모델<em&gt; In Vivo</em&gt; 염증 반응의 장기 모니터링

여기서, 우리는 미국 식품의약국(FDA)에서 승인된 대장균에 비해 녹농균의 유전자 변형  균주의 감쇠를 평가하기 위해 마우스 모델의 간단하고 재현 가능한 프로토콜을 상업적 응용을 위해 설명한다.

감염의 간단한 마우스 모델에서 녹농균 및 독성 감쇠에 대한 테스트에서 프레임 내 유전자 삭제 돌연변이의 생성

생체 발광 대장균 O1:K1:H7을 가진 신생아 마우스의 감염은 중요한 폐 염증 및 폐 병리를 가진 패혈증 감염을 초래합니다. 여기서는 전신 세균성 부담, 염증 성 프로파일링 및 폐 조직 병리학의 열거와 병행하여 세로 내 인트라비셔널 이미징을 사용하여 신생아 패혈증을 모델링하고 추가로 연구하는 절차를 설명합니다.

그람 음성 세균 패혈증의 신생아 화상 진찰 모형

이 논문은 바이러스 감염 동안 폐렴구균이 무증상 집락 상태에서 질병을 유발하는 병원체로 전환하기 위한 새로운 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 질병 진행의 여러 단계 동안 다양한 숙주에서 다미생물 및 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.

바이러스 동시 감염 시 콜로니자에서 병원체로 Streptococcus pneumoniae 의 전환을 위한 마우스 모델은 연령 악화 질병을 요약합니다.

학습하세요 생물 발광 영상을 이용한 Streptococcus pneumoniae 급성 폐렴 마우스 모델 실시간 감염 추적 방법을. 이 기술은 세균 독성 인자 평가와 항감염제 효능 연구에 활용됩니다.

생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라

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