Name: 수초 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 (MOG 35-55) C57BL / 6 쥐에 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-15T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 학습하세요 실험자가 면역 뇌척수염(EAE) 유도 방법을 C57BL/6 쥐에 MOG 35-55 펩타이드와 CFA를 사용하여 다발성 경화증 동물 모델을 구축하는 기술입니다. 이 방법은 신경면역학 연구와 신약 개발에 활용됩니다.

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이 작품은 임상 연구를위한 학제​​ 간 센터 (IZKF) 뮌스터 (SEED 3월 12일, SB)에 의해 지원되었다.

마우스 실험 1. 일반 댓글 <ol><li> 마우스를 사용하여 모든 실험은 각각의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 수행되어야한다. </li><li> 무균 조건 하에서 쥐를 유지하고 물과식이에 액세스 할 수 있도록. 주 : 질병에 대한 감수성은 나이, 성별에 따라 달라질 수 있기 때문에 실험 그룹으로 나이와 성별 일치 마우스를 사용하는 것이 중요합니다. </li><li> MOG 35-55 펩티드 항원 또는 nonencephalitogenic 펩티드가 있거나없는 PBS로 대체되는 경우 선택된 실험 조건에 따라서는, 가성 면역화 대조군으로 간주 될 수있다. </li><li> (아래 참조) 이전에 시작 실험에 대한 방법 론적 측면을 고려하시기 바랍니다. 우리는 EAE 점수에 대한 하나 또는 두 개의 눈을 멀게 관찰자를 포함하는 것이 좋습니다. </li></ol> MOG 35-55 에멀젼 2. 준비 <ol><li> MO의 1:1 비율의 200 μLG 35-55 펩타이드 솔루션 및 CFA는 각 마우스에 주입해야한다. 준비하고 주입하는 동안 점성 에멀젼의 일부 손실이있다. 따라서, 필요한 양의 1.5 배를 준비합니다. MOG 35-55 펩타이드 솔루션 및 CFA 모두의 필요한 양의 2에 의한 에멀젼과 분열의 전체 볼륨을 계산합니다. </li><li> 2 ㎎ / ㎖의 최종 농도 DDH 2 O에 동결 건조 MOG 35-55을 희석. 우리는 일반적으로 200 μg의 MOG에게 마우스 당 35-55 펩타이드를 사용합니다. 이 금액은 스톡 용액 100 μL에 포함된다. 펩티드 용액을 -20 ℃에서 보관해야 </li><li> 박격포로 건조 된 결핵균 H37RA (100 mg)을 1 병의 내용을 넣습니다. <ol><li> 얇은 분말을 얻을 수 박격포와 유 봉 접지. </li><li> 4 ° C.에 저장 될 수있는 10 ㎎ / ㎖ CFA 원액을 얻을 불완전 프로 인트 보조제 10 ㎖를 추가 </li><li> 이전에 예방 접종을, CFA 원액 재치를 희석2 ㎎ / ㎖의 최종 농도 H IFA. 미립자 물질을 재현 탁하고 실험 준비하는 동안 점성 솔루션의 일부 볼륨 손실을 고려하는 각 사용하기 전에 철저하게 섞는다. </li><li> 1 밀리그램의 최종 농도 / ㎖에 도달 할 때까지 MOG 35-55 펩티드 용액과 1:1로 섞는다. 주의 : 열 사망 결핵균은 타고난 면역 반응을 자극한다. 흡입, 섭취, 피부 및 눈에 접촉하지 않도록 할 것. </li></ol></li><li> 얼음에 솔루션을 Precool. <ol><li> 두 개의 2 ㎖ 주사기로 1 2 ㎎ / ㎖ CFA ㎖ 및 1 ㎖ 2 ㎎ / ㎖ MOG 35-55 솔루션을 그립니다. 면역화 된 동물의 수에 따라 필요한 주사기의 개수를 계산한다. 주의 : 엄밀히 말하면 그것은 육아종을 유발하거나 면역 반응을 유도 할 수 있으므로 도움이되는 준비 중에 바느질하지 마십시오. </li><li> MOG 35-55 솔루션 및 CFA에 대한 20 G 정맥에 27 G 정맥을 사용합니다. 공기 방울을 피하고에서 모두와 주사기를 연결하는 hree 방향 밸브. </li><li> 다른 하나의 주사기에서 에멀젼을 보내기 좋은 유화가 중요한 단계입니다 적어도 10 분 동안 잘 혼합. 유화를 지원하는 세 방향 밸브를 거의 닫습니다. 이 솔루션은 흰색 뻣뻣하고 단계없이 분리와 점성해야한다. </li><li> 에멀젼은 이전에 예방 접종을 몇 일 동안 저장할 수 있습니다. 그들은 안정 여부를 관찰하기 위해 에멀젼을 제조 한 후 적어도 30 분을 기다립니다. 이전에 예방 접종을 두 주사기 중 하나에 솔루션을 그리고 27 G 정맥을 연결합니다. </li></ol></li></ol> 백일해 독소의 3. 준비 <ol><li> 백일해 독소의 다른 양 또한 투여 경로 (예를 들어 정맥 내 또는 복강 내)에 의존하기 문헌에서 찾을 수있다. 우리 연구실은 복강 예방 접종의 날에 PBS 200 μL에 백일해 독소 (400) NG를 사용하고 이틀 후. 주의 : 백일해 독소는 많은 생물학적 효과를 가지고. 흡입, 섭취, 피부 및 눈과의 접촉을 피하십시오. </li><li> 100 ㎍ / ㎖의 원액 500 μL의 DDH 2 O에서 백일해 독소의 50 μg을 재구성. 4 ℃에서 보관 </li><li> PBS로 1:50 희석. 200 ㎕의 현재 PBS의 400 NG가 포함되어 있습니다. 주사기의 필요한 양을 준비하고 각각의 바늘 허브를위한 ~ 100 μL를 추가로 여분의 볼륨을 고려하십시오. </li></ol> 4. 동물 예방 접종 <ol><li> 필요한 단기 안락사에 대한 특정 기준에 대한 기관 동물 관리 및 사용위원회에 문의 해주세요. 이러한 케타민 / 자일 라진 주사 또는 halothan 같은 다른 프로토콜도 가능하다 동안 우리 연구실은 이소 플루 란과 간단한 마취제를 사용합니다. 마취를 기다린 마취의 수준을 평가하기 위해 앞발 발가락 핀치를 사용합니다. </li><li> 예방 접종은 동물에 대한 스트레스를 최소화하고 최적의 예방 접종을 위해 숙련 된 사람에 의해 수행되어 있는지 확인합니다. </li><li> 반대로 100 μl를 주입각각의 뒷 측면에 두 개의 서로 다른 사이트에 세대 / CFA 에멀젼 피하. 피부 아래 구근 대량 양식이 실험을하는 동안 유지해야하는 지 확인하십시오. </li><li> intraperitonelly 백일해 독소의 200 μl를 주입한다. </li><li> 각각의 마우스는 쉽게 꼬리베이스의 색상 표시에 의해 예를 들어, 매일 평가를 식별 할 수 있는지 확인합니다. </li><li> 예방 접종 후 하루에 두에 백일해 독소의 두 번째 용량을 관리 할 수​​ 있습니다. </li></ol> 5. EAE 모니터링 <ol><li> 무게 및 임상 점수는 매일 평가되어야한다. EAE의 발병은 일반적으로 질병 활성의 지표로서 사용될 수있는 체중 감소와 상관. 기관 동물 관리를 참조 및 개별 생쥐 실험을 꺼내해야 할 때 기준을 미리 정의 할위원회를 사용하십시오. 체중 감소는 20 초기 체중의 %하거나 심한 임상 증상이 (EAE 7 또는 더 나쁜 점수) 발생을 초과 할 때 고려되어야한다. 재를 참조하십시오허용되는 최대 점수에 대한 각 기관의 동물 관리 및 사용위원회의 spective 지침. </li><li> 생쥐가 EAE의 임상 증상을 가질 때, 수통 여전히 도달 할 수 있고 음식이 케이지 바닥에 배치하는 것이 중요하다. </li><li> 다양한 스코어링 증상이 사용될 수있다. 우리의 실험실에서 0-10 스케일이 설정됩니다. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 학년 </td><td> 임상 기호 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 임상 징후 없다 </td><td> 마우스 꼬리의 기지에서 개최하면 일반 걸음 걸이, 꼬리의 움직임과 제기 될 수 있으며, 꼬리는 둥근 물체를 감싸는 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 부분적으로 맥 빠진 꼬리 </td><td> 정상적인 걸음 걸이, 꼬리의 끝이 처진다 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 마비 꼬리 </td><td> 정상적인 걸음 걸이, 꼬리는 처진다 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 뒷다리 마비, 조정되지 않은 움직임 </TD&gt; <td> 조정되지 않은 걸음 걸이, 꼬리 파행, 뒷다리는 곤란에 응답 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 마비 하나의 뒷다리 </td><td> 하나의 뒷다리 드래그로 조정되지 않은 걸음 걸이, 꼬리 맥진 한 뒷다리가 끼에 응답하지 않습니다 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 두 뒷다리 마비 </td><td> 드래그 두 뒷다리와 조정되지 않은 걸음 걸이, 꼬리 파행, 두 뒷다리가 끼에 반응하지 않는 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 뒷다리 마비, 앞발의 약점 </td><td> 앞다리와 조정되지 않은 보행은 꼬집기 후에 몸, 앞다리의 반사를 당겨 투쟁, 꼬리는 파행 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 뒷다리는 앞다리 하나가 마비, 마비 </td><td> 마우스를 움직일 수없는, 하나의 앞다리는 발가락 핀치, 꼬리가 파행 응답 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 뒷다리는 두 앞발 마비, 마비 </td><td> 마우스를 두 앞발은 발가락 핀치에 반응하지 않는, 움직일 수없는, 꼬리는 파행 </td></tr><tr><td> 9 </td&gt; <td> 죽어가는 </td><td> 번호 이동, 변경 호흡 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 죽음 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 임상 채점 시스템.

<ol><li>McFarland, H. F., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+a+complicated+picture+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity.</a> Nat. Immunol. 8, 913-919 (2007).</li>
<li>Wiendl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%3A+the+world+is+not+enough%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation: the world is not enough.</a> Curr. Opin. Neurol. 25, 302-305 (2012).</li>
<li>vander Star, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+models+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol.+Disord.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo models of multiple sclerosis.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 11, 570-588 (2012).</li>
<li>Pachner, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Experimental models of multiple sclerosis.</a> Curr. Opin. Neurol. 24, 291-299 (2011).</li>
<li>Bittner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TASK1+channel+inhibitor+A293+shows+efficacy+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis.</a> Exp. Neurol. 238, 149-155 (2012).</li>
<li>Handel, A. E., Lincoln, M. R., Ramagopalan, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+men%3A+experimental+autoimmune+encephalitis+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Of mice and men: experimental autoimmune encephalitis and multiple sclerosis.</a> Eur. J. Clin. Invest. 41, 1254-1258 (2011).</li>
<li>Krishnamoorthy, G., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EAE%3A+an+immunologist%27s+magic+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">EAE: an immunologist's magic eye.</a> Eur. J. Immunol. 39, 2031-2035 (2009).</li>
<li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nat. Protoc. 1, 1810-1819 (2006).</li>
<li>Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+multiple+sclerosis+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 1-11 (2010).</li>
<li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice%3A+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> Eur. J. Immunol. 25, 1951-1959 (1995).</li>
<li>Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pertussis+toxin+modulates+the+immune+response+to+neuroantigens+injected+in+incomplete+Freund%27s+adjuvant%3A+induction+of+Th1+cells+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+presence+of+high+frequencies+of+Th2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells.</a> J. Immunol. 169, 117-125 (2002).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

능동 면역화 프로토콜과 상이한 EAE 모델의 다중은 지난 수십 년에 걸쳐 설명되었다. 쥐 모델은 최근까지 널리 이용되고 있지만, 마우스는 지금 EAE 연구를위한 가장 인기있는 모델 생물이다. 이러한 발전으로 인해 가능 형질 전환 마우스의 광범위하고도 증가 레퍼토리에 다른 사람 중 하나입니다. MOG 35-55 펩티드와 C57BL / 6 마우스의 면역화는 가장 널리 분산 EAE 모델의 하나이며, 신뢰성 복제 잘 사용하기 동물 모델로 간주 될 수있다. 다른 EAE 모델이보다 구체적인 실험 질문에 사용하는 동안 많은 neuroimmunological 실험실에서, MOG 35-55 유도 EAE는 선택의 모델로 설정됩니다. 고려해야 할 중요한 점은 EAE의 실험 방법 론적으로 올바른 수행되는 것을 보장하기 위해 실험 설정의 계획이다. 내부 유효성, 질병의 증상의 눈을 멀게 득점은 매우 좋습니다. exper를imental 그룹이 있어야한다 연령, 체중, 성별 일치와 마우스가 무작위로 치료 그룹에 할당해야합니다. 실험은 항상 동물 복지 규정에 따라 수행되어야한다. EAE 연구는 종종 파워 부족하고 계정에 통계 유형 II 오류을지지 않습니다. 따라서, 종래의 실험으로, 샘플 크기 계산이 수행되어야한다. 필요한 그룹의 크기는 예상 효과의 크기에 따라 달라집니다. 통계 분석에 대한 전문가의 상담 EAE 실험을 시작하기 전에 고려 될 수있다. 프로토콜의 몇 가지 제한 사항을 염두에 보관해야합니다. 가장 중요한 것은, aEAE 데이터의 해석은 면역 반응에 모두 추가 영향을 보조 백일해 독소의 사용과 예방 접종의 모드에 의해 손상된다. 또한 MOG 35-55 EAE 모델은 주로 면역 반응을 구동 CD4 + T 세포를 보여주는 것이 고려되어야한다. CD8 + T 세포와 B 세포가 재생이러한 세포 유형을 어드레싱 할 때 덜 두드러진 역할 및 대안 프로토콜이 고려되어야한다. 예상되는 질병 과정은 급성 단상과 자기 제한됩니다. 대안 적으로, 되돌아가 송금 투병 기간은 또한 대체 EAE 모델에서 달성 될 수있다. 프로토콜의 또 다른 중요한 한계는 MS의 병태 생리의 면역 성분으로 특정 편견이다. 지난 몇 년 동안, MS는 강력한 신경 퇴행성 구성 요소가 점점 명백 해졌다. 신경 학적 결손의 진보적 인 축적 희소 돌기 아교 세포 및 뉴런 결과의 죽음. 그것은 EAE 모델이 완전히자가 면역 염증의 퇴행성 신경 메커니즘에 관한 실험 문제를 해결하기 위해 적합하지 않을 수 있음을 고려해야한다. CNS 병리에 초점을 맞춘 다른 동물 모델이 고려 될 수있다 - 주변 면역 체계의 개입없이 독성 탈수 초화를 훼손 cuprizone 모델 예. 설명 프로토콜은 기본 neuroimmunological 실험 모델로 간주하고 다른 응용 프로그램에 수정 될 수 있습니다. 상술의 실험 절차는 쉽게 다른 생쥐 균주에 의해 다른 EAE 프로토콜에 적용될 수 또는 유형 및 단백질의 양 (예를 들면 치료 적 평가에 특히 적합 되돌아가 송금 EAE 질병 과정에 대한 PLP에게 139-151 펩티드 및 SJL 마우스를 사용 재발에 대한 영향). 기술 된 프로토콜은 또한 대체 전송 실험 (패시브 EAE)을 위해 사용될 수있다. 이 모델에서, C57BL / 6 마우스는 MOG 35-55 펩타이드 전술 한 바와 같이 CFA와 함께 예방 접종을하고 있습니다. 반면, 백일해 독소가 필요하지 않습니다. 7-15 일 비장 또는 림프절은 고립되고, 면역 세포는 C57BL/6se 마우스의 새로운 그룹으로 전송하기 전에 MOG 35-55 펩타이드 및 각종 사이토 카인과 함께 체외에 재 자극 후. 이받는 마우스는 몇 일전 CLAS시보다 EAE을 개발sical 예방 접종. 체외 조건은 특정 면역 학적 질문 (T H 1 또는 T H 17 세포에 예를 들어 편광)을 변화시킬 수있다. 때로는 낮은 질병 발생 또는 약한 증상은 실험적인 도전이 될 수 있습니다. 문제 해결을위한 몇 가지 권장 사항은 다음과 같습니다 : - 중증도는 펩티드 / 마우스의 상이한 양으로 변화 될 수있다. - 최적의 CFA 농도는 1 ~ 5 ㎎ / ㎖에서 다를 수 있습니다. 실험을 설정할 때 CFA의 적정을 고려하십시오. 많은 규제가 2 ㎎ / ㎖를 초과하는 CFA 농도를 금지 허용 CFA 농도에 대한 각 기관의 동물 관리 및 사용위원회의 각각의 가이드 라인을 참조하시기 바랍니다. - 다른 방법으로는 에멀젼 제조에 기술되어있다. 가난한 유화가 possib로 간주되는 경우 등 1 시간 또는 초음파에 대한 소용돌이로 교반 등의 다른 방법이 고려 될 수있다르 오류 소스. - 나이, 성별, 연도와 동물 시설 내 환경 조건의 계절 EAE의 감수성에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 이 조건이 독립적 인 실험과 비교할 수 있는지를 확인해야한다. 전술 한 바와 같이, 상기 프로토콜은 양자 EAE 실험 시작점으로 사용될 수있다. 이 모델은 특히 (야생형받는 마우스에 encephalitogenic 녹아웃 세포를 전송하여 예) 유전자 표현형의 말초 및 중추 신경계 효과를 분리하여 전송 세포의 표현형 철저 특징으로 할 수와 같은 특정 면역 질문에 적합합니다. 지난 몇 년 동안 EAE 연구의 최신 개발은 T 세포 수용체 유전자 변형 마우스입니다. 이 마우스는 외부 영향이 도움이되는 예방 접종의 문제를 회피하지 않고 자발적으로 EAE 증상을 개발할 수 있습니다. 그러나,이 모델은 breedi 위해 동물의 대용량을 필요충분한 그룹의 크기를 확인하기 위해 겨. 녹아웃 마우스의 평가는 이전 aEAE 달리 EAE 실험에 이종 교배가 필요합니다. 각 마우스가 다른 날에 질병의 증상을 개발로, 새로운 물질의 평가는 다소 복잡 할 수 있습니다. 따라서 neuroimmunological에 대한 고전적인 aEAE의 값은 도전받지 않은 남아있다.

다발성 경화증 (MS)은 중추 신경계의 만성 탈수 초 염증성 질환이다 상기 이종 및 축적 임상 증상 및 희소 돌기 아교 세포의 뉴런 결과의 파괴. MS는 중추 신경계 (CNS)의 프로토 타입 면역 질환으로 고려되고 동물 모델은 그 복잡한 발병 기전에 빛을 발산하기 위해 개발되었다. 또한, 현재의 치료법은 부분적으로 만 효과적이며 신경 변성 성분은 아마도 미래의 치료를위한 중요한 도전 동안 주로 질환의 염증 단계를 표적으로하는 것은 1,2 접근한다. 질병의 정확한 원인은 아직 불분명하지만, CNS에서 축삭의 수초 에피토프에 대한 면역 반응은 질병의 발병을 자극하는 것으로한다. 면역계, 유전 취약성 및 환경 적 요인 (예 : 감염, 비타민 D)의 조절 곤란이 믿어진다MS의 병태 생리 학적 메커니즘의 영향 중앙 부분. 동물 모델의 세 가지 유형이 현재 MS의 병리학 적 패턴의 탐사를 위해 설립 : Theiler의 쥐 뇌척수염 바이러스 (TMEV)와 같은 바이러스 성 모델, cuprizone 같은 독성 요원에 의해 유도 된 모델, 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) (3) 마지막으로 다른 변종, 4. 그들 모두가 MS의 기능을 모방 있지만, 그들은 적응 면역 체계의 참여와 같은 기본 병적 인 기능에 엄청난 차이가 있습니다. 이 신경 염증성 경로를 조사하기 위해 특히 유용합니다 종종 새로운 치료 전략 5,6의 효능에 대해 &quot;증거의 원칙&quot;모델 역할로 EAE는 가장 일반적인 동물 모델입니다. EAE는 많은 다른 동물 (예를 들어, 마우스, 쥐, miniswine, 기니 돼지, 닭, 또는 영장류)에 유도 할 수있다. 그러나, 생쥐는 적어도 부분적으로 인해 가장 널리 이용되고있다 종정교한 유전자 변형 또는 녹아웃 마우스 (7)의 레퍼토리를 확장합니다. EAE의 병태 생리학은 뇌 특정 항원에 대한 면역 시스템의 반응에 기초한다. 이 반응은 유사한 신경 학적 및 병리학 적 기능의 결과로, 항원의 장부 구조의 염증과 파괴를 유도하는 MS 환자에서 관찰 된 것과. 세 가지 다른 접근 방식이 구분 될 수있다 : 적극적으로 유도 EAE (aEAE, 활성 예방 접종),자가 면역의 연구를 허용하고, 최근에는 자연 EAE 마우스 모델 (sEAE) 수동적으로 EAE 전송, (예방 접종 동물에서 encephalitogenic 세포의 전송 pEAE) 외인성 조작없이 기계. 가장 쉬운 유도 모델은 빠르고 강력한 결과에 항복 마우스에서 aEAE입니다. 이 모델은 필드 8에있는 많은 연구자에 의해 neuroimmunological 동물 모델의 &quot;금 표준&quot;으로 간주됩니다. aEAE 유도를 들어, 동물선택된 항원으로 이루어진 에멀젼의 피하 주사와 예방 접종 및 예방 접종 하루 이틀 나중에 백일해 독소의 복강 내 주사와 함께 인트 adjuvans (CFA)를 완료합니다. 따라서, 미엘린 특정 T 림프구 외주 활성화 및 혈액 - 뇌 장벽을 가로 질러 CNS에 마이그레이션된다. CNS에 진입하면, T 세포는 단핵구 또는 대 식세포 결국 탈수 초화 및 축삭 세포의 죽음 9와 같은 다른 세포의 후속 염증 폭포, 참여의 결과로 지역 및 침투 항원 제시 세포에 의해 활성화된다. 예방 접종 프로토콜 및 마우스 변형의 조합에 따라 (예 : C57BL / 6, SJL / J, Biozzi) 및 항원 (예를 들면 수초 희소 돌기 아교 세포의 당 단백질 (MOG), 수초 기본 단백질 (MBP), 수초 테오 단백질 (PLP)), 질병 과정은 급성, 만성 진보 또는 재발 송금인 질병의 코스를 수강 할 수 있습니다. <p class= &quot;jove_content&quot;&gt; C57BL / 6 마​​우스는 유전자 변형 생쥐의 건설을위한 가장 일반적으로 사용되는 변형이되었으며 녹아웃 또는 형질 전환 마우스의 성장 다수가 사용할 수 있습니다. 우리는 여기서 집고 양이 대략 3-5 일 질병 발병과 느린 부분적인 증상 복구 후 9-14일, 질병 최대 후 첫 증상으로 단상 EAE 결과 35-55 펩티드 (10)와 C57BL / 6 마우스의 예방 접종에 대한 프로토콜을 설명 다음 10-20일 이상. 단독 MOG 35-55 펩티드의 면역 원성 잠재력 질환을 유발하기에 충분하지 바와 같이, 예컨대 CFA 보조제가 필요하다. 그것은 CFA의 구성 요소가 이러한 분자의 식균 작용 및 사이토 카인의 분비를 유도하는 단핵 식세포를 활성화 것을 가정한다. 이것은 항원의 존재 및 림프계 이들의보다 효율적인 전송의 연장 초래한다. EAE 유도는 다른 사람의 사이에서 조절하는 제안 된 백일해 독소 (PT)의 응용 프로그램에 의해 촉진된다혈액 - 뇌 장벽과 면역 응답 자체 11. 질병 유도 한 후, 특별한주의가 질병의 증상에 대한 마우스의 매일 평가를 수행해야합니다.

<table><tbody><tr><td>암컷 C57BL / 6 마우스, 10-12 주, ~ 20g 무게</td> <td> 예 : Jackson Laboratory, Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOG 35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)</td> <td>eg Pepceuticals Ltd</td><td></td><td>Store at -20 &deg; C</td></tr><tr><td>불완전한 Freund' s 보조제(IFA)</td><td>예: Sigma-Aldrich Co.</td><td>F5506</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>주사기, 1 ml, 26 G 3/8 인치 바늘&nbsp;</td><td>예: Becton Dickinson & Co.</td><td></td><td></td>309625</tr><tr><td>주사기, 2 ml</td><td>e.g. B. Braun</td><td>7389</td><td></td></tr><tr><td>바늘, 25 G 5/8 인치 및 30 G 1/2 인치&nbsp;</td><td>e.g. Becton Dickinson & Co.,</td> <td>305122, 305106</td><td></td></tr><tr><td>Three way valve</td><td>e.g. B. Braun</td><td>16494 C</td><td></td></tr><tr><td>백일해 독소, 완충액에서 동결건조됨</td><td>Enzo Life Sciences Inc.</td><td>BML-G100</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>M. 결핵 H37 RA</td><td>BD Difco</td><td>231141</td><td>Store at 4 &deg; 씨</td></tr></tbody></table>

수초 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 (mog<sub&gt; 35-55</sub&gt;) c57bl / 6 쥐에 실험자가 면역 뇌척수염 (eae) 유도

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

다발성 경화증은 강력한 신경 변성 성분과 중추 신경계의 만성 탈수 초성 다발 신경의 신경 염증성 질환이다. 질병의 정확한 원인은 아직 불분명하지만, 자기 반응성 T 림프구의 병태 생리에서 중요한 역할을하는 것으로 생각된다. MS 치료는 지금까지 단지 부분적으로 효과적이고 연구 노력은 질환의 병태 생리에 대한 우리의 지식을 확장하고, 새로운 치료 전략을 개발하는 것을 계속한다. 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)는 MS가 많은 임상 및 병리 생리 학적 기능을 공유하기위한 가장 일반적인 동물 모델입니다. 인간 MS의 다른 임상 면역 조직 학적 측면을 반영 EAE 모델의 광범위한 다양성이있다. 마우스에 적극적으로 유도 EAE 강력하고 복제 결과 가장 쉬운 유도 모델입니다. 그것은 특히 면역 neuroi 의해 도전 트랜스 제닉 마우스를 사용하여 약물의 또는 특정 유전자의 효과를 조사하기에 적합nflammation. 따라서, 마우스는 CNS 균질 또는 미엘린 단백질의 펩티드로 면역화된다. 때문에 이러한 펩티드의 낮은 면역 원성 가능성에 강한 보조제가 사용됩니다. EAE 감수성과 표현형은 선택 항원 및 설치류의 변형에 따라 달라집니다. C57BL / 6 마​​우스는 유전자 변형 마우스 건설에 일반적으로 사용되는 변형하고 수초 희소 돌기 아교 세포의 당 단백질 (MOG)에 다른 사람의 사이에서 반응한다. 면역 원성 에피토프 MOG 35-55은 이틀 후 예방 접종의 날에 적용되는 완전한 프로 인트 아쥬 반트 (CFA) 이전에 예방 접종 백일해 독소에 일시 중단됩니다. 마우스는 예방 접종 후 9-14일에서 흐늘 흐늘 한 마비를 오름차순으로 &quot;클래식&quot;자기 제한 단상 EAE을 개발한다. 생쥐 25-50일 대한 임상 점수 시스템을 사용하여 매일 평가된다. 관리 EAE와 동물의 촬영뿐만 아니라이 모델의 응용 가능성과 한계에 대한 특별한 고려 사항에 대해 설명합니다.

접종 후, 마우스 체중 및 임상 증상의 변화를 매일 평가되어야한다. 질병의 발병은 일반적으로 EAE 현상 볼 수 있습니다 1-2일 전에 시작할 수있는 무게의 감소와 상관 관계가있다. EAE의 임상 증상은 보통 하루에 9, 14 후 예방 접종 사이에 시작합니다. 병변이 주로 C57BL / 6 마​​우스에있는 MOG-EAE에서 척수 언어로 번역, 그들은 일반적으로 주동이의 패턴에 꼬리에 주로 행등 증상을 개발할 수 있습니다. EAE의 증상과 예방 접종 마우스의 예시 사진 (6 득점)는도 1a에 도시되어있다. 일부 비정형 EAE의 증상은 또한 축 로터리 방식으로 압연으로 발생할 수있는, 고전 EAE에서 반영되지 않습니다 새우등 모양이나 과민 반응은 표 1에 묘사 된 점수. 모터 증상이 모델의 주요 특징으로,이 점수는 우리에게 주는가 질병의 심각도의 좋은 표시. 다른 모니터링 시스템 (예를 들어, 0 득점 -다른 적자를 평가하는 5 또는 0 ~ 6) 더 복잡한 복합 점수도 발표되었다. 증상이 심한 경우는 각각의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 실험의 반출 할 필요가 가진 생쥐에주의하시기 바랍니다. 마우스는 다음 10-20일 이상 증상이 일반적으로 부분적인 회복을 보여줍니다. 대표적인 질병 과정은 그림 1B에 도시되어있다. 결과 매개 변수를 평가하기위한 관심의 EAE 동안 다른 시간 지점이 있습니다. 자주 찾을 수있는 몇 가지 일반적인 분석은 매우 간략하게 설명되어 있습니다. 질병 최대, 마우스는 체외에서 MOG 35-55 펩타이드 (MOG 리콜 분석)와 격리 된 면역 세포의 restimulation 후 사이토 카인의 생산 확산을 위해 평가 될 수있다. 면역 세포는 EAE의 증상이 뇌와 마우스의 척수에서 분리하고 추가로 처리, 유동 세포 계측법에 의해 예를 들어 있습니다. 척수 부분의 조직 학적 분석은 질병 m에서 수행 될 수있다병변 부하와 탈수 초화 aximum, 나중에 신경 변성 및 신경 세포 사멸에 대한 마커를 점하면서 관심이있을 수 있습니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51275/51275fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51275/51275fig1.jpg" width="600px" /> 그림 1. 대표 EAE 결과. 30 일 예방 접종 후 EAE의 증상과 예방 접종을 C57BL / 6 마우스의 A. 대표 사진 (EAE 6 득점). B. 주제 질병 과정. 데이터는 평균과 평균의 표준 오차로 표시됩니다 (N = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51275/51275fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)는 다발성 경화증의 설립 동물 모델입니다. C57BL / 6 마우스는 중추 신경계 자기 반응성 면역 세포에 의해 야기 오름차순 이완성 마비를 초래 미엘린 희소 돌기 아교 세포의 당 단백질 (MOG) 펩티드 35-55 (MOG 35-55)로 면역화된다. 질병 유도 및 모니터링을위한 프로토콜이 논의 될 것이다.

수초 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) C57BL / 6 쥐에 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 유도

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

이 절차의 전반적인 목적은 다발성 경화증의 임상적 및 병태생리학적 특징을 모방하는 실험적 자가면역성 뇌척수염 동물 모델을 유도하는 것입니다. 이는 먼저 항원과 보조제, 그리고 백일해 독소를 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 항원과 CFA 유제물을 피하에 주사하고, 백일해 독소를 복강 내에 주사하는 것입니다.이틀 후, 생쥐에게 백일해 독소를 다시 복강 내 주사합니다. 이후 동물들의 체중을 측정하고 임상 점수를 매일 평가합니다. 최종적으로, 면역화 후 9일에서 14일 사이에 실험적 자가면역성 뇌척수염의 임상 증상이 보통 관찰됩니다.rizone과 같은 독성 제제나 다양한 EIE 변이체를 사용하는 기존 프로토콜과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 기존의 모든 방법이 적응 면역 체계의 관여와 같은 근본적인 병리적 특징에서 매우 큰 차이가 있음에도 불구하고 다발성 경화증(MS)의 특징들을 모방한다는 점에 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 면역화 과정의 까다로운 취급으로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 따라서 동물의 스트레스를 줄이고 면역화 이후 최적의 상태를 보장하는 것이 절대적으로 필요합니다.이 모델은 신경면역학 분야의 연구자들이 녹아웃(knockout) 동물을 특성화할 수 있는 길을 열어주었습니다. 새로운 분자 약물 표적을 식별하거나 유망한 약물 후보 물질을 테스트하기 위해, 펩타이드 용액을 준비하려면 먼저 동결 건조된 MOG 35-55 펩타이드를 이중 증류수에 희석하여 최종 농도를 2 mg/mL로 맞춥니다. 마우스 한 마리당 이 용액 100 µL가 필요하며, 준비 과정에서 일부 손실분이 발생합니다.따라서 필요한 용액 양의 1.5배에서 2배 분량을 조제하십시오. 펩타이드 용액은 -20 °C에서 보관하십시오. 완전 프룬스 보조제(complete frons adjuvant) 또는 CFA를 만들려면, 건조된 mycobacterium tuberculosis H37RA 100 mg을 막자에 넣고 유발로 갈아 고운 분말로 만드십시오.그 다음, 불완전 프룬드 보조제(incomplete frons adjuvant) 10 milliliters를 첨가하여 10 milligram per milliliter 농도의 CFA 스톡 용액을 제조합니다. CFA 스톡은 면역 접종 당일까지 4°C에서 보관할 수 있습니다. CFA 스톡 용액을 불완전 프룬드 보조제로 희석하여 최종 농도를 2 milligrams per milliliter로 맞춘 후, 입자성 물질이 다시 부유하도록 충분히 혼합하고 얼음에 둡니다.MOG 35 to 55 펩타이드 용액의 분주액을 해동한 후, 얼음 위에 둡니다. 2mL 주사기와 27게이지 캐뉼라를 사용하여 CFA 1mL를 흡입합니다.그 다음, 두 번째 2 mL 주사기와 20게이지 캐뉼라를 사용하여 MOG 35 to 55 용액 1 mL를 흡입합니다. 기포를 모두 제거한 후, 3방향 밸브를 이용해 두 주사기를 연결합니다. 3방향 밸브를 거의 닫은 상태에서 에멀젼을 한쪽 주사기에서 다른 쪽으로, 그리고 다시 반대로 밀어 넣으며 최소 10분 동안 충분히 혼합합니다.완료되면 용액은 층 분리가 없는 흰색의 단단하고 점성이 있는 상태여야 합니다. 이제 면역화 전까지 에멀션을 최소 30분에서 최대 수일 동안 그대로 둡니다. 여전히 에멀션 상태가 유지되고 있는지 확인하십시오. 면역화 당일에 용액을 두 개의 주사기 중 하나에 취하고 27 gauge 캐눌라를 연결합니다.50 $\mu$g의 pertussis toxin을 500 $\mu$L의 이중 증류수에 재구성합니다. 100 $\mu$g/mL 농도의 스톡 용액을 만들어 필요할 때까지 4°C에서 보관하십시오. 면역 날에 pertussis 스톡 용액을 1:50으로 희석합니다.PBS를 사용하여 400 ng의 백일해 독소가 포함된 희석된 백일해 용액 200 µL를 주사기에 준비하고, 바늘 허브의 사강(dead space)을 고려하여 100 µL를 추가로 흡입합니다. iso fluorine으로 마우스를 마취시킨 후, 발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 마취 수준을 확인합니다. 항원 CFA 유제 100 µL를 각 뒷다리 옆구리의 서로 다른 두 곳에 피하 주사합니다.주사 후 피부 아래에 구형의 덩어리가 형성되어야 하며, 이는 실험 전 기간 동안 유지되어야 합니다. 다음으로, 200 µL의 백일해 독소(pertussis toxin)가 담긴 준비된 주사기를 복강 내로 주사하십시오. 매일 평가 시 개별 마우스를 쉽게 식별할 수 있도록 조치하십시오.예를 들어, 꼬리 기부의 색상 표시를 통해 가능합니다.

myelin-oligodendrocyte-glycoprotein-mog35-55-induced-experimental

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

특정 마우스 변종은 myelin 기본 단백질과 함께 실험적인 면역 encephalomyelitis (EAE)의 유도에 저항 할 수 있습니다. 여기에서 설명한 것은 응답하지 않는 문제를 역으로 여러 전형 EAE 모성 마우스 얼룩에 중풍 질환을 유도하는 간단한 예방 접종 프로토콜입니다.

입양 이전 및 Antigenic 챌린지에 의해 실험적 면역 Encephalomyelitis (EAE) 모성 마우스 변종에 응답하지 않는 문제를 극복

이 비디오는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질과 불활성화된 결핵균의 조합을 주입하여 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하는 방법을 보여줍니다. 이 모델을 통해 연구원들은 질병 메커니즘을 연구하고 치료 개입을 테스트할 수 있습니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염 유도

이 동영상은 뇌로 이동하는 자가반응성 T세포를 활성화하기 위해 미엘린 유래 펩타이드에 보조제를 주입하여 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유발하는 방법을 보여줍니다. 백일해 독소는 혈액 뇌 장벽 투과성을 증가시켜 이러한 T 세포와 다른 면역 세포가 뇌로 들어갈 수 있도록 하기 위해 투여됩니다. 이러한 면역 세포는 탈수초화를 일으켜 신경 전달 장애와 EAE 발병을 유발합니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 발생

이 비디오에서는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 사용하여 다발성 경화증의 마우스 모델을 구축합니다. 마우스에 뉴런 펩타이드와 보조제가 포함된 에멀젼을 주입하여 자가반응성 T세포를 활성화하는 면역 반응을 유발합니다. 그 다음에는 백일해 독소(PTX)를 주입하여 혈액뇌장벽 투과성을 높여 자가반응성 T세포가 뇌에 침투할 수 있도록 합니다. 이 침투는 궁극적으로 수초성 손상을 초래하는 신호 폭포를 시작하여 다발성 경화증의 탈수초성 상태를 모방합니다.

이 원고는 다양한 질병 단계에서 각각 유세포 분석 및 정량적 PCR을 사용하여 림프절, 비장, 혈액 및 척수의 면역 세포 분포 및 mRNA 사이토카인 수치를 평가하는 방법과 함께 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델의 유도 및 채점 방법을 설명합니다.

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

우리는 기본 실험실 장비만을 사용하여 마우스 Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein을 포함하는 대량의 융합 단백질을 생성하고 정제하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 이 단백질은 T 세포와 B 세포 모두에 의해 유발되는 실험적인 자가면역 뇌척수염을 유도하는 데 사용할 수 있습니다.

실험자가 면역 뇌척수염 연구 간단하고 효율적인 생산 및 마우스 미엘린 희소 돌기 아교 세포 당 단백질의 정제

화살 비행기에서 운동학 걸음 걸이 분석 운동 실행 하는 방법에 대 한 매우 정확한 정보를 생성 합니다. 우리는 중재 면역 demyelination 대상이 쥐에 대 한 걸음 걸이 적자를 식별 하기 위해 이러한 기술의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이러한 방법은 다른 마우스 모델을 갖춘 장애인된 운동에 대 한 걸음 걸이 적자 하 사용할 수 있습니다.

MOG35-55를 받게 하는 C57BL/6 쥐에 화살 평면 운동학 걸음 걸이 분석 실험적인 자기 면역 뇌 유발

이 원고는 마우스에서 활성 실험자가 면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 중추신경계(CNS)에서 침투된 림프구의 분리 및 특성화 방법도 림프구가 CNS 자가면역 질환의 발병에 어떻게 관여하는지 보여주기 위해 제시된다.

실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석

본 프로토콜은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질을 사용하는 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 임상 스코어링 시스템을 사용하여 질환 과정을 모니터링하는 것을 설명한다. 실험적 자가면역 뇌척수염 관련 증상은 마우스 대퇴골 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석 및 오픈 필드 테스트를 사용하여 분석되어 질병 과정을 종합적으로 평가합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 다양한 평가 지표

실험적 자가면역 뇌척수염은 다발성 경화증에서 가장 널리 사용되는 쥐 모델 중 하나입니다. 현재 프로토콜에서는 남녀 모두의 C57BL/6J 마우스에 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩타이드를 면역하여 주로 꼬리와 팔다리의 상행 마비를 초래합니다. 여기서는 EAE 유도 및 평가 프로토콜에 대해 논의합니다.

두 성별의 다발성 경화증 모델링: MOG35-55-유도 실험적 자가면역 뇌척수염

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증(MS)의 동물 모델로, 인간 질병과 강력한 체액성 자가면역 반응을 공유합니다. 여기에서는 EAE 면역 마우스의 혈청에서 자가항체를 정량화하기 위한 간단하고 유연한 ELISA 프로토콜을 보고합니다.

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice on Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (실험적 자가면역 뇌척수염 시 마우스의 자가반응성 항체 정량화)

학습하세요 실험자가 면역 뇌척수염(EAE) 유도 방법을 C57BL/6 쥐에 MOG 35-55 펩타이드와 CFA를 사용하여 다발성 경화증 동물 모델을 구축하는 기술입니다. 이 방법은 신경면역학 연구와 신약 개발에 활용됩니다.

수초 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 (MOG

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