입체 잉크젯 인쇄 기술을 사용하여 인간의 연골 조직 제작

이 절차의 전반적인 목표는 동시 광 중합 기능이 있는 수정된 열전사 잉크젯 프린터를 사용하여 3D 조직 프린팅의 타당성을 테스트하기 위해 3차원 인간 연골 조직을 구성하는 것입니다. 이는 먼저 시중에서 판매되는 Hewlett Packard 데스크 제트 500 열전사 잉크젯 프린터와 5 1 16 2 6, 모노 컬러 잉크 카트리지를 바이오 프린터로 수정하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 간단한 3D 프린팅 스테이지와 장파장 UV 램프를 결합하여 제조 과정에서 주입된 바이오 잉크를 즉시 중합하는 것입니다.

다음으로, 바이오 잉크는 팽창된 인간 관절 연골 세포를 10% 폴리에틸렌 글리콜 용액에 밀리리터당 500만 개의 세포로 현탁시켜 제조합니다. 마지막 단계는 동시 광중합과 함께 연골 조직을 층별로 인쇄하는 것입니다. 궁극적으로는 컨포칼 현미경 검사와 조직학입니다.

염색은 3D 하이드로겔에서 인쇄된 연골세포의 균일한 분포와 배양 중 균질한 신연골에서 우수한 연골 세포외 기질 생산을 보여주기 위해 사용됩니다. 수동 제작 후 중합 또는 제작 스캔 후 좌식 셀과 같은 기존 조치에 비해 이 기술의 주요 장점은 인쇄된 셀이 촉각 위치로 정확하게 전달되고 매트릭스의 위치를 유지한다는 것입니다. 중력으로 인해 골격의 바닥을 생각하는 대신 균질 한 카트리지를 형성합니다.

이 비디오에서 시연된 프린터 수정은 Hewlett Packard 데스크 제트 500 열전사 잉크젯 프린터와 5 1 6 2 6 검정 잉크 카트리지를 기반으로 합니다. 프린터의 상단 플라스틱 덮개를 제거하고 덮개에서 제어판을 조심스럽게 분리하는 것으로 시작합니다. 프린터 상부와 베이스 사이에 있는 세 개의 케이블 연결을 분리합니다.

그런 다음 베이스에서 프린터 상단 부분을 제거합니다. 다음으로, 프린트 헤드 세척 시스템을 구성하는 작은 플라스틱 및 고무 액세서리가 프린터 상단 부분에서 제거됩니다. 스프링이 있는 용지함 바닥을 제거합니다.

플라스틱 용지 공급 막대를 덮고 있는 금속판도 제거해야 합니다. 또한 플라스틱 용지 공급 막대는 중간 공급 휠 위치에서 절단하고 두 개의 용지 공급 휠을 제거해야 합니다. 이 비디오에서는 이러한 구성 요소가 이미 제거되었습니다.

통조림 공기와 에탄올 물티슈를 사용하여 먼지와 부스러기를 청소한 후 uv를 사용하기 전에 프린터 상단 부분을 베이스에 부착하십시오. 수정된 프린터를 층류 후드에서 최소 2시간 동안 멸균했습니다. 잉크 카트리지를 수정하려면 먼저 잉크 카트리지의 캡을 잘라냅니다.

손톱을 사용하여 잉크를 비우고 카트리지의 하단 웰 저장소를 덮고 있는 필터를 제거합니다. 흐르는 수돗물로 카트리지를 철저히 헹구어 남아 있는 잉크 울트라를 제거합니다. 카트리지를 탈이온수로 10분 동안 초음파 처리합니다.

카트리지를 검사하여 잉크가 모두 제거되었는지 확인합니다. 살균을 위해 카트리지에 70% 에탄올을 철저히 분사한 다음 살균된 탈이온수를 뿌립니다. 마지막으로, 인쇄 플랫폼 위에 장파장 UV 램프를 설정하여 동시 광 중합 용량을 제공합니다.

UV 광도계를 사용하여 인쇄 플랫폼에서 UV 강도를 측정합니다. UV 램프와 프린터 플랫폼 사이의 거리를 조정하여 인쇄 대상의 강도가 제곱센티미터당 4-8밀리와트가 되도록 합니다. 램프와 프린터 플랫폼 사이의 거리는 약 25cm여야 합니다.

바이오 잉크는 인간 연골 세포에서 단층 플레이트에서 연골 세포를 확장하기 위해 준비됩니다. 세포 확장을 위해 각 T 1 75 조직 배양 플라스크에 500 만 개의 인간 연골 세포를 DMEM에서 10 % 송아지 혈청과 1 개의 페니실린 스트렙토 마이신 글루타민 배양 세포와 5 % 이산화탄소를 함유 한 가습 공기로 섭씨 37도에서 배양 세포. 세포가 85% confluent가 될 때까지 3일마다 배양 배지를 교체하십시오.

동일한 통로의 세포를 사용합니다. 폴리에틸렌 글리콜 DL 또는 페다 용액을 준비합니다. PBS에 있는 peda를 부피 당 10%weight의 마지막 농도에 녹입니다.

광 개시제 I 2 9 5 9를 부피 필터당 중량 0.05%의 최종 농도에 추가합니다. 배양된 인간 연골 세포가 85% 합류할 때 용액을 살균합니다. 세포 농도를 계산한 후 세포를 수집합니다.

밀리리터당 500만 개의 세포로 bio를 준비하는 데 필요한 세포 현탁액의 부피를 1200RPM의 원뿔형 튜브 원심분리기로 5분 동안 이동합니다. 세포를 펠릿화하기 위해 상등액을 흡인하고 준비된 Pega 용액에 세포를 현탁시켜 바이오 잉크를 형성합니다. 이 절차를 시작하려면 Microsoft Word를 사용하여 프린터와 랩톱을 켜고 지름이 4mm 인 실선 원의 인쇄 패턴을 만듭니다.

플라스틱 금형을 프린터에 넣습니다. 패턴의 위치를 조정하고 플라스틱 금형에 정확하게 인쇄되는지 확인하십시오. 원하는 발판 두께에 도달하는 데 필요한 인쇄 수를 계산합니다.

높이가 4mm인 경우 원하는 비계를 만들려면 220번의 인쇄가 필요합니다. 잉크 카트리지에 바이오 잉크를 로드합니다. 직접적인 uuv 노출로부터 보호하기 위해 카트리지를 알루미늄 호일로 덮으십시오.

인쇄하는 동안 인쇄 명령을 프린터로 보냅니다. 프린터가 인쇄를 시작하면 용지 센서를 당겨 인쇄를 계속하십시오. 프린터를 통과하는 용지가 없는 경우 전체 인쇄 프로세스는 직경 4mm, 높이 4mm의 비계에 대해 4분 미만이 소요됩니다.

프린트된 신 연골을 24웰 플레이트로 옮기고 각 웰에 1.5ml의 배양 배지를 추가합니다. 세포 생존력을 평가하려면 인쇄된 신연골을 살아있는 생존력에서 배양합니다. 세포독성 작업용액을 실온에서 어둠 속에서 15분 동안 절단하고 세포가 함유된 하이드로겔을 반으로 자릅니다.절단 영역의 형광 이미지를 획득한 후 맹검 관찰자가 무작위로 촬영한 5개의 이미지에서 살아있는 세포와 죽은 세포를 계수하여 세포 생존력을 계산합니다.

이 사진에는 변형된 열전사 잉크젯 프린터의 특성을 기반으로 직경 4mm, 높이 4mm의 대표적인 인쇄된 신연골 조직이 표시되어 있습니다. 이 크기의 구조물의 경우, 층별 구조 중 인쇄된 각 층의 부피와 두께는 각각 0.23마이크로리터 및 18미크론이었습니다. 신연골 조직을 만들기 위한 전체 프린팅 과정은 4분도 채 걸리지 않았습니다.

이 이미지는 녹색과 주황색 형광 염료로 표지된 연골 세포의 이미지입니다. 패널 A는 3D 골격에서 인쇄된 연골 세포의 균일한 세포 분포를 보여줍니다. 세포 증착 중 주변 골격의 동시 광중합으로 인해 인쇄 및 광중합 공정은 90%의 세포 생존율로 4분 만에 완료되었습니다.대조적으로, 패널 B는 동시 광중합 없이 세포가 초기에 증착된 위치에 머무르는 대신 중력으로 인해 바닥 수평 계면으로 가라앉았음을 보여줍니다.

세포 생존율이 63%인 A와 동일한 크기의 구성물인 겔에 UV 노출이 10분 정도 걸렸으며, PEG 하이드로겔에 인쇄된 연골세포를 염색한 결과, 배양 과정에서 인쇄된 연골세포의 선천적 표현형을 3D로 나타내고 균질한 신연골이 형성되는 등 단백질 글리칸 생산이 점진적으로 증가함을 확인할 수 있었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 수정된 열전사 잉크젯 프린터를 사용하여 3D 골격에서 균일한 세포 분포를 가진 3차원 계산된 조직을 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.