현지화 번역의 메커니즘을 연구하는 효모 미토콘드리아와의 mRNA 관련의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 번역 중인 mRNA와 결합된 미토콘드리아를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 미토콘드리아 농축 조건에서 배양한 효모 세포를 수확함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 cycloheximide 존재 하에 세포를 부드럽게 용해하는 것입니다.

다음으로 차등 원심분리를 통해 미토콘드리아를 가용성 성분으로부터 분리합니다. 마지막 단계는 미토콘드리아 및 대조군 샘플에서 RNA를 추출하는 것입니다. 최종적으로, northern 분석을 사용하여 미토콘드리아 관련 RNA의 순도와 품질을 확인합니다.

이 기술의 주요 장점은 한 번의 조제 과정으로 다양한 종류의 RNA를 분리할 수 있다는 점입니다. 따라서 비교 분석이 가능합니다. 이 방법은 세포 내 타겟팅 및 소기관 기능과 같은 세포 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

본 실험 과정에서는 비발효 성장 배지에서 30 °C로 배양하여 OD 600이 1에서 1.5에 도달한 효모 세포 100~150 mL로부터 미토콘드리아를 정제합니다. 상온에서 3000 ×g로 5분 동안 세포를 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 펠렛을 2회 증류수로 세척한 뒤 다시 원심분리합니다.

상층액을 버린 후 세포 펠렛의 무게를 측정합니다. 일반적으로 세포 100 milliliters당 약 0.6 grams이 얻어집니다. 세포 0.5 grams당 1 milliliter의 DTT 버퍼를 사용하여 펠렛을 재현탁합니다.

세포벽 내의 이황화 결합을 끊어 가수분해 효율을 높이기 위해 세포를 환원제로 처리하는 것이 중요합니다. 세포를 30 °C에서 부드럽게 흔들어주며 10분 동안 배양하십시오. 다음으로, 실온에서 3000 ×g로 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠렛을 재부유시키십시오.

세포 0.15 g당 1 mL의 xmal liase 버퍼를 넣고 볼텍싱하지 마십시오. 990 µL의 물에 세포 10 µL 분주액을 희석하여 OD 600을 측정하고 이 값을 기록하십시오. 갓 제조한 xmal liase를 세포에 첨가하여 베타 1,3-글루칸 결합의 글루코스 중합체를 가수분해하고 구형세포벽제거물(Spheroplast)을 생성하십시오.

이 단계 이후부터 lysis를 방지하기 위해 Sphero plast는 등장액 상태로 유지해야 하며, 세포를 30 °C에서 가볍게 흔들어주며 15분 동안 배양합니다. 세포벽의 가수분해와 sphere of plast 생성을 확인하려면, 세포 10 µL를 물 990 µL와 혼합하여 OD 600을 측정합니다. Sphero plast는 삼투압 차이로 인해 lysis가 일어날 것으로 예상되며, OD 600 값은 xmal liase를 첨가하기 전에 측정된 값보다 최소 10배 이상 낮아야 합니다. 그렇지 않은 경우, xmal liase와 함께 15분 더 배양을 계속하십시오.

Plast의 PHE를 100 milliliters의 회복 배지로 재현탁하고, Plast 구체를 Helen Meyer Flask로 옮깁니다. 30 degrees Celsius에서 1시간 동안 흔들어주며 배양합니다. XYs 처리 과정 중에 번역이 중단되고 mRNA 국소화가 파괴되기 때문에 이 회복 단계가 반드시 필요합니다.

1시간 후, 0.1 mg/mL의 cycloheximide를 첨가하고 spheroplast를 미리 냉각시킨 50 mL conical tube로 옮깁니다. ribosome과 mRNA의 결합을 고정시키기 위해 cycloheximide 첨가가 중요합니다. 이를 통해 ribosome 의존적인 mitochondria의 mRNA 결합 상태가 유지됩니다.

원심분리기를 사용하여 4°C에서 3000 ×g로 5분 동안 원형 플라스크를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 차가운 mannitol 완충액으로 2회 세척합니다.

4 mL의 차가운 manitol buffer로 plass 구체를 현탁하고, 이를 밀착형 유발이 장착된 15 mL 용량의 Dounce homogenizer로 옮깁니다. 15회 가볍게 눌러 plass 구체를 파쇄한 후 용해물을 13 mL 튜브로 옮깁니다. 용해물을 4 °C에서 1,500 ×g로 6분 동안 원심분리합니다.

핵과 파괴되지 않은 세포를 펠렛화하기 위해서입니다. 상층액을 새 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 샘플의 1 mL 또는 25%를 분획되지 않은 샘플 또는 전체 샘플로 따로 보관합니다.

이 시료 50 µL를 새 튜브로 옮기고 15 µL의 four XLSB를 첨가합니다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 나머지 전체 시료로부터 RNA를 침전시켜 노던 분석 및 마이크로어레이 분석에 사용합니다. 상층액을 10,000 ×g에서 원심분리합니다.

4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 미토콘드리아를 펠렛화하기 위해 상층액을 새 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관합니다. 이것이 세포질 분획입니다.

이 샘플 50 µL를 새 튜브로 옮기고 four XLSB 15 µL를 첨가합니다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 나머지 세포질 샘플에서는 노던 및 마이크로어레이 분석을 위한 RNA를 침전시킵니다. 펠릿을 3 mL의 mannitol 버퍼로 세척하고 10,000 ×g에서 다시 원심분리합니다.

4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 펠렛을 3 mL의 mannitol 버퍼로 다시 현탁합니다. 이 샘플은 미토콘드리아를 포함하고 있으며, 이를 미토콘드리아 분획이라고 합니다.

이 샘플 50 µL를 새 튜브로 옮기고 Western blot 분석을 위해 4X LSB 15 µL를 추가합니다. 이 절차를 시작하려면, 각 샘플에 8 M guanidinium HCl 1 부피와 100% ethanol 2 부피를 넣고 볼텍싱한 후 -20 °C에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 샘플을 4 °C에서 10,000 ×g로 20분 동안 원심 분리합니다.

상층액을 버립니다. 펠렛이 불안정할 수 있으므로 주의하십시오. 70% ethanol로 펠렛을 세척한 후, 400 µL의 RNase free water로 펠렛을 현탁하여 샘플을 새로운 마이크로 튜브로 옮깁니다.

0.1 부피의 3 M sodium acetate (pH 5.2)와 2 부피의 100% ethanol을 첨가하여 RNA를 다시 침전시킨 후, vortexing하고 -20 °C에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 시료를 4 °C에서 20,000 ×g로 20분 동안 원심분리합니다.

상층액을 버리고 70% ethanol로 세척합니다. 펠릿을 공기 중에서 건조시킨 후 RNase-free water로 재부유하여 RNA를 저장합니다. 샘플은 -80 °C에서 보관합니다.

이후 샘플을 northern 분석 또는 마이크로어레이 분석에 사용할 수 있습니다. 마이크로어레이 분석을 위한 RNA를 준비하려면, 먼저 guanidine HCl 및 에탄올 침전법으로 얻은 각 mRNA 펠릿을 650 µL의 RNase-free water로 재부유시킨 후 스크류 캡 엔도르프 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 650 µL의 산성 페놀 클로로포름을 첨가하고 격렬하게 볼텍싱한 후, 최대 속도로 2분 동안 원심분리합니다.

상층 수용액 500 µL를 새 튜브로 옮깁니다. DNA가 포함되어 있으므로 중간층이 섞여 들어가지 않도록 주의하십시오. 또한 역전사 반응을 억제할 수 있는 페놀이 혼입되지 않도록 주의하십시오.

리튬 클로라이드 침전법을 사용하여 RNA 샘플에서 헤파린을 제거합니다. 리튬 클로라이드를 최종 농도 2 M이 되도록 첨가하고, 샘플을 -20 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 샘플을 4 °C에서 해동하고 20,000 ×g에서 원심 분리합니다.

4°C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 80% ethanol로 펠렛을 세척하여 원심분리합니다. 다시 상층액을 제거하고 공기 건조시킨 후, 잔류 lithium chloride 침전물을 제거하기 위해 150 µL의 RNase-free water에 펠렛을 재부유시킵니다. 0.1 부피의 3 M sodium acetate(pH 5.3)와 3 부피의 100% Ethanol을 가한 후 -20°C에서 최소 2시간 동안 배양합니다.

4°C에서 최고 속도로 20분 동안 원심분리합니다. 투명한 펠렛을 80% ethanol로 조심스럽게 세척하고 공기 중에서 건조시킵니다. 마지막으로 펠렛을 25 µL의 RNase-free water로 재부유시키고 샘플을 -80°C에서 보관합니다.

세포질 성분으로부터 미토콘드리아 함유 분획을 분리하는 이 프로토콜의 성공 여부는 서로 다른 분리 단계의 샘플에 대해 northern 분석 및 Western 분석을 수행함으로써 가장 잘 확인할 수 있습니다. 본 예시에서는 분획 전 또는 전체 분획, 세포질 분획, 그리고 미토콘드리아 분획의 샘플을 사용하였습니다. Northern 분석은 mRNA인 COB에 대해 수행되었습니다.

이는 미토콘드리아 내부에서 전사되는 CO1 mRNA와 미토콘드리아로 유입되는 단백질을 인코딩하는 mRNA, 세포질 액틴 단백질을 인코딩하는 ACT1 mRNA, 그리고 ER 상주 단백질을 인코딩하는 SEC61 mRNA입니다. 하단 패널은 노던 블롯 막의 메틸렌 블루 염색 결과로, 25 s와 18 s의 두 가지 뚜렷한 RNA 밴드가 검출된 것을 보여줍니다.

COB는 미토콘드리아 내부에서 전사되므로, 그 신호는 미토콘드리아에서만 나타나야 합니다. 이는 본 연구에서 관찰된 바와 같습니다. 세포질 분획에서 COB가 나타나는 것은 시료 준비 과정 중 미토콘드리아 용해가 발생했음을 나타냅니다.

ACO one은 미토콘드리아로 유입되는 단백질을 인코딩하며, 주로 미토콘드리아 분획에서 나타납니다. A CT one은 세포질 단백질을 인코딩하므로 주로 세포질 분획에서 나타납니다. 미토콘드리아 분획에서 SEC 61이 검출되는 것은 해당 분획에 ER 성분이 존재함을 나타냅니다.

RNA 신호가 두 분획 모두에서 나타나 리보솜의 존재를 나타냅니다. 다음 단백질들에 대해 웨스턴 분석을 수행하였습니다: 미토콘드리아 외막 단백질인 POR1, 세포질 단백질인 COX4(K1A), 소포체 단백질인 CUE1, 그리고 리보솜 단백질인 RPL39. 예상대로 POR1 신호는 미토콘드리아 분획에서만 검출되었습니다.

만약 세포질 분획에서 POR1 신호가 검출된다면, 이는 전처리 과정 동안 미토콘드리아 구성 성분이 해리되었음을 시사합니다. 또한 예상대로 hxK1은 세포질 분획에서만 검출되었습니다. 미토콘드리아 분획에서 강한 CUE1 신호가 나타난 것은 상당량의 ER 관련 물질이 미토콘드리아 분획에 함께 분리되었음을 나타냅니다.

이는 ER과 미토콘드리아 사이의 알려진 물리적 접촉의 결과일 수 있습니다. RPL 39 신호는 두 분획 모두에서 나타나며, 이는 다시 한번 두 분획 모두에 리보솜이 존재함을 확인시켜 줍니다. 절차에서 회수 단계를 제외하면 M 분획에서 리보솜이 사라지게 되며, 이는 mRNA의 미토콘드리아 결합에 영향을 미칩니다. 미토콘드리아 성분과 세포질 성분 간의 분리 품질을 검증하는 것 외에도, 샘플 내의 RNA 또는 단백질이 온전한지, 그리고 샘플 준비 과정 동안 RNA 또는 단백질의 심각한 손실이 없는지 확인하는 것이 중요합니다.

여기에서 보여주는 분석 결과와 같이, 온전한 상태의 RNA와 단백질은 뚜렷한 밴드로 검출되어야 합니다. 미토콘드리아로 유입되는 단백질을 인코딩하는 c CCP mRNA의 경우, 추가적인 짧은 밴드나 스미어(smear)가 나타나면 분해가 일어났음을 나타냅니다. 심각한 손실이 발생하면 전체 신호량과 상대적 신호량 사이에 상당한 차이가 나타나겠지만, 종합적으로 볼 때 그러한 현상은 관찰되지 않았습니다.

이러한 결과는 본 프로토콜이 단일 과정으로 mRNA, 리보솜 및 단백질을 분리하는 효과적인 방법임을 입증합니다. 이 절차 이후에 RNA-Seq 또는 단백질체 분석과 같은 전유전체 분석 방법을 수행하여 세포 소기관 기능의 핵심적이고 고유한 특징을 식별할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 미토콘드리아와 결합된 RNA를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.