형광 기반 얼음 비행기 선호도에 의해 부동액 단백질의 얼음 결합 평면 결정

다음 실험의 전체적인 목표는 형광 표지된 결빙 방지 단백질(antifreeze proteins)에 의해 결합된 얼음 평면을 시각화하는 것입니다. 이는 단결정을 성장시킨 후, 두 번째 단계에서 결빙 방지 단백질을 결합시킴으로써 수행됩니다. 각 결정은 직교 편광판을 통해 관찰하여 단결정 여부와 배향을 확인합니다.

다음으로, 온도 조절이 가능한 콜드 핑거(cold finger)에 얼음 결정을 장착하고 반구형으로 형성합니다. 그 후, 성장하는 반구형 결정의 특정 결합면에 동결 방지 단백질이 흡착되도록 형광 표지된 동결 방지 단백질 용액에 담급니다. 암실 상태의 저온실에서 파장 특이적 광원과 필터를 사용하여 형광 표지된 동결 방지 단백질이 결합된 얼음을 시각화하고 촬영함으로써 얼음 분석 결과를 얻습니다.

얼음 식각(ice etching)과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 결빙 방지 단백질에 형광 표지를 하여 단백질이 결합된 얼음 평면을 즉시 시각화할 수 있다는 점입니다. -0.5 °C로 온도가 조절되는 에틸렌 글리콜 배스를 준비하고, 그 안에 들어가서 뜰 수 있는 깨끗한 금속 팬을 찾아 결정 성장을 시작하십시오. 결정은 몰드에서 형성됩니다. 폴리염화비닐(polyvinyl chloride) 파이프를 3~4 cm 높이로 잘라 원통형 몰드로 사용하십시오.

각 몰드의 한쪽 면에는 너비 1 mm, 높이 2 mm의 노치가 있어야 합니다. 노치가 파인 링의 측면에 진공 그리스를 얇게 도포합니다. 그리스가 도포된 노치 표면을 금속 팬에 밀봉하되, 노치가 팬의 중심 반대 방향을 향하도록 배치합니다.

노치 부분이 그리스로 채워지거나 막히지 않도록 주의하십시오. 팬에 들어갈 수 있는 만큼의 몰드를 준비합니다. 다음으로, 몰드 외측의 팬 중앙에 필터링된 Degas와 탈이온수를 첨가합니다.

기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. 수층이 5mm까지 올라가면, 물이 노치를 통해 몰드 내부로 천천히 유입되어야 합니다. 완료되면, 팬을 에틸렌글리콜 배스에 완전히 수평이 되도록 넣으십시오.

팬과 물의 온도가 -0.5 °C에 도달하면, 몰드 바깥쪽의 팬 중앙에 작은 얼음 조각을 넣습니다. 하룻밤 동안 배양하여 향후 3일 동안 얼음 층을 형성합니다. 다시 배스로 옮겨 몰드에 물을 채웁니다.

각 몰드에 4 °C의 탈기된 탈이온수를 13 milliliters씩 넣습니다. 물을 첨가한 후 하루에 한 번씩 에틸렌 글리콜 배스의 온도를 낮춥니다. 4일째가 되면 몰드가 얼음으로 완전히 채워져야 합니다.

몰드를 꺼내고 얼음을 위한 깨끗한 표면을 준비합니다. 팬에서 각 몰드를 떼어내고 얼음 결정을 밀어내어 제거합니다. 몰드가 놓인 깨끗한 표면을 -20 °C 냉동고에 1시간 동안 보관합니다.

취급 전 단계입니다. 얼음 준비가 완료되면, 단결정 여부를 확인하기 위해 냉동실이나 저온실로 옮깁니다. 두 개의 직교 니콜 편광판 사이에 얼음을 놓습니다.

얼음이 단결정인 경우, 균열이나 불연속면이 보이지 않아야 하며 결정 내에서 빛의 방향이 변하지 않아야 합니다. 편광판을 그대로 둔 상태에서, 얼음을 회전시킬 때 투과되는 빛을 관찰하여 C축의 방향을 결정하십시오. A AEs의 방향을 결정하려면 얼음을 알루미늄 호일로 단단히 감싸십시오.

바늘을 sea 축에 수직으로 맞춘 다음, 호일을 통과하여 얼음 속에 작은 구멍을 뚫습니다. 그다음, 얼음을 0.5 millibar 진공 상태에서 20분 동안 둡니다. 결정을 회수한 후, 저온실에서 덮개를 제거합니다.

기저면의 육각형 에칭을 관찰하십시오. A AE는 육각별의 꼭짓점을 통해 지나갑니다. 이 결정은 별의 서로 마주 보는 꼭짓점에 평행한 선을 따라 절반으로 절단될 것입니다.

주 프리즘 면을 노출시키기 위해, 벤치 위에 결정을 단단히 고정합니다. 쇠톱을 사용하여 결정을 반으로 자릅니다. 콜드 핑거에 장착하기 위해 절단된 조각들을 수집합니다.

얼음 결정을 콜드 핑거(cold finger)에 장착하기 위해 추가 준비 과정이 필요합니다. 콜드 핑거와 크기가 비슷하면서 직경이 약간씩 다른 두 개의 알루미늄 막대를 준비하십시오. 이 두 막대를 교대로 사용하여 결정 상단에 구멍을 녹여 만들고, 콜드 핑거가 들어갈 수 있을 정도의 공동이 형성되면 멈추십시오. 콜드 핑거를 -0.5 °C로 냉각한 후 얼음 공동에 배치하십시오.

결정이 금속에 얼어붙을 때까지 고정합니다. 다음으로, 얼음 결정 직경의 약 2배 크기인 반구형 컵에 4°C로 냉각된 여과된 탈이온수를 채웁니다. 콜드 핑거에 고정된 얼음 결정을 컵에 담그고, 얼음 결정의 윗부분이 액체 표면과 대략 수평이 되며 얼음이 컵 바닥에 닿지 않도록 여분의 물을 제거합니다.

컵 벽면을 단열재로 덮어 온도를 -5 °C까지 낮춥니다. 약 1시간 동안 얼음이 반구 형태로 형성되도록 둡니다. 형광 단백질을 첨가할 준비를 합니다.

반구 준비가 완료되면, 컵에서 얼음 결정을 제거하고 물을 비웁니다. 그 다음, 원하는 농도로 미리 냉각시킨 형광 표지 단백질 용액 25 to 30 milliliters를 추가합니다.

전체 액체 부피를 일정하게 유지하면서 얼음 결정을 컵 속에 담급니다. 이때 결정의 윗부분이 액체 표면과 수평을 이루고 컵 벽면에 닿지 않았는지 다시 한번 확인하십시오. 콜드 핑거의 온도를 -8 °C로 낮추고 단백질 용액이 결정으로 얼 때까지 2~3시간 동안 둡니다.

단백질 용액으로부터 얼음이 최소 5 mm 형성되면 얼음 성장을 중단하십시오. 콜드 핑거가 부착된 상태에서 컵으로부터 얼음 결정을 제거하십시오. 냉각제 온도를 0 °C 바로 위로 높여 콜드 핑거를 분리하십시오.

얼음 결정이 녹아 떨어질 때까지 기다립니다. 결정이 콜드 핑거(cold finger)에서 녹아 떨어지면, 깨끗한 표면 위에 평평한 면이 아래로 향하게 놓습니다. 새로 형성된 얼음을 만지지 않도록 주의하십시오.

결정을 -20 °C에서 최소 20분 동안 보관하십시오. 형광 시각화 단계를 진행하기 전, 암전이 가능한 저온실에서 작업하십시오. 형광 표지를 여기시키기 위한 파장 특이적 여기 필터가 장착된 램프와 카메라 방출 필터를 준비하십시오. 비특이적 빛을 차단하기 위해, 얼음의 평평한 면이 아래로 가도록 램프 아래에 놓고, 실내를 어둡게 한 뒤 조명된 얼음 속의 패턴을 관찰하십시오.

부동 단백질에 의해 결합된 얼음면을 추정하기 위해, 전통적인 얼음 식각 이미지와 그에 대응하는 형광 기반 얼음면 친화도 분석 이미지를 비교하십시오. 두 이미지 모두 겨울 가자미(Pseudopleuronectes americanus)에서 생성된 1형 부동 단백질을 보여줍니다. 이 기술은 서로 다른 부동 단백질의 얼음 결합 패턴을 동시에 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 이 사례에서는 Pacific Blue로 표지된 3형 NFEA FP8과 Trixy로 표지된 1형 부동 단백질이 사용되었습니다.

이것은 type three N-F-E-A-F-P만을 시각화한 결과이며, 여기서는 type one antifreeze protein만이 시각화되어 있습니다. 두 단백질이 함께 시각화되어 있습니다. 각 이미지의 C축이 동일함에 유의하십시오.

이 영상을 시청하고 나면, 단결정 얼음을 성장시키고 배향하는 방법과 형광 기반 얼음면 친화도 분석을 사용하여 형광 표지된 부동 단백질의 얼음면 결합 패턴을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.