Name: 활성화 및 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 IL-1β를 사용하여 NLRP3 inflammasome을 활동의 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 배우세요 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 NLRP3 인플라마좀 활성을 측정하는 방법을 IL-1β 분석을 통해. R848과 니게리신을 사용하여 면역 반응 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 자신의 지원과 피드백을 올리비에 Manches, 박사, Davor Frleta 박사와 메건 오브라이언, MD를 인정하고 싶습니다. 이 연구는 알레르기 및 전염병 국립 연구소에 의해 지원 및 NIH는 건강 관련 연구 (AI089030)와 RO1 (AI081848의 다양성을 촉진하기 위해 개별 Predoctoral 동호회 (F31)에 루스 L. 키르 국립 연구 봉사상을 부여 자금으로 완료되었습니다 ).

윤리 정책 : 연구 샘플을 얻어 기증자의 동의와 연구에 저장됩니다. 모든 샘플 코드 또는 사용하기 전에 익명으로 처리해야한다. 이 프로토콜은 우리의 임상 시험 심사위원회의 가이드 라인을 따른다. 1. 단핵구 유래 수지상 세포에 인간의 말초 혈액 단핵구의 분화. 참고 : 인간 버피 코트는 인간의 말초 혈액 세포 (PBMC를)의 소스 역할을하고 뉴욕 혈액 센터 (뉴욕, NY)에서 얻을 수 있었다. 혈액 기증자는 건강한 지원자입니다. 오일 절차는 조직 배양에 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)의 도금을 시작은 35,36을 플라스. 게시 된 프로토콜에서 주목할만한 차이점은 다음과 같습니다 : <ol><li> 10cm 폴리스티렌 조직 배양 플레이트보기 플라스크 당 2 × 13의 PBMC를 다운로드 고착 대신하는 필터 캡 225cm이 비 발열 폴리스티렌 조직 배양 플라스크를 사용S (58cm 2) (1 단계). </li><li> 5 % 풀링 된 인간 혈청 (PHS, 30 ㎖)으로 미디어를 준비 500 ML RPMI-1640 + L-글루타민, 5 ㎖ 1 M HEPES 버퍼, 1.4 ㎖의 50 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신 (5 % PHS 미디어) 여과 한 다음를 통해 20 μm의 필터. 50 ㎖ 5 % PHS 미디어 225cm 당 조직 배양 플라스크의 총을 추가합니다. </li><li> 25 ML 신선한 RPMI-1640 접착 세포를 세 번 씻으십시오. 각 세척시 5 초 동안 격렬하게 흔들어 및 비 부착 세포 (4 단계)를 대기음. </li><li> 하루 한 PBMC는 처음 단계에서 도금 될 때 100 IU / μL 0 일, 2 플라스크 (3 단계) 당 GM-CSF, 4. 0 일 400 IU / μL IL-4, 380 μL의 190 μl를 추가 정의된다 1 (단계 8). </li><li> 1 × 10 6 세포 / ml (15 단계)의 농도가 수확 일 5 moDCs. </li><li> 자신의 휴식 상태로 즉시 moDCs를 사용합니다. 17 ~ 22 단계가 수행되지 않습니다. 참고 : 샘플이 최상의 결과를 최대한 빨리 수집 후 처리해야합니다. </li><li> 농도에서 나누어지는 moDCs2 × 5 세포의 기 /도 96 웰 둥근 바닥 플레이트 (웨스턴 블롯, ELISA, FACS) 또는 폴리-L-라이신 처리 chamberslide (현미경) 상 실험을위한의 (1 × 10 6 세포 / ml의 200 μL / 웰) . 참고 : 완전히 비자극 (음성 대조군) 활성화 뒤에 만 만 활성화 및 프라이밍 프라이밍, 적어도 4 조건이 있습니다. 조건이 필요한 경우 희석제 R848에 대한 컨트롤과 nigericin을 포함하도록 확장 할 수 있습니다. 다운 스트림 분석이 ICS 인 경우, 중복 이소 컨트롤에 대한 필요합니다. </li></ol> . 2 inflammasome을 준비하기 - 신호 1 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 DMSO에 동결 건조 R848을 재구성. RPMI-1640 RT에서 근무 주식을 희석. </li><li> 18 시간 동안 우물을 충당하기 위해 10 μM 최종 농도 R84​​8를 추가합니다. 장소 37 ° C에서 인큐베이터에있는 세포와 5 % CO 2. </li></ol> 3 NLRP3 inflammasome을 활성화 -. 신호2 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 에탄올에 동결 건조 nigericin을 재구성. 해당 조건에 추가하기 전에 RPMI-1640 RT에서 근무 주식을 희석. </li><li> 20 μm의 최종 농도 nigericin 추가하고 37 ° C에서 인큐베이터에 반환하고 5 % CO 2 ~ 6 시간 동안. 더 세척 단계는 프라이밍 사이에 활성화 중에 발생하지 않습니다. 주 : IL-1β의 분비 A, 모 넨신, 디 니트로 페놀 또는 카르 보닐 시안화 chlorophenylhydrazone 37, 38 brefeldin 칼슘 ionophores의 존재에 의해 증가된다. 이 IL-1β의 분비를 변경 때문에 inflammasome을 프라이밍 또는 활동을 분석 할 때 그러므로, 이러한 분비 억제제의 첨가는 권장하지 않습니다. </li></ol> 4. IL-1SS 샘플 컬렉션 <ol><li> 3 분 974 XG에 세포 상층 액 접시를 원심 분리기. </li><li> 세포 펠렛을 방해하지 않고, 뜨는을 대기음 등으로 전송eparate 라운드 상층 액에서 사이토 카인의 분비를 측정하기 위해 판을 바닥. 참고 : 상층 액이 일시적으로 -20 ° C에 저장하거나 할 수 있습니다 -80 장기 기억 ° C. </li><li> 세포 샘플에서 모든 세포 IL-1β를 제거하기 위해 3 분 974 XG에 1X PBS 200 μL와 세포 펠렛을 세 번 씻으십시오. 참고 : 96 웰 플레이트에서 세포 펠렛을 세척 할 때 샘플을 방해하지 않도록, 수거함에 신속 판 반전하여 세척을 제거합니다. </li></ol> 5. 세포 및 뜨는 샘플에서 IL-1SS 측정 <ol><li> 세포 내 사이토 카인 염색법 (ICS)는 : ICS 프로토콜은 39, 40에 대하여 설명한다. 참고 : 다운 스트림 분석은 현미경 경우 세포를 중단하지 않습니다. 모든 세척 및 포부 (다운 스트림 분석에 따라) 세포 층 / 펠렛을 방해하지 않고 수행해야합니다. <ol><li> 적절한 우물에 5 % PHS 매체 100 μl를 추가합니다. 추가적절한 볼륨 (약 1 μl/2x10 5 셀 또는 1 μL / 웰)의 찬란 α-의 CD11c 및 α-CD14 표지 (표현형 마커, 클론 B-ly6 및 MφP9, 각각) 또는 이소 제어에서 10 분 동안 세포에 어둠 속에서 RT. </li><li> 3 분 974 XG에 1X PBS로 3 회 세척한다. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 4 % PFA 100 μl를 추가하여 세포를 고정합니다. </li><li> 포인트를 일시 정지 : 1X PBS에 4 ° CO / N에서 3 분 및 저장을위한 974 XG에 100 μL 1X PBS로 세척. </li><li> 30 분 동안 세포 permeabilization 버퍼 100 μl를 추가합니다. 참고 : permeabilization 버퍼는 0.3 % 트리톤 X-100로 1X PBS로 구성하고, 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) permeabilization이다. 다운 스트림 분석은 현미경 때 자기편 세포를 방해하지 않습니다. </li><li> 적절한 α-IL-1β-FITC의 양 (약 62 NG의 antibody/2x10 5 셀, 약 또는 2.5 μL / 잘) (클론 8516) 나에 대한 아이소 타입 컨트롤을 추가37 ° C에서 인큐베이터에서 2 시간 </li><li> 어둠 속에서 3 분 동안 974 XG에서 permeabilization 버퍼 200 μL와 세포를 세 번 씻으십시오. </li><li> 선택 사항 : DAPI와 얼룩은의 mountant를 추가하고, 유리 슬라이드 위에 부드럽게 커버 슬립을 배치합니다. 현미경 이미지를 캡처하기 전에 O / N을 치료의 mountant을 허용합니다. </li><li> FACS 또는 현미경으로 데이터를 획득. 참고 : FACS이나 현미경으로 분석 적절한 염색 각 조건에 대한 아이소 타입을 비교한다. <ol><li> FACS : 한 번에 하나의 샘플을 취득. MODC 인구 프로 IL-1β 염색을 분석하기 전에 세포 -의 CD11c + CD14에 게이팅 다음에 살아있는 세포에 FSC / SSC 게이트를 설정합니다. </li><li> 현미경 : 긍정적 인 염색 샘플을 사용하여 노출 시간을 설정 - R848 치료. 프로 IL-1β 표현 moDCs을 +의 비율을 결정하는 - DAPI + 프로 IL-1β의 +와 DAPI + 프로 IL-1β를 사용합니다. </li></ol></li></ol></li><li> SDS-페이지 : 면역 블롯이 프로 IL-1β를 감지하기 위해 수행된다. 참고 : 아래에서 설명하는 기술은 표준 면역 블롯 기술, 그라데이션 4-20% 폴리 아크릴 아마이드 젤, 형광 또는 화학 발광 검출 (41, 42)을 결합한다. <ol><li> 직접 용해 완충액 (5 ㎕의 세포 용해 완충액으로 1:1로 희석 하였다 β-mercaptoethanol/950 μL 램리 시료 완충액)을 변성 10 μL를 Lyse있는 세포. 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 해물을 전송합니다. </li><li> 100 ℃에서 10 분 동안 건조 접시에 열 해물 </li><li> 액체 볼륨을 집중하는 1 분 minicentrifuge에 20,800 XG에서 해물 스핀. 지점을 일시 정지 : 샘플은 단기 저장을 위해 -20 ° C에서 얼 수있다. </li><li> 폴리 아크릴 아마이드 젤에 전체 볼륨을로드합니다. 염료 전면 겔의 바닥을 실행까지 약 1 시간, 또는위한 젤 상자를 통해 140 V를 실행합니다. </li><li> PVDF Immobilon-FL의 membr에 폴리 아크릴 아마이드 겔에서 단백질을 전송100 V. 블록 트리스 버퍼 식염수에 5 % BSA와 멤브레인 / 0.1 % 트윈 20 (TBS-T) 1 시간 동안 90 분 동안 고대 근동. 참고 : PVDF Immobilon-FL은 형광 검출에 사용하기에 가장 적합합니다. 다른 검출 기술이 배경 잡음비를 증가시키기 위해 서로 다른 조성을 갖는 막을 추천. </li><li> 5 % BSA / TBS-T의 10 ㎖에 기본 및 보조 항체를 희석. 흔들어 섞으면 서 1 시간 동안 실온에서 이차 항체를 흔들어 동안 4 ° CO / N에서 기본 항체 배양을 수행합니다. </li><li> 기본 및 보조 항체 배양하고 다시 차 배양과 영상 사이에 떨고있는 동안 5 분 TBS-T로 막 3 회 반복한다. 주 : 대역 형광 또는 화학 발광 검출을 사용하여 검출 될 수있다. 검출을위한 제조 업체의 지침을 따르십시오. </li></ol></li><li> ELISA는 : 저장을 위해 냉동 샘플을 분석하기 전에 실온으로 평형을 유지해야합니다. 뜨는 condens을 통합 원심 분리기 샘플을 스핀 다운ATION. IL-1β의 측정을 위해 제조 업체의 지침을 따르십시오. 참고 :이 프로토콜에서 IL-1β는 특히 측정; 그러나, TNFα, IL-6, 및 면역 조절 사이토 카인 IL-10의 동시 측정은 적절한 조건은 프라이머 확인 하였다. </li></ol>

저자는 공개 할 관심의 충돌이 없습니다.

염증성 사이토 카인은 바이러스 감염을 싸울 타고난 및 적응 면역 반응을 스티어링에 통합되어 있습니다. 분비되는 IL-1β는 인플루엔자 감염 3, 43, 44시 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 사이토 카인이 인간의 수지상 세포에 바이러스 성 인식에 대한 응답으로 처리됩니다되는 정확한 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 골수성 DC 아이솔레이션 키트는 비용과 시간이 걸린다. 격리 키트 및 FAC 정렬 실수 수도 스트레스 또는 세포를 활성화. 또한, 실험에 대한 격리 된 세포의 부족 금액이 자주있다. 다행히, 인간 moDCs의 생물학 밀접 모델 체외 45, 46 차 인간의 골수 수지상. 두 종류의 세포가 성숙 IL-1β 분비를 달성하기 위해, 두 개의 신호, TLR은 프라이밍과 NLRP3의 활성화가 필요합니다. 따라서 moDCs가 제공하고 저렴하고 간단한 DC 모델의 세포 유형 연구하고 내기터가 인간의 건강과 질병의 NLRP3의 inflammasome을의 관...

타고난 면역 시스템의 활성화는 감염, 질병, 예방 접종 7시 적응 면역 반응을 조종하는 데 필요합니다. 수지상 세포는 선천성 면역 체계의 세포를 제시하는 가장 강력한 항원이다; 그들은 항원의 흡수, 림프절 마이그레이션, 순진 CD4 +와 CD8 + T 세포 용해 세포 8-10의 활성화를 위해 전문화되어 있습니다. 빠른 병원체 검출을 사용하려면 타고난 면역 시스템은 보존 병원체 파생 모티브 또는 세포 스트레스와 손상의 호스트 파생 마커를 인식하는 수많은 생식 인코딩 패턴 인식 수용체 (PRR)를 사용합니다. 수용체 (TLR에) 같은 전화는 특정 세포 phagocytized 병원균 관련 분자 패턴 (PAMPS) 및 위험 관련 분자 패턴 (감쇠)를 인식 막 결합 패턴 인식 수용체이다. 수용체 (NLRs) 같은 대비 고개를 끄덕으로 세포질하고 PAMPS 및 감쇠의 다양한 범위에 응답합니다. 수용체가 다시 같이 고개를 끄덕세포 표면 및 세포 내 이입 PRRS을 회피 병원균에 대한 방어의 두 번째 라인을 제시한다. 파생 병원균, 또는 &quot;위험&quot;의 상호 작용, 관련 TLR과 NLR 리간드 요소는 다른 면역 세포와 T 세포와 자연 살해 세포 활성화 (11)의 승진 증가 DC의 상호 작용의 결과로 DC의 성숙의 상태에 이르게한다. 인터루킨-1β는 감염에 대한 숙주 방어의 중요한 구성 요소입니다. 미생물의 인식 시점이 높은 염증성 사이토 카인 IL-1β가 분비되고 화학 유인과 타고난 및 적응 면역 세포의 활성화 등의 기능은. 생체 내 IL-1β는 발열과 염증성 사이토 카인 등의 급성기 응답을 크게 책임이있다 합성 12. 대부분의 NLRs 리간드 감지, 물질 œ 인 중앙 염기 결합 도메인 (NACHT)에서 작동하는 것으로 생각되는 C 터미널 류신이 풍부한 반복 도메인을 포함NLRP3의 올리고머, 단백질 단백질 상호 작용을 통해 다운 스트림 대상에 신호 전달을 매개 N 터미널 이펙터 도메인 (NLRP3의 PYD)에 대한 rtant. NLRP3 단백질은 가장 강렬하게 공부 inflammasome을 단지를 정의합니다. 이 단백질은 NLR 가족의 일원이고 NLRP3 (또한 ASC라고도 함) 어댑터 단백질 PYCARD 및 ICE 이루어지는 멀티 분자량 단백질 복합체를 형성하는 기능을 갖는다. inflammasome을 활성화시 PYCARD은 NLRP3 N 단말기 도메인에 바인딩하고 카스파 제 활성화 및 채용 도메인 (CARD) 도메인을 통해 ICE를 모집합니다. 인터루킨-1 전환 효소는 처음의 N-말단에 카드 모티브를 포함하는 효소 원으로 생성됩니다. 두 ICE의 분자를 데려 inflammasome을 형성 결과는 충분히 닫고 촉매 활성화를 유도한다. inflammasome을 단지는 사이토 카인 성숙 세포질 프로 IL-1β를 변환 할 수 있도록하여 ICE 활성화가 필요합니다. IL 성공적으로 분비-1β의 DC에있는 두 개의 서로 다른 독립적 인 위험 신호를 감지해야합니다. 첫째, PAMPS, 감쇠, 또는 사이토 카인 신호 (TNFα 나 IL-1β)의 TLR 감지 세포질 프로 IL-1β 단백질 발현의 상향 조절됩니다. 두 번째, 종종 다른 신호는 ICE의 성숙의 상류 inflammasome을 복합체 형성이 필요합니다. 신호를 자극하는 몇 inflammasome을 세균 막 기공 (예 nigericin)를 형성하는 독소 (예 : 글루타민산 소다 요 산염 결정, MSU 등) 리소좀 중단 결정하고, 세포 외 ATP (가) 있습니다. 이러한 다양한 활성제에 의해 inflammasome을 활성화 NLRP3로 이어지는 상류 메커니즘은 명확하지 않다. inflammasome을 형성 시그널링 상류 조사 연구는 저칼륨 유도 또는 반응성 산소 종 (ROS)와 같은 세포 내 사건 간접적 inflammasome을 13-28을 활성화하는 것이 제안되어있다. NLRP3의 inflammasome을 서로 다른 바이러스 성 활성제의 사이에 B를 제공 인플루엔자이며,IL-1β 분비 3, 29-33에 필요한 기본 및 보조 신호 OTH. 마우스 NLRP3 녹아웃 모델을 사용하여이 DC에있는 IL-1β의 분비가 32 NLRP3 의존하는 것으로 나타났습니다. 또한, NLRP3 녹아웃 마우스는 감염의 사이트에 적은 백혈구을 받고 높은 사망률 2, 5를 경험했다. 최근 두 논문은 인플루엔자 바이러스 감염시 NLRP3의 inflammasome을 활성화하기위한 메커니즘을 제안; 첫 번째, 두 번째 신호 다음에 세포질 프로 IL-1β 발현을 유도하는 TLR7 또는 TLR8 (응답 세포의 TLR의 발현에 따라 다름)에 의해 또는 다른 TLR에 의한 공생 박테리아의 검출을 통해 바이러스 성 RNA, NLRP3의 활성화의 인식을 통해 프라이밍 트랜스 골지 네트워크 (33, 34)에 바이러스 성 이온 채널 단백질 (M2)로 inflammasome을 형성. 후자의 공정에서, NLRP3의 inflammasome을 트리거링은 세포 내 이온의 외란에 의해 달성된다 &lt;EM&gt; inflammasome을 형성하는 신호로서 NLPR3 의해 감지 단순히이다 ROS 생산으로 이어지는 환경. 그러나, 인플루엔자 감염시 ICE 활동의 inflammasome을 활성화 상류의 정확한 메커니즘은 아직 불분명하게 남아있다. 이 작품은 잘으로 inflammasome을 활성화 한 다음 R848과 TLR8 결찰에 대한 응답을 기준으로 DC의 기초가되는 경로 IL-1β 분비의 추가 조사를위한 기초로 사용할 수 있습니다 인간의 moDCs에서 NLRP3의 inflammasome을 공부를위한 가치있는 기술을 설명합니다 NLRP3의 알려진 활성제, nigericin. 이 방법의 변형을 포함하는 다른 세포 유형과 함께 사용하지만, 이에 한정되지 수 : 단핵구, 대 식세포, 다른 DC 서브 세트 및 상피 세포.

<table><tbody><tr><td>IL-4</td><td>R& D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Genzyme</td><td>NDC 58468-0180-2</td> 우리는 L-글루타민 Cellgro 10-040-CV <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>말초 혈액 단핵 세포와<td>RPMI 1640</td></tr> 처방전과 함께 지역 약국을 통해이 항목을 획득 <tr><td></td><td>뉴욕 혈액 센터</td><td></td><td>PBMC는 건강한 기증자의 혈액에서 분리되었습니다</td></tr><tr><td>12 잘 조직 배양 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 라운드 바닥 조직 배양 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-IL-1&beta;-FITC</td><td>R& D</td><td>IC201F</td><td></td></tr><tr><td>FITC 이소 타입 제어</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-213</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-&beta;-Tubulin</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9014</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-IL-1&beta;</td><td>R& D</td><td>mab201</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Immobilon-FL 멤브레인</td><td>Millipore</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>구배 4-12% 폴리아크릴아미드 겔</td><td>Bio Rad</td><td>161-1159</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli 샘플 버퍼</td><td>Bio Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Equitech Bio Inc</td><td></td><td>30% 용액 멸균/여과</td></tr><tr><td>PFA</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td>16% 해결책</td></tr><tr><td>인간 염증성 사이토카인 비드 어레이 키트</td><td>BD</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-nig</td><td></td></tr><tr><td>R848</td><td>3M Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-CD14</td><td>BD</td><td>340436</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>현장 재고실</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-100mL</td><td></td></tr><tr><td><a>Nunc EasYFlask 225 cm2, 필터 캡, 70ml 작업 용량, 30/Cs</a></td><td>Thermo 과학</td><td>159933</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; M 멸균 일회용 필터 유닛</td><td>Thermo Scientific</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Goat &alpha;-mouse IRDye 800CW</td><td>Licor</td><td>926-32210</td><td></td></tr><tr><td>Donkey &alpha;-rabbit IRDye 680RD</td><td>Licor</td><td>926-68073</td><td></td></tr><tr><td>Spectra multicolor broad range protein</td><td>ladder Thermo Scientific</td><td>26634</td><td></td></tr><tr><td>트리스 글리신 SDS 10x</td><td>바이오 라드</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>트리스 글리신 10x</td><td>바이오 라드</td><td>161-0734</td><td></td></tr><tr><td>메탄올 - 4 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>8 챔버 폴리스티렌 용기 조직 배양 처리 유리 슬라이드</td><td>BD Falcon</td><td>354108</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr></tbody></table>

활성화 및 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 il-1β를 사용하여 nlrp3 inflammasome을 활동의 측정

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

인터루킨의 분비 (IL)으로 인해 발생하는 염증성 과정 -1 면역 세포에 의해 가족의 사이토 카인이 로컬 또는 전신 염증, 조직 리모델링 및 수리, 및 바이러스 학적 제어 1, 2로 이어집니다. 인터루킨-1β는 타고난 면역 반응에 필수적인 요소이며 지속적인 감염 1-5의 설립을 방지하면서 병원균 침입 제거에 기여한다. Inflammasomes 1 전환 효소 (ICE 또는 카스파 1) 인터루킨의 활성화를위한 키 신호 플랫폼이다. NLRP3의 inflammasome을은 IL-1β 분비 6을 일으키는 DC가 적어도 두 개의 신호가 필요합니다. 프로 IL-1β 단백질 발현이 세포를 휴식에 제한된다; 따라서 프라이밍 신호는 IL-1β의 전사 및 단백질 발현에 필요합니다. 다중 단백질 NLRP3 inflammasome을 이용​​의 형성 NLRP3 결과에 의해 감지 제 2 신호. IR 업무 수지상 세포의 기능IL-1β 분비에 필요한 신호 D는 박테리아 독소와 NLRP3의 inflammasome을 활성화 한 다음 주요 세포 돌기 세포 (moDCs)을 파생 사람의 단핵구에서 TLR8에 의해 감지되는 합성 퓨린, R848을 사용하여 테스트 할 수 있습니다 칼륨 이온 운반체, nigericin. 단핵구 유래 수지상 쉽게 문화의 생산과 정제 된 인간의 골수의 수지상보다 훨씬 더 많은 세포를 제공한다. 그 대신 파생 마우스, DC가, 따라서 인간의 질병과 감염에 inflammasome을의 연구를 허용 체외 인간에 사용하는 여기에 제시된 방법은 다른 inflammasome을 분석 실험 다릅니다.

이 기술은 R848 프라이머를 TLR8을 측정합니다. 의 CD11c + moDCs - 프로 IL-1β에 대한 세포 내 사이토 카인 염색법은 CD14에서 현미경 및 외과 판독 할 수 있습니다. 두 기술은 프라이머 비, 또는 휴식, 휴대폰 제어뿐만 아니라 이소 제어 (도 1 및 2)에 상대적으로 정량화 될 수있다. 프로 IL-1β + 염색 세포의 비율은 평균 형광 강도 (MFI)를 제공하기 위해이 인구의 기하 평균을 곱합니다. MFI는 긍정적 인 염색 세포에 존재하는 프로 IL-1β의 양을 비교합니다. 다음과 같은 β-튜 블린 또는 β-액틴로 세포 내부 통제, (그림 3)에 대하여 정량화 세포 용 해물로부터 면역 블롯 대책 프로 IL-1β. nigericin 처리 된 세포에서 프로 IL-1β에 대한 면역 블롯은 프로 IL-1β의 감소를 공개해야한다. 이것은에 의...

수지상 세포 (DC가) nigericin와 NLRP3의 inflammasome을 활성화 한 다음 합성 퓨린, R848의 TLR8 인식에 응답하여 IL-1β 분비, 따라서 IL-1β는 NLRP3의 inflammasome을 활동을 측정하는데 사용될 수있다. 세포 내 사이토 카인 염색법, 면역 블롯 및 ELISA 정확하게 IL-1β의 발현을 통해 NLRP3의 프라이밍 inflammasome을 및 활성화를 측정하는 데 사용됩니다.

활성화 및 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 IL-1β를 사용하여 NLRP3 inflammasome을 활동의 측정

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

다음 실험의 전체적인 목적은 간단한 IL-1β 측정 분석법을 사용하여 인비트로(in vitro) 인간 수지상 세포에서의 인플라마좀 활성을 관찰하는 것입니다. 먼저 세포에 R 8 48을 첨가하여 세포 내 pro-IL-1β 발현을 유도합니다. 그다음 nigericin을 첨가하여 NLRP3 인플라마좀 형성을 활성화합니다.이는 결과적으로 분비 전 pro IL-1β가 성숙한 IL-1β로 절단되는 것을 유발합니다. 다음으로, 샘플을 수집하고 면역형광법, 웨스턴 블롯 및 ELISA를 통해 프라이밍 및 활성화된 세포로부터의 IL-1β 분비량을 측정하여 세포 내 pro IL-1β와 세포 외 성숙 IL-1β 결과를 측정합니다. 검출 결과, 인간 DC를 프라이밍하면 R 8 48로 프라이밍된 세포에서 세포 내 pro IL-1β 생성이 유도되며, nigericin으로 프라이밍 및 활성화된 세포 모두에서 IL-1β 분비가 일어남을 보여줍니다.이 방법은 합성 리간드에 대한 인간 수지상 세포 반응에서 NLRP3 인플라마좀의 역할에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 박테리아, 바이러스 및 자가염증성 질환과 같은 생리학적 트리거를 테스트하도록 설계된 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 휴지 상태의 신선하게 분리된 단핵구 유래 수지상 세포 200 µL를 96-웰 라운드 바텀 플레이트에 분주합니다.자극하지 않은 음성 대조군, 프라이밍 단독, 활성화 단독, 그리고 프라이밍 후 활성화라는 네 가지 표준 조건으로 시작합니다. 그런 다음 실험 설계에 따라 R 8 48 및 nissin에 대한 희석액 대조군을 포함하고, 후속 세포 내 사이토카인 염색 분석을 위해 인플라마좀을 프라이밍하는 동형 대조군을 중복으로 포함합니다. 적절한 웰에 R 8 48을 최종 농도 10 µM이 되도록 첨가합니다.세포를 37°C, 5%CO2 조건의 배양기에 넣고 18시간 동안 배양합니다. 그 후, NLRP3 인플라마솜을 활성화하기 위해 nige를 최종 농도 20 µM로 첨가합니다. 배양물을 다시 배양기에 넣고 6시간 더 배양한 후 샘플을 수확합니다. 세포 펠릿이 손상되지 않도록 배양 플레이트를 974 ×g에서 3분간 원심분리합니다.EISA를 통해 사이토카인 분비량을 측정하기 위해 각 상층액을 별도의 라운드 바텀 플레이트로 옮깁니다. 이제 다양한 기법을 통한 추가 분석을 위해 세포 펠렛을 200 µL의 1x PBS로 3회 세척하여 세포 샘플로부터 세포 외 IL-1β를 제거합니다. pro-IL-1β의 웨스턴 블롯 검출을 위해 세포를 10 µL의 변성 용해 버퍼(denaturing lysis buffer)에서 직접 용해합니다. 용해물을 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮긴 후, IL-1β의 유세포 분석 형광 검출을 위해 샘플을 100 °C에서 10분 동안 가열합니다.세포 시료에 5% PHS 배지 100 µL와 표현형 마커 또는 이소타입 대조군에 대한 형광 표지 항체 1 µL를 추가하고, 실온의 암실에서 10분 동안 배양합니다. PBS로 3회 세척한 후, 4% PFA 100 µL를 사용하여 실온의 암실에서 20분 동안 세포를 고정합니다. 그다음, 투과성 버퍼 100 µL를 추가하여 30분 동안 처리하고, 이어서 62 ng의 anti IL-1β FSE 항체 또는 이소타입 대조군을 추가하여 37 °C에서 2시간 동안 시료를 배양합니다.세포를 200 µL의 투과성 완충액으로 3회 세척하고 1 XPBS에 재부유합니다. 샘플을 호일로 감싸 4 °C에서 보관하십시오. 현미경으로 IL-1β를 검출하는 경우, 세포를 DAPI로 염색하고 마운팅 용액을 추가한 뒤 슬라이드 글라스 위에 커버 슬립을 조심스럽게 덮으십시오.유세포 분석을 통한 형광 검출용 현미경 이미지를 캡처하기 전, 하룻밤 동안 경화시키십시오. 샘플을 하나씩 순차적으로 획득합니다. 살아있는 세포에 대해 전방 산란광(forward scatter) 및 측방 산란광(side scatter) 게이트를 설정하십시오. 다음으로 CD 11 C 양성 및 CD 14 음성 세포에 게이트를 설정하십시오.마지막으로 현미경 데이터 획득 시 pro IL-1β 염색을 기반으로 MODC 집단을 분석합니다. 양성 염색을 보인 R 8 48 처리 시료를 사용하여 노출 시간을 설정하십시오. 그런 다음 western blot 검출을 위해 pro IL-1β를 발현하는 MODC의 비율을 결정하십시오.전체 시료 부피를 폴리아크릴아마이드 젤에 로딩하십시오. 염료 전선이 젤 끝까지 내려올 때까지 140V에서 전기영동을 수행하십시오. 폴리아크릴아마이드 젤의 단백질을 PVDF 면막으로 전이시키십시오.TBST 내 5% BSA로 막을 1시간 동안 블로킹합니다. 1차 항체와 함께 4°C에서 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다. TBST로 5분씩 세 번 세척한 후, 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다시 TBST로 세 번 세척한 후 막을 이미지화합니다. ELISA로 분비된 사이토카인을 측정할 때는 샘플을 실온에서 평형화합니다.상층액 응축물을 모으기 위해 샘플을 원심 분리하고, 제조사의 지침에 따라 IL-1β 측정 단계를 수행합니다. 세포 내 사이토카인 염색을 통해 pro-IL-1β를 분석하면, CD11c 양성 및 CD14 음성인 단핵구 유래 수지상 세포로부터 현미경 관찰 및 FACS 판독이 가능합니다. 두 기술 모두 비자극 또는 휴지기 세포 대조군 및 이소형 대조군(isotype control) 대비 정량화할 수 있습니다. pro-IL-1β 염색 세포의 비율에 해당 세포군의 기하 평균값을 곱하여 중앙 형광 강도(median fluorescent intensity)를 산출합니다.MFI는 양성 염색 세포에 존재하는 pro IL-1β의 양과 비례합니다. 여기에서는 세포 용해물로부터 pro IL-1β를 측정하기 위해 면역 블로팅 기술이 사용되었습니다. 정량적 데이터는 예상대로 beta-tubulin과 같은 내부 세포 대조군에 상대적인 값으로 표시됩니다.NI Nigerian 처리 세포에서 pro IL-1β에 대한 면역 블로팅을 수행한 결과, pro IL-1β의 감소가 확인되었습니다. 이는 E ELI a(먼저 R 8 48, 이어서 NI Nigerian 조건)로 측정한 상층액 내 IL-1β의 동시 증가에 의해 뒷받침됩니다. TNF-α, IL-10 및 IL-6와 같은 다른 염증성 사이토카인을 동시에 측정하여 Niger가 IL-1β의 분비를 특이적으로 유도함을 확인하였습니다.프라이밍의 수준은 시간과 용량에 의존적입니다. 세포 외 단백질 농도 측정, 성숙한 IL-1β 생성의 화학발광 검출, 또는 인플라마좀 차단과 같은 추가 실험을 통해 세포 외 IL-1β가 성숙한 절단 형태인지, 그리고 IL-1β 분비가 NLRP3 인플라마좀 활성에 의존적인지 결정하는 데 도움이 될 것입니다.

activation-measurement-nlrp3-inflammasome-activity-using-il-1-human

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 autoinflammatory phenotypes와 함께 제시 환자에있어서 IL - 1 베타의 생산과 같은 프로 염증성 크린 시토킨의 생산, 측정하는 간단한 면역 분석법을 설명합니다. 특히 lipopolysaccharide와 병원체 - 관련된 분자 패턴과 전체 혈액 배양에서 세포를 활성화하여, 시토킨 분비가 편리 전체 혈액 supernatants에서 평가하실 수 있습니다.

전체 혈액 자극 분석을 사용하여 프로 염증성 시토킨 IL - 1β의 정확하고 간단한 측정

우리는 (ImageStream 기술의 사용을...

Monocytes과 인간 혈액의 작은 샘플에서 돌기 세포의 리니지 특정 수신자 같은 수용체 - 매개 시그널링의 정량 이미징

이 비디오는 형광 리포터 프로브를 사용하여 대식세포에서 NLRP3 인플라마솜 활성화를 감지하는 방법을 보여줍니다. 세포는 인플라마솜 조립 및 카스파제-1 활성화를 유도하기 위해 칼륨 이오노포어와 글리신으로 처리됩니다. 형광 리포터 프로브는 활성화된 카스파제-1을 시각화하고 세포는 핵 시각화를 위해 형광 염료로 염색됩니다.

Fluorescence Microscopy를 통한 Inflammasome 활성화 검출

이 동영상은 면역형광을 통해 일차 대식세포에서 NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) 인플라마솜 형성을 연구하는 기술을 보여줍니다. 대식세포는 먼저 NLRP3 단백질 발현을 상향 조절하기 위해 박테리아 지질다당류(LPS)로 프라이밍됩니다. 대식세포를 칼륨 이오노포단인 니게리신(nigericin)에 노출시키면 NLRP3가 활성화되고 인플라마좀(inflammasome)이 형성되며, 이는 면역형광을 통해 시각화됩니다.

대식세포에서 인플라마솜 복합체 형성을 연구하기 위한 시험관 내 기술

이 프로토콜은 높은 세포 활력과 분화 및 편광에 대한 완전한 식세포 용량을 유지하면서 높은 형질 전환 효율로 전기 천공에 의해 또는 siRNA의 플라스미드 DNA와 함께 인간 대 식세포 THP-1을 형질 효율적이고 신뢰할 수있는 방법을 제시한다.

Nucleofection에 의해 인간의 THP-1 대 식세포의 고효율 형질

이 현재 프로토콜은 형광 리포터, 생체 내 라벨링 및 생체 내 이미징 기술을 사용하여 살아있는 동물의 호중구 프라이밍의 동적 과정을 모니터링할 수 있습니다.

IL-1β의 발기인 기반을 DsRed 기자 마우스를 사용 호중구 초벌의 생체 내에 영상

Monocyte 파생 된 DC (MoDC) 위험 관련 된 분자의 작은 금액을 느낄 수 및 따라서 쉽게 끝났다. 우리는 혈액과 종양과 그들의 조기 활성화를 피하기 위해 고려해 야 하는 주요 조치를 강조 하면서 면역성이 있는 복합물으로 그들의 활성화에서 MoDC의 격리에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 및 활성 caspase-1와 어댑터, ASC에 대 한 얼룩 세포질 기준 NLRP3 inflammasome 활성화의 탐지를 설명 합니다. 젖 산 효소 자료 분석 결과 인구 기준 pyroptotic 세포를 감지 하 여. 이 기술은 inflammasome 생물학의 여러 측면을 연구 적응 될 수 있다.

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

MALT1 타고 난 면역을 조절 하지만 병이 정의 남아 어떻게이 발생 합니다. 우리는 타고 난 신호 통행세 같이 또는 C 형 lectin 같이 수용 체의, MALT1 골수성 cytokines의 생산 조절 시연 다운스트림 다운스트림 MALT1의 기여를 푸는 선택적 MALT1 paracaspase 억제제 MLT-827 사용 C-타입 lectin 같이 수용 체의 선택적으로.

골수성 타고 난 신호 통로에 한 규제 MALT1 Paracaspase 활동

이 프로토콜은 연구원에게 생체 재료 임플란트 미세 환경을 모델링하는 다양한 중합체 표면 및 흡착 단백질 층에 대응하여 뮤린 대식세포 세포주에서 TLR 의존적 NF-θB/AP-1 전사 인자 활성을 측정하는 신속하고 간접적인 방법을 제공합니다.

고분자 표면에 흡착 된 단백질 층에 유료 수용체 매개 NF-kB / AP-1 신호를 검사하는 대식 세포 분석

이 프로토콜은 인간 혈액 샘플로부터 단핵구 유래 대식세포 (MDM)를 얻는 워크 플로우, 세포 생존력과 행동을 손상시키지 않고 염증성 카스파제 BiFC (BiFC) 리포터를 인간 MDM에 효율적으로 도입하는 간단한 방법, 살아있는 세포에서 염증성 카스파제 활성화를 측정하기위한 이미징 기반 접근법을 설명합니다.

인간 단핵구 유래 대식세포에서 근접성을 유도한 염증성 카스파제의 시각화

배우세요 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 NLRP3 인플라마좀 활성을 측정하는 방법을 IL-1β 분석을 통해. R848과 니게리신을 사용하여 면역 반응 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

활성화 및 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 IL-1β를 사용하여 NLRP3 inflammasome을 활동의 측정

더 많은 동영상 탐색