Name: 에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling 초파리 안테나 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: 학습하세요 Drosophila 안테나의 전체 마운트 면역염색을 통해 후각 수용체 뉴런을 시각화하는 방법을. 이 기술은 ORN 다양화의 분자 메커니즘을 이해하는 데 도움을 줍니다.

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본 연구는 사립 대학의 전략적 연구 재단과 우리는 비디오 클립을 편집 할 수 오타케 Norihito에게 감사의 말씀을 전합니다 HT에 대한 JSPS 젊은 과학자 B 보조금에 대한 문부 과학성 - 지원 프로그램에 의해 지원되었다.

1. 사과 접시를 준비합니다 <ol><li> 12.5 g 한천을 혼합, 125 ㎖의 100 % 시판 사과 주스, 12.5 g 포도당, 375 ML의 H 2 O 1-2분의 혼합물을 전자 레인지와 3cm 세포 배양 접시에 붓는다. 4 ℃에서 보관 </li></ol> 2. 유전 크로스 <ol><li> 다음과 같은 대표적인 유전 십자가를 사용 </li></ol> Or49a-mCD8 :: GFP / CYO X 1,118 (W) 3. 해부 및 염색 프로토콜 <ol><li> 파리를 마취 한 다음 집게를 사용하여 개최하여 수직으로 비행 머리를 잘라. </li><li> 조심스럽게 사과 접시에 안테나를 포함하는 부분을 놓습니다. </li><li> 미세 해부 가위를 사용하여 안테나의 세 번째 세그먼트를 잘라. </li><li> 유리 바닥 배양 접시의 중간에 () 0.1 % 트리톤 X-100 0.1 % PBST (PBS에 4 % 파라 포름 알데히드)의 고정 솔루션의 9​​0 μl를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 해부 antenn 전송직접 고정 솔루션에 날카로운 바늘 AE. 필요한 경우, 물리적으로 바늘을 사용하여 용액에 안테나를 물속. </li><li> 실온 (RT)에서 40 분 알을 품다. 같은 접시에 그들을 유지 (0.4 % 트리톤 X-100과 PBS) 0.4 % PBST에 각각 3 배 10 분 안테나를 씻으십시오. PBST 솔루션을 제거하고 추가하는 노란색 팁을 사용합니다. 때마다 세척 용액 90 μl를 사용합니다. 참고 : 면역 조직 화학 염색 동안 진탕에 접시를 올려 놓지 마십시오. 접시에 솔루션을 제거하거나 추가하기 전에 바늘을 사용하여 요리의 중심으로 모든 안테나를 가지고 조심스럽게 접시의 가장자리에서 솔루션을 추가하거나 제거 할 수 있습니다. </li><li> 실온에서 20 분 동안 0.1 % PBST 5 % 정상 말 혈청 90 μL와 안테나를 차단합니다. </li><li> 차단 솔루션을 제거한 후, 전술 한 바와 같이 축축한 용기에 4 ° C에서 48 시간 동안 5 % 말 혈청을 포함하는 0.1 % PBST에 차 항체의 90μl와 안테나를 품다 <s업&gt; 8. </li><li> 0.4 % PBST -10 분 6 배 안테나를 씻으십시오. </li><li> 4 ℃에서 48 시간 동안 5 % 말 혈청을 포함하는 0.1 % PBST 이차 항체의 90 μL와 안테나를 품어 0.4 % PBST를 사용하여 6 배 10 분 씻으십시오. </li><li> , 안테나를 탑재 가능한 한 배양 접시에서 PBST를 제거하고 점차적으로 안테나에 글리세롤의 두 개의 서로 다른 농도를 소개합니다. 처음 1 2 분 동안 요리에 40 % 글리세롤을 추가; 다음이를 제거하고 80 % 글리세롤을 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 노란색 팁을 사용하여 배양 접시에서 (80 % 글리세롤을 포함한다) 안테나를 추출하고 슬라이드에 배치합니다. 조심스럽게 상단에 커버 슬립을 배치하고 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉. 안테나는 지금 형광 현미경으로 몇 군데 준비가​​ 된 것입니다. </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

우리가 설명하는 초파리 안테나의 해부는 단순하고 실험실 환경에서 수행하기 쉽습니다. 성공적인 절개를 보장하기 위해, 그것을 잘 양날 가위를 사용하는 것이 필수적입니다. 해부 안테나를 면역 염색 동안, 항체 용액의 증발을 방지하기 위해 습기가 채워진 용기들을 배양하는 것이 중요하다. 해부 안테나 솔루션에 떠있는 경향이있다. 고정 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤을 사용하고 단계를 차단하는 솔루션에 안테나의 침수를 용이하게하고 더 나은 염색을 보장합니다. &quot;유리 바닥 배양 접시&quot;를 사용하여 면역 염색 중에 안테나의 손실을 줄이고, 각 실험에 사용 된 항체 용액의 소량 (90 μL)를 지킬 수 있었다. 신경 세포 수준의 다양 화는 신경의 핵심 기능입니다. 이 생리적 과정은 후각 수용체 신경 세포의 큰 배열을 이용하여 후각 시스템 (ORN)에 예시되어클래스. 후각 수용체 발현 및 축삭 타겟팅 ORNs의 다양한 세대 높은 뇌 센터에 악취 분자로부터 정...

후각 시스템은 악취 분자의 거대한 다양한 구분할이어서 높은 뇌 센터에 생성 된 정보를 전송하기 위해 사용된다. 이 입력은 정확히 같은 먹이와 짝짓기 1-6로 기본적인 동물의 동작을 제어하는 데 사용됩니다. 각각의 후각 신경 세포의 종류가 냄새의 특정 세트, 후각 수용체 뉴런의 다양 화와 연관 될 때 (ORN)의 적절한 후각 시스템 기능 7 필수적이다. 초파리 유전학 ORN 개발 및 생리 기능 8-16과 관련된 분자 메커니즘을 포함하는 단일 세포 수준의 연구를 수행하는 가능하게한다. 초파리 안테나의 전체 마운트 면역 염색은 더 자세히 후각 수용체 뉴런의 다양 화에 관련된 분자 메커니즘 (ORN)의 7을 이해할 수있게되었습니다. 여기에서 우리는 교류에 간단한 방법의 포괄적 인 설명을 제공이 hieve.

<table><tbody><tr><td>Stemi DV4 해부 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 문화 접시&nbsp;</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>쥐 anti-ELAV</td><td>발달 연구 Hybridoma Bank</td><td>7E8A10</td><td>희석 1:200</td></tr><tr><td>마우스 anti-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>희석 1:400</td></tr><tr><td>당나귀 Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-225-152</td><td>희석 1:200</td></tr><tr><td>당나귀 항 쥐 IgG</td><td>잭슨 면역 연구소</td><td>712-165-150</td><td>희석 1:200</td></tr></tbody></table>

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

악취 물질 분자는 정확하고 조정 된 방법으로 자신의 목표 수용체에 결합한다. 각 수용체는 특정 신호를 인식하고 뇌에 정보를 중계한다. 이와 같이, 후각 정보 인식과 행동, 장점 조사를 모두 수정, 뇌에 전달하는 방법을 결정하는 단계를 포함한다. 흥미롭게도, 세포 전달 및 전사 인자는 후각 수용체 신경 세포의 다양 화에 관여하는 것을 새로운 증거가있다. 여기에서 우리는 강력한 전체가 생체 내 후각 수용체 신경 세포 조직을 분석 실험하는 면역 표시 방법을 마운트 제공합니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 안티 ELAV 항체 알려져 팬 신경 마커 Or49a-mCD8 :: GFP, 특히 안티 GFP 항체를 사용하여 NBA의 신경 세포에서 발현 후각 수용체 신경 세포의 모든 후각 수용체 뉴런을 확인했다.

해부 및 고정 모두가 신속하게 수행하는 것을 보장하는 것은이 프로토콜을 사용하여 성공을 달성하는 핵심 요소입니다. 미세 가위와 집게를 사용하면 매우 중요합니다. 면역 염색 한 후, 형광 표지 된 안테나는 공 초점 현미경으로 관찰 하였다. 우리는 일반적으로 20 배 렌즈를 사용하여 1 ㎛ 섹션을. 우리는 NBA에게 Or49a-mCD8 :: GFP를 사용하여 7 ORNs을 표시하고 야생 형 안테나의 NBA ORNs의 수를 세었다. mCD8-GFP 기자 세포막 지역화 등 표현은 그림 GFP를 표현 OR49a ORNs 2 전시 세포막에서 볼. 그림 2에서 안티 GFP 항체 및 항 ELAV가 팬 신경 마커로 사용을 사용하여 NBA ORNs 표정을 보여줍니다. 안테나 당 농구 (NBA) ORNs의 평균 수는 20 (N = 8). <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" sr...

여기에서는 후각 수용체 뉴런(ORN)의 다양화와 관련된 분자 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있도록 초파리 더듬이의 전체 마운트 면역 염색 과정을 설명합니다.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

다음 실험의 전체적인 목적은 전체 마운트 촉각 염색을 통해 후각 수용체 뉴런을 시각화하는 것입니다. 먼저 파리를 마취시킨 후 머리를 수직으로 절단하십시오. 다음으로, 절단된 파리의 머리를 애플 플레이트에 놓으십시오.그 다음, 면역조직화학 염색을 수행하기 위해 안테나의 세 번째 마디를 절단하여 유리 바닥 배양 접시에 놓습니다. 안테나를 슬라이드 글라스에 마운팅한 후, 공초점 현미경을 통해 다양한 유형의 후각 수용체 뉴런을 시각화할 수 있습니다. 우리는 후각 시스템을 연구하고 있습니다.후각 시스템은 매우 다양한 분자들을 구별하는 데 사용됩니다. 이 시스템 내에 존재하는 광범위하고 뚜렷한 후각 신경세포들은 표적 수용체로부터 뇌 내 신경세포로 정보가 정밀하고 조율되게 전달될 수 있도록 합니다. 오늘은 이러한 후각 수용체 신경세포의 다양성을 검출하기 위한 안테나 전체 마운트 염색법에 대해 설명하겠습니다.성공적인 전체 마운트 및 안테나 염색을 보장하기 위해, 프로토콜을 시작하기 직전에 고정액을 새로 준비하는 것이 매우 중요합니다. 초파리를 마취한 후, 핀셋으로 몸통을 잡고 머리 부분을 수직으로 절단합니다. 이제 절단된 안테나를 애플 플레이트 위에 조심스럽게 놓습니다.미세 해부 가위로 안테나의 세 번째 마디를 절단합니다. 디쉬 중앙에 고정액 90 µL를 넣습니다. 날카로운 바늘을 사용하여 절단된 안테나를 고정액으로 조심스럽게 옮깁니다.이제 고정 과정이 완료될 때까지 실온에서 40분 동안 그대로 둡니다. 세척액을 제거하면서 PBST로 안테나를 3회 세척하며, 각 세척 단계는 10분 동안 진행합니다. 먼저, 바늘을 사용하여 모든 안테나를 디시 중앙으로 모읍니다.그런 다음 디쉬 측면에서 용액을 제거합니다. 배양 중 교반은 필요하지 않습니다. 염색을 준비하기 위해 마지막 PBST 세척액을 제거하고, 챔버에 0.1%PBST에 희석된 5% horse serum 90 µL를 채워 고정된 더듬이를 블로킹합니다. 이후 블로킹 용액을 5% horse serum 혼합액에 희석한 1차 항체로 교체합니다.PBST 내에서, 안테나 시료의 건조를 방지하기 위해 1:400으로 희석한 mouse anti GFP와 1:200 농도로 희석한 rat anti eof 1차 항체를 사용합니다. 배양 접시 뚜껑에 젖은 티슈를 넣고 파라필름으로 감쌉니다. 그 다음, 젖은 티슈가 들어 있는 플라스틱 용기에 배양 접시를 넣습니다.48시간 후, 촉각을 1차 항체에 넣고 4°C에서 48시간 동안 배양합니다. PBST로 10분씩 6회 세척하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거합니다. 이는 이전에 설명한 고정액 제거 절차와 유사합니다.1시간 동안 PBST로 세척한 후, PBST에 5% horse serum을 혼합하여 희석한 2차 항체 용액을 첨가합니다. 본 예시에서는 항체로 anti rabbit IgG와 anti rat IgG를 사용하였습니다. 이 시점부터는 광퇴색을 방지하기 위해 용기를 알루미늄 호일로 덮습니다. 다음으로, 4 °C에서 48시간 동안 2차 항체 내에서 안테나를 배양합니다.이제 안테나를 장착할 준비가 되었습니다. 배양 접시에서 PBST를 최대한 제거하고, 안테나에 글리세롤을 점진적으로 도입하기 시작합니다. 이어서 40% glycerol을 접시에 넣고 1~2분간 둔 다음, 이를 제거하고 80% glycerol을 추가하여 5분 동안 둡니다.형광 염색을 통해 Elof 양성 뉴런과 표적 후각 뉴런을 확인하였습니다. 후각 뉴런 유전자 모자이크 생성 등 다른 유사한 방법들과 이 절차를 결합함으로써, 후각 뉴런 탈분화의 기계적 제어를 시작하고 다른 중요한 과학적 질문들에 대한 답을 얻고자 합니다.

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신경과학

우리는 생활 antennal 엽에서 냄새 evoked 칼슘 반응을 측정하고 분석하기 위해 설립 기법을...

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

등의 연결을 dendrites 같은 복잡한 세포 모양은, 개발하는 동안 달성하는 방법 이해하기 위하여, 정확하게 분석 미세 소관 기관 수 있도록 중요합니다. 여기 돌기 arborization의 신경 감각 dendrites의 미세 소관 조직, 기관, 근육을 검토하는 강력한 immunohistological 라벨링 방법을 설명 및...

Immunohistological 감각 신경 세포의 Dendrites에 Microtubules의 라벨링, Tracheae, 그리고 근육에 Drosophila 유충 바디 벽

우리는 중추 신경 시스템에 하나의 뉴런을 라벨에 대한 기술 (CNS)의...

의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨<em&gt; Drosophila melanogaster</em

후각 감각 뉴런의 섬모는 신호 전달 캐스케이드의 단백질을 포함하고 있지만, 냉동 절편에서 그 분포에 대한 자세한 공간 분석은 어렵습니다. 여기에서는 전체 마운트 라벨링 및 섬모 단백질의 얼굴 시각화를 위한 최적화된 접근 방식에 대해 설명합니다.

마우스의 메인 후각 시스템의 섬모의 전체 마운트 라벨링

이 프로토콜의 전반적인 목표는 장쇄 사상 페로몬에 반응하는 Drosophila 후각 수용체 뉴런으로부터 단일 감각 기록을위한 낮은 휘발성의 냄새 물질을 제시하는 방법을 입증하는 것입니다.

에서 전기 생리 학적 기록<em&gt; Drosophila</em&gt; 낮은 휘발성의 냄새에 반응하는 Trichoid Sensilla

셀 다른 형태학을 표시 하 고 그들의 이웃과 상호 작용의 다양 한 설정. 이 프로토콜에는 단일 세포의 형태를 공개 하 고 확고 Gal4/UAS 식 시스템을 사용 하 여 세포 세포 상호 작용을 조사 하는 방법을 설명 합니다.

높은 해상도 단일 셀 형태학 초파리 에서 명과의 세포 상호 작용을 공부 하 고 다 색 FlpOut 기술의 응용

여기, 우리는 무대와 초파리 종에서 후 각 조직 개발 해 부 프로토콜을 제시. 있으 나 해 부 조직 immunohistochemistry 또는 제자리에서 같은 비보에 분석 뿐만 아니라 양적 RT-PCR (반전 전사-연쇄 반응) 또는 시퀀싱 (RNAseq), RNA와 같은 분자 분석에 대 한 나중에 사용할 수 있습니다. 교 잡입니다.

주변 후 각 조직에 대 한 개발 준비 분자와 초파리 의 Immunohistochemical 분석

이 프로토콜은 후각 회로 어셈블리의 연구를 위한 안테나-뇌 explant 시스템의 해부 절차, 배양 조건 및 라이브 이미징을 기술한다.

초파리의 후각 회로 어셈블리의 타임랩스 이미징 연구를위한 Explant 시스템

여기에서는 초파리 청소년 뇌에서 더듬이엽 시냅스 사구체의 후각 경험 의존적 리모델링을 유도하고 분석하는 방법을 설명합니다.

Experience-Dependent Remodeling of Juvenile Brain Olfactory Sensory Neuron Synaptic Connectivity in an Early-Life Critical Period(어린 뇌 후각 감각 뉴런 시냅스 연결성의 경험 의존적 리모델링)

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)은 확장 현미경 검사와 FISH(Fluorescence in situ hybridization)를 결합하여 두꺼운 조직에서 여러 유전자의 발현을 검출하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜은 이 방법의 최근 발전과 온전한 초파리 중추 신경계를 라벨링하기 위한 적응을 간략하게 설명합니다.

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization을 사용한 온전한 초파리 뇌의 유전자 발현의 다중 검출

이 글에서는 시약을 경제적으로 사용하고 소수의 상상 디스크를 쉽게 다룰 수 있는 효율적인 상상 디스크 해부 및 항체 염색 프로토콜을 설명합니다.

Drosophila melanogaster의 눈-더듬이 및 날개 상상 디스크의 소규모 해부 및 항체 염색

학습하세요 Drosophila 안테나의 전체 마운트 면역염색을 통해 후각 수용체 뉴런을 시각화하는 방법을. 이 기술은 ORN 다양화의 분자 메커니즘을 이해하는 데 도움을 줍니다.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling

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