Name: 신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: 배우세요 형광 현미경 이미지의 신속한 분석 및 탐사 방법을 PhenoRipper 플랫폼을 사용하여. 이 워크플로우는 고속 스크리닝 데이터에서 표현형 프로파일을 효율적으로 식별하여 연구자들이 복잡한 세포 표현형을 빠르게 비교할 수 있게 합니다.

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우리는 아담 코스터와 도움의 의견과 토론 Altschuler와 우 실험실의 다른 모든 구성원 감사합니다. 이 연구는 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다 R01 GM085442 및 CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), 그리고 웰치 재단 I-1619 (SJA)를 부여하고 I-1644 (LFW).

1. 준비 샘플 및 이미징 <ol><li> 세포 배양 <ol><li> 일상적으로 문화를 분할하고 20~70%의 합류에 유지한다. 이전 실험에 어느 날, (둘 베코의 수정 이글 중간 재료의 표 참조) DMEM에서 HeLa 세포의 성장과 10 % FBS (태아 혈청) 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충. </li><li> 실험의 날에, 분할 세포 배양 (약 50 %의 합류)에서 성장. </li><li> 몇 초 동안 트립신 / EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산)의 약 2 ㎖에 노출, PBS (인산염 완충 생리 식염수)으로 세포를 씻으십시오. 초과 트립신 / EDTA를 대기음 ~ 3 분 동안 실온에서 후드 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 박막에 목욕 세포를 유지. </li><li> 기계적으로 두 번 플라스크를 흔들어 혈청 보충 미디어 세포를 분리. 세포를 세어 미디어의 5,000 cells/50 μL로 희석 즉시 아니라 자동화 된 액체 처리 로봇 (30를 사용하여 384도 유리 바닥 판에 50 μL / 웰 플레이트플레이트들)은 여기에 사용됩니다. </li><li> 웰 소재 가장자리 효과를 최소화하기 위해 30 분 동안 RT에서 플레이트를 배양한다. 하룻밤 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에서 RT 배양, 장소 플레이트 후. </li><li> 각각의 약물은 중복으로 측정됩니다. 판은 이미 미디어를 포함에 해당 우물에 약 25 μl를 추가합니다. </li><li> 24 시간 후 약물 치료에서 PBS에 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 플레이트를 고정합니다. </li></ol></li><li> 염색 여기에 사용 된 특정 기본 항체, 형광 표지 된 이차 항체와 다른 형광 얼룩은 재료의 표에 나열되어 있습니다. <ol><li> 투과 3 분 TBS에서 0.2 % 트리톤 X-100 용액 (트리스 완충 식염수)로 세포를 고정하고, TBST (트리스 완충 식염수 + 트윈 20) 3 배, 세척. 블로킹 TBST에서 5 % BSA (소 혈청 알부민) 솔루션을 추가합니다. </li><li> 2 시간 동안 실온에서 접시를 품어 후 TBST 배, 세척. </li><li> 차 항체 dilut을TBST에서 5 % BSA에 이온 (재료의 표 참조)도 10 μL /를 추가합니다. 2 시간 동안 실온에서 접시를 품어 후 TBST로 3 회 세척한다. </li><li> TBST에 차 항체 dilutionin 5 % BSA (재료의 표 참조)을 확인하고도 10 / μL를 추가합니다. </li><li> 2 시간 동안 실온에서 어둠 속에서 판을 품어 후 TBST로 두 번 씻는다. </li><li> PBS에서 (재료의 표 참조) 훽스트 및 phalloidin도에 대한 희석을 준비하고 잘 10 μL /를 추가합니다. </li><li> RT에서 30 분 동안 어둠 속에서 접시를 품어. </li><li> 후 2 TBST 세척, 4 ° CO / N.에서 박 및 저장소의 커버 플레이트 </li></ol></li><li> 영상 카메라의 1x1 비닝로 20X 대물 렌즈를 이용하여 표면 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득. 480 이미지 (배 채널)의 총, 각 웰에 여섯 이미지를 획득. </li></ol> 2. 이미지 분석 다운로드 phenoripper.org에서 PhenoRipper를 설치하고 IMA의 분석을 시작 PhenoRipper를 시작GES. PhenoRipper은 TIFF를 지원, PNG 및 JPEG와 MATLAB에서 지원하는 모든 다른 형식 (현미경 소프트웨어는 일반적으로 TIFF로 수출을 지원합니다). 2.1 데이터 로딩 <ol><li> 표준 이름 / 조직 컨벤션 로딩 이미지와 연관 메타 데이터를 만들 수있는 현미경 이미지, 존재하지 않습니다 (예 : 치료의 유형으로, 즉 실험적인 주석을 잘 수 등) 워크 플로의 가장 어려운 부분입니다. (아래에 설명) 제시된 방법 중 하나를 선택합니다. <ol><li> PhenoLoader : 원하는대로 파일 이름 및 / 또는 디렉토리 구조 (예 : B16 HeLa_Drug5-DAPI.png 이미지가 잘 B16에서 않기 때문입니다 그룹의 이미지에 충분한 정보가 포함되어있는 경우 데이터를로드 반 자동이 옵션을 선택하면, 세포 처리됩니다 이 이름 지정 규칙을 사용하여, 잘 A1 또는 약 5 처리의 모든 이미지를 쉽게 분류 할 수있다) - ID가 5이고, 이미지가 핵 DAPI의 얼룩을 캡처 마약. 마법사는 것이미지 그룹과 메타 데이터를 연결하고 다음과 같이 마커를 정의하는 단계로 사용자 단계를 안내 : <ol><li> PhenoLoader 창에 액세스 할 수 있습니다 &quot;파일 구조&quot;를 클릭하십시오. </li><li> 이미지 데이터 집합을 포함하는 디렉토리를 선택하려면 &quot;정의 루트 디렉토리&quot;를 클릭하십시오. 그런 다음 분석 (옵션, 빈 남아있을 수 있습니다)에 사용하지 않는 파일 (사용하지 않는 파일)를 필터링 할 수 있습니다. </li><li> 실험에 사용 된 바이오 마커를 지정하고 이미지와 연결하는 &quot;정의 마커&quot;를 클릭하십시오. 구체적으로 다음 고유 생체를 식별하는 파일 이름의 부분을 선택하여 이미지 파일을 클릭합니다. 마지막으로, 각각의 바이오 마커의 이름을 입력합니다. </li><li> 각각의 이미지와 정보를 연결하는 &quot;정의 메타 데이터&quot;를 클릭하십시오. 특히, 이미지 파일을 클릭 한 다음 이미지 정보 (물론 이름 예 : &quot;B16&quot;)를 식별하는 파일 이름의 일부를 선택합니다. 창은 그룹 이름 (예 : &quot;요청 우리LL &quot;)의 이름을 입력 나타납니다. 파일 이름에서 추출 된 그룹의 구성원) 예를 들어, 잘 이름의 전체 목록 (그룹 테이블에 표시됩니다. 파일 이름에없는 추가 정보를 추가하려면 클릭&quot; (옵션) 다음 &quot;추가 그룹 이름 (예를 들어, 입력&quot;메타 그룹 추가 &quot;버튼을 클릭합니다.를 클릭&quot;약을 &quot;)와 미리 정의 된 그룹의 각 값에 대해 (예를 들어,&quot;음 &quot;)의 값을 입력합니다 (예 :&quot;탁솔 &quot;) . 추가 할 수있는 추가 그룹의 수는 제한이 없다. </li><li> 마지막으로, 메타 데이터 파일을 생성하고 분석을 계속하기 위해 &quot;만들기 Metadatafile&quot;을 클릭합니다. 메타 데이터 파일은 이전에 생성 된 경우, 상기 단계들은 직접 옵션 (아래에 설명 된 세) &quot;메타 파일&quot;을 이용하여 파일을로드함으로써 회피 될 수있다. </li></ol></li><li> 정규 표현식을 기반으로 템플릿 : 정규 표현식은 패턴과 일치하는 표준 방법입니다텍스트. 파일명 및 / 또는 디렉토리 구조는 그룹 화상에 충분한 정보를 포함하고 네이밍 컨벤션 기존 템플릿 중 하나와 일치 할 때이 옵션을 선택한다. 정규 표현식을 기반으로 사용자 정의 템플릿을 수동으로 정의하고 재사용 할 수있다. 이 고급 옵션은 정규 표현식을 잘 알고있는 사용자 만 사용해야합니다. </li><li> 메타 데이터 파일 : 궁극의 커스터마이즈에 대해이 옵션을 선택합니다. 정의하고 쉼표로 구분 된 값을 각각의 이미지에 연결된 파일 이름 및 메타 데이터를 포함하는 (CSV) 파일을로드합니다. 파일 형식의 예는 웹 사이트 (phenoripper.org)의 다운로드 부분에 유효하다. 단순히 포함 된 정보를 표시 할 인터페이스를 통해 파일을로드합니다. </li></ol></li><li> 중복을 피하기 위해 샘플링 실험 복제물을 정의 메타 데이터 필드를 선택한다. 노출 수 있습니다 (물론에 의해 예)를 그룹화, 반복 실험을 (잘 예를 들어, 모든 이미지가 비슷해야한다) 포함하는 데이터 세트에 대한비켜 성능을 제공합니다. 대부분의 경우에 임의의 부분 집합을 선택하는 기본 옵션 &quot;무작위 (모른다)&quot;을 선택하는 것이 합리적이다. </li></ol> 2.2 분석 매개 변수 설정 데이터 집합을 처리하는 데 필요한 매개 변수를 정의하는 &quot;매개 변수 설정&quot;을 클릭합니다. 정의하는 파라미터는 좌측 패널이다. 오른쪽 패널에 데이터 세트의 병합 된 샘플을 표시합니다. 서로 다른 이미지를 전환 할 왼쪽 / 오른쪽 화살표를 클릭하십시오. <ol><li> 임계 강도 : 약 화상 셀룰러 부 (아닌 배경, 비 세포 영역)를 식별하기 위해 적절한 임계 값을 선택. 임계치 PhenoRipper 의해 미리 계산되지만, 화상의 상단에 제공되는 스크롤 바를 이용하여 셀룰러 영역의 강조를 향상시키기 위해 조정될 수있다. 선택된 임계 값은 모든 이미지에서 작동하지 않는 경우, 비 세포 영역이 아닌 휴대 영역을 삭제를 포함하도록 임계 값을 낮 춥니 다. </li><li> 블록 S이지는 : 그리드에 이미지를 픽셀 단위로 적절한 블록 크기를 선택합니다. 지정된 크기의 블록은 이미지에 중첩됩니다. 20 ~ 30 블록 / 셀의 평균을 얻기 위해 블록의 크기를 조절합니다. &quot;블록 크기&quot;필드 앞의 체크 박스에 이미지 버튼을 클릭함으로써 그리드를 중첩합니다. </li><li> 선택적 매개 변수 : 자동 조정 이미지를 원하는 상대 강도와 마커를 (예를 들어, 하나의 색상이 포화 상태)를 표시 또는 마커 분석에서 제외 할 필요가있는 경우, &quot;채널의 강도를 조절&quot;옵션을 사용하지 않는 경우. 마커의 하위 집합에 휴대 영역을 식별하려면 옵션 &quot;임계 값에 사용되는 채널&quot;을 사용합니다. 다른 매개 변수의 기본 선택은 일반적으로 충분하지만, 필요한 경우, &quot;고급 분석 옵션&quot;을 사용하여 조정합니다. </li><li> 주 응용 프로그램 패널의 &quot;PhenoRip&quot;를 눌러 분석을 실행합니다. PhenoRipper 자동으로 이미지에 재발 블록 유형을 식별합니다. 표현형 프로파일이 생성됩니다그것에 상이한 블록 유형의 분획에 기초하여 각각의 이미지. </li></ol> 3. 탐색 결과 <ol><li> PhenoBrowser (그림 1)를 사용하여 이미지의 표현형 프로파일 사이의 관계를 탐구한다. PhenoBrowser 인터페이스는 4 개의 패널로 구성됩니다 : 왼쪽 상단 패널은 서로 다른 이미지 / 조건의 상대적인 유사성의 그래픽 표현 (산포도)이며, 선택된 조건의 오른쪽에 표시 샘플 이미지 및 최종 패널 (막대 차트에있는 두 개의 패널 )는 자신의 표현형 프로파일을 비교합니다. </li><li> &quot;데이터 처리&quot;메뉴를 사용하여 &quot;빈 프레임을 폐기&quot;. </li><li> 가난한 품질의 이미지를 제거 첫째, 개별 이미지는 &quot;데이터 처리&quot;메뉴에서 그룹을 해제 공부. 다음으로, 산점도의 국외자 점을 클릭하고 (예를 들어, 초점, 염색 유물) 낮은 품질의 이미지를 버린다. </li><li> 데이터를 탐색 : 필드 정의를 메타 데이터 결정하십시오비교의 기본 단위 (예를 들어 약물과 비교하기 위해, 메타 데이터 필드의 동일한 값 &quot;약물&quot;와 이미지는 함께 그룹화 될 필요가있다). &quot;그룹으로&quot;를 하나의 데이터 요소에이 메타 데이터 필드의 값이 동일한 모든 이미지를 축소. 예를 들어, 마약류 그룹은 약 당 하나의 포인트를 얻을 각 약물에서 이미지를 평균 할 것이다. 산포도 인근 (또는 먼) 포인트와 유사한 (또는 이종) 세포의 표현형을 유도 조건을 반영합니다. 해석 능력을 돕기 위해 가능한 메타 데이터를 기반으로 색상 또는 라벨 포인트 (데이터 표시 메뉴). 3D 플롯은 &quot;회전&quot;체크 박스에 왼쪽 버튼을 클릭하고 마우스를 드래그하여 클릭하여 회전 가능하다. </li><li> 직접 비교하는 두 개의 서로 다른 점을 선택합니다. 이미지 패널은 각 포인트에 대한 샘플 이미지를 표시하고, 막대 차트 패널은 그 발생 빈도 두 점 사이의 대부분의 다른 블록 형식을 보여줍니다. </li><li> C를 시작합니다블록 종류 및 실험 조건 사이의 관계의 더욱 글로벌 뷰를 제공하는 &quot;Clustergram 메뉴」로부터 lustergram. 블록의 종류와 조건을 모두 그룹화하여,이 표현은 가장 좋은 조건의 그룹 (그림 5)를 구별 세포 표현형을 강조한다. </li></ol>

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</ol>

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여기에 설명 된 워크 플로는 빠르고 쉬운 특성과 현미경 이미지의 비교를 할 수 있습니다. 우리는 먼저이 워크 플로는 빠르게 현미경 이미지에 대한 품질 관리를 수행하여, 예를 들어 실험의 최적화를 할 수있는 방법을 보여 주었다. 다음으로, 우리는 높은 처리량 검사 데이터를 분석에 대한 가능성을 보여 주었다 : 우리는 그들의 행동 메커니즘을 기반으로 그룹의 약물에 수 있었다. 약물의 그룹은 PhenoRipper 빨리 규모의 명령에도 불구, 더 복잡한 방법 6을 사용하여 발견에 필적했다. 우리는 모든 이미지 기반의 접근 방식으로, 산발적 실험 변동에 대한 강력한이 방법을 발견했지만, 판독 체계적인 비 생물학적 효과에 의해 영향을받을 것입니다. 예를 들어, 마커 강도 플레이트에 플레이트 변화는 관심의 생물학적 효과를 마스크 할 수 있습니다. 이러한 아티팩트의 영향은 적절한 교정 07에 의해 감소 될 수 중에는, P 8판 정상...

지난 10 년 동안 이미징 기술의 급속한 진보는 많은 실험실에게 높은 처리량 현미경을 수행 할 수있는 능력을 부여 하였다. 문제는 지금 분석 중 하나에 이미지 중 하나를 이동했다. 우리는 어떻게 비교, 특성, 그리고 일반적인 높은 처리량 영상 화면에 생성 된 복잡한 아직 미묘한 표현형의 급류를 탐험 할 수 있습니까? 이미지 분석 및 정보학 플랫폼의 숫자는 이미지의 큰 컬렉션에서 생체 정보를 추출하기위한 사용자 정교한 도구 상자 1-3을 받고 있습니다. 그러나 많은 중요한 장애물은 높은 처리량 이미지 기반 화면에서 데이터를 분석 남아있다. (그 시스템) 이미지와 알고리즘 파라미터의 미세 조정의 적절한 특성화를 선택과 관련된 어려움은 종종 특히 이미지 분석 전문 지식이없는 사용자를 위해 긴 설치 시간에 발생합니다. 특히, 셀 분할, 개별 셀을 식별하는 프로세스해당 화상은,이 점에서 주요 병목 현상이다. 분할은 세포 유형, 세포 밀도와 바이오 마커와 같은 실험적인 매개 변수에 매우 민감하고, 자주 큰 데이터 세트에 대한 반복 조정을 필요로 할 수 있습니다. 이러한 이유로, 이미지 분석은 종종 오히려 실험 플로의 통합 부분보다 전문가에 의해 수행 독립적 단말 단계이다. 이 분석 및 실험, 분석 개발의 중요한 부분의 신속한 피드백주기를 배제한다. 여기에서 우리는 높은 처리량의 형광 현미경에 최적화 상기 어려움의 많은 것을 방지하는 다른 워크 플로우에 대해 설명합니다. 이를 위해, 우리는 PhenoRipper 4, 빠른 탐사 및 현미경 이미지 분석을위한 오픈 소스 소프트웨어 플랫폼을 사용합니다. 중요한 것은, PhenoRipper 단일 세포를 식별하려고 시도하지 않음으로써 세포 분할과 관련된 여러 가지 문제를 피할 수 있습니다. 대신, PhenoRipper 픽셀로 이미지를 분할세포 내 크기의 블록들이 포함 된 블록의 측면에서 이미지를 특징. 특히, PhenoRipper 마커 - colocalization을 기반 기능의 측면에서 블록을 프로파일 자동 교육 이미지의 가장 대표적인 유형을 차단 4 식별합니다. PhenoRipper 다음 각 블록과 가장 유사한 대표 블록 타입에 할당하고, 마지막에 포함 된 블록의 종류에 따라 이미지를 특징. 전통적인 단일 셀 기반의 접근 방식에 비해,이 방법은 최소한의 미세 조정과 전문​​ 지식을 필요로합니다. 블록 크기와 그래픽 피드백을 설정 둘 임계 강도 (이미지의 비 세포 부분을 폐기) : 이와 같이, 사용자는 두 개의 매개 변수를 설정해야합니다. 중요한 것은, 여기에 설명 된 워크 플로는 속도와 최소한의 미세 조정이 큰 시간과 신뢰성 향상을 제공 훨씬 더 큰 데이터 세트를 쉽게 확장 4를 보였다. 실제로, 우리는 발견이이 응용 프로그램바퀴벌레는 모두 크기가 4의 배수 주문하여 설치 및 실행에 필요한 시간을 줄일 수 있습니다. PhenoRipper의 기본 출력은 세포가 유사한 표현형을 표시하는 원인이 실험 조건의 그룹을 식별하기 위해 사용자를 가능하게하는 이미지의 유사성을 시각적으로 표시 한 것입니다. 일반적으로 발견 PhenoRipper 그룹화는 더 많은 시간이 소요되는, 세포 기반 방법 (4)에 의해 생성 된 것과 비교 &quot;생물학적 해석 가능성&quot;이. 실제로, 이것은 종종, 전형적인 96 - 웰 형광 현미경 실험을 행하는 반 시간 내에, 종래 이미지 분석 경험이없는 실험자가 자신의 실험의 성능에 대한 신뢰성있는 판독을 얻을 수 있다는 것을 의미한다. 실험은 다른 실험 조건 사이의 관계를 탐구하고 이미지 표현형에 이러한 관계의 관계를 시작할 수 있습니다. 우리는 효과를 분석하여 여기에이 워크 플로를 보여DNA와 세포 골격 마커 스테인드 HeLa 세포에 별개의 기계적인 클래스의 약물. 약물의 같은 클래스로 처리 된 세포의 이미지가 함께 그룹화하고, (그래서에 초점을 세포 밖으로 염색 유물)별로 품질의 이미지를 식별하고 잠재적으로 폐기하기가 용이하고, 아웃 라이어로 등장했다. 이 워크 플로는 이미지 기반 분석의 큰 숫자에 대한 유용하지만, 다른 방법이 잠재적으로 더 많은 정보를 될 수 분명히 많은 경우가 있습니다. 예를 들어, PhenoRipper로부터의 출력은 주로 실험 조건에 걸쳐 형광 패턴의 상대적인 비교이다. 특정 단일 세포 형질의 절대적 특성화가 (셀의 얼룩 무늬의 예 번호) 대신에 필요한 경우, 단일 세포 기반 분석이 요구된다. 그럼에도 불구하고, 심지어 이러한 유형의 상황에서, PhenoRipper이 단일 셀 표현형의 변화를 감지 할 가능성이 있으므로 분석 OPTI를위한 유용한 도구가 될 수mization.

<table><tbody><tr><td>DMEM, High Glucose</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td>High Glucose, L-Glutamine</td></tr><tr><td>Marker Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>DNA stain, dilution 1:2,000 of 5 mg/ml</td></tr><tr><td>stock Marker phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Conjugated phallotoxin, dilution 1:200</td></tr><tr><td>Primary Antibody &alpha;-tubulin</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200</td></tr><tr><td>Secondary Antivody anti-Mouse TRITC</td><td>Jackson</td><td>115-025-166</td><td>Conjugated secondary Ab, 0.5 mg in 1 ml PBS + 1 ml glycerol</td></tr><tr><td>Aldosterone</td><td></td><td></td><td>농도 사용: 0.2 &mu; </td></tr><tr>M<td>사용 된 아피시딘</td><td></td><td></td><td>농도 : 20 &mu; </td></tr><tr>M<td>콜히친</td><td></td><td></td><td>농도 사용 : 0.16 &mu; </td></tr><tr>사용 된<td>M 코티솔</td><td></td><td></td><td>농도 : 0.2 &mu; </td></tr><tr>M<td>사용된 덱사메타손</td><td></td><td></td><td>농도: 0.2 &mu; </td></tr><tr>M<td>도세탁셀</td><td></td><td></td><td>농도 사용: 0.2 &mu; </td></tr><tr>M<td>M344</td><td></td><td></td><td>농도 사용: 20 &mu; </td></tr><tr>M<td>MS-275</td><td></td><td></td><td>농도 사용 : 5 &mu; </td></tr><tr>M<td>노코다졸</td><td></td><td></td><td>농도 사용 : 0.3 &mu; </td></tr><tr>M<td>프레드니솔론</td><td></td><td></td><td>농도 사용: 0.2 &mu; </td></tr><tr>M<td>RU486</td><td></td><td></td><td>농도 사용 : 0.2 &mu; M</td></tr><tr><td>Scriptaid</td><td></td><td></td><td>농도 사용: 70 &mu; </td></tr><tr>M<td>탁솔</td><td></td><td></td><td>농도 사용 : 0.3 &mu; M</td></tr><tr><td>트리코스타틴 A</td><td></td><td></td><td>농도 사용: 0.2 &mu; </td></tr><tr>M<td>Vinorelbine</td><td></td><td></td><td>농도 사용 : 0.3 &mu; 미디엄</td></tr></tbody></table>

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

높은 처리량 현미경의 급속한 발전에도 불구하고, 정량적 인 이미지 기반 분석은 여전히​​ 중요한 도전을 제기. 전문 영상 분석 툴의 다양한 사용할 수 있지만, 대부분의 전통적인 이미지 분석 기반의 워크 플로우 (분석 매개 변수를 미세 조정에 대한) 가파른 학습 곡선을 가지고 이미징 및 분석 간의 긴 처리 시간에 발생합니다. 특히, 셀 분할은 이미지의 개별 셀을 식별하는 프로세스는,이 점에서 주요 병목 현상이다. 여기에서 우리는 PhenoRipper, 신속한 분석 및 현미경 이미지의 탐험을 위해 디자인 된 오픈 소스 소프트웨어 플랫폼을 기반으로 대체, 세포 분할이없는 워크 플로우를 제시한다. 여기에 제시된 파이프 라인은 세포 배양의 면역 형광 현미경 이미지를 최적화하고 최소한의 사용자 개입이 필요합니다. 반 시간 내 PhenoRipper은 일반적인 96 - 웰 실험 데이터를 분석하고 이미지의 프로파일을 생성 할 수 있습니다. 사용자 수다음 시각적으로 데이터를 탐색 자신의 실험에 품질 관리를 실시하고, 섭동에 대한 응답을 보장하고 반복 실험의 재현성을 확인합니다. 이 분석 및 분석 최적화시 매우 중요합니다 실험 사이의 신속한 피드백주기를 용이하게한다. 이 프로토콜은 단지 품질 관리를위한 제 1 패스 분석으로서 유용하지만 엔드 투 엔드 솔루션으로 사용될 수 있고, 특히 스크리닝. 여기에서 설명한 워크 플로우는 높은 처리량 스크린에 의해 생성 된 것과 같은 큰 데이터 세트로 스케일링하고, 정확하게 생물학적 시스템의 넓은 범위 표현형에 의해 그룹 실험 조건에 도시되었다. PhenoBrowser 인터페이스는 표현형 공간을 탐구하고 생물 주석에 이미지 속성을 관련하는 직관적 인 프레임 워크를 제공합니다. 종합적으로, 여기에 설명 된 프로토콜을 기반으로 화상 스크린의 정량 분석​​을 채택하는 장벽을 낮출 것이다.

여기에서 우리는 그들의 행동 메커니즘을 기반으로 그룹의 약물이 워크 플로의 능력을 시험했다. 헬라 세포는 384 - 웰 플레이트의 30 우물에 씨앗을 품고 및 DNA / 말라 / α-tubulin에 대한 염색 하였다. 사용 된 특정 기본 항체, 형광 표지 된 이차 항체 및 기타 형광 얼룩은 재료의 표에 나열되어 있습니다. 웰스는 세 기계론의 클래스 (히스톤 탈 아세틸 화 효소의 억제, 미세 소관 타겟팅 및 DNA 손상) 24 시간 동안 20 배 목표 배율 표면 형광 현미경을 사용하여 몇 군데에 속하는 15 약물로 치료했다. 열 여섯 이미지 480 이미지 (배 채널)의 총, 잘 각각 인수했다. 여기에 설명 된 데이터는 www.phenoripper.org에서 다운로드 할 수 있습니다. 전술 한 바와 같이, PhenoRipper은 이러한 이미지를 분석하는 데 사용 하였다. 전경 임계 값은 5 % (최대 가능한 강도, 즉 5 %) 및 20 픽셀 블록 크기 <stron...

여기에서 우리는 빠르게 PhenoRipper, 최근에 개발 된 이미지 분석 플랫폼을 사용하여 형광 현미경 이미지의 컬렉션을 분석하고 탐구를위한 워크 플로를 설명합니다.

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 이미지 분석 플랫폼을 사용하여 형광 현미경 이미지를 신속하게 분석하고 탐색하는 것입니다. 이를 위해 먼저 세포를 플레이트에 분주하고, 각 웰에 섭동(perturbation)을 가한 후 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 자동 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득하며, pheno loader 도구를 사용하여 pheno ripper 이미지 분석 플랫폼에 이미지를 반자동으로 로드합니다.분석 파라미터를 설정하면, pheno ripper가 이미지에서 반복되는 블록 유형을 자동으로 식별하고 각 이미지에 대한 표현형 프로필을 생성하며, 이는 pheno browser를 통해 탐색할 수 있습니다. 최종적으로, 최종 클러스터그램은 서로 다른 조건과 이미지 특징 간의 관계를 보여주어, 고처리량 이미지 스크리닝으로 생성된 복잡하면서도 미묘한 표현형들을 비교할 수 있게 합니다. 개별 세포의 자동 식별이 필요한 기존 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은 사용법이 훨씬 빠르고 간편하다는 것입니다.이 방법은 서로 다른 약물이 세포 과정에 어떤 영향을 미치는지와 같은 생의학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 절차는 텍스트 프로토콜에 설명된 세포 배양 및 세포 고정으로 시작하며, 텍스트 프로토콜에서 확인할 수 있는 특정 1차 항체, 형광 표지 2차 항체 및 기타 형광 염색제를 사용하여 고정된 세포를 염색합니다. 세포 염색 후, 에피 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다.본 예제에서는 Benning의 1-by-1 카메라를 사용하여 20배 배율로 촬영하였습니다. 웰당 16장의 이미지를 획득하여 총 480장의 이미지를 수집하였습니다. 이미지를 분석하려면 우선 pheno ripper 웹사이트에서 pheno ripper를 다운로드하여 설치하십시오.org에서 Pheno Ripper를 실행하십시오. 이미지 분석을 시작하여 이미지와 관련 메타데이터를 반자동으로 로드하려면, 'file structure'를 클릭하여 Pheno Loader에 접속하십시오. 이미지 데이터 세트가 포함된 디렉토리를 선택하고, 필요한 경우 이미지의 파일 확장명을 지정하십시오.분석에 사용되지 않는 파일들을 필터링하십시오. 'define markers'를 클릭하여 실험에 사용된 바이오마커를 지정하고 이를 이미지와 연결하십시오. 구체적으로는 이미지 파일을 클릭한 다음, 바이오마커를 고유하게 식별할 수 있는 파일 경로의 일부를 선택하십시오.마지막으로, 각 바이오마커의 이름을 입력합니다. 다음 단계는 메타데이터 정의(define metadata)를 클릭하는 것입니다. 각 이미지에 정보를 연결하려면, 이미지 파일을 클릭한 다음 파일 경로에서 이미지 정보를 식별하는 부분을 선택하십시오.그룹 이름을 입력하는 창이 나타납니다. 이름을 입력하십시오. 파일 이름에서 추출된 그룹 구성원들이 그룹 테이블에 표시됩니다.이 정보는 분석 결과의 시각화 과정에서 사용할 수 있습니다. 파일 이름에 없는 추가 정보를 입력하려면 '추가 정보 추가' 버튼을 클릭한 후 '메타데이터 그룹 추가'를 선택하고 추가할 그룹 이름을 입력하십시오. 이어서 미리 정의된 그룹의 각 값을 입력하며, 추가할 수 있는 그룹의 수에는 제한이 없습니다.마지막으로, create metadata file을 클릭하여 PhenoRipper에서 읽을 수 있는 데이터 주석(annotation) 파일을 생성하고, 중복 샘플링을 방지하기 위해 실험 내 반복구(replicate)를 정의하는 메타데이터 필드를 선택합니다. 반복구가 포함된 데이터 세트의 경우, 이들을 함께 그룹화하면 성능을 향상시킬 수 있습니다. 다음으로, set parameters를 클릭하여 데이터 세트 처리에 필요한 파라미터를 설정합니다.정의할 파라미터는 왼쪽 패널에 있습니다. 오른쪽 패널에는 데이터 세트의 샘플이 표시됩니다.왼쪽 또는 오른쪽 화살표를 클릭하여 다른 이미지로 전환하십시오. 이미지에서 세포 부분을 대략적으로 식별하기 위해 적절한 임계값(threshold)을 선택하십시오. 임계값은 pheno ripper에 의해 사전 계산되지만, 이미지 상단에 있는 스크롤 바를 사용하여 세포 영역의 강조 표시를 개선하기 위해 조정할 수 있습니다.선택한 임계값이 모든 이미지에 적용되지 않는 경우, 세포 영역을 제외하기보다 비세포 영역이 포함되도록 임계값을 낮추십시오. 다음으로, 이미지를 블록 그리드로 세분화하기 위해 픽셀 단위로 측정된 적절한 블록 크기를 선택하십시오. 그리드를 이미지 위에 중첩시켰을 때 세포당 평균 20~30개의 블록이 되도록 블록 크기를 조정하십시오.블록 크기 필드 앞의 체크박스를 클릭하십시오. 자동 스케일링된 이미지에서 원하는 상대적 강도의 마커가 표시되지 않거나 분석에서 특정 마커를 제외해야 하는 경우, 채널 강도 조정 옵션을 사용하여 일부 마커의 세포 영역을 식별하십시오. 임계값 옵션 기본값에 사용되는 채널을 선택하십시오.다른 파라미터들의 선택 값은 보통 적절하지만, 필요한 경우 이를 조정하십시오. 고급 분석 옵션을 사용하여 메인 애플리케이션 패널에서 pheno rip을 눌러 분석을 실행합니다. Pheno ripper는 이미지 내의 반복되는 블록 유형을 자동으로 식별합니다.각 이미지 내의 서로 다른 블록 유형의 비율을 기반으로 표현형 프로파일이 생성됩니다. pheno 브라우저를 사용하여 이미지의 표현형 프로파일 간의 관계를 탐색하십시오. pheno 브라우저 인터페이스는 4개의 패널로 구성되어 있습니다.왼쪽 상단 패널은 서로 다른 이미지와 실험 조건 간의 상대적 유사성을 그래프로 나타낸 것입니다. 오른쪽의 두 패널은 선택된 조건의 샘플 이미지를 보여줍니다. 마지막 패널은 선택된 조건들의 표현형 프로필을 비교합니다.먼저 데이터 처리 메뉴에서 그룹화 설정을 꺼서 개별 이미지를 확인하십시오. 그다음 산점도의 이상치 지점들을 클릭하여 품질이 낮은 이미지를 제거하십시오. 비교의 기본 단위를 정의하는 메타데이터 필드를 결정하십시오.예를 들어, 약물을 비교하려면 metadata 필드 drug의 값이 동일한 이미지들을 함께 그룹화하십시오. 이제 각 점은 단일 약물을 나타냅니다. 데이터 표시 메뉴를 사용하여 가능한 metadata를 기반으로 점의 색상을 변경하거나 레이블을 지정하여 해석력을 높이십시오. 점들 사이의 거리는 해당 실험 조건들의 상대적인 표현형 유사성을 반영합니다.점이 서로 가까울수록 유사성이 높음을 나타냅니다. 회전 가능 체크박스를 선택하면 3차원 그래프를 회전시킬 수 있습니다. 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태에서 그래프 위로 마우스를 드래그하십시오.두 개의 서로 다른 지점을 선택하여 직접 비교하십시오. 이미지 패널에는 각 지점의 샘플 이미지가 표시되며, 막대 그래프 패널에는 두 지점을 가장 잘 구분하는 블록 유형이 나타납니다. 클러스터그램 메뉴에서 클러스터그램을 실행하면 블록 유형과 실험 조건이 모두 그룹화되어, 블록 유형과 실험 조건 간의 관계를 보다 포괄적으로 확인할 수 있습니다.이 표현은 각 조건 그룹을 가장 잘 구분하는 세포 표현형을 강조합니다. Pheno ripper를 사용하여 DNA, 액틴 및 알파 튜불린을 형광 염색한 HeLa 세포를 분석하였으며, 히스톤 탈아세틸화 효소, 미세소관 표적 억제제 및 DNA 손상 약물을 처리한 후 이미징하였습니다. 이 이미지들의 전경 임계값은 5%, 블록 크기는 20 픽셀로 설정하였으며, 표준 데스크톱 컴퓨터에서 이 데이터 세트를 분석하는 데 약 10분이 소요되었습니다.결과를 탐색하기 위해 pheno 브라우저 인터페이스를 사용하였습니다. 이미지 간의 상대적 표현형 유사성은 다차원 척도법(multidimensional scaling)을 사용하여 시각화하였습니다. 각 점은 단일 이미지를 나타내며, 해당 약물의 작용 기전에 따라 색상을 구분하였습니다.이 그래프는 표현형 프로파일을 통해 작용 기전에 따라 약물을 그룹화할 수 있음을 보여줍니다. 기공 염색이나 빈 프레임과 같은 이미징 아티팩트는 명확한 이상치로 나타나므로 쉽게 식별할 수 있었습니다. 데이터의 클러스터그램은 이러한 그룹화를 여기의 표현형 프로파일과 연관시킵니다.각 행은 단일 약물을 나타내며, 각 열은 블록 유형을 나타냅니다. 회색조 값은 표현형 프로파일을 반영합니다. 더 밝은 값은 해당 블록 유형의 분율이 더 높음을 나타내며, 계층적 군집 분석을 통해 약물 클래스별로 서로 다른 약물들이 대부분 분리됩니다.이 기술을 숙달하고 적절하게 수행한다면 10분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 마친 후에는 IRA 프로파일링과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이는 서로 다른 유전자가 유사한 경로에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 단일 세포의 세 차원 공 촛점 형광에서 가져 정의되지 않은 형태의 형태학의 변화를 측정하기 Imaris 신경 과학, ImarisXT 및 MATLAB을 사용하는 소프트웨어 플랫폼을 개발했습니다. 이 새로운 접근 방식은 수용체 활성화에 따라 세포 모양의 변화를 수량화하는 데 사용되므로 약물 발견을위한 가능한 추가 도구를 나타냅니다 할 수 있습니다.

3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

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고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

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형광 표지 된 세포의 다중 이미지 기반 분석을 가능하게하는 유연한 정보학 워크 플로우입니다 발표. 워크 플로는 핵 및 세포질 마커를 정량화하고 이러한 구획 사이에 마커 전위를 계산한다. 절차 96- 웰 포맷으로 간접 면역 형광에 의해 마커 검출 용 siRNA를 안정적인 방법을 사용하여 세포의 섭동 제공된다.

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소포 수송 이벤트의 정확한 정량화는 종종 특정 단백질의 역할과 돌연변이의 영향에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 본 논문은 정량적 형광 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 세포내 이벤트를 정량화하기 위한 도구로 pH에 민감한 GFP 변이체인 초황도 pHluorin을 사용하는 방법을 제시합니다.

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

우리는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 기초 판독하여 단백질 상호 작용을 분석 자동화 형광 수명 이미징 (FLIM)을 이용하는 오픈 소스 고 함량 분석 (HCA) 기기를 제시한다. 이 openFLIM-HCA 기기에 대한 데이터 수집은 소프트웨어 μManager 작성 및 데이터 분석 FLIMfit에 착수에 의해 제어된다.

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

여기 우리는 widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템 (WHCAS)를 사용 하 여 슬라이드에 붙일 레이블된 조직의 자동화 된 세그먼트에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 생물 과학, 의료 공학, 건강 과학 등 생물 조직에서 형광 표식의 정량과 관련 된 모든 분야에서 광범위 한 응용 프로그램 있다.

자동된 슬라이드 스캔 및 Widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템을 사용 하 여 붙일 표시 된 조직에서 시장 세분화

스펙트럼 이미징은 단일 샘플에서 여러 형광 신호를 식별하고 분리하는 신뢰할 수 있는 솔루션이 되었으며 관심 있는 신호를 배경 또는 자동 형광과 쉽게 구분할 수 있습니다. 여기 스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징은 필요한 이미지 수집 시간을 줄이면서 동시에 신호 대 잡음 비를 증가시킴으로써 이 기술을 향상시킵니다.

형광 신호를 효율적으로 구별하기 위한 여기-스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징 현미경 검사법

우리는 형광 현미경 이미지의 특정 세포 구획에서 세포 체의 신속한 탐사와 정확한 분석을 위해 구축 된 자유롭게 사용할 수있는 워크플로우를 제시합니다. 이 사용자 친화적인 워크플로우는 오픈 소스 소프트웨어 Icy에서 설계되었으며 ImageJ 기능을 사용합니다. 파이프라인은 이미지 분석에 대한 지식없이 저렴합니다.

하위 구조 분석기: 형광 현미경 이미지에서 세포 체의 신속한 탐색 및 정확한 분석을 위한 사용자 친화적인 워크플로우

여기서, 3차원 공간에 분포된 모든 개별 라이브 셀로부터 광적으로 추출 및 분류하는 프로토콜(즉, 세포 자동 형광)을 제시한다. 이 방법은 박테리아, 곰팡이, 효모, 식물 및 동물의 세포를 포함하여 단일 세포 해상도에서 다양한 생물학적 시스템의 타고난 형광 서명을 연구하는 데 적합합니다.

공초점 현미경 검사법에 의한 단세포 인천성형광서명의 재구성

접근 가능한 오픈 소스 미세유체(microfluidic) 워크플로우는 박테리아의 플라스미드 보유에 대한 병렬 분석을 위해 제공됩니다. 형광 현미경 검사를 사용하여 겔 미세방울 내 단일 세포 미세군체의 플라스미드 존재를 정량화함으로써 이 방법은 기존 플레이트 카운팅에 대한 정확하고 접근 가능하며 확장 가능한 대안을 제공합니다.

Open-Source Droplet Microfluidics를 이용한 플라스미드 안정성 분석

배우세요 형광 현미경 이미지의 신속한 분석 및 탐사 방법을 PhenoRipper 플랫폼을 사용하여. 이 워크플로우는 고속 스크리닝 데이터에서 표현형 프로파일을 효율적으로 식별하여 연구자들이 복잡한 세포 표현형을 빠르게 비교할 수 있게 합니다.

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

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