Name: 현지화 번역의 메커니즘을 연구하는 효모 미토콘드리아와의 mRNA 관련의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-14T17:50:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: 배우세요 효모에서 번역 중인 mRNA와 결합된 미토콘드리아를 분리하는 방법을. 차등 원심분리를 통해 세포질 성분으로부터 미토콘드리아를 분리하고 북부 분석으로 RNA 품질을 검증합니다. 이 기술은 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는 Drs에 감사드립니다. Erez Eliyahu, 다니엘 멜라 메드, Ophry 소나무와이 프로토콜의 설립시 도움과 의견을 주셔서 도론 라파. 이 작품은 ISF (허가 번호 1193년에서 1109년까지)에 의해 투자된다.

1. 미토콘드리아 정화 세포의 펠렛을 단다. 약 0.6 g을 100 ㎖의 세포에서 얻을 수있다. <ol><li> 30에서 600 = 1.5 과다 복용 효모 세포의 100 ~ 150 ㎖의 성장 미토콘드리아에 대한 풍부하기 위해, 이러한 갈락토스 기반 성장 매체로서 nonfermentable 성장 배지에 C를 °. </li><li> 원심 분리기 세포 실온에서 5 분 3,000 XG에 상층 액을 버린다. </li><li> 다시 증류수와 원심 분리기와 펠렛을 씻으십시오. 상층 액을 버린다. </li><li> 세포의 0.5 g 당 1 ㎖ DTT 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 그것에 의해 가수 분해를 향상 세포벽 내 이황화 결합을 파괴하기 위해 환원제로 세포를 치료하는 데 중요하다. </li><li> 30에서 10 분 동안 세포를 배양한다 부드러운 흔들림와 C를 °. 한편, 세포 1g 당 6 밀리그램 zymolyase의 무게를 Zymolyase 버퍼에 일시 중지합니다. </li><li> 5 분 3,000 XG에 원심 분리기 세포T 실내 온도와 상층 액을 버린다. </li><li> 세포의 0.15 g 당 1 ㎖ Zymolyase 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 없는 소용돌이를 수행합니다. </li><li> 물 990 μL에있는 세포의 10 μL 나누어지는의 OD 600을 측정합니다. </li><li> β-1, 3 - 글루칸 결합에 포도당 중합체를 가수 분해 spheroplasts를 생성하는 세포에 Zymolyase (단계 1.5)를 추가합니다. 이 단계에서, spheroplasts 용균을 피하기 위하여 등장액에 보관한다. </li><li> 부드러운 흔들림으로 30 ° C (zymolyase 최적의 활동에 대한)에서 15 분 동안 세포를 품어. 세포벽과 spheroplasts 세대의 가수 분해를 확인하기 위해, 물 990 μL와 세포의 10 μl를 섞는다. Spheroplasts 인해 삼투압 차이에 용해 할 것으로 예상되고, OD (600)은 적어도 1.9 단계에서 결정된 값 미만을 10 배량한다. 그렇지 않을 경우, 또 다른 15 분 동안 zymolyase과 배양을 계속합니다. </li><li> 상온에서 5 분 3,000 XG에 원심 분리기 세포. 조심스럽게 병에 감염카드 상층 액, 펠릿으로 불안정 할 수 있습니다. </li><li> Zymolyase 버퍼 spheroplasts을 세척하고 상층 액을 버린다. </li><li> 100 ㎖의 복구 매체와 spheroplasts을 재현 탁. 삼각 플라스크에 spheroplasts를 전송하고 30에서 1 시간 동안 배양 동요와 C를 °. Zymolyase 처리 번역 중에 체포되고, mRNA의 현지화 (그림 1B) 중단되기 때문에이 복구 단계가 필요합니다. </li><li> 예비 냉각 50 ML 원뿔 튜브에 0.1 ㎎ / ㎖의 CHX 및 전송 spheroplasts를 추가합니다. CHX의 추가의 mRNA와 리보솜 협회를 동결하는 것이 중요합니다. 따라서, 미토콘드리아와 리보솜에 의존하는 mRNA의 관계가 유지됩니다. </li><li> 원심 분리기 spheroplasts 4 ° C에서 5 분 3,000 XG에 상층 액을 버린다. </li><li> 차가운 만니톨 버퍼로 두 번 씻으십시오. </li><li> 4 ML 차가운 만니톨 버퍼 spheroplasts을 재현 탁하고 꽉 끼는을 갖춘 15 ㎖의 용량의 다운스 균질로 전송유. 조심스럽게 15 선을 spheroplasts을 중단하고 13 ML 튜브에 해물을 전송합니다. </li><li> 핵 및 손상되지 않은 세포를 펠렛 4 ° C에서 10 분 동안 1,500 XG에서 해물을 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 미분 획 샘플 ( &quot;전체&quot;샘플)로 옆으로 시료 1 ㎖ (25 %)을 설정합니다. 새로운 튜브로 전송이 샘플 50 ㎖ 및 웨스턴 블롯 분석을위한 4 배 LSB 15 ㎖를 추가합니다. &quot;총&quot;샘플의 나머지 침전물 RNA는 (프로토콜 3, RNA 침전 참조). </li><li> 4시 10 분 10,000 XG에 뜨는을 원심 분리기 미토콘드리아 펠렛 C를 °. </li><li> 새로운 튜브에 뜨는 (~ 3 ㎖)를 전송하고 얼음에 보관. 이것은 &quot;세포질&quot;조각이다. 새로운 튜브로 전송이 샘플 50 ㎖ 및 웨스턴 블롯 분석을위한 4 배 LSB 15 ㎖를 추가합니다. &quot;세포질&quot;샘플의 나머지 침전물 RNA는 (보호 해주는에게보기ocol 3, RNA 침전). </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 10,000 XG에 다시 3 ㎖ 만니톨 버퍼와 원심 분리기와 펠렛을 씻으 </li><li> 3 ㎖ 만니톨 버퍼와 펠렛을 Resuspend. 이 샘플은 미토콘드리아를 포함하고 &quot;미토콘드리아&quot;분수로 함. 새로운 튜브로 전송이 샘플 50 ㎖ 및 웨스턴 블롯 분석을위한 4 배 LSB 15 ㎖를 추가합니다. </li></ol> 2. RNA 추출 <ol><li> 각 샘플에 8 M 구 아니 디늄-HCl을 하나의 볼륨 및 100 % 에탄올 두 개의 볼륨에 추가합니다. 소용돌이 -20 적어도 2 시간 동안 배양 ° C. </li><li> 4 20 분 10,000 XG에 원심 분리기 샘플 ° C. 상층 액을 버린다. 펠릿이 불안정 할 수 있습니다로주의해야합니다. </li><li> 70 % EtOH로 펠렛을 씻으십시오. </li><li> RNase가없는 물 400 ㎖로 펠렛을 재현 탁하고 새로운 에펜 도르프 튜브에 샘플을 전송합니다. </li><li> 3 M 나트륨 acetat 0.1 볼륨을 추가하여 다시 RNA를 침전전자의 pH 5.2와 100 %의 EtOH 두 권. 소용돌이 -20 적어도 2 시간 동안 배양 ° C. </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 20,000 XG에 원심 분리기 샘플 뜨는을 취소하고 70 % EtOH로 세척한다. </li><li> 공기는 펠렛을 건조 및 RNase가없는 물에 재현 탁. -80에서 보관 RNA 샘플 ° C. 샘플 북부 분석 19 또는 마이크로 어레이 분석 18 (프로토콜 3 참조)를 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 마이크로 어레이 분석을위한 RNA 준비 <ol><li> RNase가없는 물 650 mL를 2.2 단계에서의 mRNA를 재현 탁. </li><li> 적극적으로 클로로포름 (5:1의 pH 4.7)와 소용돌이 : 잔여 DNA 또는 단백질을 제거하려면, 같은 산성 페놀의 양 (650 ㎖)에 추가합니다. 2 분 동안 최대 속도로 원심 분리기. </li><li> 새로운 튜브로 위 상 (수상) 500 ㎖를 전송합니다. 그것은 DNA가 들어 있으므로, 계면을 복용하지 마십시오. 또한, 역전사 반응을 억제 할 수있는 페놀을 복용에주의. &lt;/ 리&gt; <li> RNA 샘플은 역전사 효소의 강력한 억제제이다 헤파린의 상당한 양이 포함되어 있습니다. 따라서, RT-PCR 또는 마이크로 어레이 라벨링을 위해 제거 될 필요가있다. LiCl을 침전에 의해 헤파린을 제거 2 M의 최종 농도로하여 LiCl을 추가하고 -20에서 밤새 샘플을 품어 ° C. </li><li> 4에서 샘플을 해동 ° C와 11 ° C에서 20 분 동안 20,000 XG에 원심 분리기 </li><li> 조심스럽게 뜨는을 취소하고 80 % 에탄올로 펠렛을 씻으십시오. 단계 3.5에 설명 된대로 다시 원심 분리기. </li><li> 상층 액, 공기 건조를 취소하고 RNase가없는 물 150 ㎖에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 잔류하여 LiCl을 제거하려면, 3 M 아세트산 나트륨의 pH 5.3의 0.1 볼륨 및 100 % 에탄올의 전 3 권으로 다시 침전. -20 품다 최소 2 시간 동안 C를 °. </li><li> 4에서 20 분 동안 최고 속도로 원심 분리기 ° C. 80 %의 에탄올과 건조한 공기로 조심스럽게 투명 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 재현 탁25 ㎖의 RNase가없는 물과 펠렛 -80에서 샘플을 유지 ° C. </li><li> (18, 20)에 설명 된 RNA의 라벨 및 하이브리드의 단계를 따릅니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

이미징 기술의 발전은 mRNA의 현지화를 연구하는 높은 해상도 도구를 산출했다. 오늘날, 하나는 msec의 시간 스케일 23-26이라도 단일의 mRNA 분자의 움직임을 측정 할 수있다. 그러나, 전통적인 생화학 적 접근법은, 상술 한대로, 또한 유익한 일부 경우에 바람직하다. 생화학 격리의 mRNA 및 단백질의 큰 레퍼토리의 정화를 허용하고, 게놈 넓은 연구에 대한 것이 바람직하다. 하나의 분리, 하나는 DNA 마이크로 어레이 또는 RNA-SEQ 18,27 의해 하나, 수천 개의 유전자의 특성화를 허용하도록 충분한 mRNA 수준을 얻을 수있다. 이와 병행하여, 하나의 단백질을 분리 및 미토콘드리아 28 프로테옴을 특성화 단백질체 분석을 수행 할 수있다. 생화학 fractionations은 ER (29) 특히, 다른 세포 소기관 미토콘드리아로부터 분리하도록 구성 될 수있다. 이것은 세포의 몇 가지 유형에 유리할 수있다 높은 공간 중첩이 있었다ER 및 ...

진핵 세포는 특정 기능을 가지는 별개의 구획으로 구성되어 있습니다. 그 기능을 수행하기 위해, 각 구획의 활동에 필수적인 단백질의 고유 한 집합이 포함되어 있습니다. 이 단백질은 자신의 구획에 접근 통해 가능한 메커니즘은 로컬 라이즈 1,2입니다. 이 과정에서, 단백질은 리보솜 군데 위치에서 mRNA를 대상으로 합성된다. 현지화 번역의 가능성 장점이 단백질의 타겟팅의 효율성을 증가하는 가운데, 단백질 보호자에 필요한 감소하고, 사이트 별 규제 메커니즘을 가능하게한다. 또한, 지역화의 mRNA와 리보솜은 일반 번역이 억제되어 세포 스트레스의 경우 번역 기계의 외딴 저장 될 수 있습니다. 미토콘드리아는 최근 몇 년 동안 현지화 번역을 연구 중심 모델이되었다. 대부분의 미토콘드리아 단백질은 세포질로 번역 핵, 인코딩 된와 세포 기관으로 수입. 증거의 다양한 라인이 단백질의 많은 지역의 번역 과정을 통해 생산되는 것을 나타냅니다. 처음에는 전자 현미경 및 생화학 적 분류 연구는 미토콘드리아 3-5과 관련된 변이를 발견했습니다. 다음 만 cotranslational 방식으로 6,7 가져온 것으로 나타났다 특정의 mRNA에 일에 의해 생체 내에서 뒷받침 이러한 연구. 미토콘드리아와의 mRNA 협회의 게놈 넓은 연구의 mRNA의 상당 부분이 미토콘드리아 부근 8-10로 지역화 된 것으로 나타났다. 이들의 mRNA 중 일부는 또한 생선이나 MTAG 9, 11 등의 생체 내 형광 방법을 특징으로했다. 이 협회의 직선적 해석은 이들의 mRNA가 현지화 번역에 대한 템플릿 역할을한다는 것입니다. 이들의 mRNA가 미토콘드리아에 접근하는 메커니즘은 알려져 있지 않다. 비 암호화 도메인 (대부분의 significantlY 3 &#39;의 UTRs)은 미토콘드리아 12 mRNA의 연관에 관여하는 것으로 나타났다. 이 도메인은 자신의 전송을 중재 RNA 결합 단백질에 결합 부위의 역할을 할 가능성이있다. 효모의 연구는 단백질의 PUM 가족 (Puf3)의 회원이 미토콘드리아 8,13와 mRNA의 연결을 지원하는 것으로 나타났다. 다른 가족 구성원의 기능을 기반으로 Puf3에 대한 그럴듯한 역할은 mRNA의 라우팅 14 엉 동안 번역을 억제하는 것입니다. 따라서,의 mRNA는 비 암호화 영역과 상호 작용하는 RNA 결합 단백질에 의해, 비 번역 상태로 운송 할 수있다. 또한, 작품의 큰 몸은 단백질이 합성되는 동안 전송이 발생하는 것이 좋습니다. 특히, 번역 억제제의 mRNA에게 연결 8,13에 영향을 표시했다. 또한, 같은 8월로 번역 기능은, 미토콘드리아 타겟팅 순서 (MTS) 또는 ORF 영역은 현지화 8,11,15에 도움을 나타내었다. HSP70 세대 단백질 채널미토콘드리아 외부 막에 aperone 단백질 수용체는 또한 추가로 인코딩 된 단백질의 기능은 mRNA의 현지화 16 중요하다는 것을 의미한다, mRNA의 연결을 지원하기 위해 표시했다. 이는 리보솜 대두 단백질이 미토콘드리아에 17의 mRNA-리보솜 단백질 복합체를 표적 인식을위한 요소로서 기능하는 모델과 일치한다. 미토콘드리아 부근의 현지화 된 번역은 전자 현미경 (리보솜을 시각화하기 위해) 3 FISH 9, (특정의 mRNA를 검출하는) 녹색 RNA 11, 생화학 적 분류 (RNA와 리보솜을 모두 감지하는) 10,18 등 다양한 방법으로 연구 하였다. 전자의 방법은 생체 내에서 현지화를 감지하고 전송 역학의 시각화를 허용 할 수 있지만, 후자는 하나의 실험에서 여러 가지의 mRNA를 검출 할 수 있습니다. 또한, 생화학 분류 코딩 또는 비 암호화 도메인에 대해 알 수 필요가 없습니다까지 입력 그러므로 특정 역할이 평가 될 수있다. 생화학 분별 성공적 많은 다른 세포 구획 분리를 위해 수년 동안 사용되어왔다. 그 원칙과 한계는 잘 설립하고, 하나는 쉽게 다른 목적을 위해 기존의 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 필요한 장비, 따라서 그것은 일반적으로 세포 내 현지화를 공부에 대한 선택의 첫 번째 방법이다, 많은 실험실에서 표준입니다. 우리는 리보솜이 미토콘드리아와 관련된 동안의 mRNA의 분리에 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 따라서 미토콘드리아 부근의 현지화 번역에 관련된 요인을 공부에 최적입니다.

<table><tbody><tr><td>효모 추출물</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td></td><td></td> 갈락토오스 <td>성장 배지</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>를 오토클레이브하지 마십시오 <td>미토콘드리아 농축을 위해 갈락토오스 기반 성장 배지 살균 1% 효모 추출물, 2% 박토펩톤, 2% 갈락토스</td></tr><tr><td>0.1 M Tris-HCl, pH 9.4</td><td>와 같은 비fermentable 탄소원을 사용해야 합니다.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30mM Tris-HCl, pH 7.6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨(DTT)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10mM DTT 완충액</td><td></td><td></td><td>0.1m TrisHCl pH 9.4, 10mM 디티오트레이톨(DTT). 매번 신선하게 만드십시오</td></tr><tr><td>1.2 M 소르비톨</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 mM KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 mM K2HPO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &#956; m 필터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>자이몰랴제 완충액</td><td></td><td></td><td>1.2 M 소르비톨, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. 이 버퍼를 필터링합니다(0.2 &#956; m) 및 향후 사용을 위해 실온에 보관</td></tr><tr><td>Zymolyase 20T</td><td></td><td></td><td>20,000 U/g</td></tr><tr><td>회수 배지</td><td></td><td></td><td>갈락토오스 기반 성장 배지에 1 M 소르비톨</td></tr><tr><td>0.1 mg/ml 시클로헥시미드(CHX)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.6 M 만니톨</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM MgAc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mg/ml 헤파린</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM 페닐메탄설포닐플루오라이드(PMSF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>만니톨 완충액</td><td></td><td></td><td>0.6 m 만니톨, 30 mM 트리스-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. 새로 추가: 0.5 mg/ml 헤파린, 0.1 mg/ml CHX 및 1mM (PMSF). 이 완충액을 여과하고 얼음처럼 차갑게 사용하십시오</td></tr><tr><td>8 M Guanidinium-HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 % 및 70 % 에탄올 (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>3 M 아세테이트 나트륨, pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 M LiCl 원액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mM Tris HCl pH 6.8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&#946;-메르캅토에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x LSB</td><td></td><td></td><td>250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% 글리세롤, 20% &#946;-메르캅토에탄올 및 0.02% 브로모페놀 블루</td></tr><tr><td>Dounce 15 ml 용량의 균질화기 타이트한 유봉</td><td></td><td></td><td></td>이 장착되어</tr></tbody></table> 있습니다.

현지화 번역의 메커니즘을 연구하는 효모 미토콘드리아와의 mrna 관련의 분리

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

미토콘드리아 단백질의 대부분은 핵으로 인코딩 및 세포 기관으로 수입 할 필요가있다. 단백질이 미토콘드리아 근처에 합성하는 동안 수입이 발생할 수 있습니다. 이 가능성에 대한 지원은 미토콘드리아 단백질을 코딩하는 많은의 mRNA가 미토콘드리아 부근에 지역화하는 것으로 된 최근 연구에서 파생됩니다. 함께 외부 막과 리보솜 협회 이전 시위, 이러한 결과는 현​​지화 번역 과정을 제안한다. 현지화 번역, 수입 효율을 향상 독특한 규제 사이트를 제공하고 자궁외 표현의 경우를 최소화 할 수 있습니다. 다양한 방법이 지역화 된 번역을 중재 요인과 요소를 특성화하기 위해 사용되어왔다. 이 가운데 표준 차동 원심 분리하여 세포 내 분획이다. 이 프로토콜은 하나의 절차에서 mRNA가 리보솜 단백질의 분리의 장점이 있습니다. 이들은 다음 다양한 분자량 및 BI에 의해 특성화 될 수있다ochemical 방법. 또한, transcriptomics 및 프로테오믹스 방법하여 게놈 넓은 통찰력에게 수, 생성 된 물질에 적용 할 수 있습니다. 이러한 연구의 모델 생물로 효모의 활용 속도, 비용과 단순성의 이점이있다. 또한, 진보 된 유전 도구와 사용 가능한 삭제 균주 후보 요인의 검증을 용이하게한다.

이 프로토콜은 세포질 구성 요소에서 미토콘드리아 함유 부분을 분리 할 수​​ 있습니다. 성공을 테스트하는 가장 좋은 방법은 다른 분리 단계에서 샘플을 분석 북부와 서부 분석 (그림 1) 수행하는 것입니다. 격리 품질에 대한 세 가지 매개 변수는이 분석에서 파생됩니다. 첫째, 샘플에서 RNA 나 단백질은 손상 여부 - 이러한 분석에서 뚜렷한 밴드로 감지됩니다. 분해 이벤트를 추가, 짧은 밴드 또는 얼룩의 모양을 유도 할 것이다. 둘째, 입력 (즉, 전체)로부터의 신호와 각 단계에서의 신호를 비교하는 제제 중에 손실에 관한 중요한 정보를 제공한다. 심한 손실은 전체 신호의 상대적인 양 사이의 상당한 차이로 관찰 될 것이다. 마지막으로, 가장 중요한 미토콘드리아와 세포질 성분들 사이의 분리의 품질이 결정될 수있다. 그대로 mitochondri의 분리는 미토콘드리아 분획이 아닌 세포질 분획 (그림 1A)에서 미토콘드리아 전사 증명서를위한 신호가 발생합니다. ...

미토콘드리아 단백질을 코딩하는 대부분의 mRNA는 미토콘드리아 외부 막과 연결되어 있습니다. 우리는 관련의 mRNA와 리보솜과 효모 미토콘드리아의 고립을 목표로 세포 내 분획 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 mRNA의 지방화의 메커니즘과 미토콘드리아 근처 현지화 번역을 표시하기 위해 다양한 조건에서 자란 세포에 적용 할 수 있습니다.

현지화 번역의 메커니즘을 연구하는 효모 미토콘드리아와의 mRNA 관련의 분리

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

이 절차의 전반적인 목표는 번역 중인 mRNA와 결합된 미토콘드리아를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 미토콘드리아 농축 조건에서 배양한 효모 세포를 수확함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 cycloheximide 존재 하에 세포를 부드럽게 용해하는 것입니다.다음으로 차등 원심분리를 통해 미토콘드리아를 가용성 성분으로부터 분리합니다. 마지막 단계는 미토콘드리아 및 대조군 샘플에서 RNA를 추출하는 것입니다. 최종적으로, northern 분석을 사용하여 미토콘드리아 관련 RNA의 순도와 품질을 확인합니다.이 기술의 주요 장점은 한 번의 조제 과정으로 다양한 종류의 RNA를 분리할 수 있다는 점입니다. 따라서 비교 분석이 가능합니다. 이 방법은 세포 내 타겟팅 및 소기관 기능과 같은 세포 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.본 실험 과정에서는 비발효 성장 배지에서 30 °C로 배양하여 OD 600이 1에서 1.5에 도달한 효모 세포 100~150 mL로부터 미토콘드리아를 정제합니다. 상온에서 3000 ×g로 5분 동안 세포를 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 펠렛을 2회 증류수로 세척한 뒤 다시 원심분리합니다.상층액을 버린 후 세포 펠렛의 무게를 측정합니다. 일반적으로 세포 100 milliliters당 약 0.6 grams이 얻어집니다. 세포 0.5 grams당 1 milliliter의 DTT 버퍼를 사용하여 펠렛을 재현탁합니다.세포벽 내의 이황화 결합을 끊어 가수분해 효율을 높이기 위해 세포를 환원제로 처리하는 것이 중요합니다. 세포를 30 °C에서 부드럽게 흔들어주며 10분 동안 배양하십시오. 다음으로, 실온에서 3000 ×g로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠렛을 재부유시키십시오.세포 0.15 g당 1 mL의 xmal liase 버퍼를 넣고 볼텍싱하지 마십시오. 990 µL의 물에 세포 10 µL 분주액을 희석하여 OD 600을 측정하고 이 값을 기록하십시오. 갓 제조한 xmal liase를 세포에 첨가하여 베타 1,3-글루칸 결합의 글루코스 중합체를 가수분해하고 구형세포벽제거물(Spheroplast)을 생성하십시오.이 단계 이후부터 lysis를 방지하기 위해 Sphero plast는 등장액 상태로 유지해야 하며, 세포를 30 °C에서 가볍게 흔들어주며 15분 동안 배양합니다. 세포벽의 가수분해와 sphere of plast 생성을 확인하려면, 세포 10 µL를 물 990 µL와 혼합하여 OD 600을 측정합니다. Sphero plast는 삼투압 차이로 인해 lysis가 일어날 것으로 예상되며, OD 600 값은 xmal liase를 첨가하기 전에 측정된 값보다 최소 10배 이상 낮아야 합니다. 그렇지 않은 경우, xmal liase와 함께 15분 더 배양을 계속하십시오.Plast의 PHE를 100 milliliters의 회복 배지로 재현탁하고, Plast 구체를 Helen Meyer Flask로 옮깁니다. 30 degrees Celsius에서 1시간 동안 흔들어주며 배양합니다. XYs 처리 과정 중에 번역이 중단되고 mRNA 국소화가 파괴되기 때문에 이 회복 단계가 반드시 필요합니다.1시간 후, 0.1 mg/mL의 cycloheximide를 첨가하고 spheroplast를 미리 냉각시킨 50 mL conical tube로 옮깁니다. ribosome과 mRNA의 결합을 고정시키기 위해 cycloheximide 첨가가 중요합니다. 이를 통해 ribosome 의존적인 mitochondria의 mRNA 결합 상태가 유지됩니다.원심분리기를 사용하여 4°C에서 3000 ×g로 5분 동안 원형 플라스크를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 차가운 mannitol 완충액으로 2회 세척합니다.4 mL의 차가운 manitol buffer로 plass 구체를 현탁하고, 이를 밀착형 유발이 장착된 15 mL 용량의 Dounce homogenizer로 옮깁니다. 15회 가볍게 눌러 plass 구체를 파쇄한 후 용해물을 13 mL 튜브로 옮깁니다. 용해물을 4 °C에서 1,500 ×g로 6분 동안 원심분리합니다.핵과 파괴되지 않은 세포를 펠렛화하기 위해서입니다. 상층액을 새 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 샘플의 1 mL 또는 25%를 분획되지 않은 샘플 또는 전체 샘플로 따로 보관합니다.이 시료 50 µL를 새 튜브로 옮기고 15 µL의 four XLSB를 첨가합니다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 나머지 전체 시료로부터 RNA를 침전시켜 노던 분석 및 마이크로어레이 분석에 사용합니다. 상층액을 10,000 ×g에서 원심분리합니다.4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 미토콘드리아를 펠렛화하기 위해 상층액을 새 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관합니다. 이것이 세포질 분획입니다.이 샘플 50 µL를 새 튜브로 옮기고 four XLSB 15 µL를 첨가합니다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 나머지 세포질 샘플에서는 노던 및 마이크로어레이 분석을 위한 RNA를 침전시킵니다. 펠릿을 3 mL의 mannitol 버퍼로 세척하고 10,000 ×g에서 다시 원심분리합니다.4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 펠렛을 3 mL의 mannitol 버퍼로 다시 현탁합니다. 이 샘플은 미토콘드리아를 포함하고 있으며, 이를 미토콘드리아 분획이라고 합니다.이 샘플 50 µL를 새 튜브로 옮기고 Western blot 분석을 위해 4X LSB 15 µL를 추가합니다. 이 절차를 시작하려면, 각 샘플에 8 M guanidinium HCl 1 부피와 100% ethanol 2 부피를 넣고 볼텍싱한 후 -20 °C에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 샘플을 4 °C에서 10,000 ×g로 20분 동안 원심 분리합니다.상층액을 버립니다. 펠렛이 불안정할 수 있으므로 주의하십시오. 70% ethanol로 펠렛을 세척한 후, 400 µL의 RNase free water로 펠렛을 현탁하여 샘플을 새로운 마이크로 튜브로 옮깁니다.0.1 부피의 3 M sodium acetate (pH 5.2)와 2 부피의 100% ethanol을 첨가하여 RNA를 다시 침전시킨 후, vortexing하고 -20 °C에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 시료를 4 °C에서 20,000 ×g로 20분 동안 원심분리합니다.상층액을 버리고 70% ethanol로 세척합니다. 펠릿을 공기 중에서 건조시킨 후 RNase-free water로 재부유하여 RNA를 저장합니다. 샘플은 -80 °C에서 보관합니다.이후 샘플을 northern 분석 또는 마이크로어레이 분석에 사용할 수 있습니다. 마이크로어레이 분석을 위한 RNA를 준비하려면, 먼저 guanidine HCl 및 에탄올 침전법으로 얻은 각 mRNA 펠릿을 650 µL의 RNase-free water로 재부유시킨 후 스크류 캡 엔도르프 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 650 µL의 산성 페놀 클로로포름을 첨가하고 격렬하게 볼텍싱한 후, 최대 속도로 2분 동안 원심분리합니다.상층 수용액 500 µL를 새 튜브로 옮깁니다. DNA가 포함되어 있으므로 중간층이 섞여 들어가지 않도록 주의하십시오. 또한 역전사 반응을 억제할 수 있는 페놀이 혼입되지 않도록 주의하십시오.리튬 클로라이드 침전법을 사용하여 RNA 샘플에서 헤파린을 제거합니다. 리튬 클로라이드를 최종 농도 2 M이 되도록 첨가하고, 샘플을 -20 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 샘플을 4 °C에서 해동하고 20,000 ×g에서 원심 분리합니다.4°C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 80% ethanol로 펠렛을 세척하여 원심분리합니다. 다시 상층액을 제거하고 공기 건조시킨 후, 잔류 lithium chloride 침전물을 제거하기 위해 150 µL의 RNase-free water에 펠렛을 재부유시킵니다. 0.1 부피의 3 M sodium acetate(pH 5.3)와 3 부피의 100% Ethanol을 가한 후 -20°C에서 최소 2시간 동안 배양합니다.4°C에서 최고 속도로 20분 동안 원심분리합니다. 투명한 펠렛을 80% ethanol로 조심스럽게 세척하고 공기 중에서 건조시킵니다. 마지막으로 펠렛을 25 µL의 RNase-free water로 재부유시키고 샘플을 -80°C에서 보관합니다.세포질 성분으로부터 미토콘드리아 함유 분획을 분리하는 이 프로토콜의 성공 여부는 서로 다른 분리 단계의 샘플에 대해 northern 분석 및 Western 분석을 수행함으로써 가장 잘 확인할 수 있습니다. 본 예시에서는 분획 전 또는 전체 분획, 세포질 분획, 그리고 미토콘드리아 분획의 샘플을 사용하였습니다. Northern 분석은 mRNA인 COB에 대해 수행되었습니다.이는 미토콘드리아 내부에서 전사되는 CO1 mRNA와 미토콘드리아로 유입되는 단백질을 인코딩하는 mRNA, 세포질 액틴 단백질을 인코딩하는 ACT1 mRNA, 그리고 ER 상주 단백질을 인코딩하는 SEC61 mRNA입니다. 하단 패널은 노던 블롯 막의 메틸렌 블루 염색 결과로, 25 s와 18 s의 두 가지 뚜렷한 RNA 밴드가 검출된 것을 보여줍니다.COB는 미토콘드리아 내부에서 전사되므로, 그 신호는 미토콘드리아에서만 나타나야 합니다. 이는 본 연구에서 관찰된 바와 같습니다. 세포질 분획에서 COB가 나타나는 것은 시료 준비 과정 중 미토콘드리아 용해가 발생했음을 나타냅니다.ACO one은 미토콘드리아로 유입되는 단백질을 인코딩하며, 주로 미토콘드리아 분획에서 나타납니다. A CT one은 세포질 단백질을 인코딩하므로 주로 세포질 분획에서 나타납니다. 미토콘드리아 분획에서 SEC 61이 검출되는 것은 해당 분획에 ER 성분이 존재함을 나타냅니다.RNA 신호가 두 분획 모두에서 나타나 리보솜의 존재를 나타냅니다. 다음 단백질들에 대해 웨스턴 분석을 수행하였습니다: 미토콘드리아 외막 단백질인 POR1, 세포질 단백질인 COX4(K1A), 소포체 단백질인 CUE1, 그리고 리보솜 단백질인 RPL39. 예상대로 POR1 신호는 미토콘드리아 분획에서만 검출되었습니다.만약 세포질 분획에서 POR1 신호가 검출된다면, 이는 전처리 과정 동안 미토콘드리아 구성 성분이 해리되었음을 시사합니다. 또한 예상대로 hxK1은 세포질 분획에서만 검출되었습니다. 미토콘드리아 분획에서 강한 CUE1 신호가 나타난 것은 상당량의 ER 관련 물질이 미토콘드리아 분획에 함께 분리되었음을 나타냅니다.이는 ER과 미토콘드리아 사이의 알려진 물리적 접촉의 결과일 수 있습니다. RPL 39 신호는 두 분획 모두에서 나타나며, 이는 다시 한번 두 분획 모두에 리보솜이 존재함을 확인시켜 줍니다. 절차에서 회수 단계를 제외하면 M 분획에서 리보솜이 사라지게 되며, 이는 mRNA의 미토콘드리아 결합에 영향을 미칩니다. 미토콘드리아 성분과 세포질 성분 간의 분리 품질을 검증하는 것 외에도, 샘플 내의 RNA 또는 단백질이 온전한지, 그리고 샘플 준비 과정 동안 RNA 또는 단백질의 심각한 손실이 없는지 확인하는 것이 중요합니다.여기에서 보여주는 분석 결과와 같이, 온전한 상태의 RNA와 단백질은 뚜렷한 밴드로 검출되어야 합니다. 미토콘드리아로 유입되는 단백질을 인코딩하는 c CCP mRNA의 경우, 추가적인 짧은 밴드나 스미어(smear)가 나타나면 분해가 일어났음을 나타냅니다. 심각한 손실이 발생하면 전체 신호량과 상대적 신호량 사이에 상당한 차이가 나타나겠지만, 종합적으로 볼 때 그러한 현상은 관찰되지 않았습니다.이러한 결과는 본 프로토콜이 단일 과정으로 mRNA, 리보솜 및 단백질을 분리하는 효과적인 방법임을 입증합니다. 이 절차 이후에 RNA-Seq 또는 단백질체 분석과 같은 전유전체 분석 방법을 수행하여 세포 소기관 기능의 핵심적이고 고유한 특징을 식별할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 미토콘드리아와 결합된 RNA를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

isolation-mrnas-associated-with-yeast-mitochondria-to-study

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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기능 및 구조 분석을위한 Peptidyl - tRNAs를 포함 번역 리보솜의 분리

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Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

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미토콘드리아 접촉 부위는 미토콘드리아 내막 및 외막 단백질과 상호 작용하는 단백질 복합체입니다. 이 부위는 미토콘드리아 막과 세포질과 미토콘드리아 기질 사이의 통신에 필수적입니다. 여기에서는 이 특정 종류의 단백질에 적합한 후보를 식별하는 방법을 설명합니다.

미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

이 연구는 생물학적 방법을 사용하여 효모 미토콘드리아를 형질전환하는 방법을 설명합니다. 또한 형질전환체를 선택하고 정제하는 방법과 미토콘드리아 게놈 내의 표적 위치에 원하는 돌연변이를 도입하는 방법을 보여줍니다.

베이커의 미토콘드리아 변환

AviTag 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화(ALIBi)는 리보솜의 아세포 집단을 표지하고 친화력을 정제하기 위해 개발된 새로운 광유전학 활성화 방법으로, 하위 시퀀싱과 단백질체 분석을 위해 개발되었습니다.

재조합 펩타이드 태그 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화를 기반으로 한 세포 내 리보솜 하위 집단의 분리

배우세요 효모에서 번역 중인 mRNA와 결합된 미토콘드리아를 분리하는 방법을. 차등 원심분리를 통해 세포질 성분으로부터 미토콘드리아를 분리하고 북부 분석으로 RNA 품질을 검증합니다. 이 기술은 세포 생물학 연구에 활용됩니다.

현지화 번역의 메커니즘을 연구하는 효모 미토콘드리아와의 mRNA 관련의 분리

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