Ligatable 형광 프로브에 의한 실험 스트로크에서 세포 죽음의 식세포 정리 평가

이 절차의 전반적인 목표는 뇌졸중 시 세포 시체를 제거하는 활성 식세포 세포를 선택적으로 라벨링하는 것입니다. 이는 먼저 Tite 기반 신호 증폭 반응을 위한 구성 요소를 준비하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 섹션을 준비하는 것입니다.

다음으로, 효소 vaccinia, topoisomerase 및 책임 형광 프로브를 사용하여 라벨링 반응을 수행합니다. 마지막 단계는 IDE 기반 형광 신호 향상입니다. 궁극적으로, 형광 현미경 검사는 국소 뇌 허혈의 조직 절편에서 죽은 세포의 식세포 제거를 평가하는 데 사용됩니다.

식세포에 의한 죽은 세포의 제거는 허혈 후 뇌 회복에 중요한 역할을 합니다. 제시된 방법은 죽은 세포를 능동적으로 제거하는 페고 크기에만 라벨을 표시하여 이 프로세스의 효율성을 결정합니다. 이 방법은 허혈성 뇌에 대한 통찰력을 제공하지만 다른 장기 및 조직의 허혈성 손상을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다.

죽은 세포의 FA 산성 제거가 중요한 경우. IDE 신호 증폭 또는 TSA 단계는 라벨링의 마지막 단계에서 발생하지만 이 반응을 준비하는 데 한 시간 이상이 걸릴 수 있습니다. 따라서 TSA 시약을 먼저 만드는 것이 더 편리합니다.

첫 번째 단계는 300마이크로리터의 DMSO에서 TSA 라벨링 키트에 포함된 tyrom 시약 파일로 fluoro four TYROM 원액을 만드는 것입니다. 다음으로, TNT 세척 완충액을 준비하여 차단 시약을 완전히 용해시킵니다. TNB 차단 버퍼를 만들 때 용액을 섭씨 55도까지 서서히 가열하면서 저어주면서 조금씩 천천히 첨가하십시오.

지속적으로 교반하면 용액이 유백색으로 보이며 부분 표본을 사용하기 전에 실온에 보관하고 장기간 사용하기 위해 섭씨 영하 20도에서 보관해야 하며, 이 절차를 위해 5마이크로미터 두께의 섹션을 장착하여 슬라이드를 미리 준비합니다. 포르말린 고정 조직에서 자릅니다. 먼저 15분 동안 크실렌으로 섹션을 처리하고 일련의 에탄올 세척을 통해 섹션을 재수화한 다음 물로 두 번 세척합니다.

다음으로, 원액을 PBS에서 밀리리터당 50마이크로그램으로 희석하여 proteinAse K 작동 용액을 만듭니다. 이 실험에서 가장 어려운 부분은 단백질분해효소 K 소화 조절의 이상적인 시간을 결정하는 것이며, 조직의 크기와 유형에 따라 성공을 보장하기 위해 더 짧고 긴 소화 시간이 필요할 수 있습니다. 적절한 부피의 단백질 ACE K 작업 용액을 절편에 추가하고 섭씨 23도에서 15분 동안 배양합니다.

배양 후 증류수로 각 5분씩 두 번 섹션을 세척합니다. 섹션이 담그는 동안 활성 프로브가 포함된 라벨링 혼합물을 준비합니다. 활성 프로브 용액을 준비하기 위해 올리고뉴클레오티드를 물과 1몰, HCL 및 키트에 제공된 백시니아 토포이소머라제와 피펫팅으로 부드럽게 혼합하고 프로브가 활성화될 수 있도록 실온에서 15분 동안 배양합니다.

두 번째 세척 기간이 끝나면 항아리에서 부분을 제거하고 남은 물을 흡입합니다. 준비가 되면 이전에 준비한 활성 프로브 용액을 커버합니다. 섹션을 미끄러져 섭씨 23도에서 15분 동안 배양합니다.

배양 후 슬라이드를 물에 담그고 커버 슬립을 부드럽게 제거합니다. 슬라이드를 각각 5분씩 세 번 물로 씻습니다. 마지막 세척 후 조직 부분을 TNB 차단 버퍼로 덮고 실온에서 30분 동안 가습 챔버에서 슬라이드를 배양합니다.

이 시간 동안 벗겨진 과산화효소 접합체를 1-100 희석하여 준비합니다. S-A-H-R-P를 TNB 블로킹 버퍼에서 슬라이드를 검색하고 TNB 블로킹 버퍼를 흡인합니다. S-A-H-R-P 용액을 바르기 전에 전체 조직 부분을 덮을 수 있을 만큼 충분한 시약을 사용하십시오.

뚜껑을 덮고 나면 실온에서 30분 동안 슬라이드를 배양합니다.배양 후 슬라이드를 각각 5분씩 세 번 세척합니다. 실온의 TNT 세척 완충액에 1-50 희석액을 1 x 증폭 희석액으로 사용 직전에 준비합니다. 조직 섹션을 완전히 덮는 슬라이드에 용액을 피펫으로 주입합니다.

용액은 재사용할 수 없으므로 사용하지 않은 부분은 모두 버리십시오. 슬라이드를 실온에서 3-10분 동안 배양합니다. 형광을 모니터링합니다.

이때 구조의 첫 번째 힌트가 보일 때까지 현미경으로 증가시킵니다. 세탁 단계를 빠르게 진행하십시오. 슬라이드를 각각 5분씩 세 번 세척합니다.

TNT에서 교반과 함께 실온에서 완충액을 세척합니다. 세탁 후 DPI와 커버 슬립으로 변색 방지 용액을 첨가하십시오. 형광 현미경으로 결과를 관찰합니다.

이 이미지는 PHA 산성 제거의 두 가지 예를 보여줍니다. 핵 염색 dappy는 파란색 형광으로 표시되고 책임 vac topo 프로브는 녹색 형광 다이어그램으로 표시되며, 이 이미지에 표시된 이벤트의 다이어그램은 다양한 소화 단계에서 식세포의 핵과 틱이 여분의 핵을 삼켜 있음을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 3시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 비디오를 시청하면 조직 절편에서 책임 있는 형광 프로브를 사용하는 방법을 알게 될 것입니다. 또한 허혈성 뇌에서 죽은 세포를 제거하는 활성 ides에 선택적으로 라벨을 붙일 수 있습니다.