Name: 형광 기반 얼음 비행기 선호도에 의해 부동액 단백질의 얼음 결합 평면 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-15T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 배우세요 형광 기반 얼음 비행기 선호도 분석을 통해 부동액 단백질이 얼음 결합 평면에 결합하는 과정을 시각화하는 방법을. 이 기술은 저온생물학 및 단백질 화학 연구에 활용됩니다.

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PLD는 단백질 공학에서 캐나다 연구 위원장을 보유하고 있습니다. 이 작품은 PLD에 건강 연구의 캐나다 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다. 이 연구는 또한 일본 과학진흥협회(JSPS)(제23310171호)와 일본 바이오 중심기술연구진흥기관(BRAIN)의 과학연구를 위한 보조금 지원에도 의해 지원되었습니다. 우리는 FIPA로 이어진 선구적인 작업에 대한 박사 크리스 마샬과 마이크 쿠이퍼에 감사드립니다. 우리는 또한 이 사업의 일부에 대한 시설을 제공하고 형광 광 여기 및 방출 필터를 설정한 로리 그레이엄 박사님께 도리어 사카에 츠다 박사님께 감사드립니다.

1. 성장하는 단일 얼음 결정
<ol><li>깨끗한 금속 팬 (직경 15cm, 높이 4.5cm)을 가지고 에틸렌 글리콜 냉각 욕조에 장착할 수 있습니다.</li>
	<li>파이프에서 단면을 톱질하여 폴리염화비닐(PVC) 원통형 몰드(직경 4.5cm, 높이 3-4cm, 두께 4mm)를 준비한다.<ol>
<li>한쪽에 노치(폭 1mm, 높이 2mm)를 자른다(그림 1A).</li>
		<li>팬에 편안하게 맞을 수 있는 금형을 최대한 준비합니다(그림 1B) 참고: 연구에 따르면 폴리비닐 알코올(PVA)이 얼음핵(22)에영향을 줄 수 있는 것으로 나타났습니다. 그러나 개방형 금형 PVC 시스템에서는 비정형 얼음 형성에 문제가 발생하지 않았습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>노치 컷이 있는 표면인 각 금형의 바닥 표면 링에 진공 그리스의 가벼운 필름을 적용합니다. 노치가 팬 의 중심에서 멀리 방향을 그리는 금속 팬에 기름칠한 노치 표면을 밀봉합니다. 노치를 기름으로 채우거나 방해하지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>0.22 μm을 팬 중앙에 여과 및 탈기/탈기/탈온된 물을 추가하지만 금형 바깥쪽에 서서히 노치를 통해 금형에 물이 들어갈 수 있도록 합니다. 거품을 소개하지 않도록주의하십시오. 물 층은 약 5mm 깊이여야 합니다.</li>
	<li>팬을 온도 조절에 따라 -0.5°C로 냉각된 에틸렌 글리콜 목욕에 넣습니다. 팬은 완벽하게 평평해야합니다. 필요한 경우 팬 의 측면에 밸러스트 웨이트를 추가합니다.</li>
	<li>팬과 물이 -0.5 °C에 도달 한 후, 금형의 외부, 팬의 중간에 얼음의 작은 조각을 추가합니다.<ol>
<li>이것은 팬을 가로 질러 금형에 과냉각 된 물에 얼음 성장을 핵 것입니다. 각 금형의 하단에 있는 작은 노치를 통해 하나의 얼음 크리스탈만 전파할 수 있으며, 그 결과 각 금형에 단일 얼음 결정이 생성됩니다.</li>
		<li>하룻밤 동안 배양하여 얼음 층을 형성합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 3일 동안 하루에 한 번 각 금형에 4°C 의 탈가스/탈이온수 13ml를 추가하고, 첫날 -0.8°C를 각각 첨가한 후 에틸렌 글리콜 목욕의 온도를 1일째에 -1.1°C, 3일째에는 -1.5°C로 떨어뜨린다.<ol>
<li>하룻밤 사이에 그 온도에서 배양.</li>
		<li>4일째가 되면 금형은 얼음으로 완전히 채워져야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>팬에서 금형을 당겨 얼음 결정을 금형밖으로 밀어 내고 계량 보트와 같은 깨끗한 표면에 보관하여 처리하기 전에 약 1 시간 동안 -20 ° C 냉동고에 보관하십시오.</li>
	<li>많은 작은 단일 얼음 결정을 준비하는 대신, 기사23에의해 설명 된 바와 같이 볼륨에 큰 단일 얼음 결정 여러 리터를 제조 할 수 있습니다. 대형 얼음 결정은 -15 ~ -20 °C 냉동고로 덮여 보관하는 경우 1 년 이상 보관 할 수 있습니다. 단일 결정의 부분은 필요에 따라 톱으로 얼음 블록에서 절단 될 수 있습니다.</li>
</ol>2. 얼음 결정의 특이점 과 방향을 결정
<ol><li>금형에서 배출된 얼음이 두 개의 교차 폴라로이드(그림 1D)사이에 있는 냉동실에서 관찰하여 단일 결정인지 확인합니다.<ol>
<li>얼음 결정이 단일인 경우 균열이나 불연속성을 볼 수 없으며 얼음 결정 내에서 빛의 방향이 바뀌어서는 안 됩니다. 참고: 냉동실을 사용할 수 없는 경우 필요한 모든 단계에서 콜드룸을 사용할 수 있으며, 신속하게 작업하고 얼음을 아껴서 처리해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>얼음 비경작으로 인해 c-축의 방향을 동시에 결정할 수 있습니다. 다음 정보를 사용하여 방향을 결정합니다.<ol>
<li>c-축이인시던트 라이트와 정확히 평행하면 이론적으로 교차된 폴라로이드를 통과하는 빛은 없습니다. 입사 라이트가 c-축과평행하여 약간 제목이 있는 경우 교차 폴라로이드 사이에서 회전할 때 균일한 다색 스펙트럼의 빛이 크리스탈을 통해 전달됩니다. 이 균일한 전송은 c-축24를따라 얼음 Ih의 광학 비활성에서 발생합니다. 얼음 결정의 기저 평면은 c-축에정상입니다.</li>
		<li>c-축이입사 광과 평행에서 교차 폴라로이드 사이에 회전하면, 전달된 빛은 크리스탈의 회전마다 0-100% 송전을 번갈아 가며 회전합니다.</li>
		<li>가장 일반적으로 c-축은원통형 얼음 결정의 원형 평면으로 정상이 될 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>알루미늄 호일에 얼음 결정을 단단히 감싸고, 호일을 통해 바늘로 작은 구멍을 뚫고 기저 평면(c-축까지 정상)에 넣고 20분 동안 진공 아래에 놓음으로써 -축의방향을 결정합니다.<ol>
<li>이 치료는 기저 평면에 육각대 대칭으로 육각형 대칭을 가진 에칭을 생성합니다, 여기서 -축은6 면 별 (그림 2A)의정점을 통해 실행됩니다.</li>
		<li>원하는 경우, 얼음 결정은 각각 차가운 손가락에 수직으로 1차 또는 이차 프리즘 평면으로 장착하기 위해 육각형의 한쪽에 평행 또는 수직으로 톱으로 절단될 수 있다(그림 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 단일 얼음 결정에 형광 라벨부동액 단백질의 흡착
<ol><li>먼저 크리스탈의 상단에 캐비티를 지루하게하여 차가운 손가락 (그림 1C)에 단일 얼음 결정을 마운트합니다. 이렇게하려면, 약간 다른 직경의 두 개의 알루미늄 막대로 얼음을 녹여, 그러나 차가운 손가락의 직경과 유사, 차가운 손가락이 맞을 수있는 구멍을 형성한다.</li>
	<li>차가운 손가락을 -0.5°C로 식히고 얼음 구멍에 놓고 얼음 결정을 금속으로 동결할 때까지 제자리에 고정시한다(도 2B). 손가락에서 막대로 의기온을 효율적으로 전달하는 것을 방해하기 때문에 손가락에 크리스탈을 부착할 때 기포를 피하십시오.</li>
	<li>얼음 결정의 직경의 약 2배에 달하는 반구형 컵을 여과된 탈온화 물 또는 완충액으로 채우고 약 4°C로 냉각시다. 차가운 손가락바인딩 얼음 결정을 컵에 담그고 얼음 결정의 상단이 액상층과 약 수준이며 얼음이 컵 벽을 만지지 않도록 과도한 물이나 버퍼를 제거합니다.<ol>
<li>단열재로 컵을 덮고 온도를 -5 °C로 낮춥춥습니다.</li>
		<li>얼음 결정이 반구로 형성될 때까지 약 1시간 정도 기다려 약 20분마다 상태를 확인합니다(그림 2C).</li>
		<li>얼음은 얼음 결정을 녹이고 성장시킴으로써 반구형 컵의 모양을 취할 것이지만, 컵 벽을 만지기 위해 결코 자라서는 안됩니다. 벽과 반구 사이에 는 적어도 1cm 간격이 있어야하며 차가운 손가락은 얼음에서 튀어 나가지 않아야합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>얼음 결정에서 컵을 제거하고 25-30ml의 최종 부피와 원하는 분석 농도에 형광 단백질 용액을 추가하여 컵의 총 액체 부피를 변하지 않도록 주의하십시오. 전형적인 AFP 농도는 0.1 mg/ml입니다.<ol>
<li>얼음 결정의 상단이 액체와 수준에 있고 얼음 결정이 컵 벽을 만지지 않도록 컵에 얼음 결정을 다시 병합 (도 2D).</li>
		<li>차가운 손가락 온도를 -8°C로 떨어뜨리고 단백질 용액이 얼음 결정으로 2-3 시간 동안 동결되어 용액을 자주 저어줍니다. 단백질 용액에서 형성된 얼음은 얼음 성장을 멈추기 전에 적어도 5mm여야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>차가운 손가락에 부착된 상태에서 컵에서 얼음 결정을 제거합니다. 차가운 손가락을 통해 냉각수를 0°C 이상으로 데우고 얼음 결정이 녹을 때까지 기다립니다.</li>
	<li>결정평면면을 계량 접시와 같은 깨끗한 표면에 내려놓고 새로 형성된 얼음을 만지지 않도록 주의하고 -20°C에서 최소 20분 동안 보관하십시오.</li>
</ol>4. 부동액 단백질 바인딩 얼음 비행기의 시각화
<ol><li>형광의 시각화는 어두운 냉동고 또는 콜드 룸에서 수행되며, 파장 특정 흥분 필터가있는 램프 아래에 얼음 결정 평면 면을 배치하여 다른 비특이적 인 빛을 차단합니다. 패턴에 따라, AfP에 의해 바인딩되는 얼음 비행기를 추정 할 수있다 (그림 4).</li>
	<li>파장 특정 조명을 사용할 수 없는 경우 UV 라이트 박스를 대신 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>전통적인 얼음 등광은 얼음 반구가 적어도 3 시간 동안 -20 °C에서 승화할 수 있도록 함으로써 간단하게 수행 될 수 있으며, 그 후에 잔류 단백질 분말이 얼음 표면 (그림 5)에서볼 수 있습니다.</li>
	<li>2.3단계는 완성된 얼음 반구의 -축의방향을 결정하기 위해 반복될 수 있다.</li>
</ol>

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<li>Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+active+qae+isoform+confers+thermal+hysteresis+activity+on+a+defective+sp+isoform+of+type+iii+antifreeze+protein%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein.</a> FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).</li>
<li>Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+ice+growth+and+melting+modifications+by+antifreeze+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins.</a> J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).</li>
<li>Celik, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).</li>
<li>Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dimeric+beta-helical+model+of+an+ice+nucleation+protein+with+bridged+active+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites.</a> BMC Struct. Biol. 11, (2011).</li>
</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

AFP 바인딩 아이스 비행기의 결정에 대한 찰스 나이트에 의해 얼음 에칭 방법의 개발은 크게 AFP에 의해 얼음 바인딩의 메커니즘에 대한 연구를 고급. Afp의 구조는 X 선 결정학26,27에 의해 해결 될 수있는 반면 AFP가 결합하는 얼음에 보완 표면을 추론하는 명백한 방법은 없었다. 겨울 가자미에서 I 타입 I AFP가 처음에 특징지어졌을 때, 얼음28의주요 프리즘 비행기에 결합하는 것이 가설이 되었다. 그러나, 기사의 획기적인 얼음 에칭 실험 I AFP 유형의 그들은 얼음의 피라미드 비행기에 바인딩 하는 것으로 나타났다13. 이 결과 AFP 연구 커뮤니티는 AFP 얼음 결합 메커니즘을 재고하고 AFP9의얼음 바인딩 면을 보다 정확하게 결정하도록 자극했습니다. 기사의 원래 얼음 에칭 실험은 AFP 생산 유기체에서 정제 된 네이티브 AfP를 사용하여 수행되었다. 재조합 AfP의 개발과 GFP 태그의 사용증가로, 다른 많은Afp29로</su...

부동액 단백질 (AfP)의 생산은 얼음이 가득한 환경에 사는 일부 유기체의 중요한 생존 메커니즘입니다. 최근까지, AFP의 유일한 기능은 혈액 순환을 막고 조직 손상을 일으키고 삼투압을 유발하는 내부 얼음 결정의 성장을 방지하거나 늦추는 것이라고 생각되었습니다. 물고기와 같은 동결정도를 견딜 수 없는 유기체는 얼음 결정 성장을 완전히 저해하기 위해 AFP를발현한다 1. 잔디와 같은 다른 것들은 동결 관용이며 조직에 큰 얼음 결정의 형성을 감소시키는 얼음 재결정을 억제하기 위해 AFP를 발현한다2. 저온에서 멤브레인의 안정화는 AFP3에대해 제안된 또 다른 기능이다. 최근, 얼음으로 덮인 황천 호수4에서남극 박테리아 마리노모나스 원시인의AFP에 대한 새로운 역할이 제안되었습니다. 이 AFP는 훨씬 더 큰 접착 단백질의일부입니다 5 산소와 영양소에 더 나은 액세스를 위해 얼음에 박테리아를 부착 하는 것으로 생각 되는6. 그밖 미생물은7에사는 얼음의 구조물을 바꿀 수 있는 AFP를 분비하기 위하여 알려지고 있습니다.
일부 물고기, 곤충, 식물, 조류, 박테리아, 규격 및 곰팡이에서 Afp가 발견되었습니다. 그들은 여러 경우에 다른 선조에서 그들의 진화와 일치 하는 현저하게 발산 순서와 구조; 그러나 그들은 모두 얼음에 결합하고 흡착 억제 메커니즘 8에 의해 성장을억제한다. AFP에는 각각 얼음 바인딩 사이트(IBS)의 역할을 하는 특정 표면이 있습니다. 이들은 전형적으로 표면 잔류물의 사이트 지시 돌연변이 발생에 의해 확인되었습니다9-11. IBS는 얼음의 특정 평면과 일치하는 얼음 모양의 패턴으로 물 분자를 배열하는 가설입니다. 따라서 AFP는5, 12에바인딩하기 전에 리간드를 형성한다. 얼음 비행기는 밀러 지수에 의해 정의될 수 있으며, 다른 AFP는 다른 평면에 묶을 수 있습니다. 따라서, 겨울 가마에서 타입 I AFP는 20-21 피라미드 평면(13)에바인딩, 유형 III AFP는 복합 얼음 바인딩 표면을 사용하여 기본 프리즘과 피라미드 평면을 모두 결합11,14,가문비 나무 budworm AFP, 활동적인 AFP, 기본 및 기저 평면 모두에 동시에 결합15,16. MpAFP와 같은 다른 활동적인 AFP는 단일 얼음 결정 반구5,17의완전한 커버리지에 의해 표시된 바와 같이 여러 얼음 비행기에 결합합니다. 기저 평면뿐만 아니라 다른 평면을 묶는 활동적인 AFP의 능력이 적당히 활성18을통해 10 배 더 높은 활동을 차지할 수 있다고 가설이 있습니다. 활동적인 AF의 효율성은 잘 문서화되어 있지만 여러 얼음 비행기에 결합하는 능력은 아직 이해되지 않습니다.
AFP 바인딩 얼음 비행기를 결정하는 원래 방법은 찰스 나이트에 의해 개발되었다13,19. 이 방법에서 거시적인 단일 얼음 결정은 중공 금속 막대 (차가운 손가락)에 장착되어 탈가스물로 채워진 반구 컵에 침수하여 반구로 형성됩니다. 이어서, 반구는 AFP의 희석용액으로 침수되고, 차가운 손가락을 통해 순환하는 에틸렌 글리콜의 온도에 의해 제어되는 몇 시간 동안 AFP 용액에서 얼음 결정 반구로 얼음층이 재배된다. 얼음 결정은 용액에서 제거되고, 차가운 손가락에서 분리하고- 10 ~ -15 °C 냉동실에 놓습니다. 표면은 부동액 단백질 용액의 냉동 표면 필름을 제거하기 위해 날카로운 블레이드로 긁어 내고 얼음 결정은 적어도 3 시간 동안 승화 할 수 있습니다. 승화 후, AfP에 의해 결합된 얼음 비행기는 잔류 단백질에서 파생된 백색 에칭 패턴으로 볼 수 있다. 얼음 반구는 c-축및-축을 향하여 얼음의 기저 및 프리즘 평면을 찾고 에칭 패치의 밀러 지수를 결정할 수 있습니다. 
여기서우리는 형광기반 얼음 평면 친화성(FIPA)11로지칭하는 방법인 얼음의 AFP 바운드 평면을 결정하는 본래 방법의 수정을 설명한다. AfPs는 녹색 형광 단백질 (GFP)11,16,17,20과같은 키메라 태그 또는 AFP5,21에공유결합된 형광 염료로 형광으로 표시된다. 형광으로 표시된 AfP는 단일 얼음 결정으로 흡착되고 원래얼음 에칭 실험과 동일한 실험 절차를 사용하여 자란다. 성장하는 얼음 반구에 결합하는 AFP의 범위는 자외선(UV) 램프를 사용하여 실험 전반에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 실험이 완료되면 반구는 차가운 손가락에서 직접 분리하고 승화없이 이미지화 될 수 있습니다. 그러나 원하는 경우 반구를 상화하여 기존의 얼음 식각을 시각화할 수 있습니다. FIPA 방법론에 도입된 수정은 기존의 얼음 에칭 프로토콜을 몇 시간 단축시합니다. 또한, AFP 바인딩 된 얼음 비행기의 중복 패턴을 시각화하기 위해 서로 다른 형광 라벨을 가진 여러 AfP를 동시에 이미징 할 가능성이 있습니다.

<table><tbody><tr><td>NESLAB RTE 냉장 수조/순환기</td><td>Thermo Scientific</td><td>RTE7</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜, 사전 혼합 부동액/냉각수</td><td>인증</td><td>29-3037-0</td><td>일반 자동차 부동액</td></tr><tr><td>Cold finger</td><td>사용할 수 없음</td> 사용할 <td>수 없음</td><td>황동으로 맞춤 제작(길이 9cm, 외경 1.5cm)</td></tr><tr><td>반구형 컵</td><td>사용할 수 없음</td><td>사용할 수 없음</td><td>수지로 맞춤 제작 (외경 8cm, 내경 6cm)</td></tr> <tr><td>고 이중 출력 조명 시스템</td><td>Lightools Research</td><td>LT-99D2, Illumatools DLS 120 볼트 AC, LT-9470FX, LT-9549FX</td><td>추가 및 사용자 정의 여기 필터는 Lightools Research</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Canon</td><td>EOS 50D</td><td></td></tr><tr><td>방출 필터</td><td>Lightools Research</td><td>LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG</td><td>에서 구입할 수 있습니다.필터를 카메라 렌즈에 장착하기 위해 필터 링 어댑터가 필요할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

형광 기반 얼음 비행기 선호도에 의해 부동액 단백질의 얼음 결합 평면 결정

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

부동액 단백질(Afp)은 내부 얼음 성장을 방지하거나 늦추기 위해 다양한 냉강한 유기체로 표현됩니다. AFP는 얼음 바인딩 표면을 통해 특정 얼음 평면에 바인딩합니다. 형광 계 얼음 평면 선호도 (FIPA) 분석은 AFP가 결합하는 얼음 비행기를 결정하는 데 사용되는 수정 된 기술입니다. FIPA는 AFP 바인딩 된 얼음 비행기를 결정하기위한 원래의 얼음 에칭 방법을 기반으로합니다. 실험 시간이 단축된 후 선명한 이미지를 생성합니다. FIPA 분석에서 AFP는 키메라 태그 또는 공유 염료로 형광으로 형광으로 표시된 다음 천천히 거시적 단일 얼음 결정으로 통합되어 반구로 미리 형성되어 a-및 c-축을결정합니다. AFP 바인딩 된 얼음 반구는 비특이적 인 빛을 차단하기 위해 필터를 사용하여 AFP 바인딩 평면을 시각화하기 위해 UV 빛 아래 이미지입니다. AFP의 형광 라벨링을 통해 AFP흡착을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 레이블은 AF가 바인딩하는 비행기에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. FIPA 분석은 또한 결합 평면을 차별화하는 데 도움이 동일한 단일 얼음 결정에 서로 다른 태그가 달린 AFP를 바인딩하는 옵션을 소개합니다. FIPA의 이러한 응용 프로그램은 AFP가 성장을 중지얼음에 바인딩하는 방법과 많은 AFP 생산 유기체가 여러 AFP 동위 형태를 표현하는 이유에 대한 우리의 이해를 발전시키는 데 도움이됩니다.

단일 얼음 결정의 준비 및 장착은 오류가 가장 일반적으로 이루어지는 FIPA 절차의 두 단계입니다. 준비된 얼음 결정이 단일인지 여부를 결정하는 것은 프로토콜 섹션의 2.1 단계에서 설명된 대로 교차 폴라로이드(도 1D)를통해 이를 검사하여 수행된다. FIPA 분석에 다결정 얼음 결정이 사용되는 경우, 그 결과는 일관된 결합 패턴(도 6B)없이반구에 대한 AFP의 불연속 결합이 될 것이다. 얼음 결정 인터페이스가 AFP가 결합하는 얼음 비행기 주변에 있는 경우 최종 결과를 해석할 수 없습니다. 이러한 이유로, 얼음 결정은 신중하게 다음 단계로 이동하기 전에 특이성을 확인해야합니다. FIPA 분석에 대한 단일 얼음 결정이 있을 확률을 높이기 위해 여러 가지 동시에 만들어야 한다.
또 다른 일반적인 오류는 장착 하는 동안 차가운 손가락으로 크리스탈 면을 잘못 정렬 하는. 차가운 손가락에 수직으로 원차 또는 이차 프리즘얼굴을...

부동액 단백질(AfP)은 얼음 의 특정 평면에 결합하여 얼음 성장을 방지하거나 느리게 합니다. 형광계 얼음 비행기 선호도(FIPA) 분석은 AFP 바인딩 된 얼음 비행기의 측정을위한 원래 얼음 에칭 방법을 수정한 것입니다. AFP는 형광으로 표시되고, 거시적 단일 얼음 결정에 통합되고, UV 빛 아래에서 시각화됩니다.

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

다음 실험의 전체적인 목표는 형광 표지된 결빙 방지 단백질(antifreeze proteins)에 의해 결합된 얼음 평면을 시각화하는 것입니다. 이는 단결정을 성장시킨 후, 두 번째 단계에서 결빙 방지 단백질을 결합시킴으로써 수행됩니다. 각 결정은 직교 편광판을 통해 관찰하여 단결정 여부와 배향을 확인합니다.다음으로, 온도 조절이 가능한 콜드 핑거(cold finger)에 얼음 결정을 장착하고 반구형으로 형성합니다. 그 후, 성장하는 반구형 결정의 특정 결합면에 동결 방지 단백질이 흡착되도록 형광 표지된 동결 방지 단백질 용액에 담급니다. 암실 상태의 저온실에서 파장 특이적 광원과 필터를 사용하여 형광 표지된 동결 방지 단백질이 결합된 얼음을 시각화하고 촬영함으로써 얼음 분석 결과를 얻습니다.얼음 식각(ice etching)과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 결빙 방지 단백질에 형광 표지를 하여 단백질이 결합된 얼음 평면을 즉시 시각화할 수 있다는 점입니다. -0.5 °C로 온도가 조절되는 에틸렌 글리콜 배스를 준비하고, 그 안에 들어가서 뜰 수 있는 깨끗한 금속 팬을 찾아 결정 성장을 시작하십시오. 결정은 몰드에서 형성됩니다. 폴리염화비닐(polyvinyl chloride) 파이프를 3~4 cm 높이로 잘라 원통형 몰드로 사용하십시오.각 몰드의 한쪽 면에는 너비 1 mm, 높이 2 mm의 노치가 있어야 합니다. 노치가 파인 링의 측면에 진공 그리스를 얇게 도포합니다. 그리스가 도포된 노치 표면을 금속 팬에 밀봉하되, 노치가 팬의 중심 반대 방향을 향하도록 배치합니다.노치 부분이 그리스로 채워지거나 막히지 않도록 주의하십시오. 팬에 들어갈 수 있는 만큼의 몰드를 준비합니다. 다음으로, 몰드 외측의 팬 중앙에 필터링된 Degas와 탈이온수를 첨가합니다.기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. 수층이 5mm까지 올라가면, 물이 노치를 통해 몰드 내부로 천천히 유입되어야 합니다. 완료되면, 팬을 에틸렌글리콜 배스에 완전히 수평이 되도록 넣으십시오.팬과 물의 온도가 -0.5 °C에 도달하면, 몰드 바깥쪽의 팬 중앙에 작은 얼음 조각을 넣습니다. 하룻밤 동안 배양하여 향후 3일 동안 얼음 층을 형성합니다. 다시 배스로 옮겨 몰드에 물을 채웁니다.각 몰드에 4 °C의 탈기된 탈이온수를 13 milliliters씩 넣습니다. 물을 첨가한 후 하루에 한 번씩 에틸렌 글리콜 배스의 온도를 낮춥니다. 4일째가 되면

determining-ice-binding-planes-antifreeze-proteins-fluorescence-based

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

그런가에 대한 정량, 높은 처리량, 실시간 및 레이블이없는 biomolecular 감지 (DNA, 단백질...

Interferometric 반사율 이미징 센서 (IRIS)를 채용 Biomolecular 감지

또한 부동액 단백질로 알려진 아이스 바인딩 단백질 (IBPs)는, 얼음의 성장을 억제하고 조직의 cryopreservation에서 사용할 수있는 유망 첨가제입니다. IBPs을 조사하는 데 사용되는 주요 도구는 nanoliter의 osmometer입니다. 우리는 광학 현미경에 장착 홈 디자인 냉각 단계를 개발하고 맞춤형 LabVIEW 루틴을 사용하여 제어. nanoliter의 osmometer는 매우 민감한 방식으로 샘플 온도를 조작 여기에 설명했다.

아이스 바인딩 단백질 수사 LabVIEW 운영하는 소설 Nanoliter의 Osmometer

이 비디오에서는 형광단 태그가 지정된 Shwachman-diamond syndrome(SBDS) 단백질과 신장 인자 유사 1 GTPase(EFL1) 사이의 상호 작용을 연구하기 위한 형광 이방성 기술에 대해 설명합니다. EFL1의 농도가 점차적으로 증가하는 SBDS 단백질을 배양할 때 이방성의 꾸준한 증가가 관찰되어 두 단백질 간의 성공적인 상호 작용을 나타냅니다.

Fluorescence Anisotropy-based Detection of Protein-Protein Interaction(단백질-단백질 상호작용의 형광 비등방성 기반 검출)

이 비디오는 전사 인자와 DNA 간의 상호 작용을 모니터링하는 데 도움이 되는 고성능 형광 이방성에 대해 설명합니다. 이 분석은 형광단으로 표지된 DNA의 분자 회전 또는 이방성으로 인한 편광 정도를 측정하여 형광단으로 표지된 DNA 분자와 특정 전사 인자의 상호 작용을 모니터링합니다.

Transcription Factor-DNA Binding Affinity를 결정하기 위한 형광 이방성

시차 주사 형광 측정법은 단백질과의 상호 작용을 위해 작은 분자의 라이브러리를 스크리닝하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 여기에서는 이러한 분석을 확장하여 작은 분자와 단백질 파트너 사이의 해리 상수를 추정하는 간단한 방법을 제시합니다.

시차 주사 Fluorimetry를 사용하여 단백질 - 리간드 상호 작용의 결정

단백질 상호 작용은 세포의 기능의 핵심이다. 열량 및 분광 기술은 일반적으로 그 특성을하는 데 사용됩니다. 여기에서 우리는 Shwachman - 다이아몬드 증후군 (SBDS)에 돌연변이 단백질과 신장 인자 같은 1는 GTPase (EFL1) 사이의 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성을 설명합니다.

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배우세요 형광 기반 얼음 비행기 선호도 분석을 통해 부동액 단백질이 얼음 결합 평면에 결합하는 과정을 시각화하는 방법을. 이 기술은 저온생물학 및 단백질 화학 연구에 활용됩니다.

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