활성화 및 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 IL-1β를 사용하여 NLRP3 inflammasome을 활동의 측정

다음 실험의 전체적인 목적은 간단한 IL-1β 측정 분석법을 사용하여 인비트로(in vitro) 인간 수지상 세포에서의 인플라마좀 활성을 관찰하는 것입니다. 먼저 세포에 R 8 48을 첨가하여 세포 내 pro-IL-1β 발현을 유도합니다. 그다음 nigericin을 첨가하여 NLRP3 인플라마좀 형성을 활성화합니다.

이는 결과적으로 분비 전 pro IL-1β가 성숙한 IL-1β로 절단되는 것을 유발합니다. 다음으로, 샘플을 수집하고 면역형광법, 웨스턴 블롯 및 ELISA를 통해 프라이밍 및 활성화된 세포로부터의 IL-1β 분비량을 측정하여 세포 내 pro IL-1β와 세포 외 성숙 IL-1β 결과를 측정합니다. 검출 결과, 인간 DC를 프라이밍하면 R 8 48로 프라이밍된 세포에서 세포 내 pro IL-1β 생성이 유도되며, nigericin으로 프라이밍 및 활성화된 세포 모두에서 IL-1β 분비가 일어남을 보여줍니다.

이 방법은 합성 리간드에 대한 인간 수지상 세포 반응에서 NLRP3 인플라마좀의 역할에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 박테리아, 바이러스 및 자가염증성 질환과 같은 생리학적 트리거를 테스트하도록 설계된 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 휴지 상태의 신선하게 분리된 단핵구 유래 수지상 세포 200 µL를 96-웰 라운드 바텀 플레이트에 분주합니다.

자극하지 않은 음성 대조군, 프라이밍 단독, 활성화 단독, 그리고 프라이밍 후 활성화라는 네 가지 표준 조건으로 시작합니다. 그런 다음 실험 설계에 따라 R 8 48 및 nissin에 대한 희석액 대조군을 포함하고, 후속 세포 내 사이토카인 염색 분석을 위해 인플라마좀을 프라이밍하는 동형 대조군을 중복으로 포함합니다. 적절한 웰에 R 8 48을 최종 농도 10 µM이 되도록 첨가합니다.

세포를 37°C, 5%CO2 조건의 배양기에 넣고 18시간 동안 배양합니다. 그 후, NLRP3 인플라마솜을 활성화하기 위해 nige를 최종 농도 20 µM로 첨가합니다. 배양물을 다시 배양기에 넣고 6시간 더 배양한 후 샘플을 수확합니다. 세포 펠릿이 손상되지 않도록 배양 플레이트를 974 ×g에서 3분간 원심분리합니다.

EISA를 통해 사이토카인 분비량을 측정하기 위해 각 상층액을 별도의 라운드 바텀 플레이트로 옮깁니다. 이제 다양한 기법을 통한 추가 분석을 위해 세포 펠렛을 200 µL의 1x PBS로 3회 세척하여 세포 샘플로부터 세포 외 IL-1β를 제거합니다. pro-IL-1β의 웨스턴 블롯 검출을 위해 세포를 10 µL의 변성 용해 버퍼(denaturing lysis buffer)에서 직접 용해합니다. 용해물을 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮긴 후, IL-1β의 유세포 분석 형광 검출을 위해 샘플을 100 °C에서 10분 동안 가열합니다.

세포 시료에 5% PHS 배지 100 µL와 표현형 마커 또는 이소타입 대조군에 대한 형광 표지 항체 1 µL를 추가하고, 실온의 암실에서 10분 동안 배양합니다. PBS로 3회 세척한 후, 4% PFA 100 µL를 사용하여 실온의 암실에서 20분 동안 세포를 고정합니다. 그다음, 투과성 버퍼 100 µL를 추가하여 30분 동안 처리하고, 이어서 62 ng의 anti IL-1β FSE 항체 또는 이소타입 대조군을 추가하여 37 °C에서 2시간 동안 시료를 배양합니다.

세포를 200 µL의 투과성 완충액으로 3회 세척하고 1 XPBS에 재부유합니다. 샘플을 호일로 감싸 4 °C에서 보관하십시오. 현미경으로 IL-1β를 검출하는 경우, 세포를 DAPI로 염색하고 마운팅 용액을 추가한 뒤 슬라이드 글라스 위에 커버 슬립을 조심스럽게 덮으십시오.

유세포 분석을 통한 형광 검출용 현미경 이미지를 캡처하기 전, 하룻밤 동안 경화시키십시오. 샘플을 하나씩 순차적으로 획득합니다. 살아있는 세포에 대해 전방 산란광(forward scatter) 및 측방 산란광(side scatter) 게이트를 설정하십시오. 다음으로 CD 11 C 양성 및 CD 14 음성 세포에 게이트를 설정하십시오.

마지막으로 현미경 데이터 획득 시 pro IL-1β 염색을 기반으로 MODC 집단을 분석합니다. 양성 염색을 보인 R 8 48 처리 시료를 사용하여 노출 시간을 설정하십시오. 그런 다음 western blot 검출을 위해 pro IL-1β를 발현하는 MODC의 비율을 결정하십시오.

전체 시료 부피를 폴리아크릴아마이드 젤에 로딩하십시오. 염료 전선이 젤 끝까지 내려올 때까지 140V에서 전기영동을 수행하십시오. 폴리아크릴아마이드 젤의 단백질을 PVDF 면막으로 전이시키십시오.

TBST 내 5% BSA로 막을 1시간 동안 블로킹합니다. 1차 항체와 함께 4°C에서 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다. TBST로 5분씩 세 번 세척한 후, 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다시 TBST로 세 번 세척한 후 막을 이미지화합니다. ELISA로 분비된 사이토카인을 측정할 때는 샘플을 실온에서 평형화합니다.

상층액 응축물을 모으기 위해 샘플을 원심 분리하고, 제조사의 지침에 따라 IL-1β 측정 단계를 수행합니다. 세포 내 사이토카인 염색을 통해 pro-IL-1β를 분석하면, CD11c 양성 및 CD14 음성인 단핵구 유래 수지상 세포로부터 현미경 관찰 및 FACS 판독이 가능합니다. 두 기술 모두 비자극 또는 휴지기 세포 대조군 및 이소형 대조군(isotype control) 대비 정량화할 수 있습니다. pro-IL-1β 염색 세포의 비율에 해당 세포군의 기하 평균값을 곱하여 중앙 형광 강도(median fluorescent intensity)를 산출합니다.

MFI는 양성 염색 세포에 존재하는 pro IL-1β의 양과 비례합니다. 여기에서는 세포 용해물로부터 pro IL-1β를 측정하기 위해 면역 블로팅 기술이 사용되었습니다. 정량적 데이터는 예상대로 beta-tubulin과 같은 내부 세포 대조군에 상대적인 값으로 표시됩니다.

NI Nigerian 처리 세포에서 pro IL-1β에 대한 면역 블로팅을 수행한 결과, pro IL-1β의 감소가 확인되었습니다. 이는 E ELI a(먼저 R 8 48, 이어서 NI Nigerian 조건)로 측정한 상층액 내 IL-1β의 동시 증가에 의해 뒷받침됩니다. TNF-α, IL-10 및 IL-6와 같은 다른 염증성 사이토카인을 동시에 측정하여 Niger가 IL-1β의 분비를 특이적으로 유도함을 확인하였습니다.

프라이밍의 수준은 시간과 용량에 의존적입니다. 세포 외 단백질 농도 측정, 성숙한 IL-1β 생성의 화학발광 검출, 또는 인플라마좀 차단과 같은 추가 실험을 통해 세포 외 IL-1β가 성숙한 절단 형태인지, 그리고 IL-1β 분비가 NLRP3 인플라마좀 활성에 의존적인지 결정하는 데 도움이 될 것입니다.