활성화 및 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 IL-1β를 사용하여 NLRP3 inflammasome을 활동의 측정

다음 실험의 전반적인 목표는 간단한 IL one 베타 판독 분석을 사용하여 체외 인간 수지상 세포에서 인플라마솜 활성을 관찰하는 것입니다. 먼저 세포에 R 8 48을 첨가하여 세포 내 pro IL one 베타 발현을 유도합니다. 그런 다음 nige를 추가하여 NLRP 3 인플라마솜 형성을 활성화합니다.

그것은 차례로 pro IL 1 beta에서 분비 전에 성숙한 IL 1 beta로 분열을 유발합니다. 다음으로, 샘플을 수집하고 면역형광, 웨스턴 블롯 및 eli에 의해 프라이밍 및 활성화된 세포에서 IL one 베타의 분비를 측정하여 얻은 세포 내 pro IL one 베타 및 세포 외 성숙 IL one 베타 결과를 측정합니다. 검출은 인간 DCS를 프라이밍하면 R 8 48 프라이밍된 세포에서 세포 내 pro IL one beta 생산과 나이지리아 juris로 프라이밍 및 활성화된 세포에서 IL one beta의 분비를 초래한다는 것을 보여줍니다.

이 방법은 합성 리간드에 대한 인간 수지상 세포 반응에서 NLRP 3 인플라마솜의 역할에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 박테리아, 바이러스 및 자가염증성 질환과 같은 생리적 유발 요인을 테스트하도록 설계된 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 갓 분리된 단핵구 유래 수지상 세포 200마이크로리터를 96웰 라운드 바닥 플레이트에서 휴지 상태로 분주합니다.

자극되지 않은 음성 제어, 프라이밍만, 활성화만, 프라이밍 후 활성화의 네 가지 표준 조건으로 시작하십시오. 그런 다음 실험 설계에 따라 R 8 48에 대한 희석제 대조군과 다운스트림 세포 내 사이토카인 염색 분석을 위한 nissin을 포함하고, 인플라마좀을 프라이밍하기 위한 동형 대조군에 대한 중복을 포함합니다. R 8 48을 추가하고 10 마이크로 몰 최종 농도를 적절한 웰에 추가합니다.

세포를 섭씨 37도, CO2 5%의 인큐베이터에 18시간 동안 넣습니다. 그런 다음 NLRP 3 인플라마솜을 활성화하려면 20마이크로몰 최종 농도에서 nige를 첨가합니다. 배양액을 추가로 6시간 동안 인큐베이터에 다시 넣어 샘플을 수확하고, 세포 펠릿을 방해하지 않고 3분 동안 배양 플레이트를 974배 G로 원심분리합니다.

EISA에 의한 사이토카인 분비를 측정하기 위해 각 상층액을 별도의 둥근 바닥판으로 옮깁니다. 이제 세포 펠릿을 200마이크로리터의 1 XPBS로 3회 세척하여 세포 샘플에서 세포 외 IL 1베타를 제거하고 10마이크로리터의 변성 용해 완충액에서 세포를 직접 용해하는 프로 IL 1베타의 웨스턴 블롯 검출을 위한 다양한 기술로 추가 분석을 수행합니다. 용해물을 1.5 millil einor tube로 옮긴 후, IL one beta의 유세포 분석에 의한 형광 검출을 위해 섭씨 100도에서 10분 동안 샘플을 가열합니다.

세포 샘플에 100마이크로리터의 5%PHS 배지를 추가하고 1마이크로리터의 형광 표지 항체를 표현형 마커 또는 동형대조군에 첨가하여 어두운 실온에서 10분 동안 배양합니다. PBS를 3회 세척한 후 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 4%PFA 100마이크로리터로 셀을 고정합니다. 다음으로, 100마이크로리터의 투과성 완충액을 30분 동안 첨가한 다음 62나노그램의 항 IL 1 베타 FSE 항체 또는 동형 대조군 샘플을 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.

200마이크로리터의 투과성 완충액으로 세포를 세 번 세척하고 하나의 XPBS에 재현탁합니다. 샘플을 호일로 싸서 섭씨 4도에서 보관하십시오. 현미경 검사로 IL one beta를 검출하면 dappy로 세포를 염색 할 수 있으며, 산을 추가하고 유리 슬라이드 위에 커버 슬립을 부드럽게 놓습니다.

유세포 분석으로 형광 검출을 위해 현미경 이미지를 캡처하기 전에 산이 하룻밤 동안 경화되도록 합니다. 한 번에 하나의 샘플로 데이터를 수집합니다. 살아있는 세포의 전방 및 측면 산란 게이트를 설정합니다 다음 게이트는 CD 11 C 양극 CD 14 음성 세포입니다.

마지막으로, 현미경 데이터 수집에서 pro IL one beta staining을 기반으로 MODC 모집단을 분석합니다. 양성 염색 R 8 48 처리된 샘플로 노출 시간을 설정합니다. 그런 다음 웨스턴 블롯 검출을 위해 MO dcs 용이성을 표현하는 pro IL one beta의 백분율을 결정합니다.

총 샘플 부피를 폴리 아크릴아미드 겔에 로드합니다. 다이 전면이 젤에서 떨어질 때까지 140볼트에서 실행합니다. FL 막에 A-P-V-D-F immo에 많은 아크릴아미드 젤에서 단백질을 옮기십시오.

TBST에서 5%BSA로 멤브레인을 1시간 동안 차단합니다. 1차 항체와 함께 밤새 섭씨 4도에서 흔들면서 배양합니다. TBST 세척 3회, 5분 세척 후 실온에서 1시간 동안 2차 항체와 함께 배양한 후, 3회 이상의 TBST 세척 후 ELI SA에 의해 분비된 사이토카인을 측정할 때 멤브레인을 이미지화하고 실온에서 샘플을 평형화합니다.

샘플을 스핀다운하여 상등액 응축을 강화하고 pro IL one beta에 대한 IL one beta 세포 내 사이토카인 염색을 위한 제조업체의 지침을 따라 CD 11 C positive CD 14 negative monocyte 유래 수지상 세포의 현미경 및 사실 판독을 수행할 수 있습니다. 두 기술 모두 비프라임 또는 휴지 세포 대조군과 동형 대조군을 기준으로 정량화할 수 있습니다. pro IL one 베타 염색 세포의 비율에 이 집단의 기하학적 중앙값을 곱하여 중앙값 형광 강도를 제공합니다.

MFI는 양성 염색 세포에 존재하는 pro IL one beta의 양과 비슷합니다. 여기. 면역 블로팅 기법은 세포 용해물에서 pro IL one beta를 측정하는 데 사용됩니다. 정량적 데이터는 예상대로 베타 튜불린과 같은 내부 세포 제어에 상대적으로 표현됩니다.

NI 나이지리아 처리 세포에서 pro IL one beta에 대한 면역 블로팅은 pro IL one beta의 감소를 나타냅니다. 이는 상등액에서 IL 1 베타의 동시 증가에 의해 보완되며, E ELI a는 R 8 48에 불과하며 NI는 나이지리아 조건에 의해 측정됩니다. T, NF, 알파, IL 10 및 IL 6과 같은 다른 염증성 사이토카인의 동시 측정은 니제르가 IL 1 베타의 분비를 유발하는 데 특이적임을 확인합니다.

프라이밍 수준은 시간과 용량에 따라 다릅니다. 세포외 단백질 농도 측정, 성숙한 I 1 베타 세대의 화학발광 검출 또는 인플라마솜 차단과 같은 추가 실험은 ex extracellular IO one beta가 성숙한 절단된 형태인지, IO one beta 분비가 nlrp인지 여부를 결정하는 데 도움이 될 것입니다. 3 개의 inflammasome 활성에 따라 다릅니다.