테스트

이 절차의 전반적인 목적은 Drosophila melanogaster의 후각을 테스트하기 위한 간단한 Y-미로 분석법을 제공하는 것입니다. 이는 먼저 파리를 16~18시간 동안 굶겨서 휘발성 자극이 있는 새로운 환경을 탐색하도록 유도함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 용매 단독 처리군 대비 용매에 녹인 아세트산과 같은 냄새원들을 거름종이에 담아 Y-미로 장치를 조립하는 것입니다.

세 번째 단계는 초파리를 로딩 바이알에 빠르고 부드럽게 넣는 것입니다. 몇 시간이 지난 후, 마지막 단계로 미로 내 초파리의 위치를 기록합니다. 궁극적으로, Y-미로를 통해 얻은 데이터는 후각 자극제에 대한 반응을 보여줄 수 있습니다.

우리는 초파리의 후각 반응을 테스트하기 위해 단순하고 저렴한 방법을 찾고자 했을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 다른 선택지와 비교하여 이 기술이 갖는 장점은 초파리가 너무 많은 스트레스를 받는지 여부에 대해 결정을 내릴 수 있게 한다는 점입니다. 절차 시연은 저희 연구실의 박사 과정 학생인 Megan Simon이 맡을 것입니다. 이 프로토콜을 위해 안정적이고 강력한 행동 표현형을 가진 ISO 표준화 초파리 라인을 준비하십시오. 이러한 모든 계통은 후각 테스트의 대조군으로 사용될 수 있으며, 실험에 사용할 각 유전적 계통에 대해 대조군 계통과 5세대 동안 역교배(back-cross)하십시오.

각 역교배(back cross)를 위해 단일 실험 균주 암컷을 소수의 동형 접합 수컷과 쌍을 지어 교배하십시오. 후각 실험의 경우, 초파리를 항생제가 포함된 표준 옥수수 가루 배지에서 1212 광주기 및 25 °C 조건으로 유지하십시오.

실험은 항상 25 °C에서 초파리가 인식할 수 없는 원적외선 스펙트럼의 광원 아래에서 수행해야 합니다. 또한, 다음 날 아침 분석을 실시하기 전 실험 사이에 실내를 완전히 환기할 수 있어야 합니다. 하루 일과가 끝나면, 10~20마리로 구성된 실험군 라인들을 젖은 수건으로 습도가 유지되는 유리 바이알로 옮기십시오.

초파리는 16~18시간 이내에 테스트해야 하며, 그렇지 않으면 다음 날 탈수나 굶주림으로 인해 죽을 수 있습니다. Y-미로를 조립하십시오. 먼저 피펫 팁을 잘라 만든 폼 커넥터를 사용하여 Y자형 커넥터를 두 개의 유리 바이알에 연결합니다. 이렇게 하면 피펫 팁의 테이퍼 형상 덕분에 일방향 통로가 형성됩니다.

Y자형 관의 세 번째 분지는 피펫 팁의 넓은 부분으로 만든 로딩 튜브에 연결되어 있으며, 로딩 바이알에서 미로의 선택 지점까지의 통로 역할을 합니다. 각 테이퍼형 터널 너머에는 유리 바이알이 있으며, 그중 하나에는 취기 물질을 충전해야 합니다. 이는 28 mm 정사각형 크기의 티슈 페이퍼에 40 µL의 볼러스를 흡수시킨 형태입니다.

테스트를 먼저 수행할 때, 두 경로 중 어느 쪽에 향료를 넣을지는 무작위로 교대로 결정해야 합니다. 초파리를 얼음 위에 잠시 두어 움직임을 둔하게 만듭니다. LED 전구의 원적외선 조명 아래, 25 °C에서 초파리 집단을 로딩 바이알에 조심스럽게 넣고 Y-maze에 테스트용 초파리를 로드합니다.

가스 마취제를 사용하지 마십시오. 파리를 로딩 바이알로 신속하고 부드럽게 옮기는 것이 매우 중요합니다. 파리가 Y-mass 내의 다른 파리들과 섞이기 전에 빠르게 깨어나야 하므로, 이 단계가 실제 실험에서 가장 어려운 부분입니다.

초파리가 미로를 충분히 탐색하여 최대한 많은 수가 어느 한쪽의 유리 바이알로 이동할 수 있도록 24시간 동안 둡니다. 각 튜브에 존재하는 초파리의 수를 통해 후각 지수(olfactory index)를 계산합니다. 최대 10마리의 초파리 행동 데이터로부터 얻은 이 값에 표준 통계 방법을 적용해야 합니다.

10마리의 초파리 코호트로 일관된 결과가 나오지 않는 경우, 20마리의 초파리 코호트로 실험을 진행할 수 있습니다. 미로 구성 요소를 세척하려면, 분해된 상태로 RBS 35 MD에 하룻밤 동안 담가 두십시오. 그 후 수돗물로 헹구고, 마지막으로 DI water로 헹군 다음 자연 건조하십시오.

취기 물질에 대한 표준 반응입니다. Y-미로를 사용하면 유인, 무관심 또는 회피 반응을 확인할 수 있습니다. 예를 들어, 초파리는 10% acetic acid는 강하게 회피하지만, 10% pheno acetic acid는 회피하지 않습니다.

이 절차를 수행할 때, 이 파동 분석(wave assay)이 초파리에게는 인위적인 환경이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 초파리의 후각 반응과 다양한 조건들을 확인하기 위해, 팀원들이 수행한 아레나(arena) 분석이나 내부 분석(internal assays)과 같은 방법으로 이 절차를 보완하여 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, SW 분석을 사용하여 *Drosophila melanogaster*의 후각 반응을 간단하게 테스트하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.