Name: 라이브 일차 전지에 G3BP 스트레스 과립 역학의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 배우세요 라이브 일차 세포에서 G3BP 스트레스 과립의 형성과 역학을 공초점 현미경으로 시각화하는 방법을. 이 기법은 신경세포 스트레스 반응 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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저자는 인수가 수행 된 몽펠리에 리오 영상 (MRI) 플랫폼을 인정하고 싶습니다. 그들은 프로토콜의 다른 부분에서의 도움을 이사벨 로페즈 크리스티나 메 지아, 알렉산드라 메츠, 이리나 Lassot, SOLANGE Desagher, 파비앙 Loust​​alot 및 버지니 Georget 감사합니다. 이 작품은 라 공들인 Médicale (FRM) (퀴프 FRM 2011-N ° DEQ20111223745는) 매그가 부어 지원되었다.

이 프로토콜의 모든 동물의 절차 11 월 24 일 1986 (86-609/EEC)의 유럽 공동체위원회 지침의 가이드 라인을 엄격하게 준수하고 있습니다. 물과식이 허용 그룹의 집은 마우스,. 12 시간 빛 : 어두운주기 (오전 7:00에 빛) 12 시간과 통제 된 환경 (22 ± 1 °의 C, 55 ± 5 %의 습도)에서 그들을 유지합니다. 1 쥐과 차 전지의 문화 :. 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs) <ol><li> 얇은 집게뿐만 아니라 곡선 포셉 및 해부 가위를 압력솥. 멸균 용기에 보관합니다. 멸균 D-PBS (둘 베코 인산염 완충 식염수)를 사용합니다. 완전한 MEFs 매체를 준비 : 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 ㎜의 L-글루타민, 1 mM의 피루브산 나트륨, 1 % 비 필수 아미노산, 및 0.5 mM의 2 - 머 캅토 에탄올이 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) / F12 37 ° C에서 따뜻한 </li><li> 13.5 일 후 교미 (DPC에서 임신 한 마우스 (안락사)) 자궁 전위에 의해. 90 % EtOH로 소독 한 마우스에서 자궁 뿔을 제거합니다. 살균하고 깨끗한 후드에서 37 ° C에서 배아와 뿔을 배치는 D-PBS를 데워진. 뿔, 장소를 엽니 다 100mm 멸균 플라스틱 페트리 접시에있는 태아는 탯줄 자료에서 그들을 청소하고 혈액의 과잉을 제거하는 따뜻한 D-PBS로 세척. 양안에서 태아의 사지, 내장을 제거하고 뇌를 포함하는 헤드의 상부. </li><li> 새로운 배양 접시에서 말하다 무균 수술에 아주 작은 조각으로 배아 잎 가위 (최소 1 분). 다른 유전자형의 배아의 경우, 각각의 페트리 접시에 각각의 배아를 넣어 유전자형의 꼬리 또는 위쪽 머리를 유지하기 위해주의해야합니다. </li><li> 1X 트립신-EDTA (0.25 % 트립신, 1 ㎜ EDTA)와 배아를 커버. 30 분 37 ° C의 배양기에서 1 시간 동안 품어. 전체의 10 ML을 추가트립신 반응을 정지 MEFs 매체. 피펫은 위아래 모두 집계를 제거합니다. 10 분 (완전 배지로 가득) 50 ㎖ 튜브에 세포 현탁액을 앉아 보자, 상온에서 300 XG에서 5 분 동안 뜨는을 원심 분리기. 완전 배지 (1 배아 6 ml)에 펠렛을 Resuspend. 가능한 유핵 세포는 트리 판을 사용하여 계산 될 수있다 푸른 (약 5 × 106 세포는 한 배아로부터 예상 될 수있다.) 60mm 페트리 접시 당 플레이트 3 ㎖. </li><li> 다음날 매체를 변경하고 세포가 성장하도록 허용 요리는 컨 플루 언트 될 때까지. 많은 세포 유형은 알 수있다, 하지만 섬유 아 세포는 계대 배양을 살아남을 것입니다. </li><li> 세포를 분리하고이 형질에 대한 50~70% 자랄 때까지, 유리 바닥 (시간 경과 실험에 대한 중요한)와 35mm 요리에서 성장 할 수 있습니다. 마이코 플라즈마와 마우스 병원균에 대한 검사. </li></ol> 2. 문화뉴런의 경우 daptations <ol><li> 문화 전날, 폴리-L-라이신 살균 청소 후드 (0.1 ㎎ / ㎖의 200 μL)과 함께 코트 35mm 유리 바닥 배양 접시 하룻밤 둡니다. </li><li> 다음날 아침에 두 번 45 분에서 1 시간에 한번씩 5 분, 대한​​ 멸균 순수한 물로 씻어. 2 DMEM의 ML 플러스 10 % FBS 배지로 교체하고 37 ° C 배양기에서 유지. </li><li> 18.5 DPC에서 배아를 해부하다. 살균하고 깨끗한 후드, 100mm 페트리 접시에 차가운 무균 HBSS (행크의 균형 소금 솔루션)에 배아와 뿔을 배치합니다. 신생아 새끼 또한 댐의 수명을 유지하고, 특히 얻기 어려울 수 형질 전환 동물의 경우에, 더 많은 자손을 생성 할 수있게하기 위해 배아 대신 사용될 수있다. 각각의 배양 접시에서 각 태아 또는 신생아을하고 가위로 머리를 잘라. 눈에 곡선 집게를 삽입하여 머리를 잡아 피부를 잘라 조심스럽게 뒷면에서 부드러운 두개골을 열헤드의 눈​​까지, 헤드의 각 측면에. 시신경과 뇌 줄기를 잘라, 뇌를 제거하고 HBSS를 포함하는 새로운 배양 접시에 넣어. 입체경에서 두 개의 얇은 집게를 사용하여 모든 수막을 제거합니다. 해마, 대뇌 피질 또는 연구하는 구조에 따라 두뇌의 다른 부분을 분리합니다. </li><li> 차가운 HBSS 4.5 ㎖에 해부 뇌 구조를 담가 15 ML 튜브에 미리 준비하고 트립신 소화 될 때까지 얼음 계속. 2.5 % 트립신 0.5 mL를 넣고 20 분까지 15 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 소화 뇌 부분을 폐기 할 수 없음을 매우주의하고, HBSS와 트립신의 3 배를 씻어. </li><li> 이 때까지 1 ㎖ 팁을 탑재 한 1 ㎖ 마이크로 피펫 1 ㎖ (피질) DMEM 플러스 10 % FBS 최대 피펫 아래로 여러 번에 500 μL (해마)에 재현 탁, 그 후에, 1 ㎖ 플러스 200 μL 팁 장착 눈에 띄는 집계하지 않습니다. </li><li> 각 35mm 유리 BOTTO에 세포 현탁액 100 ~ 200 μl를 배포DMEM 플러스 10 % FBS를 포함하고 신경이 적어도 3 시간 동안 37 ° C에서 밀착시켜 m 접시. 데워진 신경 완전 배지로 교체 (Neurobasal 매체, 250 μM의 L-글루타민과 NS21 보충 첸 등. 19에 기술 된 바와 같이 제조) 및 신경 세포의 성장을 할 수 있도록 37 ° C에 둡니다. (DIV) (형질 전환 효율이 DIV하지만 시냅스 연결의 몇 가지 더 나은 7-10 사업부에서 설립 된 후에 높은) 체외에서 5~14일에서 신경 세포를 형질. </li></ol> EGFP-G3BP1 구문의 3. 형질 35mm 접시 당 정제 된 플라스미드의 3 μg을 사용하여, 형광 마커 (등 GFP, YFP) 융합 관심의 단백질의 cDNA를 (SG를의 구성 요소)를 포함하는 벡터로 세포를 형질. <ol><li> 제조자의 프로토콜 (자재 / 시약의 표 참조) 다음, 시판의 방법을 사용 MEFs를 형질. </li><li> 칼슘과 함께 신경 세포를 형질. 시아 등 20 간단히에서 적응 인산 방법 : <ol><li> 솔루션을 준비 : DMEM 세척 : 25 밀리미터의 KCl을 포함하는 DMEM; 형질 솔루션 : 1X DMKY (HEPES 5 mm의 MgCl2를 10 mM의 페놀 레드)를 포함하는 DMEM 세척; 충격 솔루션 : HEBS 1X, 1X DMKY 및 DMSO 2 % (V / V) 37 ℃에서 보관하십시오 </li><li> 뉴런, 여과 액에서 용지를 제거하고, 37 ℃에서 보관 DMEM 세척으로 세척 한 후 형질 배지로 교체하고 인산 칼슘 플라스미드 DNA 침전물의 준비 기간 동안 37 ° C로 유지한다. </li><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서, (이 순서대로) 브라운 물 (최종 부피 50 μL), 염화칼슘 2.5 M의 5 μL, 플라스미드 DNA의 3 μg을 추가합니다. 이미 둥근 바닥 폴리 프로필렌 튜브에 도입 HEBS 2 배의 50 μL에이 조합을 삭제합니다. 낙하와 함께 회전에 의해 튜브를 섞는다. 30 분 동안 실온에서 침전물 형태하자. </li><li> precipitat 추가전자 뉴런에 적가하고 30 ~ 50 분 동안 37 ° C에서 둡니다. </li><li> 1 분 동안 충격 솔루션으로 교체 한 후 DMEM 세척과 헹굼 마지막으로 미리 조정 매체를 재 도입. 37 ° C에서 세포를 유지 </li></ol></li></ol> SG를 조립 및 역학을 포함하는 G3BP 4. 시각화 <ol><li> 페놀 레드없는 매체에 의해 페놀 레드를 포함하는 세포의 매체를 교체합니다. </li><li> 인수에 대한 형광을 갖춘 공 ​​초점 현미경을 사용합니다. 현미경 시스템을 켜십시오 : 수은 램프, 컴퓨터 및 레이저. 20 분 이상 인수를 시작하기 전에 37 ° C에 실을 따뜻하게. </li><li> G3BP의 이상 발현은 SG를 유형의 자연 형성을 유도한다. 세포는 따라서 스트레스 유도없이 형질 전환 후 SG를 24 시간 오른쪽의 조립 관찰 할 수있다. 대안 적으로, 응력은 상기 SG를 조립을 유도하도록 유도 될 수있다. 0.5 ㎜의 아비산 나트륨과 별 추가오른쪽 화합물 (과립 확실히 1 시간 내에 형성 될 것이다)의 첨가 후 획득 t. </li><li> 침지 목적에 기름을 추가 (40X 또는 63X 목표를 사용) 및 적응 35mm 현미경 홀더의 목적에 페트리 접시를 설치, 무대 홀더에 안정. 요리의 인수가 변경 될 것입니다 그렇지 않으면 평평한 지 확인합니다. 관련 형광 물질에 따라 형광 빛을 켜고 형질 전환 세포를 시각화. 그 세포는 표백 및 세포 독성을 최소화하기 위해 필드에 한 번 형광을 끕니다. </li><li> &quot;취득 탭&quot;에서 태그 형광 (EGFP-태그 G3BP를 사용하여 우리의 프로토콜에있는 488 나노 미터)의 여기 파장에 따라 레이저를 선택하고 PMT에 대한 적응 방출 길이 (광전자 증 배관)을 선택합니다. 잡음 및 과포화뿐만 아니라 독성을 최소화하기 위해 레이저 파워 (통상 10 % 이상)을 조정하고, 이득을 설정하고 신호 대 잡음비를 수정 오프셋.레이저 박람회 기간 (라인 평균 2, 프레임 평균 1)을 최소화하기 위해 (1,000 Hz에서) 빠른 스캔합니다. 원하는 경우, Z 스택에 대한 매개 변수가 3D에서 이미지를 (1 ㎛의 Z 단계는 세포와 일반적으로 괜찮습니다) 재구성 할 수 있도록 설정. 각 인수 사이의 시간 간격을 결정 : 작은 간격은보다 일관된 영화를 얻을 수 있도록하지만이 광표백 및 독성 (20 초 간격이 기술 실험에 사용 된)를 유도 할 수 있습니다. 총 취득 기간은 스트레스의 유형에 따라 다를 수 있습니다. 많은 G3BP 함유 SG를이 아비 산염 처리에서 매우 빠르게 형성과 치료의 1 시간 후 잘 볼 수 있습니다됩니다 :이 경우에, 15의 인수의 총 지속 시간, 바로 스트레스 후 인수 필름 및 시작 빠르게 셀을 선택합니다 - 20 분 여러 SG를 조립을 준수 크게 충분. </li><li> 사진을 저장하고 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 스택과 영화를 재구성. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

프로토콜 우려 형질 조심스럽게 세포 독성을 낮추기 위해 모니터링 할 필요가 더 많은, 특히 시간 경과 인수에서 가장 중요한 단계. 일차 세포의 배양 한 멸균 조건이 유지되고,주의가 절개 및 세포 분리 단계 동안의 손상을 방지하기 위해 수행되는 한, 어려운 부분이 아니다. MEFs 초기 구절에서 냉동 보관하실 수 있습니다. 칼슘과 함께 신경 세포의 형질이 잘 21 일을 표시 한이 프로토콜은 외 시아에서 적응. (20)가 형질 전환의 좋은 수준을 가능하게, 그러나 그것은 특정 세포 죽음을 유도 할 수있다. 이 용액의 pH를 확인하고 1 시간을 넘지 않아야 인산 칼슘 침전물 플라스미드와 뉴런의 인큐베이션을 모니터링하는, 배양 다음 몇 일 사이 뉴런 형질하는 것이 중요하다. 광학 현미경으로 확인하고 트란 제거sfection 매체 집계가 관찰되는 경우. DMEM으로 세척의 수는 증가 될 수있다. <p cla...

스트레스 과립 (SGS는) 같은 높은 온도, 산화 스트레스, 저산소증, 삼투압 충격, 자외선 조사, 포도당 박탈, 또는 바이러스 감염 1과 같은 환경 스트레스에 대한 세포 보호 반응으로 형성된 비 막 세포질 초점입니다. 이들은 산화 스트레스를 유발 나트륨 아비 산염과 같은 화합물로 처리함으로써 화학적으로 유도 될 수있다. SG를 실속 번역 체포 메신저 리보 (mRNPs)를 축적하면 번역 기계에서의 mRNA를 금속 이온 봉쇄, 2 단지, 자신의 어셈블리 eIF2α의 인산화 (진핵 개시 인자 2 α)에 의해 트리거 될 수 있습니다. SGS는 P-시체 같은 polysom​​es 및 다른 과립과 구성 요소를 교환 동적 구조입니다. 그들은의 mRNA가 정렬하고 안정적인 비 polysomal의 mRNPs 3로 번역, 재개시, 저하 또는 포장 중 하나에 대해 처리하는 &quot;우선 순위 구분 센터&quot;를 구성. SG를 조립 빠른 B입니다유타는 큰 과립으로 뭉쳤다 초기 다수의 작은 골재와 점진적 과정이다. 미세 소관을 중단 시키거나 안정화 화학적 억제제의 사용은 미세 소관 네트워크가 조립 합체 및 분해 공정 등 SG 역학 필요하다는 것을 보여준다. SG를의 동적 어셈블리는 TIA-1 (T-세포 내부 항원-1)과 같은 특정 RNA 결합 단백질 (RNA-BP)의 집계에 의해 추진됩니다 TIAR 이량 할 수 있습니다 (TIA-1 관련 단백질), SGS 및 4에 polysome 분해의 mRNA의 경로를 촉진합니다. G3BP (RasGAP SH3 도메인 결합 단백질)의 세포가 아비 산염 또는 고온 강조하고, 탈 인산화 G3BP의 과발현이 SG를 어셈블리 (5)를 유도 할 수있을 때 SG를에 지역화와 같은 RNA-BP입니다. G3BP는 처음 RasGAP P (라스 - GTPase의 활성화 단백질과의 상호 작용을 특징으로 한 진화 적으로 보존 된 RNA-BP입니다(120) 6); 그러나 이러한 상호 작용은 최근 7을 재 방문했다. G3BP 제품군은 두 개의 포유류의 회원, G3BP1 (G3BP이라 함)과 G3BP2 8이 포함되어 있습니다. 세포가 스트레스를 9을 실시 할 때 두 단백질은, SGS에 colocalize. 정식 RNA 인식 모티프 (RRM)를 보존 RNP1 및 RNP2 모티브 : G3BPs는 N-말단 NTF2 도메인 프롤린 리치 (PxxP) 모티프 다음에 자신​​의 현지화 및 올리고머를, 영향을 제안 구성, 다음 C-말단 모티브는 RNA 바인딩과 관련된 , 아르기닌 - 글리신 리치 (RGG) 상자 하였다. 흥미롭게도, EGFP 융합 다른 도메인을 구성하여 단백질의 상이한 부분을 분석 한 NTF2 같은 도메인 및 RNA-결합 도메인이 가장 효율적 이량의 특성의 중요성을 제안하는, SGS 모집 및 RNA는 바인딩 것으로 나타났다 SG를 조립. 다양한 모델은 체외 10-13에서 G3BP 단백질의 다른 기능을 공개했다.생쥐 G3BP가 중단 발달 성장과 생존 14,뿐만 아니라 공간 작업 기억 (15)에 운동 장애와 결함을 특징으로 중추 신경계 (CNS)에 G3BP의 중요한 역할이 단백질의 중요성을 보여 주었다. G3BP 결핍은 SG 형성 및 신경 퇴행성 질환 (15) 사이의 직접 링크를 설정, 변경된 신경 가소성과 칼슘 항상성에 이르게한다. 이 신경 세포와 같은 일차 전지에있는 SG를의 역학을 연구 할 수있는 것이 중요하다. 이 프로토콜은 아비 산염 처리에서 일차 전지에 G3BP1 함유 SG를 조립을 관찰 할 수있는 간단한 방법을 제공합니다. 그것은 스트레스의 예를 다른 종류의 서로 다른 조건에서 SG를 조립을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 SG를 다른 과립 또는 다른 성분으로 구성 될 수있다. 사실,이 프로토콜은 G3BP1에 초점을 맞추고 있지만, TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2와 같은 다른 스트레스 과립 마커가있다FMRP (허약 한 X 정신 지체 증후군 단백질) 16, TDP-43 (transactive 응답 DNA 결합 단백질 43) (17) 또는 슈타우펜 18. 특히, TIA-1 / R과 같은 단백질이 과발현되면 다른 SG를 형성 기능, 규제와 관련된 성적에 차이가있다하더라도, SGS 어셈블리를 유도 할 수 RNA 결합 단백질을 핵, G3BP 같은입니다. SG를 이러한 핵심 구성 요소의 일부 또는 nucleators의 형광 - 태그 버전의 형질 이미지 특정 SG를 조립 및 역학을 수행 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td>37°C에서 예열; C</td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>Gibco</td><td>15096</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 B-35</td><td>Greiner</td><td>627860/627861</td><td>처리 여부(처리: 부착 세포의 부착 증가)</td></tr><tr><td>폴리-L-라이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td>37°C에서 예열; C</td></tr><tr><td>HeBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103</td><td>37°C에서 예열; C</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>펜치</td><td>Biotek</td><td>DU-110-A</td><td>매우 얇음, 팁 0.1 mm (수막 제거에 유용)</td></tr><tr><td>곡선형 펜치</td><td>Biotek</td><td>P-110-BUF</td><td>매우 얇음, 팁 0.1 mm</td></tr><tr><td>작은 가위</td><td>Biotek</td><td>CM-85-BS</td> 해마 Polyplus transfection JetPEI 시약을 <td>제거하는 데 유용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Ozyme</td><td>101-10</td><td>MEFs 트랜스펙션, 순방향 프로토콜 따르</td></tr><tr><td>기 도립 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

라이브 일차 전지에 g3bp 스트레스 과립 역학의 시각화

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGS는 특정 단백질의 구성 요소 또는 폴리 A +의 mRNA의 면역 염색에 의해 세포를 시각화 할 수 있습니다. SGS는 매우 동적이며 자신의 조립과 운명의 연구는 스트레스에 대한 세포 반응을 이해하는 것이 중요합니다. G3BP (RasGAP SH3 도메인 결합 단백질)과 같은 SG를 주요 요인의 결핍 생쥐와 중추 신경계의 변화에​​ 발달 결함이 발생합니다. 유기체, 1 캔 문화의 기본 세포에서 세포의 SG를의 역학을 연구하고 SG를의 형질 태그 구성 요소의 지역화를 수행합니다. 우리는 마우스 배아 섬유 아 세포의 G3BP1 함유 SG를 (MEFs)을 관찰하기 위해 시간 경과 실험을 설명합니다. 이 기술은 또한 최근 이러한 SG를가 알츠하이머 병 같은 신경 퇴행성 질환의 발병에 형성되어 도시되었을 결정적이다 라이브 뉴런 G3BP 함유 SG를 연구하는 데 이용 될 수있다. 이 방법은 임의의 다른 셀룰러 바디 및 과립 단백질 성분에 적응하고, 수행 될 수있다형질 전환 동물,이 과립의 특정 인자의 부재하에, 예를 들면 과립 역학 라이브 연구를 허용한다.

스트레스 과립 형성 스트레스 아폽토시스 방지 연결된 클리어 할 때까지, 스톨 번역문 셀룰러 적응을 허용, 스트레스에 셀의 반응에서 중요하다. 이 분석은 허가 키의 SGS 단백질 구성 요소의 현지화 (그림 1)에 따라, 일차 전지에있는 SG를 공부합니다. G3BP, SGS 어셈블리의 핵심 요소는, 배양 MEFs 또는 뉴런 (그림 2A의 A와 C)의 세포질에 오히려으로 확산 존재하고, 명확하게 MEFs에서 아비 산염의 치료뿐만 아니라 신경 세포 (그림 2A의 B에서 분리 된 과립에 존재하고있다 D). 일차 전지는, 예를 들면 자신의 구성 요소 중 하나의 부재에 응력 과립의 연구를 허용하는 형질 전환 마우스 모델에서 얻을 수있다. 흥미롭게도, 마우스에 G3BP1의 결핍, 중추 신경계의 심각한 결함에 특히 ataxic P 리드과 공간 작업 기억의 변경 (사지 물림쇠 테스트,도 2b에서와</strong...

스트레스 과립 (SGS는) 실속 리보 입자 (RNP들), 각종 스트레스에 대한 세포 반응에 중요한 포함하는 세포질 RNA 과립이다. SG를 역학 스트레스 후 형질 일차 전지에있는 SG를의 태그 구성 요소의 현지화를 시각화하여 살아있는 세포에 따라 할 수있다.

라이브 일차 전지에 G3BP 스트레스 과립 역학의 시각화

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

다음 실험의 전반적인 목적은 일차 세포, 특히 스트레스 과립의 형성과 같은 리보핵단백질 과립의 역학을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마우스 배아 섬유아세포나 관심 동물의 해마 뉴런과 같은 세포를 배양합니다. 두 번째 단계로, 스트레스 과립의 태그된 성분을 형질전환시켜 이를 시각화할 수 있도록 합니다.다음으로, 세포에 스트레스를 유도하고 타임랩스 공초점 현미경으로 관찰합니다. 얻어진 결과는 직접적인 시각화를 통해 마우스의 또는 거울 및 해마 뉴런에서 G3BP1을 포함하는 스트레스 과립의 동역학을 보여줍니다. 이러한 방법은 뉴런과 같은 세포의 스트레스 반응에 관한 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.예를 들어, 마우스에서 스트레스 과립에 필수적인 단백질을 억제하는 RNA 녹다운을 수행했을 때 신경세포 결함이 발견되었습니다. 따라서 이 방법은 이러한 관찰 결과의 배후에 있는 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. E 13.5 임신 마우스를 안락사시킨 후, 90% ethanol로 마우스를 소독하고 멸균 후드 내에서 자궁각을 적출하십시오.뿔을 37 °C의 DPBS로 옮기고 배아를 제거합니다. 배아를 100 mm 디쉬로 옮깁니다. 과잉 조직을 제거하고 따뜻한 DPBS로 세척합니다.이제 현미경 하에서 사지, 내장 기관 및 뇌가 포함된 머리 윗부분을 제거합니다. 꼬리 또는 머리 부분은 유전형 분석(genotyping)에 사용할 수 있습니다. 남은 조직을 별도의 접시에 옮겨 최소 1분 동안 잘게 다집니다.한 배아 집단(litter) 내에서 유전형이 달라야 하는 경우, 유전형을 혼합하지 마십시오. 잘게 다진 조직을 1x trypsin EDTA로 덮고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 그 다음, 10 mL의 complete mes medium을 추가합니다.반응을 중단시키려면 피펫으로 조직을 풀어준 다음, 생성된 현탁액을 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 튜브에 배지를 가득 채우고 내용물이 가라앉도록 둡니다. 그런 다음 부유 세포를 데칸테이션하여 제거합니다.다음으로, 현탁액을 300 Gs에서 5분 동안 원심 분리합니다. 실온에서, 배아당 6 mL의 완전 배지로 펠렛을 재현탁합니다. 생존 가능한 유핵 세포 수는 배아당 약 500만 개여야 합니다.그 다음 60 mm 플레이트에 3 mL의 세포 현탁액을 분주하고 배양합니다. 다음 날 배지를 교체하고 세포가 완전히 밀집될 때까지 배양합니다. 세포를 계대 배양하면 섬유아세포만 살아남게 됩니다.합류된 플레이트를 35 mm 유리 바닥 디쉬로 분할하십시오. 이 디쉬들을 50~70% 합류도까지 배양한 후 transfection을 진행하십시오.35mm 디쉬당 transfection을 위해 3µg의 정제된 plasmid를 준비합니다. 시판되는 transfection 키트를 사용하면 충분합니다. 본 예시에서는 RAs gap을 발현하는 벡터를 사용하였습니다.SSH three domain binding protein을 트랜스펙션합니다. 이는 스트레스 과립의 중요한 구성 요소입니다. 이 절차는 당연히 펍(pup)을 수확하기 전날 섬유아세포에서 관심 있는 모든 벡터를 연구하는 데 적용할 수 있습니다.Pauline lysine 코팅 디쉬를 준비하려면, 먼저 18.5 DPC 임신모로부터 배아를 수집하여 큰 디쉬의 HBSS로 옮깁니다. 원하는 경우, 모체의 희생을 방지하기 위해 신생 자손으로 대체할 수 있습니다. 머리를 절단하고 뇌를 적출합니다.그 다음, 현미경 하에서 HBSS가 담긴 깨끗한 접시에 새끼 쥐의 뇌를 채취합니다. 미세 핀셋을 사용하여 모든 뇌수막을 제거합니다. 그런 다음 해마와 같이 필요한 뇌 부위를 분리합니다.조직을 15 mL 튜브에 담긴 4.5 mL의 차가운 HPSS로 옮기고 얼음 위에 둡니다. 0.5 mL의 2.5% trypsin 용액을 첨가하여 조직을 소화시킵니다. 37 °C에서 15~20분 동안 배양합니다.그 다음, 조직이 손실되지 않도록 주의하며 HBSS로 세 번 세척하여 트립신을 제거합니다. 이제 10% FBS가 포함된 DMM 0.5~1 mL에 조직을 다시 부유시킵니다. 그런 다음 피펫을 통해 조직을 통과시켜 균질화합니다.그 다음 200 µL 팁으로 교체하고 가시적인 응집체가 없을 때까지 용액을 파이펫팅합니다. 이어서, DMM FBS 배지가 준비된 35 mm 글라스 바닥 디쉬에 세포 현탁액 100~200 µL를 첨가하고 디쉬를 배양합니다. 3시간 동안 배양한 후, 남은 배양 시간 동안 배지를 미리 데워둔 neuron complete media로 교체합니다.5~14일 동안 배양한 후, 인산칼슘법을 사용하여 뉴런을 형질전환합니다. 형질전환이 성공적으로 이루어진 24시간 후에 G3BP 과발현으로 인해 스트레스 과립이 조립되기 시작합니다. 추가적인 스트레스는 스트레스 과립의 조립을 더욱 유도합니다. 스테이지를 37 °C로 가열하는 것을 포함하여, 공초점 현미경 구성 요소를 최소 20분 동안 예열하십시오.세포를 시각화하기 직전에 35mm 플레이트 홀더가 필요합니다. 다음과 같이 수행하십시오. 먼저, phenol red가 포함된 세포 배지를 phenol red가 없는 배지로 교체하십시오.즉시 세포 이미징을 시작하십시오. 스트레스 과립은 한 시간 이내에 형성되므로, 세포 시각화 이후에 스트레스를 유도해야 합니다. 스트레스 유도 후 가능한 한 빨리 획득을 시작하는 것이 중요하며, 세포 유형과 단백질 유형에 따라 두 가지 매개변수를 정밀하게 조정하십시오.세포 독성을 줄이기 위해 레이저 강도와 획득 시간을 모두 낮춥니다. 다음으로, 40 x 및 63 x 오일 침강 렌즈로 세포를 관찰합니다. 플레이트가 홀더에 평평하게 놓였는지 확인하고, 형광 조명 사용을 최소화하십시오.관심 영역을 찾았다면, 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득하십시오. 레이저 출력은 10% 이하로 시작하고, 가능한 최적의 신호 대 잡음비를 얻도록 게인(gain)과 오프셋(offset)을 설정하십시오. 세포의 레이저 노출을 최소화하기 위해 1000 hertz로 스캔하고, 질병 스택을 원하는 대로 설정하며, 배양 상태를 더 잘 유지하기 위해 스캔 간격을 가능한 한 길게 유지하십시오.MEF에서는 10분 이내에 과립 형태가 형성되며 1시간 이내에 명확하게 관찰되므로, 필요한 만큼 데이터를 수집하십시오. 뉴런에서는 이 과정이 조금 더 느리게 진행됩니다. 설명된 기술을 사용하면 G3BP는 최소 45분 동안 충분히 강한 신호를 제공할 것입니다.배양 세포에서 스트레스 과립 형성을 관찰하였습니다. G3BP 태그 단백질의 국소화는 배양된 생쥐 세포의 세포질에서 확산되어 있었으며, 뉴런의 세포질에서도 마찬가지로 확산되어 있었습니다. 아소나이트(arsenite) 처리 시, 두 세포 유형 모두에서 단백질이 명확하고 더 큰 초점으로 국소화되었습니다.이것들이 스트레스 과립입니다. 촬영된 이미지들은 타임랩스 영상으로 재구성할 수 있습니다. 첫 번째와 두 번째 영상은 스트레스에 반응하는 섬유아세포를 보여줍니다.세 번째 영상에서도 동일한 결과가 나타납니다. 해마 뉴런에서 Zack 재구성법을 통해 표지된 G three B bp의 3D 위치를 파악할 수 있으며, 이를 통해 추적에 대한 다른 관점을 얻을 수 있습니다. 이 절차를 거친 후, 면역세포화학법을 사용하여 다양한 종류의 스트레스 상황 및 자체 고정 후의 과립 성분을 시각화할 수 있습니다.이를 통해 다양한 조건에서 서로 다른 세포체의 크기와 수에 관한 정량적 질문에 답할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이러한 세포 마이 그 레이션으로 세포 프로세스 전통적으로 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에 연구하고 있습니다. 이 보고서는 직접 단백질 지방화를 시각화하고보다 생리학 관련, 3 차원 매트릭스에서 마이 그 레이션 세포의 단백질 역학을 분석하는 기술을 설명합니다.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

이 비디오는 mRNA, RNA 결합 단백질(RBP) 및 기타 다양한 단백질로 구성된 포유류 스트레스 과립을 특성화하고 정량화하기 위한 분석을 보여줍니다.

포유류 스트레스 과립을 특성화하고 정량화하기 위한 면역형광 분석

심근세포의 세포주기 변이와 세포 분열을 구별하기 위해 심근세포 핵의 명확한 식별을 위한 Myh6-H2B-mCh 형질전환 마우스와 세포 분열과 세포주기 변이를 구별하기 위한 CAG-eGFP-아닐린 마우스의 두 가지 형질전환 마우스 라인을 사용하는 프로토콜을 제시합니다.

출생 후 심근 세포의 세포주기 변화의 시각화 및 핵의 결정

우리는 세포가 박테리아와 여러 가지 스트레스에 도전을받은 후 포유류 세포에서 스트레스 과립 형성의 정성 및 정량 분석 ​​방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 광범위한 호스트 - 박테리아 상호 작용에서 세포 스트레스 과립 반응을 조사하는 데 적용 할 수 있습니다.

포유류 세포의 박테리아 감염 후 스트레스 과립 형성의 면역 형광 분석

스트레스 과립 (SGs)은 다양한 스트레스에 노출 된 세포에서 형성되는 비 세포 성 세포질 구조입니다. SG는 mRNA, RNA 결합 단백질, 작은 리보솜 서브 유닛, 번역 관련 인자 및 다양한 세포 신호 전달 단백질을 포함한다. 이 프로토콜은 선량있는 SG를 탐지, 특성화 및 정량화하기위한 몇 가지 실험적 방법을 사용하는 워크 플로를 설명합니다.

포유류 스트레스 과립으로 세포질 초점을 분류하는 방법

라이브 셀 이미징 고정된 셀 이미징 혼자 여 달성 하지 않은 단일 셀 이나 전체 인구에 풍부한을 정보를 제공 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 프로토콜 안티 mitotic 마약 paclitaxel와 치료 다음과 세포 운명 결정을 평가 하는 설명 합니다.

장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

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유사 분열 동안 염색체 분리의 라이브 셀 이미징

여기에서 우리는 스핀들 형성 및 유사분열 진행의 역학을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 타임랩스 이미징을 적용하면 사용자가 유사분열의 다양한 단계에서 세포를 식별하고, 유사분열 결함을 추적 및 식별하며, 항 유사분열 약물에 노출될 때 스핀들 역학 및 유사분열 세포 운명을 분석할 수 있습니다.

미토틱 스핀들 교란에 따른 메타페이즈 타이밍 및 세포 운명의 역학을 평가하기 위한 라이브 셀 이미징

중요한 형광 염료는 현대 곰팡이 세포 생물학에 있는 살아있는 세포 화상 진찰 분석을 위한 필수적인 공구입니다. 이 논문은 필라멘트 균류에서 플라즈마 막 역학, 내분비 / 외신 세포증 및 세포 벽 형태 형성을 추적하기위한 확립되고 덜 알려진 형광 염료의 응용 프로그램에 대해 자세히 설명합니다.

필라멘트 곰팡이의 살아있는 세포 이미징을 위한 막 및 세포벽 선택적 형광 염료의 적용

우리는 형광 현미경 이미지의 특정 세포 구획에서 세포 체의 신속한 탐사와 정확한 분석을 위해 구축 된 자유롭게 사용할 수있는 워크플로우를 제시합니다. 이 사용자 친화적인 워크플로우는 오픈 소스 소프트웨어 Icy에서 설계되었으며 ImageJ 기능을 사용합니다. 파이프라인은 이미지 분석에 대한 지식없이 저렴합니다.

하위 구조 분석기: 형광 현미경 이미지에서 세포 체의 신속한 탐색 및 정확한 분석을 위한 사용자 친화적인 워크플로우

다음 프로토콜은 세포주기 동기화 후 RPA2 면역형광 염색을 사용하여 세포주기의 G1 단계에서 단일 가닥 DNA 병소를 검출하는 방법을 제시합니다.

세포 주기의 G1 단계에서 단일 가닥 DNA 병소 시각화

배우세요 라이브 일차 세포에서 G3BP 스트레스 과립의 형성과 역학을 공초점 현미경으로 시각화하는 방법을. 이 기법은 신경세포 스트레스 반응 메커니즘 연구에 필수적입니다.

라이브 일차 전지에 G3BP 스트레스 과립 역학의 시각화

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