처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 주 화성을 측정하기위한 미세 유체 플랫폼

이 미세유체 기술은 다중화될 수 있는 플랫폼에서 한 방울의 혈액에서 직접 인간 호중구의 기능을 측정하는 것을 목표로 합니다. 중앙 로딩 챔버는 전혈 공급원 역할을 하며 16개의 국소 화학주성 챔버에서 형성되는 화학 유인 구배를 위한 싱크 역할도 합니다. 적혈구의 독특한 기계적 여과 기능을 통해 혈액, 세포 및 생화학적 구성 요소의 자연적인 맥락에서 호중구의 기능을 조사할 수 있습니다.

국소 화학주성 챔버로 이어지는 채널과 장치를 빠져나가는 채널 사이의 분기는 이동하는 호중구의 방향성을 정량화하고 조절할 수 있습니다. 따라서 결과는 얼마나 활발하게 이동하는 호중구가 갇힌 적혈구를 지나 쉽게 이동하고 시간이 지남에 따라 숫자가 축적되는지를 보여줄 수 있습니다. 당사의 미세유체 장치의 독특한 특징 중 하나는 제조 및 설정이 매우 쉽다는 것입니다.

이들은 유리 바닥, 단일 또는 다중 웰 플레이트에 접착하는 마이크로 가공 웨이퍼에 주조된 PDMS 층으로 구성됩니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 전혈 한 방울만 필요하다는 것입니다. 이 장치는 표준 피펫과 함께 사용할 수 있고, 움직이는 부품이 없으며, 튜브 또는 외부 주사기 펌프가 필요하지 않습니다.

이 기술의 의미는 기존 기술에 필요한 것과 비교하여 임상 적용으로 확장됩니다. 당사의 접근 방식은 혈액 채취 시점부터 호중구 이동 분석까지 몇 분이 걸립니다. 새로운 적혈구 필터링 빗은 적혈구가 호중구의 활발한 이동을 차단하는 것을 방지하고 이 방법을 다른 미세유체 방법과 차별화합니다.

이를 위해서는 화학 요법이 수행되기 전에 혈액을 제거해야 합니다. 적혈구와 채널의 기계적 재밍은 우리의 기술을 차별화하고 혈청과 혈소판을 포함한 전혈의 생리학적 환경에서 호중구를 테스트할 수 있게 합니다. 따라서 기술은 정확하고 사용하기 쉬우며 건강과 질병에서 호중구와 C 선천성 면역 체계의 역할에 대한 이해를 크게 향상시킬 수 있습니다.

마스터 금형 웨이퍼를 제작하여 제조업체 First pattern의 지침에 따라 마이그레이션 채널을 정의합니다. 처음 3 미크론 에폭시 기반 네거티브 포토레지스트 층은 두 번째 50 미크론 층을 패턴화하여 세포 로딩 및 케모카인 챔버를 정의합니다. 이제 폴리메틸 소안 장치를 캐스팅하기 위해 20g의 PDMS와 2g의 개시제를 5분 동안 격렬하게 혼합합니다.

PDMS를 패턴화된 웨이퍼에 조심스럽게 붓고 진공 건조에서 1시간 동안 Degas를 건조시킵니다. 그런 다음 PDMS 미세유체 장치를 섭씨 65도 오븐에서 최소 3시간 동안 굽고 경화시킵니다. PDMS가 올바른 온도에서 베이킹되도록 하려면 온도계로 내부 오븐 온도를 모니터링해야 합니다.

직경 1.5mm의 중앙 전혈 로딩 챔버를 펀칭합니다. 또한 직경 5.0mm의 도넛 모양 장치를 통째로 펀칭합니다. 접착 테이프를 사용하여 도넛 장치에서 입자를 제거합니다.

다음으로, 멀티 웰 플레이트를 탈이온수로 헹구고 플레이트를 섭씨 60도 오븐에 5분 동안 넣은 후 질소로 건조시킵니다. 35초 동안 산소 플라즈마 치료를 합니다. 그런 다음 도넛 장치와 산소 플라즈마를 추가합니다.

35초 더 치료합니다. 장치를 플레이트의 웰로 조심스럽게 옮기고 섭씨 80도 핫 플레이트에서 접착 된 장치로 10 분 동안 굽습니다. 산소 플라즈마 처리 후 장치는 친수성이며 모세관 효과는 장치의 작은 채널의 프라이밍을 촉진할 수 있습니다.

화학요법 유인 용액의 경우, 5마이크로리터의 10마이크로몰 FMLP를 5마이크로리터의 피브로넥틴 1밀리리터 및 490마이크로리터의 HBSS와 혼합합니다. 화학 유인 용액을 전혈 로딩 챔버 피펫에 천천히 피펫으로 넣고 장치 외부 주위에 화학 유인제 20 마이크로 리터를 추가로 주입합니다. 플레이트를 건조제에 15분 동안 놓습니다.

장치에 진공을 적용하여 장치를 화학 유인 용액으로 프라이밍합니다. 건조제에서 플레이트를 제거하고 기포의 크기를 점차적으로 감소시켜 장치 채널의 습윤을 확인합니다. 그런 다음 전혈 로딩 챔버와 장치 외부를 철저히 세척하여 과도한 화학 유인 용액을 제거합니다.

다음으로, 각 국소 화학주성 챔버에서 장치 센터로의 화학 유인제의 구배를 생성합니다. 100마이크로리터의 PBS를 구멍에 부드럽게 주입하여 장치 상단에 PBS 방울이 형성되도록 합니다. 플레이트를 기울이고 장치 주위로 PBS 1ml를 피펫팅하여 웰 바닥에 모으고 액체를 흡인하고 PBS 세척을 세 번 반복합니다.

다음으로, 각 웰을 미디어로 채워 장치를 담그고 그라디언트가 안정화될 때까지 15분 동안 기다립니다. 그런 다음 2마이크로리터의 전혈을 각 전혈 로딩 챔버에 천천히 피펫으로 넣으십시오. 손가락으로 찌르는 혈액을 채취하려면 비누와 물로 손을 씻으십시오.

항응고제 얼룩 용액으로 피부를 건조시킵니다. 1 밀리리터의 0.2 % HSA와 10 마이크로 리터의 32.4 마이크로 몰 후크를 추가합니다. 헤파린 채혈 튜브에 얼룩이 생긴 후 건강한 헌혈자의 손가락을 찌르고 첫 번째 혈액 한 방울을 닦아냅니다.

항응고제 염색 용액에 50마이크로리터의 혈액을 모으고 부드럽게 섞습니다. 바이오 챔버를 섭씨 37도, 습도 80%, CO2 5%로 설정합니다.의미 있는 통계 분석을 위해 10배 이상의 배율에서 타임 랩스 이미징을 즉시 시작하고 각 샘플에서 최소 50개의 호중구를 수동으로 추적합니다.

시간이 지남에 따라 국소 화학주성 챔버에 들어가는 세포를 세십시오. 그런 다음 이미지 J를 사용하여 WBLC와 FCC 사이의 채널에서 호중구 속도를 계산합니다. 그런 다음 호중구의 방향성을 정량화하기 위해 분기를 통과하는 세포의 수를 세고 국소 화학주성 챔버 쪽으로 향하는 세포의 수와 장치를 빠져나가는 세포 사이의 비율을 계산합니다.

방향성이 없는 세포는 화학주성 구배(chemotactic gradient)를 따르지 않기 때문에 FCC와 출구 채널을 향해 동일한 수로 이동합니다. 이 실험에서 전혈 호중구 화학주성 분석법은 FMLP 구배를 향한 호중구 축적을 측정하여 검증되었습니다. 결과는 적혈구가 여과 빗에 갇혀 있는 반면 호중구는 전혈에서 활발하게 이동할 수 있음을 확인했습니다.

전혈 미세유체 장치에 의해 형성된 안정적인 선형 화학 유인 구배는 FSE 표지 덱스트란을 사용하여 확인하고 시간 경과에 따른 형광 수준을 측정했습니다. 새로운 WB Chemotaxis 플랫폼을 사용하여 얻은 결과는 모든 혈액 공급원의 호중구가 일정한 속도와 유사한 총 이동 세포로 이동하는 것을 보여줍니다. 중요한 것은 이 시스템을 통해 호중구를 정량화할 수 있으므로 화학주성과 화학요법 Kinesis를 구별할 수 있다는 것입니다. 이 기술을 마스터하면 적절하게 수행되면 10분 이내에 완료할 수 있습니다.

표준 클린룸 기술, 시설, 여러 조건을 동시에 스크리닝하는 12 또는 24웰 플레이트에 장치를 통합합니다. 이 기술을 사용하여 단일 세포 수준에서 호중구 속도와 방향성을 측정할 수 있습니다. 벌크 종말점 세포 이동을 측정하는 기존 방법과 달리, 적혈구가 장치의 com을 지나가지 않도록 미세유체 장치를 조심스럽게 프라이밍하고 두 샘플을 천천히 로드하는 것을 잊지 마십시오.

설명된 프로토콜은 일시적인 호중구 화학주성 결핍을 측정하는 데 특히 유용하며, 여러 시점에 걸쳐 반복적인 샘플링을 가능하게 할 뿐만 아니라 다른 모델 유기체에서 다른 세포 유형의 이동을 측정하는 데에도 적용할 수 있습니다. 이 방법은 외상 환자, 주요 수술 후 환자 및 화학 요법을 받는 암 환자를 포함하여 감염 발병률 증가와 관련된 다양한 상태를 가진 환자에서 호중구 기능의 일시적인 변화에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.