Name: 처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 주 화성을 측정하기위한 미세 유체 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 배우세요 미세유체칩을 이용해 처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 화성을 측정하는 방법을. 이 기술은 적혈구 여과 없이 빠르게 호중구 이동성과 방향성을 정량화하여 임상 진단과 면역 연구에 활용됩니다.

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건강의 국립 연구소에서 지원하고 이너스 화상 병원 (GM092804, DE019938을 부여합니다.)

1. 미세 유체 디바이스 제조 <ol><li> 표준 포토 리소그래피 기술을 이용하여, 클래스 1000 청정실 마스터 몰드 웨이퍼를 제조. 본 제조자의 지시에 따른 이동 채널을 정의하는 제 3 μm의 얇은 에폭시 계 네거티브 포토 레지스트 층. 패턴 셀 로딩 및 케모카인 챔버를 정의하는 두 번째 50 μm의 두꺼운 층. </li><li> 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 장치를 캐스팅 패턴 웨이퍼를 사용합니다. 적극적 큰 플라스틱 무게 트레이에 플라스틱 포크를 사용하여 5 분 동안 개시 (2g)와 PDMS (19 g)을 혼합. </li><li> 조심스럽게 금형에 PDMS를 붓는다. </li><li> 1 시간 동안 진공 데시 케이 부어 PDMS와 금형을 배치하여 PDMS를 탈기. </li><li> 빵을 65 ° C로 설정 오븐에서 적어도 3 시간 동안 PDMS 마이크로 유체 장치 치료 </li><li> 1.5 mm의 선단 직경 펀칭기를 사용하여 중앙 WBLCs 펀치 아웃. </li><li> punc를 사용하여 전체 도넛 모양의 장치를 펀치5.0 mm의 팁 직경을 가진 그녀. </li><li> 접착 테이프를 사용하여 도넛 장치에서 입자를 제거합니다. </li><li> 탈 물과 질소로 다음 건조로 12 - 웰 플레이트를 씻어. 5 분 60 ° C 오븐에서 접시를 놓습니다. </li><li> 산소 플라즈마는 두 번 12 - 웰 플레이트를 치료; 한 번 단독으로 35 초 후 다시 다른 35 초 동안 도넛 장치. </li><li> 조심스럽게 핀셋을 사용하여 판의 우물에 장치를 배치합니다. </li><li> 10 분 동안 80 ° C로 설정 핫 플레이트에 결합 장치와 빵 접시. </li></ol> 2. 미세 유체 분석 준비 <ol><li> 즉, 산소 플라즈마 처리 후 프라임 미세 유동 장치 장치가 친수성 ​​모세관 효과 장치에서 작은 채널 프라이밍을 촉진 할 수있을 때. </li><li> 5 ㎕의 피브로넥틴 [원액을 1 ㎎ / ㎖] 490 ㎕의 HBSS에 5 μL fMLP [원액 10 μM]을 혼합하여 화학 유인 물질 솔루션을 만듭니다. </li><li> 천천히 피펫 &amp; #160; WBLC에 화학 유인 물질 용액, 젤 로딩 팁 (그림 1A)를 사용하여. 장치의 외부 주변 화학 유인 물질의 피펫은 추가적인 20 μL. </li><li> 15 분 동안 건조기에서 접시를 놓습니다. 장치에 진공을 적용하여, 용액 장치와 PDMS 통해 확산 된 공기의 사이드 채널로 주입된다. </li><li> 데시 케이 터에서 접시를 제거하고 현미경 장치 채널의 습윤을 확인합니다. 화학 유인 물질 용액 챔버를 입력으로 거품이 작아짐 손목 시계. 아무 거품은 진공 처리 후 장치 내에서 본 제품을 장착 할 수 없습니다. </li><li> WBLC 세척 장치의 외부에 철저를 초과하는 화학 유인 물질 솔루션을 제거 할 수 있습니다. 이 단계는 디바이스 중심 초점 화학 주성 챔버 (FCCS) 각각으로부터 화학 유인 물질의 구배를 생성한다. <ol><li> 주사기에 30 G 무딘 바늘 팁을 추가, PBS로 1 ML의 주사기를 채우십시오. 온화있는 주사기의 바늘 끝을 삽입도넛 구멍의 중심에. 조심스럽게 구멍에 PBS 100 μl를 밀어 있도록 장치의 상단에 PBS 형태의 물방울. </li><li> 장치 주변의 PBS의 경사판 피펫 1 ㎖ 액체 웰의 바닥에 수집되도록. 대기음 (분리 된 호중구가 미디어에로드 할 경우 대신 버퍼의 사용 미디어) 신선한 완충 용액을 사용하여 3 배의 총 액체 반복 과정 9. </li></ol></li><li> 장치의 정상 액체에서 침수 될 때까지 미디어와 잘 각을 입력합니다. 장치가 그라데이션이 안정 될 수 있도록 15 분 동안 앉아 보자. 실험 결과와 유한 요소 시뮬레이션 이론적 데이터는 이러한 장치의 그라데이션이 작은 분자 (예를 들면, fMLP)과 큰 분자량 (예를 들어, IL8)에 대한 몇 가지 일 최대 24 시간까지 안정되어 있음을 보여줍니다. </li><li> 젤 로딩 팁을 사용하여, 천천히 각 전혈 LOA에 2 ㎕의 혈액 (또는 고립 된 호중구를) 피펫딩 챔버 (WBLC) (그림 1A). </li></ol> 3. 샘플 준비 모세관 혈액에서 인간의 호중구 <ol><li> 아니 면역 억제제에 건강한 자원 봉사의 손가락 찌르기에서 모세관 혈액을 수집합니다. 모든 환자의 샘플을 작성 동의서를 얻을, 그리고 MGH와 라이너스 기관 검토 보드의 승인 절차를 통해되었습니다. <ol><li> 손가락 찌르기 혈액 수집을 위해, 물과 비누로 손을 씻어 피부를 건조. 혈액 수집 관 (1.65 USP/50 ㎕의 혈액을) 헤파린에 1 ㎖의 HBSS + 0.2 % HSA 10 μL 훽스트 얼룩 (32.4 μM)를 추가하여 anti-coagulant/stain 주식 솔루션을 준비합니다. 혈액의 첫 번째 드롭을 닦아 부드럽게 주식 항응고제 및 훽스트 형광 염색 용액 (10 μL) 등을 포함하는 에펜 도르프 튜브에 혈액의 50 μl를 수집, SurgiLance 안전 바소 (2.2-mm의 깊이, 22 G)를 사용하여 손가락을 찔러 혼합. </li></ol></li&gt; <li> 핵 형광 염색 수 있도록 10 분 동안 혈액과 훽스트 얼룩을 품어. 혈액 수집의 1 시간 이내에 샘플을 실행합니다. </li></ol> 정맥 혈액에서 인간의 호중구 <ol start="3"><li> 33 USP 헤파린을 포함하는 튜브에 말초 정맥 혈액 10 ㎖를 그립니다. </li><li> 전술 한 바와 같이 미디어와 헥스 얼룩에 정맥 혈액의 50 μl를 추가합니다. 핵 형광 염색 수 있도록 10 분 동안 혈액과 훽스트 얼룩을 품어. 혈액 수집의 1 시간 이내에 샘플을 실행합니다. </li></ol> 전체 혈액에서 호중구의 분리 - 긍정적 인 제어 <ol start="5"><li> , 호중구를 분리 헤 타스 타치를 사용하여 10 ㎖ 정맥 전체 혈액 샘플에서 호중구를 분리하기 위해 무균 기술을 사용하려면 (6 % W / V) 제조 업체의 프로토콜을 다음과 같은 음의 선택 자기 비드 분리 키트 다음에 밀도 구배. </li><li> concentr에서 호중구의 최종 나누어지는 재현 탁1X HBSS + 0.2 % 인간 혈청 알부민 / μL 4,000 세포의 ATION. 실험을 실행할 준비가 될 때까지 37 ° C에서 세포를 유지합니다. </li></ol> 호중구 화성 측정을위한 4. 현미경 및 이미지 분석 <ol><li> 5 %에서 37 ° C, 80 %의 습도 및 CO 2 biochamber 온도를 설정합니다. </li><li> 현미경 (10 배 이상 확대)에 시간 경과 이미징을 사용하여 즉시 이미징 시작합니다. </li></ol> 5. 통계 분석 <ol><li> 수동으로 각 샘플의 적어도 50 호중구를 추적 할 수 있습니다. </li><li> 시간이 지남에 따라 FCC들이 세포 (도 2)를 카운트. </li><li> ImageJ에 (NIH) (그림 2)를 사용하여 WBLC 및 FCC 사이의 채널에서 호중구의 속도를 계산합니다. </li><li> 분기점을 전달 세포의 수를 카운트하고 종료 번째 FCC와 세포를 향해 회전하는 셀의 수 사이의 비율을 계산하여 호중구의 방향성을 정량화전자 장치. 방향없는 세포는 화성의 기울기를 따라 때문에 FCC 및 출구 채널 (그림 2)을 향해 동일한 개수의 마이그레이션되지 않습니다. </li></ol>

<ol><li>Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and atherosclerosis.</a> Annual review of pathology. 1, 297-329 (2006).</li>
<li>Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neutrophil+in+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">The neutrophil in vascular inflammation.</a> Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).</li>
<li>Butler, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burn+injury+reduces+neutrophil+directional+migration+speed+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices.</a> PloS one. 5, (2010).</li>
<li>Lavrentieva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+markers+in+patients+with+severe+burn+injury.+What+is+the+best+indicator+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Burns+%3A+journal+of+the+International+Society+for+Burn+Injuries%22%5BJournal%5D)">Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis.</a> Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).</li>
<li>De Filippo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+and+macrophage+chemokines+CXCL1%2FCXCL2+control+the+early+stage+of+neutrophil+recruitment+during+tissue+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation.</a> Blood. 121, 4930-4937 (2013).</li>
<li>Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+serum+heat+treatment+on+chemotaxis+and+phagocytosis+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Palabrica, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+accumulation+promoting+fibrin+deposition+is+mediated+in+vivo+by+P-selectin+on+adherent+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets.</a> Nature. 359, 848-851 (1992).</li>
<li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+kit-on-a-lid%3A+a+versatile+platform+for+neutrophil+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays.</a> Blood. 120, (2012).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chambers+for+monitoring+leukocyte+trafficking+and+humanized+nano-proresolving+medicines+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).</li>
<li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).</li>
<li>Lyons, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+human+leucocyte+subsets%3A+the+advantages+of+positive+selection+and+rapid+purification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification.</a> BMC genomics. 8, (2007).</li>
<li>Hasenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immunomagnetic+negative+enrichment+of+neutrophil+granulocytes+from+murine+bone+marrow+for+functional+studies+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo.</a> PloS one. 6, (2011).</li>
<li>Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+assay+from+a+drop+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration assay from a drop of blood.</a> Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).</li>
<li>Hoang, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+neutrophil+speed+and+directionality+during+chemotaxis%2C+directly+from+a+droplet+of+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood.</a> Technology. 0, 1-9 (2013).</li>
<li>Kurihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+D2+restores+neutrophil+directionality+and+improves+survival+after+burns%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal+%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).</li>
<li>Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+function+in+surgical+patients.+Relationship+to+adequate+bacterial+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses.</a> Arch Surg. 119, 39-43 (1984).</li>
<li>Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+inhibition+of+chemotaxis+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).</li>
</ol>

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이 작품에서 우리는 혈액의 액체 방울 (2 μL)에서 호중구의 화학 주성을 측정 할 수있는 미세 유체 플랫폼을 개발했다. 적극적으로 호중구를 마이그레이션에서 적혈구의 온 - 칩 기계적 여과는 호중구를 활성화하여 유물을 소개하는 경향이 이러한 밀도가 10 그라디언트 등의 번거로운 세포 분리 방법, 긍정적 인 선택 (11), 또는 음의 선택 (12)에 대한 필요성을 우회. 적혈구의 기계적 여과는 호중구의 이동을 프로빙 다른 미세 유체 칩에서 우리의 기술을 구분합니다. 예를 들어, 우리가 실험실 13에서 이전 작품 비비 등. 전에 화성 분석에 전체 혈액 샘플에서 호중구를 분리하는 칩 8 이용 셀렉틴. 셀렉틴 표면에서 분리 한 후, 호중구의 이동은 완충 용액에서 발생했습니다. 이러한 조건에서, 호중구의 화학 주성에 혈청의 효과가 제거되었습니다. 더욱이, 셀렉틴이 알려져있다특정 수용체와 결합하여 세포를 활성화하기 때문에 <...

<html> 호중구의 인신 매매는 죽상 경화증 1, 세균 감염이나 패혈증 2을 (를) 포함하여 많은 염증성 질환의 진행과 해상도를 결정하는 중요한 역할을하고, 부상 3을 구울 수 있습니다. 건강과 질병 상태에 대한 그들의 큰 기여를 들어, 호중구는 종종 임상과 연구 실험실에서 고려 된 표준 혈액 분석의 일부입니다. 그러나, 대부분의 유비쿼터스 테스트 중 하나, 감염과 패혈증의 진단에 호중구의 가치에도 불구하고 자주 4 의문을 제기하고있다. 예를 들어, 화상 환자의 호중구의 한 연구는 호중구 수와 호중구 마이그레이션 기능은 상관 관계가없는 것으로 나타났습니다; 그 호중구 혼자 계산 의미하는 것은 면역 상태 3의 정확한 표시되지 않습니다. 측정하기 더 어렵게되지만, 호중구 기능적 능력 조건의 넓은 범위에서보다 가치로서 제안되었다. t는 &quot;&gt; 중요한 것은, 호중구 결함의 대부분은 일시적이며 영구적 인 유전 적 결함, 대부분 최근까지 병원에서 간과 된 차이에 의해 실행되지 않습니다. 화상 부상의 맥락에서, 호중구 이주의 과정을 모니터링 할 수 염증 상태 또는 감염 3의 지표로서 환자의 치료는 혈액의 대용량을 필요로하기 때문이다. 현재 실험실 (보이 덴 챔버 던 챔버, 마이크로 피펫 분석)에 사용 된 전통적인 이동 분석법은 임상로 변환 할 수없는 번거로운 시간 소모적 호중구의 분리에 필요한 혈액의 양이 하나의 샘플 수 및 종종 심지어 풀링 필요하기 때문에 호중구의 분리 기법 (표 1). 이러한 분석법은 또한, 예컨대 생쥐 같은 작은 실험실 동물의 호중구 화학 주성에서 일시적인 변화를 모니터링하기 위해 사용될 수 없다 하나의 분석에 대해 여러 동물의 피. 예를 들어, 관련된 연구는 M여러 시간 지점에 ultiple 조건과 치료는 잠재적으로 현재 화성 분석을 사용하여 마우스의 수천을 필요로 할 수 있습니다. 이 부상, 감염의 맥락에서 면역 기능의 복잡한 역학을 이해하거나 자주 쥐 모델 5에서 공부를 레코딩 할 수있는 기본적인 생물학 연구를 제한합니다. 최소한의 혈액량을 요구하면서, 급속한 견고 호중구 기능적 분석을위한 필요성을 해결하기 위해, 우리는 전체 혈액의 작은 방울로부터 직접 호중구 주 화성을 측정 미세 유동 장치를 개발했다. 그것은 혈청 6 혈소판 7을 포함하여 전체 혈액에있는 많은 요인이, 호중구의 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 그것은 전혈 미세 분석은 시험 관내 분석으로 8 주 화성의 변동을 측정 할 때 호중구의 생체 내 미세 환경을 유지하는 시료 처리를 최소화하는 것이되므로 유리하다. 이 방법혈액 컬렉션에서 기존의 기술을 사용하여 시간에서 호중구 마이그레이션 분석에 시간이 줄어 듭니다 단지 분 (표 1)에. 전체 혈액의 미세 유체 플랫폼은 실험의 길이 안정적인 선형 화학 유인 물질 구배를 생성 움직이는 부분이 없으며, 외부 압력 소스 (즉, 주사기 펌프)를 필요로하지 않습니다. 전혈 마이크로 유체 장치의 디자인에서 중요한 특징은 기계적 장치의 이주 채널 입력에서 적혈구를 필터링 적혈구 (RBC) 여과 빗의 혼입이다. 이 여과 빗 우회전 가능성 적혈구 의해 막히는 것 크기 배제 여과의 필요성을 방지하고, 따라서 WB에서 적극적 마이그레이션 호중구 도달 화학 유인 물질 그라데이션 블록. 12 또는 24 - 웰 플레이트의 전체 혈액의 미세 유체 장치의 결합은 인간이나 쥐의 호중구의 화학 주성시의 여러 매개 물질의 검사를 용이하게로 섞고.

<table><tr><tbody><td colspan="4">Device Fabrication</td></tr><tr><td>SU-8</td><td>Microchem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>Sylgard 184 1.1 lb. Kit</td><td></td></tr><tr><td>표준 유리 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>125495 1 X 3 인치</td></tr><tr><td>유리 바닥 판</td><td>MatTek</td><td>P12G-1.5-14-F</td><td></td></tr><tr><td>해리스 유니 코어, 팁 직경 5.0 mm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15081</td><td></td></tr><tr><td>해리스 유니 코어, 팁 직경 1.5 mm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15072</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microfluidic Assay 준비 및 분석</td></tr><tr><td>젤 로딩 피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-139</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>Fisher Scientfic</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>블런트 팁 바늘, 30 G &frac12; in.</td><td>Brico Medical Supply</td><td>BN3005</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer, Heparin</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인간 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A5843-5G</td> HBSS 피브로넥틴<td>의 0.2% 최종 농도</td></tr><tr><td></td><td>시그마-알드리치</td><td>F0895-1MG</td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>시그마-알드리치</td><td>F3506-10MG</td><td></td></tr><tr><td>SurgiLance 안전 란셋, 2.2-mm 깊이, 22 G</td><td></td><td>SLN240</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht stain</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Positive Control</td></tr><tr><td>HetaSep</td><td>STEMCELL Technologies Inc.</td><td>7906</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 인간 호중구 농축 키트</td><td>STEMCELL Technologies Inc.</td><td>19257</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 Asher</td><td>March Instruments</td><td>P-250</td><td></td></tr><tr><td>Lindberg/Blue M 오븐</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-258-30C</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 정밀 핀셋</td><td>Techni Tool</td><td>758TW458</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Scienceware 내화학성 진공 탈착기</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>데이터플레이트 디지털 핫 플레이트</td><td>알파 멀티 서비스</td><td>PMC 720</td><td></td></tr><tr><td>니콘 TiE 도립 현미경</td><td>니콘 - Micro Video Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEA53100 CFI 계획 Fluor DL 10X NA 15.2 wd 객관적인</td><td>Nikon - 마이크로 비디오 악기 Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRH20101 Nikon Nikon용 2미터 라이트 가이드가 있는 Lumen 200</td><td>- Micro Video Instruments Inc.</td><td>500-L200NI2</td><td></td></tr><tr><td>DAPI / Hoechst / AMCA 협대역 32mm 여자-25mm 이미 터</td><td>크로마 - Micro Video Instruments Inc.</td><td>31013v2</td><td></td></tr><tr><td>Retiga R 2000 냉각 CCD 카메라 1,600 x 1,200 픽셀</td><td>Qimaging - Micro Video Instruments Inc.</td><td>레트-2000R-F-M-12-C</td><td></td></tr></tbody></table>

처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 주 화성을 측정하기위한 미세 유체 플랫폼

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

호중구가 혈액 감염과 그들의 숫자에 대한 보호에 필수적인 역할을 자주 병원에서 측정됩니다. 낮은 호중구 카운트 감염에 대한 높은 위험에 대한 경고 표시하는 동안 혈액에있는 높은 호중구의 수는 일반적으로 지속적인 감염의 지표입니다. 자신의 기능을 수행하기 위해, 호중구는 감염이 발생 조직으로, 그들의 생활의 대부분을 보내는 혈액에서 효율적으로 움직일 수있다. 따라서, 마이그레이션하는 호중구의 기능에 결함이 호중구가 혈액에 해당 번호에 존재하는 경우에도, 감염에 대한 위험을 증가시킬 수있다. 그러나, 병원에서 호중구의 이동 능력을 측정하는 것은, 시간이 소요되는 어려운 작업이며 많은 혈액의 양 및 전문 지식이 필요합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 circum, 처리되지 않은 혈액 한 방울을 요구하는 호중구의 이동에 대한 강력한 마이크로 유체 분석 설계호중구의 분리의 필요성을 통풍구 및 간단한 현미경 정량화하기 쉽다. 이 분석에서, 호중구 화학 주성의 소스를 향해 작은 경로를 통하여 혈액 방울에서 직접 이동한다. 같은 채널을 통해 적혈구의 세부적인 흐름을 방지하기 위해, 우리는 선택적으로 적혈구의 진행을 차단하는 것이집니다 직각으로 기계적인 필터를 구현했습니다. 우리는 손가락 찌르기와 정맥 혈액에서 수집 된 혈액 방울에서 호중구의 이동을 비교하여 분석을 확인. 우리는 또한 정제 된 호중구의 샘플에서 호중구의 마이그레이션이 전혈 (WB) 소스를 비교 세 가지 소스에 일관된 속도와 방향성을 발견했다. 이 미세 유체 플랫폼은 건강과 질병에서 호중구의 기능에 대한 우리의 이해를 발전에 도움이되는 병원과 연구 환경에서 인간의 호중구 이주의 연구를 가능하게 할 것이다.

전혈 (WB) 호중구 주 화성 분석은 fMLP 구배 (동영상 S1)쪽으로 호중구의 축적을 측정함으로써 입증 하였다. 결과는 호중구 (파란색)이 적극적으로 전혈 (그림 3a 및 영화 S1) 중 마이그레이션 할 수있는 동안 적혈구가 여과 빗에 의해 갇혀 있는지 확인합니다. 전혈 미세 유동 장치에 의해 형성된 안정 화학 유인 물질 선형 구배 (그린)를 FITC-표지 된 덱스 트란 (도 3a의 삽입)을 이용하여 확인하고 시간에 따른 형광 수준을 측정 하였다. 이러한 장치에서 생성 된 그라데이션 큰 분자량 작은 분자에 대한 24 시간까지 일주일까지 안정. 세척 프로토콜의 효율은 WBLC의 신호가 없으면 FCC에서 지역화 된 형광 신호를 영상화하거나 장치 주변에 의해 확인되었다. 장치는 다음에 다른 BL로부터 호중구 이동의 차이를 평가하기 위해 사용되었다짐 우드 소스. <p class="jove_content"...

이 프로토콜은 강력한 재현성 전체 혈액 한 방울에서 인간 호중구의 화학 주성을 측정하기위한 분석을 자세히 설명합니다. 이 접근법은 호중구의 분리의 필요성을 우회하고 분석 준비 시간의 몇 분을 필요로한다. 마이크로 유체 칩은 유아 또는 샘플의 양이 제한되어 작은 포유 동물에 시간이 지남에 따라 호중구의 화학 주성의 반복 측정을 가능하게합니다.

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

본 미세유체 기술은 다중 분석이 가능한 플랫폼 상에서 단 한 방울의 혈액으로부터 인간 호중구의 기능을 직접 측정하는 것을 목표로 합니다. 중앙 로딩 챔버는 전혈 공급원 역할을 하는 동시에 16개의 국소 화학주성 챔버에서 형성되는 화학 유인 물질 농도 구배의 싱크(sink) 역할을 합니다. 적혈구의 독특한 기계적 여과 과정을 통해 혈액의 세포 및 생화학적 성분이 존재하는 천연 환경 내에서 호중구의 기능을 탐색할 수 있습니다.초점 화학주성 챔버로 이어지는 채널과 장치에서 나가는 채널 사이의 분기점은 이동하는 호중구의 방향성을 정량화하고 조절할 수 있게 합니다. 따라서, 활발하게 이동하는 호중구가 포획된 적혈구를 쉽게 지나쳐 이동하며 시간이 지남에 따라 그 수가 축적되는 양상을 결과로 보여줄 수 있습니다. 저희 미세유체 장치의 한 가지 독특한 특징은 제조와 설정이 매우 쉽다는 점입니다.이 장치들은 유리 바닥의 단일 또는 다중 웰 플레이트 위에 결합된 미세 가공 웨이퍼 위에 캐스팅된 PDMS 층으로 구성됩니다. 이 기술의 주요 장점은 전혈 한 방울만 필요하다는 점입니다. 이 장치들은 표준 피펫과 함께 사용할 수 있으며, 가동 부품이 없고 튜빙이나 외부 시린지 펌프가 필요하지 않습니다.이 기술의 함의는 전통적인 기술이 필요로 했던 것과 비교하여 임상 응용 분야까지 확장됩니다. 본 연구의 접근 방식은 혈액 수집 시점부터 호중구 이동 분석까지 수 분밖에 걸리지 않습니다. 새로운 적혈구 여과 콤은 적혈구가 호중구의 활발한 이동을 방해하는 것을 방지하며, 이 점이 본 방법을 다른 미세유체 방법들과 차별화합니다.이는 화학요법 분석을 수행하기 전에 혈액을 제거해야 함을 의미합니다. 적혈구와 채널의 기계적 폐쇄(jamming)는 당사 기술의 차별점으로, 혈청과 혈소판을 포함한 전혈이라는 생리적 환경에서 호중구 테스트를 가능하게 합니다. 따라서 이 기술은 정밀하고 사용하기 쉬우며, 건강 및 질병 상태에서 호중구와 선천 면역 체계의 역할에 대한 이해를 크게 증진시킬 수 있습니다.제조사인 First pattern의 지침에 따라 마스터 몰드 웨이퍼를 제작하여 이동 채널을 정의합니다. 먼저 3 µm 두께의 에폭시 기반 음성 포토레지스트 층을 형성한 후, 두 번째 50 µm 층을 패턴화하여 세포 적재 및 케모카인 챔버를 정의합니다. 이제 폴리메틸실록산(Polymethylsiloxane) 소자를 캐스팅하기 위해 20 g의 PDMS와 2 g의 개

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜은 chemoeffectors의 안정적인 농도 기울기에 박테리아 chemotaxis 조사를위한 microfluidic 장치의 개발을 설명합니다.

안정적인 농도 기울기에 박테리아 Chemotaxis을 Quantifying위한 Microfluidic 장치

이 동영상은 all-on-chip 방법을 사용한 호중구 화학주성 분석을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 면역자기 음성 선택에 의해 전혈에서 호중구를 직접 분리한 후 미세유체 칩에서 화학주성 분석을 수행할 수 있습니다.

전혈을 이용한 신속한 호중구 화학요법 분석을 위한 미세유체 칩 기반 방법

감염의 사이트에서 활성화 된 내피 세포에 백혈구 준수는 호스트의 염증 반응의 중요한 구성 요소입니다. 수 있습니다 호중구 결합 분석은이 보고서에...

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

백혈구는 세포층 또는 세포 횡단 경로를 사용하여 내피 세포 단일 층을 교차. 우리는 내생 접합부의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1 백혈구 transendothelial 이주 중에 생리 흐름에 따라이 윤회 노선을 구별하기 위해 수행하는 간단한 분석을 개발했다.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

카메라 화학 주성 분석 화학 주성은 매개 세포 이동 방향을 제어하는​​ 방법에 진핵 세포의 이해에 필수적이다. 1) 실시간 다중 화학 주성 분석법 고해상도 모니터링 및 2)에 동시에 화학 유인 그라데이션 시각화 및 호중구와 같은 HL60 세포의 이벤트 신호의 시공간 역학 : 여기서는 대한 구체적인 방법을 설명한다.

이미징 G의 호중구와 같은 HL60 세포에서 화성과 시그널링 이벤트 수용체가 매개 단백질 결합

이 기사에서는 전혈에서 온 칩 호중구 분리와 단일 마이크로 유체 칩의 화학 주성 테스트를 통합하여 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을 수행하는 자세한 방법을 제공합니다.

혈액 방울로부터의 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을위한 올 온칩 (all-on-chip) 방법

림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

이 연구에서 임상 기도 분 비 물이 나선형 관성 마이크로의 폐쇄 루프 작업에서 레이블 없는 호 중구 분리 방법을 설명 합니다. 제안된 된 방법 분석 실험 임상 생체 외에서 다양 한 호흡기 질환에 대 한 확장 이라고 합니다.

폐쇄 루프 관성 마이크로 사용 하 여 환자 파생 기도 분 비에서 레이블 없는 호 중구 농축

개발에 집단 세포 이동, 상처 치유, 그리고 암 전이 종종 성장 인자 또는 신호 분자의 그라데이션에 의해 유도. 여기에 설명된 견인 현미경과 미세 유체 시스템을 결합한 실험 시스템과 생화학 구이도하에서 집단 이동의 역학을 정량화하는 방법에 대한 데모입니다.

화학적 집단 이동을 위한 미세 유체와 통합된 견인 현미경 검사법

이 프로토콜은 공간적으로 제어된 호중구 무리를 제공하는 생체 입자 마이크로어레이를 생성합니다. 그것은 호중구가 마이그레이션 하는 동안 해제 하는 중재자에 쉽게 액세스를 제공 하 고 정량적 이미징 분석을 허용 합니다.

생체 외에서 인간 호중구 떼의 화학 및 분자 분석을 위한 생체 입자 미세어레이

이 프로토콜에서는 생리학적으로 관련된 미세혈관 환경을 재현하고 전체 백혈구 부착/이동 캐스케이드를 재현할 수 있는 생체모방 미세유체 분석법이 염증성 질환에서 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 데 사용됩니다.

염증 중 백혈구-내피 세포 상호작용을 연구하는 미생리학적 시스템

배우세요 미세유체칩을 이용해 처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 화성을 측정하는 방법을. 이 기술은 적혈구 여과 없이 빠르게 호중구 이동성과 방향성을 정량화하여 임상 진단과 면역 연구에 활용됩니다.

처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 주 화성을 측정하기위한 미세 유체 플랫폼

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