Name: 아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 학습하세요 고처리량 스크리닝을 위한 단일일 세포 기반 cAMP 과민화 분석법을 개발하는 방법을. 동결보존 세포와 HTRF 기술을 활용하여 소분자 및 siRNA 스크리닝 효율성을 향상시킵니다.

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저자는 방법론 교육 및 분석 지침 씨 리처드 아연 토드 Wiernicki을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한주의 읽기 및 편집 제안 요한 바오로 스펜스 감사합니다. 이 작품은 국민 건강 MH 060397, 두뇌와 행동 연구 재단과 일라이 릴리의 연구소와 릴리 연구 상 프로그램 (LRAP)를 통해 회사에 의해 지원되었다.

1. 분석 준비 세포의 확장과 냉동 보존 <ol><li> 문화 CHO-K1-DRD 2L 1.0 μM의 L-글루타민, 800 ㎍ / μL의 G418, 300 ㎍ / ㎕의 하이 그로 마이신, 100 U / μL에게 보충 햄의 F12 미디어에서 15cm 2 세포 배양 접시에 (CHO-D 2L) 세포 페니실린, 100 개 / μL 스트렙토 μg, 10 % 소 태아 혈청 (FBS). </li><li> 세포가 90 % -95 %의 합류 때까지 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 세포를 품어. 10 ㎕의 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)으로 세포를 세척하고 37 ℃에서 5 분 동안 세포 분리 버퍼의 3 μl를 추가하여 세포를 수확 배양액 12 μl를 사용하여 세포를 재현 탁하고 트리 판 블루 배제를 이용하여 세포를 센다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 500 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기. 뜨는을 대기음 및 동결 미디어의 5 μL (10 % 디메틸 설폭 사이드, 90 % F에있는 세포 펠렛을 resuspendBS). 원하는 세포 농도 (예 1-20 × 106 세포 / μL)을 달성하기 위해 세포 현탁액을 희석. </li><li> 각 cryovial에 셀 솔루션의 나누어지는 1.0 μL. -80 ° C 하룻밤에 셀 냉동 컨테이너에 cryovials을 품어. 장기 저장을위한 액체 N 2 탱크에 cryovials을 전송합니다. </li></ol> 2. 분석 준비 세포 (및 역 형질 옵션) 도금 <ol><li> 빠른 속도로 37 ° C의 물을 욕조에있는 세포의 고정 cryovial을 해동. 세포를 해동되면, 옵티-MEM 15 μl를 함유하는 15 ㎕의 원뿔 튜브에 세포를 전송하고, 튜브 (3)-5X를 반전시켜 혼합한다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 500 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는을 기음과 1 ㎕의 옵티-MEM에있는 세포를 재현 탁. </li><li> 세포 생존 능력을 결정하고 필요한 경우 (예. 3 × 105 세포 / μL 농도)에서 생존 세포를 희석하기 위하여 트리 판 블루 배제를 이용하여 세포를 세어OPTI-MEM. 플레이트는 조직 배양 세포의 10 μL / 잘은 멀티 채널 피펫을 사용하여 384 - 웰 플레이트를 처리. </li><li> (권장 사항 제조에 따라 - 7 항 참조) 세포에 의해 캠프 생산을 추정하는 표준 곡선을 생성하는 옵티-MEM 캠프의 시리얼 희석합니다. 접시에 10 μL / 잘 캠프 표준의 추가 참고 :. 단일 표준 곡선 분석 플레이트 중 하나에 별도의 판 또는 빈 우물에 제조 할 수있다. </li><li> 실온에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기, 1 시간 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 알을 품다. </li></ol> 3. * siRNA의 형질 옵션 반전 이 섹션에서는 그림 3을 선택하고 관련이 있습니다. <ol><li> RNA 분해 효소가없는 DDH 2 O (예를 들어 0.4 pmol의 / μL)에서의 siRNA의 솔루션을 준비합니다. 384 - 웰 플레이트의 각각의 웰에 5 μl를 추가, 15 SE 100 XG에서 접시를 원심 분리실온에서 C. </li><li> (예 : 옵티-MEM 1000 μL에 리포 펙 타민 2000 년 6 μl를 추가), 아래로 pipetting에 의해 혼합 0.006의 요인에 의해 옵티-MEM에서 리포 펙 타민 2000을 희석. </li><li> 실온에서 5 분 동안 리포 펙 타민 2000/Opti-MEM 용액을 배양한다. 이미의 siRNA를 포함 384 - 웰 플레이트의 각각의 웰에 희석 리포 펙 타민 2000/Opti-MEM 솔루션의 5 μl를 추가합니다. 실온에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기. </li><li> 실온에서 30 분 동안 플레이트를 배양한다. </li><li> (2 절) 전술 한 바와 같이 플레이트 분석 준비 세포. 실온에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기. </li><li> (토론 참조) 노크 타겟 유전자에 대한 결정에 따라 48 ~ 96 시간 동안 37 ° C (5 % CO 2)에 가습 인큐베이터 분석 플레이트를 돌려줍니다. </li></ol> 4. 작은 분자 스크리닝 <ol><li> 옵티에 관심있는 약물 (예. 작은 분자 억제제)를 희석-MEM 원하는 최종 농도의 6 배. 시리얼 희석 휴대용 피펫 또는 액체 핸들링 스테이션을 이용하여 완료 될 수있다. </li><li> 시험 화합물을 2.5 μL / 웰을 추가 또는 멀티 채널 피펫을 사용하여 웰의 측면에, 차량 (예 DMSO)을 함유하는 버퍼. </li><li> 실내 온도 (배양는 선택 사항입니다)에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기. </li></ol> 5. 영구 작용제 치료 <ol><li> 600 nm의 옵티-MEM에서 quinpirole 용액 (100 ㎚의 예. 6 번 원하는 최종 농도)를 준비합니다. </li><li> 2.5 μL / 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 우물의 측에 600 nm의 quinpirole 솔루션을 추가합니다. </li><li> 실온에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기, 2 시간 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 알을 품다. </li></ol> 6. 캠프 축적의 자극 <ol><li> 2 시간 배양시 stimulati 준비옵티-MEM 용액에. 자극 용액을 40 μM의 포스 콜린으로 구성되어 2 μM 3 - 이소 부틸 -1 - methyxanthine (IBMX) 및 4 μM 스피 페론의 (6 단계의 모든 농도는 원하는 최종 농도의 4 배된다). </li><li> 5 μL / 웰의 멀티 채널 피펫을 사용하여 웰 측으로 자극 용액을 추가. </li><li> 실온에서 15 초 동안 100 XG에 플레이트를 원심 분리하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다. </li></ol> 7. 캠프 축적의 냉각 및 추정 <ol><li> 세포에 의해 cAMP의 생산은 제조업체의 지시에 따라 cAMP를 동적 2 키트를 사용하여 측정된다. 간단히, 증류수 안티 캠프 - 크립 테이트 및 캠프-D2를 재구성. 단기 저장을 위해 -20 ° C에서 분주 동결. </li><li> 작업 솔루션을 만들 수있는 제조 업체의 지침에 따라 용해 버퍼에 방지 캠프 - 크립 테이트 중 하나가 나누어지는 개별적으로 캠프-D2 중 하나가 나누어지는을 희석. </li><li>체크인 yyyy 방지 캠프 - 크립 테이트 작업 용액 10 μL / 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 384 - 웰 플레이트에 캠프-D2의 작업 솔루션의 10 μL / 잘. </li><li> 실온에서 15 초 동안 100 XG에 플레이트를 원심 분리하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 337 ㎚의 여기를 사용하여 형광 플레이트 리더 (감도 자동 스케일 설정)의 판을 읽고마다 620 ㎚, 665 ㎚에서 배출량을 측정 지침을 제조하고 있습니다. </li><li> 당 평가하는 비율 계량 분석을 적용 캠프의 표준 곡선은 지침을 제조하고 있습니다. 결과 값을 사용하여 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 테스트 웰에서 추정 된 cAMP의 축적을 추정. </li></ol>

<ol><li>Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+regulation+of+adenylate+cyclase+accounts+for+narcotic+dependence+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).</li>
<li>Watts, V. J., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+adenylate+cyclase+by+Galpha%28i%2Fo%29-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors.</a> Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).</li>
<li>Christie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+neuroadaptations+to+chronic+opioids%3A+tolerance%2C+withdrawal+and+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).</li>
<li>Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+AGS3+during+morphine+withdrawal+promotes+cAMP+superactivation+via+adenylyl+cyclase+5+and+7+in+rat+nucleus+accumbens%2Fstriatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons.</a> Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).</li>
<li>Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m-Opioid+receptor+desensitization+by+%CE%B2-arrestin-2+determines+morphine+tolerance+but+not+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence.</a> Nature. 408, 720-723 (2000).</li>
<li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+long-term+plasticity+underlying+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction.</a> Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).</li>
<li>Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opiate-induced+adenylyl+cyclase+superactivation+is+isozyme-specific%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific.</a> J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).</li>
<li>Sadana, R., Dessauer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+for+G+protein-regulated+adenylyl+cyclase+isoforms%3A+insights+from+knockout+and+overexpression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies.</a> Neurosignals. 17, 5-22 (2009).</li>
<li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenylyl+cyclase+type+5+%28AC5%29+is+an+essential+mediator+of+morphine+action%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).</li>
<li>Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenylyl+cyclase+isoforms+as+novel+therapeutic+targets%3A+an+exciting+example+of+excitotoxicity+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Interv%22%5BJournal%5D)">Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection.</a> Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).</li>
<li>Beazely, M. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+properties+of+adenylate+cyclases+type+5+and+6%3A+A+progress+report%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report.</a> Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).</li>
<li>Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+10%5BTitle%5D)+AND+%22Adenylyl+cyclase+isoform-specific+signaling+of+GPCRs.+G+Protein-Coupled+Receptors%3A+Structure%2C+Signaling%2C+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chapter 10.</a> Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. Siehler, S., Milligan, G. 10, Cambridge University Chapter. 189-217 (2010).</li>
<li>Lin, Y., Smrcka, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+molecular+recognition+by+G+protein+betagamma+subunits+on+the+path+to+pharmacological+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting.</a> Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).</li>
<li>Cumbay, M. G., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+sensitization+of+recombinant+adenylate+cyclases+by+activation+of+D2+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).</li>
<li>Watts, V. J., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+endogenous+and+recombinant+adenylate+cyclase+by+activation+of+D2+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors.</a> Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).</li>
<li>Nevo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adenylyl+cyclase+isozymes+on+acute+and+chronic+activation+of+inhibitory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors.</a> Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).</li>
<li>Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+activation+of+the+m-opioid+receptor+with+the+endogenous+ligand+endomorphin+differentially+regulates+adenylyl+cyclase+isozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes.</a> Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).</li>
<li>Beazely, M. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+a+novel+PKC+isoform+synergistically+enhances+D2L+dopamine+receptor-mediated+sensitization+of+adenylate+cyclase+type+6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Signal%22%5BJournal%5D)">Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6.</a> Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).</li>
<li>Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+tools+to+dissect+the+role+of+Gs+in+sensitization+of+AC1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1.</a> Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).</li>
<li>Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D2+receptor-induced+heterologous+sensitization+of+adenylyl+cyclase+requires+Gas%3A+Characterization+of+Gas-insensitive+mutants+of+adenylyl+cyclase+V%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V.</a> Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).</li>
<li>Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D%282%29+Receptor-Mediated+Heterologous+Sensitization+of+AC5+Requires+Signalosome+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Signal+Transduct%22%5BJournal%5D)">Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly.</a> J. Signal Transduct. 2012, 210324(2012).</li>
<li>Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+sensitization+of+adenylate+cyclase+is+protein+kinase+A-dependent+in+Cath.a+differentiated+%28CAD%29-D2L+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells.</a> J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+adenylyl+cyclase+inhibitor+for+treating+neuropathic+and+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain.</a> Sci. Transl. Med. 3, 65ra3(2011).</li>
<li>Nordstedt, C., Fredholm, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modification+of+a+protein-binding+method+for+rapid+quantification+of+cAMP+in+cell-culture+supernatants+and+body+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid.</a> Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).</li>
<li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+morphine-induced+cAMP+overshoot%3A+a+cell-based+assay+model+in+a+high-throughput+format%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).</li>
<li>Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+cells+facilitate+cell-based+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).</li>
<li>Varga, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adenylyl+cyclase+isoenzymes+in+CHO+and+B82+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells.</a> Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).</li>
<li>Masri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+dopamine+D2+receptor%2Fbeta-arrestin+2+interaction+is+a+common+property+of+clinically+effective+antipsychotics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).</li>
<li>Thaker, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+glioblastoma+multiforme+through+short+interfering+RNA+screening%3A+a+paradigm+for+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurg.+Focus%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development.</a> Neurosurg. Focus. 28, E4(2010).</li>
<li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells%3A+a+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Geneti%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Ejendal, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+antagonists+of+tick+dopamine+receptors+via+chemical+library+screening+and+comparative+pharmacological+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).</li>
<li>Meyer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22genome-to-lead%22+approach+for+insecticide+discovery%3A+pharmacological+characterization+and+screening+of+Aedes+aegypti+D%281%29-like+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors.</a> PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478(2012).</li>
<li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).</li>
<li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+genetically+encoded+biosensors+using+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase.</a> ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).</li>
<li>Jiang, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+cAMP+BRET+sensor+to+characterize+a+novel+regulation+of+cAMP+by+the+sphingosine+1-phosphate%2FG13+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway.</a> J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).</li>
</ol>

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이종 과민 반응의 연구를 촉진하기위한 노력의 일환으로, 우리는 광범위하게 우리의 이전 방법 효율적인 달성을 수정했습니다 &quot;혼합 및 읽기&quot;높은 처리량 검사 및 행동 검사의 메커니즘을 수정할 수있는입니다 형식. 다음과 같이 우리의 프로토콜에 큰 변형이 요약 될 수있다 : 1) &quot;분석 준비&quot;시약 등의 동결 보존 세포의 사용, 384 - 웰 포맷으로 분석의 2)의 소형화와, HTRF 둘레 3) 사용률 캠프. 우리의 세포 기반 분석을위한 냉동 보존의 채용이 크게 일 실험과 심사 노력에 우리가 하루에 대한 효율성과 재현성을 향상되었습니다. 이러한 접근 방식은 업계 표준으로, 용이 26 설정 학술 연구로 번역 될 수있다. 세포 배양 효율을 향상시키기 위해 세포의 바이알, 해동 희석하고 384 - 웰 플레이트 FO에 직접 도금되는 해당 셀 축적량 「선반 용 시약 off &quot;로 사용각 분석 연구. 우리는 이전 무척추 G 단백질 결...

이종 또는 초 과민성으로 알려진 응답 신호 적응 아데 닐 레이트 사이 클라 제 (AC)를 첫 번째 노벨상 수상자, 마샬 박사 Nirenberg의 연구실에서 발견되었다. 박사 Nirenberg 만성 δ 아편 수용체 활성화 다음 관찰 증가 AC 응답이 아편 내성과 의존성 1에 관여하는 메커니즘이라고 제안했다. 만성 δ 아편 수용체 활성화뿐만 아니라, AC 신호의이 neuroadaptive 응답은 또한 여러 가지 다른 Gαi / O를 결합 수용체 2의 지속적인 활성화 다음 발생합니다. 특히,이 수용체의 대부분은 통증, 신경 정신 및 신경 장애와 연관 μ / κ 아편, D 2 / 4 도파민, 5HT 1A 및 M 2 / 4 무스 카린 수용체 2를 포함한다. 박사 Nirenberg의 발견에 더하여, 기록하는 큰 몸체의 양쪽 만성 오피오이드 수용체 활성화에 AC 신호의 감작을 연결 존재 <e생체 외 및 생체 내 3-7 미터&gt;. AC의 감작도 (검토를 위해 참고 2 참조) 정신 분열증과 파킨슨 병 등의 D 2와 같은 도파민 수용체를 포함하는 다양한 질병과 관련이있다. 과민 반응의 잠재적 인 중요성에도 불구하고, 정확한 메커니즘 (들)은 AC 응답이 크게 알려지지 않은 남아 증가로 연결 지속 Gαi / O를 결합 수용체의 활성화와 관련. 이러한 연구는 중요한 신경 생물학적 대상으로 아데 닐 레이트 사이 클라 제의 민감성에 대한 메커니즘을 조사하기위한 이론적 근거를 제공한다. 마찬가지로, 개별 AC 아형이 적응 응답하여 홀드 8 시그널링 AC의 생리 학적 관련성 및 중요성도 2,9,10을 인식해야한다. 우리의 연구의 맥락에서, AC의 재조합 이소 형의 이종 감작과 관련된 일반적인 특징은 그 특성을 평행 데AC의 내생 이소을 공부 cribed. 특히, 이전의 연구는 Gαi / O 단백질 및 후속 릴리스 / 재 배열 βγ 서브 유닛의 활성화는 모든 AC 이소 형의 수용체에 의한 감작을위한 중요한 요구 사항입니다 것을 발견했습니다. 또한, 여러 연구는 단백질 키나아제 및 Gβγ 서브 유닛에서 신호가 과민성 2,11-13에 참여하는 것이 좋습니다. 개별 ACS는 또한 독특하고 뚜렷한 증감 패턴 (12)을 표시합니다. 밀접한 관련이 AC3는 2 민감하지 반면 예를 들어, 효능에 D 2 수용체의 지속적인 노출은, 칼슘 2 + / 칼 모듈 린의 자극 (14, 15)에 AC1 및 AC8의 과민 반응과 연관되어 있습니다. AC2, AC4, 및 AC7 밀접 단, PKC 자극 AC2 활동이 견고 7,14,16,17을 주작 동근하는 D 2 수용체의 장기간 노출 후 민감하고, 관련이 있습니다. 또한, AC5 및 AC6은 heter의 현저한 정도를 나타냅니다ologous D 2 수용체 14,18-20의 활성화에 다음과 같은 가스와 포스 콜린 자극 캠프 축적에 과민 반응하지만, Gβγ 서브 유닛 - AC에 대한 자신의 요구 사항에 차이가 나타납니다 (21)를 상호 작용. AC 감작의 대부분의 연구 모델 세포주 (예를 들어 HEK293 세포는 각각의 AC 이소 형을 표현하는)를 사용하고 있지만, 이러한 연구 결과는 원시 신경 세포 모델 4,22로 번역 것으로 보인다. 더 최근에, AC 아형을 발현하는 HEK293 세포에서 식별 AC 이소 선택적 소분자 억제제의 효과는 또한 생체 행동 연구 (23)로 변환 할 수있다. 이종 감작위한 식별 분자 메커니즘의 부족 가능성 적응 반응의 복잡성뿐만 아니라 AC가 12 이소 폼의 개별 고유 규제 특성을 반영한다. 그러한 복잡성을 이루는 것이 더욱 성가신 방법론 t의 사용에 의해 복잡모자 공정한 방법을 사용에서 학술 조사를 제한하고있다. 48 잘 조직 문화 형식 (15) - 예를 들어, 우리의 이전의 기계 론적 연구 (24)를 사용하여 지속적으로 배양 세포 모델을 사용하고있었습니다. 배양 된 세포는 일반적으로 48 시간 동안 성장하고 세포 세척 및 배양 일련의 (그림 1) 다음에 효능 약물 치료 (2-18 시간)을 실시 하였다. AC-이소 특정 캠프 축적 프로토콜 캠프 방법론 15,24 바인딩 노동력과 시간이 소요 [3 H]를 사용하여 캠프 축적 측정한다 사용 후했다. 각각의 분석을 위해 처음부터 끝까지 지속 기간은 일반적으로 세포 도금의 데이터 분석 (그림 1)에 4-5일 총이 필요합니다. 새로운 기술과 자동화의 응용 프로그램은 산업 및 HTS 센터 설정에 감작 연구에 표시된 향상되었다. 예를 들어, 케미을위한 국립 센터와 협력 그룹칼 유전체학은 2 하루 1,536 잘 형식 25 μ 오피오이드 수용체에 의한 감작의 작은 분자 억제제를 식별하기위한 분석 절차를 HTS 보도했다. 본 기사는 대부분의 학술 연구 기관에서 사용할 수있는 기술을 사용하여 이종 과민 반응의 연구를위한 HTS 분석을 개발하는 우리의 노력을 설명합니다. 이 전략은 heterologously 내인성 또는 개별 재조합 아데 닐릴 시클 라제 이소 폼 (CHO-D 2L 또는 HEK-AC6 / D 2 L)와 조합 D 2 도파민 수용체를 발현하는 세포 모델에서 냉동 보관 세포의 사용을 통합함으로써 달성되었다. 우리의 처리량을 개선하기 위해, 우리는 기본적으로 &quot;혼합 읽기&quot;이었다 384 - 웰 형식의 5 단계, 하루의 분석에 우리의 48 개 감작 분석 (4-5 일 동안 ca.&gt; 20 단계)를 재 설계. 새로운 형식은 캠프 ACC를 측정하기 위해 시중에서 균일 한 시간 해결 형광 (HTRF) 분석을 사용하여멀티 모드 플레이트 리더와 손상 세포 umulation. 분석은 강력하고 작은 분자 검사 의무, 그리고 효과적으로 이종 과민 반응의 억제에 대한 화면으로 적용 할 수 있습니다. 또, 일반적인 방법으로 오직 사소한 수정을 가진 대상 또는 게놈 와이드 siRNA의 라이브러리 스크리닝 된 siRNA의 형질 감염과 역방향이 분석의 사용을 허용 데이터를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>CHO-K1-DRD2L 셀</td><td>DiscoveRx</td><td>930579C2</td><td></td></tr><tr><td>Ham' s F12 매체</td><td>VWR</td><td>SH30026fs</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>VWR</td><td>SH3007003</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>시그마</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>하이그로마이신</td><td>피셔</td><td>50-230-5556</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>라이프 테크놀로지</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>15cm 접시</td><td>BD 팔콘</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>세포 해리 완충액</td><td>Life Technologies</td><td>13150016</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Fisher</td><td>976171</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TC 처리 384웰 플레이트</td><td>Perkin-Elmer</td><td>6007688</td><td></td></tr><tr><td>HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62AM4PEB</td><td>http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay</td></tr><tr><td>Synergy 4</td><td>Biotek</td><td>H4MLFPTAD</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6</td><td>GraphPad 소프트웨어</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)퀸피롤</td><td>시그마</td><td>Q111</td><td></td></tr><tr><td>스피페론</td><td>시그마</td><td>S7395</td><td></td></tr><tr><td>클로자핀</td><td>시그마</td><td>C6305</td><td></td></tr><tr><td>할로페리돌</td><td>시그마</td><td>H1512</td><td></td></tr><tr><td>S-(-)설피리드</td><td>시그마</td><td>S112</td><td></td></tr><tr><td>리포펙타민 2000 트랜스펙션 시약</td><td>인비트로겐</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루</td><td>라이프 기술</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>물, DNase 및 RNase가 없는</td><td>MP 바이오메디컬</td><td>821739</td><td></td></tr><tr><td>Gas siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>맞춤형 siRNA</td><td></td></tr><tr><td>비표적 siRNA 제어</td><td>Dharmacon Dharmacon</td><td>D-001206-14-20</td><td></td></tr><tr><td>siGlo Red</td><td>Dharmacon</td><td>D-001630-02</td><td></td></tr></tbody></table>

아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 sirna의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

아데 닐 레이트 사이 클라 제 (AC) 신호의 과민 반응은 약물 남용 및 파킨슨 병 등의 신경 정신 및 신경 질환의 종류에 연루되어있다. Gαi / O를 결합 수용체의 급성 활성화는 AC의 활성을 억제, AC의 이종 감작에있는이 수용체 결과의 지속적인 활성화 및 세포 내 cAMP의 수준 증가하는 반면. 이전 연구는 AC의 응답 성이 향상이 D 2 도파민을 포함하고 오피오이드 수용체를 μ Gαi / O를 결합 수용체의 여러 종류의 만성 활성화 다음 시험 관내 및 생체 내에서 모두 관찰되는 것을 증명하고있다. AC의 이종 감작이 처음 사십 년 전에보고했지만,이 현상을 기초 메커니즘 (들)은 크게 알려지지 않은 남아있다. 기계적인 데이터의 부족은 아마도 nonbiased 방법 식별에 도움을 수 있다고 제안,이 적응 응답과 관련된 복잡성을 반영AC의 이종 과민 반응에 관여하는 분자 경로를 보내고. 이전 연구는 AC의 이종 과민 반응을 조절하는 구성 요소를 중복으로 키나제 및 Gbγ 신호를 내포하고 있습니다. AC의 과민 반응과 관련된 독특하고 추가 중복 표적을 확인하기 위해, 확장 성 캠프 민감성 분석의 개발 및 검증은 처리량이 필요합니다. 과민 반응을 연구하는 이전 방식은 연속적인 세포 배양 유지 보수뿐만 아니라 다수의 세척 단계를 포함 cAMP의 축적을 측정하는 복잡한 방법을 포함 일반적으로 복잡하다. 따라서, 384 웰 포맷에서 높은 처리량 스크리닝 (HTS)에 사용할 수있는 강력한 세포 기반 분석의 발전은 미래 연구를 용이하게한다. 두 개의 D 2 도파민 수용체 세포 모델 (예. CHO-D 2L와 HEK-AC6 / D 2L)를 사용하여, 우리는 다섯의 우리의 48 잘 증감 분석 (&gt; 20 단계 4 ~ 5 일) 변환 한TEP, 384 - 웰 형식으로 하루의 분석. 이 새로운 형식은 작은 분자 검사 의무이며, 우리는이 분석의 디자인도 쉽게 대상의 siRNA 라이브러리 심사의 기대에 siRNA를 역 형질 전환을 위해 사용될 수 있음을 보여줍니다.

시판 셀 모델을 사용하여 소분자 저해제를 식별하기 위해 384도 이종 감작 분석법 개발 부품 I.. 세포 모델에서 이종 과민 반응을 연구하기 위해, 우리는 &quot;혼합 읽기&quot;형식으로 분석을 간소화 할 수있었습니다 개선의 번호를했다. 키의 여러 변형이 아래 강조되고 논의에서 더욱 상세히 설명된다. 첫 번째 중요한 단계는 냉동 보관 된 세포 (26)에 지속적으로 배양 된 세포에서 우리의 세포 배양을 수정했다. 우리는 지금 일상적 × 10 1-20 6 세포 / μL 사이의 농도에서 세포의 배양 배치 냉동 보존 할 수있다. 각각의 분석의 경우, 세포 주식은 해동 희석 계산 한 다음 384 - 웰 플레이트에 직접 도금되어있다. 배양 기간의 필요성을 제거하고 분석의 편리 성을 증가시킨다. 우리의 이전의 민감성 분석의 형식은 48 - 웰, 담배 마는 활용UE 배양 플레이트, 및 세척, 캔트, 전송 단계 <s...

아데 닐릴 시클 라제 시그널링의 억제 감작있는 G 단백질 결합 수용체 결과의 지속적인 활성화. 필수 분자 경로를 식별하기 위해 nonbiased 접근이 필요하지만,이 전략은 확장 셀 기반 캠프 민감성 분석의 개발이 필요합니다. 여기서, 우리는 작은 분자 및 siRNA의 검사에 대한 민감성 분석을 설명합니다.

아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

이 프로시저의 전반적인 목표는 화학 라이브러리 스크리닝을 포함한 고처리량 스크리닝 응용 분야를 위한 단일일 세포 기반 cyclic A MP 민감화 분석법을 개발하는 것입니다. 이는 먼저 이전에 준비된 분석 준비 완료 동결 보존 세포를 해동하고 플레이팅함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 세포에 테스트 화합물 또는 길항제를 첨가한 후, 아데닐릴 시클라제 민감화 약물을 첨가하는 것입니다.다음으로, cyclic AMP 축적을 자극하기 위해 phosphodiesterase 억제제가 존재하는 상태에서 adenylyl cyclase 활성제를 첨가합니다. 마지막 단계는 lysis buffer에 포함된 homogenous time resolved fluorescence 또는 HTRF cyclic AMP 검출 시약으로 반응을 정지시킨 후 형광을 측정하는 것입니다. 궁극적으로, 냉동 보존 세포와 HTRF cyclic AMP 기술을 사용하면 소분자 스크리닝을 위한 단일 일 감작 분석을 수행할 수 있습니다.저희는 치과 cyclase의 수용체 매개 이종 감작을 연구하기 위해 고처리량 스크리닝을 사용하는 것에 관심을 갖게 되었을 때 처음으로 이 접근 방식에 대한 아이디어를 얻었습니다. 여기서 사용된 두 가지 핵심 기술은 동결 보존 세포를 기성 시약으로 사용하는 것과 cyclic AMP를 측정하기 위한 균질 시간 분해능 형광(HTRF) 에세이 키트를 사용하는 것입니다. 여기에 적용된 기본 방법론은 세포 기반 에세이를 사용하여 세포 신호 전달 및 약물 발견의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 15cm 세포 배양 접시에서 CHO-D2 L 세포를 배양하십시오. 세포가 90~95% Confluent 상태가 될 때까지 37°C, 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 배양합니다. 그다음 10mL의 인산 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척하고, 37°C에서 5분간 배양한 후 3mL의 세포 해리 완충액으로 세포를 수확하십시오.12 milliliters의 배양액을 사용하여 세포를 재현탁한 후, trypan blue 배제법을 이용하여 세포 수를 측정하십시오. 세포 현탁액을 실온에서 500 Gs로 5분간 원심분리하십시오. 그 다음 상층액을 흡입하여 제거하고, 세포 현탁액을 원하는 세포 농도로 희석한 후 5 milliliters의 동결 배지로 세포 펠렛을 재현탁하십시오. 각 cryo vial에 1 milliliter의 세포 용액을 분주하십시오. cryo vial을 세포 동결 용기에 넣어 -80 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.다음 날, 장기 보관을 위해 동결 보존용 튜브를 액체 질소 탱크로 옮깁니다. 플레이트 분석 준비가 된 세포를 얻기 위해 먼저 37 °C 항온수조에서 동결 보존된 세포 튜브를 빠르게 해동합니다. 세포가 해동되면 9 mL의 OptiMEM이 들어 있는 15 mL 원추형 튜브로 세포를 옮기고, 튜브를 3~5회 반전시켜 혼합합니다. 500 Gs에서 5분 동안 세포를 원심 분리한 후, 실온에서 상층액을 흡입하여 제거하고 1 mL의 OptiMEM에 세포를 재현탁합니다.트리판 블루 배제법을 사용하여 세포 수를 세어 세포 생존율을 결정한 후, 필요에 따라 생존 세포를 희석하십시오. 그다지 다채널 파이펫을 사용하여 조직 배양 처리된 384-웰 플레이트의 각 웰에 세포 10 µL를 최적으로 플레이팅하십시오.세포에 의한 cyclic AMP 생산량을 추정하기 위한 표준 곡선을 작성하기 위해 cyclic AMP를 연속 희석하여 최적 농도로 준비합니다. 각 웰에 cyclic AMP 표준액 10 µL를 첨가합니다. 플레이트를 상온에서 100 ×g로 15초 동안 원심분리하고, 5% CO2가 공급되는 습윤 인큐베이터에서 37 °C로 1시간 동안 배양합니다.소분자 스크리닝을 위해, 먼저 관심 약물을 최적 농도부터 최종 희망 농도의 6배까지 희석합니다. 연속 희석은 핸드헬드 피펫이나 액체 핸들링 스테이션을 사용하여 완료할 수 있습니다. 테스트 화합물 또는 용매가 포함된 버퍼를 웰당 2.5 µL씩 첨가합니다.멀티채널 피펫을 사용하여 웰의 측면에 용액을 가한 후, 플레이트를 100 g에서 15초 동안 원심 분리합니다. 지속적인 작용제 처리를 위해 상온에서 600 nM의 Quinagolide 용액을 준비하고, 멀티채널 피펫을 사용하여 웰의 측면에 600 nM Quinagolide 용액을 웰당 2.5 µL씩 가합니다. 플레이트를 다시 원심 분리한 후, 5% CO2가 공급되는 37 °C의 습윤 배양기에서 2시간 동안 배양합니다.2시간의 배양 동안, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 optimum에서 자극 용액을 준비합니다. 플레이트를 이전과 같이 원심 분리한 후, 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰의 측면에 5 µL의 자극 용액을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 세포에 의한 cyclic AMP 생성은 제조사의 지침에 따라 cyclic AMP dynamic two 키트를 사용하여 측정합니다. 간단히 설명하면, anti-cyclic AMPK crypt와 cyclic AMPD 2를 증류수에 재구성합니다. 제조사의 지침에 따라 lysis buffer에서 anti-cyclic AMPK crypt 한 aliquot과 cyclic AMPD 2 한 aliquot을 각각 희석하여 작업 용액을 만듭니다. 384-well 플레이트 내의 cyclic AMP 축적을 중단시키기 위해, anti-cyclic AMP crypt 8 작업 용액 10 µL와 cyclic AMPD 2 작업 용액 10 µL를 각 웰에 첨가합니다.멀티채널 피펫을 사용하여 플레이트를 실온에서 100 GS로 15초 동안 다시 원심 분리한 후, 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 제조사 지침에 따라 형광 플레이트 리더를 사용하여 337 nanometers의 들뜸 파장에서 플레이트를 읽고, 620 nanometers 및 665 nanometers에서 방출 파장을 측정합니다. 제조사 지침에 따라 비율 측정 분석(ratio metric analysis)을 적용하여 cyclic A MP 표준 곡선을 평가합니다. 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 결과 값으로부터 테스트 웰의 추정 cyclic A MP 축적량을 외삽합니다.동결 보존된 CHO D two L 세포를 384-웰 분석 플레이트에 직접 분주하여, 민감화 분석을 384-웰 형식으로 수행함으로써 단계를 20단계 이상에서 5단계로 줄일 수 있음을 입증하였습니다. 연구 결과, Quin Perol을 이용한 2시간의 전처리가 이후의 four 자극에 의한 cyclic A MP 축적을 용량 의존적으로 증가시켰으며, 이는 이종 민감화와 일치하는 결과였습니다. 두 번째 실험 시리즈에서는 이렇게 간소화된 새로운 분석법을 민감화 억제제 평가에 활용할 수 있는지 탐색하였습니다.초기 결과에서는 haloperidol 또는 piPerone과 같은 전형적인 D₂ 길항제 사전 처리가 Quin parol로 유도된 포스포릴화된 cyclic AMP 축적의 민감화를 완전히 방지했음이 밝혀졌습니다. 이후 이 방법을 사용하여 일련의 D₂ 길항제의 효능을 평가함으로써, 이 화합물들이 이전 결과와 유사하게 민감화를 억제하는지 테스트하였습니다. 이러한 연구를 통해 D₂ 길항제가 효능제 유도 민감화를 용량 의존적으로 억제한다는 것이 입증되었습니다.다음 목표는 텍스트 프로토콜에 기술된 것과 같이 확장 가능한 역형질전환 siRNA 라이브러리 스크리닝을 수행하는 데 사용할 수 있는 384웰 감작화 분석법을 개발하는 것이었습니다. 결과에 따르면, 세포를 작용제인 Quinparole에 2시간 동안 노출시켰을 때 forskolin의 효과가 현저히 강화되었으며 cyclic AMP 축적이 촉진되었습니다. forskolin 100 nM 및 300 nM 농도 모두에서 증가한 cyclic AMP 축적량은 vehicle 처리 세포와 비교하여 15배 이상이었습니다. D2 수용체를 발현하는 세포에 Gs siRNA를 역형질전환하면 작용제에 의해 유도되는 adenyl cyclase의 감작화가 차단됩니다.D2 수용체 작용제인 Quin Perol을 첨가하고 순환시키면 cAMP 축적이 자극되며, 이는 HTRF를 사용하여 측정되었습니다. 15배의 감작 반응이 94% 감소했습니다. 이 절차를 적절히 따르면, 숙달 시 전체 분석을 8시간 이내에 완료할 수 있습니다. 추가적인 수용체 신호 전달 경로를 조사하기 위해 IP1 및 Phospho-ERK와 같은 다른 신호 분자들도 측정할 수 있습니다.

drug-induced-sensitization-adenylyl-cyclase-assay-streamlining

Research

연구

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Bioengineering

생명공학

이 비디오에서는 증폭된 발광 근접 균질 분석(bead-based proximity assay)을 시연합니다. 이 제품은 균일한 크기의 수용체 및 공여체 비드를 사용하며, 단백질 상호 작용을 억제하는 잠재적인 소분자를 스크리닝하기 위해 상호 작용하는 경향이 있는 두 개의 단백질로 고정되어 있습니다.

Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay: 단백질-단백질 상호작용을 억제하는 소분자를 스크리닝하기 위한 비드 기반 근접 Assay입니다.

세포 프로세스의 시스템 수준의 이해를 달성하는 것은 현대 세포 생물학의 목표입니다. 우리는 여기에서 다양한 세포 기능의 다중 루시 페라 제 기자에 대한 전략을 설명하는 엔드 포인트 게놈 규모의 RNAi 라이브러리를 사용하여 유전자 기능을 심문.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

우리는 순차적으로 온 - 칩 bioorthogonal 사이클로 화학 및 항체 - 항원 캡처를 사용하여 작은 분자의 빠른 가역적 고정화 및 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 연구를위한 기능화 나노 입자 어셈블리에 대한 방법을 제시한다.

역으로 작은 분자 또는 바이오 센서 애플리케이션을위한 다중 구성 요소 구조를 무력화하는 미세 유체 온칩 캡처 - 고리 화 반응

여기서는 작은 간섭 합성 RNA(siRNA), 화학 화합물 및 진균 결핵 돌연변이 라이브러리의 고처리량/고함량 스크린에 적용되는 표현성 분석을 설명합니다. 이 방법은 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광으로 표지된 숙주 세포 내의 형광표지 진균 결핵의 검출에 의존합니다.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

조정 가능한 엄격성 마그네틱 비드 선택 방법을 기반으로 저분자 타겟에 대한 구조 스위칭 압타머를 선택하기 위한 프로토콜이 제공됩니다. 구조 스위칭 특성으로 선택된 Aptamers는 설명된 금 나노입자 분석과 같이 표적의 존재를 알리기 위해 구조적 변화가 필요한 분석에 유용합니다.

색채 금 나노 입자 분석에 적용 구조 전환 앱 타머를 선택하는 방법

전통적인 팁 기반 연속 희석 중 플라스틱 용기에 펩타이드 흡착은 효능 결정에 상당한 영향을 미치고 약물 발견의 선도 물질 식별 및 선도 물질 최적화 단계에 사용되는 구조-활성 관계의 이해를 혼란스럽게 할 수 있습니다. 여기에서는 펩타이드 샘플의 자동화된 음향 비접촉 연속 희석 방법에 대해 설명합니다.

효능 판별 분석에서 펩타이드 작용제의 직렬 희석에 대한 분배 자동 음향

우리는 현재의 연구에서 형질 전환 마우스에서 파생 된 림프구를 사용하여 새로운 형광 기반의 분석을 제시한다. 이 분석은 억제 또는 림프구의 활성을 촉진하거나 용량을 부여 소분자의 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 적합하다.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

이 종이 저 해제 및 T 세포 수용 체 신호에 영향을 주는 그들의 목표의 확인에 대 한 화학 억제제의 스크린 라이브러리에 교류 cytometry 기반 분석 결과 사용 합니다. 여기서 설명 하는 방법 또한 높은 처리량 검사에 대 한 확장할 수 있습니다.

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합 된 ATPase 분석제는 소분자 미오신 억제제의 반고 처리량 스크리닝에 적응되었다. 이 운동 분석은 384웰 마이크로플레이트 형식으로 실행되며 총 반응량은 웰당 20 μL에 불과합니다. 이 플랫폼은 거의 모든 ADP 생산 효소에 적용되어야 합니다.

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

이 프로토콜은 자동화 지원 유전자 라이브러리 생성 및 평가를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서의 체계적인 글로벌 최적화 방법을 제공합니다. 이는 실험을 간소화하고 유전적 구성 요소를 선택하여 바이오센서를 특정 설계 결과에 맞게 조정할 수 있도록 하는 실험 설계 방법론과 결합됩니다.

실험 설계 및 자동화 워크플로우를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서 설계 공간의 효율적인 샘플링

이 프로토콜은 단백질 합성의 천연 산물/소분자 억제제를 식별하기 위해 최적화된 형광측정 스크리닝 방법론을 도입합니다. 그 실용성 덕분에 학부 신약 개발 기술 교육과 의약 화학 캠페인 구현 모두에 적합합니다.

자연 공급원에서 단백질 합성 억제제의 예비 스크리닝을 위한 형광 기반 프로토콜

학습하세요 고처리량 스크리닝을 위한 단일일 세포 기반 cAMP 과민화 분석법을 개발하는 방법을. 동결보존 세포와 HTRF 기술을 활용하여 소분자 및 siRNA 스크리닝 효율성을 향상시킵니다.

아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

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