형광 기반 얼음 비행기 선호도에 의해 부동액 단백질의 얼음 결합 평면 결정
2014년 1월 15일
부동액 단백질(AfP)은 얼음 의 특정 평면에 결합하여 얼음 성장을 방지하거나 느리게 합니다. 형광계 얼음 비행기 선호도(FIPA) 분석은 AFP 바인딩 된 얼음 비행기의 측정을위한 원래 얼음 에칭 방법을 수정한 것입니다. AFP는 형광으로 표시되고, 거시적 단일 얼음 결정에 통합되고, UV 빛 아래에서 시각화됩니다.
다음 실험의 전반적인 목표는 형광 표지된 부동액 단백질에 의해 결합된 얼음 평면을 시각화하는 것입니다. 이것은 부동액 단백질이 두 번째 단계로 결합할 수 있는 단일 얼음 결정을 성장시킴으로써 달성됩니다. 각 결정은 특이점과 방향을 설정하기 위해 교차 편광판을 통해 볼 수 있습니다.
다음으로, 얼음 결정을 온도가 조절되는 차가운 손가락에 장착하고 반구로 형성합니다. 그런 다음 부동액 단백질을 성장하는 반구의 특정 결합 평면에 흡수하기 위해 형광 표지된 부동액 단백질 용액에 담그십시오. 얼음 결과는 어둡고 차가운 방에서 파장 비광과 필터를 사용하여 형광 표지된 부동액 단백질로 결합된 얼음을 시각화하고 이미징하여 얻을 수 있습니다.
아이스 에칭과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 부동액 단백질이 형광 표지되어 단백질 결합 얼음 평면을 즉시 시각화할 수 있다는 것입니다.섭씨 영하 0.5도에서 온도 조절 에틸렌 글리콜 수조를 준비하고 그 안에 들어가 그 위에 떠 있을 수 있는 깨끗한 금속 팬을 찾아 결정 성장을 시작합니다. 결정은 주형으로 형성됩니다. 폴리 염화 비닐 파이프에서 3-4cm 높이로 자른 원통형 금형을 사용하십시오.
각 금형에는 한쪽 면에 너비 1mm, 높이 2mm의 노치가 있어야 합니다. 노치가 절단된 링 측면에 진공 그리스의 가벼운 필름을 바르십시오. 이 기름칠한 노치 표면을 노치가 팬 중앙에서 멀어지도록 하여 금속 팬에 밀봉합니다.
노치에 그리스를 채우거나 막지 않도록 하십시오. 팬에 들어갈 수 있는 한 많은 금형을 준비합니다. 다음으로, 여과된 Degas와 탈이온수를 금형 외부의 팬 중앙에 추가합니다.
거품이 생기지 않도록 주의하세요. 물층이 5mm로 올라감에 따라 물은 노치를 통해 금형으로 천천히 들어가야 합니다. 완료되면 팬을 에틸렌 글리콜 수조에 완벽하게 수평으로 놓습니다.
팬과 물이 섭씨 영하 0.5도에 도달한 후 틀 바깥쪽의 팬 중앙에 작은 얼음 조각을 추가합니다. 하룻밤 동안 배양하여 3일 동안 얼음 층을 형성합니다. 욕조로 돌아가 틀에 물을 넣으십시오.
섭씨 4도의 13밀리리터, 탈기 및 탈이온수를 각 금형에 주입합니다. 물을 추가한 후 하루에 한 번 에틸렌 글리콜 수조의 온도를 낮추십시오. 4일째가 되면 틀에 얼음이 완전히 채워져야 합니다.
곰팡이를 회수하고 얼음을 위한 깨끗한 표면을 준비합니다. 팬에서 각 틀을 당겨 얼음 결정을 밀어냅니다. 곰팡이가 있는 깨끗한 표면을 섭씨 영하 20도의 냉동고에 1시간 동안 넣습니다.
취급하기 전에. 얼음이 준비되면 냉동실이나 냉장실로 가져가 단결정인지 확인합니다. 두 개의 교차된 편광판 사이에 얼음을 놓습니다.
얼음이 단결정인 경우 균열이나 불연속성이 보여야 하며 결정 내에서 빛의 방향이 변하지 않아야 합니다. 편광판이 제자리에 있는 상태에서 얼음이 회전할 때 투과되는 빛을 관찰하여 C축의 방향을 결정합니다. A AE의 방향을 결정하려면 얼음을 알루미늄 호일로 단단히 감쌉니다.
바늘을 바다 축에 수직으로 향하게 하고 호일을 통해 얼음 속으로 작은 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 얼음을 0.5mbar 진공 청소기에 20분 동안 넣습니다. 크리스탈을 회수하면 차가운 방에서 덮개를 덮으십시오.
기저 평면에서 육각형 에칭을 관찰합니다. A AE는 6개의 뾰족한 별의 꼭지점을 통과합니다. 이 결정은 별의 반대쪽 지점에 평행한 선을 따라 반으로 잘립니다.
기본 프리즘 평면을 노출시키려면 결정을 벤치에 단단히 고정하십시오. 쇠톱을 사용하여 크리스탈을 반으로 자릅니다. 차가운 손가락에 장착할 조각을 모으십시오.
얼음 결정은 차가운 손가락에 장착하기 위해 더 준비해야 하며, 직경이 약간 다르지만 차가운 손가락과 크기가 비슷한 두 개의 알루미늄 막대를 찾아야 합니다. 막대를 번갈아 사용하여 차가운 손가락이 들어갈 수 있는 구멍이 있을 때 크리스탈 스톱 상단의 구멍으로 구멍을 녹입니다. 차가운 손가락을 영하 0.5도로 식힌 후 얼음 구멍에 넣습니다.
금속에 얼 때까지 크리스탈을 제자리에 고정하십시오. 다음으로, 얼음 결정 직경의 약 두 배가 있는 반구형 컵에 여과된 탈이온수를 섭씨 4도로 냉각시킵니다. 차가운 손가락으로 묶인 얼음 결정을 컵에 담그고 여분의 물을 제거하여 얼음 결정의 상단이 액체와 대략 수평이 되고 얼음이 닿지 않도록 합니다.
컵 벽은 컵을 단열재로 덮고 온도를 섭씨 영하 5도까지 낮춥니다. 얼음이 약 한 시간에 걸쳐 반구를 형성하도록 합니다. 형광 단백질을 추가할 준비를 합니다.
반구가 준비되었을 때. 컵에서 얼음 결정을 제거하고 컵에서 물을 제거하십시오. 그런 다음 원하는 농도로 사전 냉각된 형광 표지된 단백질 용액 25-30ml를 추가합니다.
총 액체량을 변하지 않은 해상도로 유지하면서 얼음 결정을 컵에 담그십시오. 다시. 크리스탈의 상단이 액체와 수평을 이루고 컵 벽에 닿지 않는지 확인하십시오. 차가운 손가락 온도를 섭씨 영하 8도로 낮추고 단백질 용액을 2-3시간 동안 결정체로 얼립니다.
단백질 용액에서 최소 5mm의 얼음이 형성되면 얼음 성장을 멈춥니다. 차가운 손가락을 붙인 상태에서 컵에서 얼음 결정을 꺼냅니다. 냉각수를 섭씨 0도 바로 위로 가열하여 차가운 손가락을 분리합니다.
얼음 결정이 녹을 때까지 기다리십시오. 차가운 손가락에서 결정이 녹으면 평평한 면이 아래로 향하게 하여 깨끗한 표면에 놓습니다. 새로 형성된 얼음을 만지지 않도록 주의하세요.
결정을 섭씨 영하 20도에서 최소 20분 동안 보관하십시오.진행하기 전에 어두워질 수 있는 차가운 방에서 형광 작업을 시각화합니다. 파장별 excitation filter가 있는 램프를 준비하여 fluorescent label과 camera emission filter를 excitate합니다. 불특정 빛을 차단하려면 얼음을 평평한 면이 아래로 향하게 하여 램프 아래에 놓고 방을 어둡게 하고 조명이 켜진 얼음의 패턴을 관찰합니다.
부동액 단백질에 결합된 얼음 평면을 추정하려면 기존의 얼음 식각 이미지를 해당 형광 기반 얼음 평면 친화도 분석의 이미지와 비교하면 둘 다 겨울 넙치 pseudo pectus Americana에 의해 생성되는 1형 부동액 단백질을 보여줍니다. 이 기술은 서로 다른 부동액 단백질의 얼음 결합 패턴을 동시에 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 이 경우, 퍼시픽 블루는 3형 NFEA FP 8형을, 트릭시는 1형 부동액 단백질을 라벨링했습니다.
이것은 3형 N-F-E-A-F-P 8형만 시각화한 결과이며, 여기서는 1형 부동액 단백질만 이 이미지에서 시각화됩니다. 이 둘은 함께 시각화됩니다. C축은 각 이미지에 대해 동일합니다.
이 동영상을 시청한 후에는 단일 얼음 결정을 성장시키고 방향을 정하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 형광 기반 얼음 평원 친화도 분석을 사용하여 형광 표지된 부동액 단백질의 얼음 평원 결합 패턴을 평가할 수 있을 것입니다.
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개요
본 연구는 형광 표지된 동결 방지 단백질(AFPs)으로 경계된 얼음 평면의 시각화에 초점을 맞추고 있습니다. 이 실험은 형광 기반 얼음 평면 친화성 분석을 활용하여 AFPs가 얼음 결정과 상호작용하는 방법을 관찰합니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 생화학
- 동결 생물학
- 단백질 화학
배경
- 동결 방지 단백질은 특정 얼음 평면에 결합하여 얼음 성장을 방지합니다.
- 형광 기반 기술은 이러한 상호작용의 시각화를 향상시킵니다.
- 이 연구는 분석을 위해 수정된 얼음 에칭 방법을 활용합니다.
- AFPs에 대한 이해는 식품 보존 및 동결 보존 등 다양한 분야에서 함의를 가질 수 있습니다.
연구 목적
- AFPs가 얼음 평면에 결합하는 것을 시각화하기 위함입니다.
- AFP 기능성에 대한 이해를 향상시키기 위함입니다.
- 얼음 결정의 향상된 이미징을 위해 형광을 활용하기 위함입니다.
사용된 방법
- AFP 결합을 위한 단일 얼음 결정 성장.
- 결정 방향을 확립하기 위한 교차 편광기 사용.
- 온도 제어된 냉각 핑거에 얼음 결정 장착.
- 결정을 형광 AFP 용액에 담그고 결합.
주요 결과
- AFPs로 경계된 얼음 평면의 성공적인 시각화.
- 이미징에서 형광의 효과성 입증.
- AFPs의 결합 메커니즘에 대한 통찰 제공.
- AFP에 의해 결합된 얼음의 구조적 특성 밝혀짐.
결론
- 이 연구는 동결 생물학에서 형광 기반 기술의 유용성을 확인합니다.
- 연구 결과는 동결 방지 단백질 상호작용에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 동결 보존 방법 개선에 대한 잠재적 응용 가능성.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Understanding antifreeze protein (AFP) binding specificity to ice planes provides mechanistic insights for cryoprotectant design in biopharmaceutical applications. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) enables rapid, high-resolution visualization of protein-ice interactions, supporting target validation in cold-adaptation biology. This approach aids in de-risking early-stage discovery by clarifying structure-function relationships critical for protein engineering and formulation stability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of AFP-ice binding mechanisms to validate ice-binding surface hypotheses.
- Operational Value: Uses fluorescent labeling for real-time monitoring of protein adsorption without altering binding specificity.
- Predictive Value: Supports comparative analysis of multiple AFP isoforms on a single ice crystal to assess functional redundancy or specialization.
Assay Development & Screening
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved binding patterns for AFP candidates under controlled crystallization conditions.
- Operational Value: Produces clearer images in reduced time versus traditional ice-etching, improving assay throughput and reproducibility.
- Scalability: Facilitates side-by-side comparison of differently tagged AFPs to inform lead selection in protein-based cryoprotectant screens.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links AFP binding modes to ice recrystallization inhibition activity, informing preclinical efficacy predictions.
- Operational Value: Enables orientation-controlled ice crystal preparation to standardize binding assessments across experimental batches.
- Translational Continuity: Supports structure-guided optimization of AFPs for use in cell and tissue cryopreservation workflows.
Pipeline & Workflow Integration
FIPA fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, particularly for biologics requiring cold-chain stability or ice-interaction modulation.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses regarding AFP specificity and ice-plane recognition through direct visualization.
- Assay Readiness: Delivers reproducible, quantitative outputs on binding plane occupancy to support go/no-go decisions in protein engineering.
- Analytics: Provides fluorescence intensity and spatial distribution metrics to compare AFP variants under identical conditions.
- Translational Research: Connects binding site characterization to functional outcomes in ice growth inhibition, relevant for formulation development.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for evaluating AFP candidates across multiple projects targeting cryoprotection or ice-interaction mechanisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in AFP functionality by reducing ambiguity in binding site assignment.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and imaging protocols to ensure cross-laboratory reproducibility.
- Strategic Value: Accelerates lead identification by enabling rapid comparison of AFP isoforms, reducing time-to-insight in early discovery.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of AFP-based candidates based on validated target engagement and mechanistic de-risking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein fluorescence labeling, ice crystal growth, and polarized light microscopy.
- Depends on temperature-controlled equipment, vacuum systems, and UV-visible imaging setups with appropriate filters.
- Necessitates standardization of ice crystal orientation and hemisphere formation for comparable binding assessments.
- Involves optimization of AFP concentration and incubation time to avoid non-specific adsorption or signal saturation.
- Limited to fluorescently labeled proteins; label choice must be empirically validated to ensure no perturbation of native binding behavior.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Growing Single Ice Crystals
3:18
Determining Singularity and Orientation o the Ice Crystal
4:37
Absorption of Fluorescently Labeled Antifreeze Proteins to a Single Ice Crystal
7:20
Results: Fluorescence-based Ice Plane Affinity Analysis Images
8:18
Conclusion
