Name: 입체 잉크젯 인쇄 기술을 사용하여 인간의 연골 조직 제작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 배우세요 입체 잉크젯 바이오프린팅 기술을 사용하여 인간 연골 조직을 제작하는 방법을. 수정된 열전사 프린터와 동시 UV 중합을 활용하여 균일한 세포 분포를 가진 3D 네오카티라지를 구축합니다.

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저자는 뉴욕 수도권 연구 얼라이언스 그랜트의 지원을 인정하고 싶습니다.

1. Bioprinting 플랫폼 구축 프린터 수정은 HP 데스크젯 500 열 잉크젯 프린터와 HP 51626a 검정 잉크 카트리지를 기반으로했다. <ol><li> 프린터 상단의 플라스틱 덮개를 분리하고 조심스럽게 덮개에서 제어판을 분리합니다. </li><li> 프린터 상단 부분과베이스 사이의 3 케이블 연결을 분리합니다. 기지에서 프린터 상단 부분을 제거합니다. </li><li> 프린터 상단 부분에서, 잉크 카트리지 아래 우측에있는 작은 플라스틱 및 고무 부속품 (프린트 헤드 세척 장치)를 제거한다. </li><li> 스프링 용지함 받침대를 제거합니다. </li><li> 플라스틱 급지 줄을 덮고있는 금속 플레이트를 제거합니다. </li><li> 손보고 또는 다른 절단 도구를 사용하여 중간 공급 휠 위치의 플라스틱 급지 줄을 잘라. </li><li> 이전 단계 이후에 노출 된 2 급지 바퀴를 제거합니다. 바퀴 플라스틱은 매우 단단하고 전자입니다톱 도움이 될 것입니다. </li><li> 통조림 공기와 에탄올 잎사귀를 사용하여 먼지와 이물질을 청소합니다. </li><li> 베이스에 프린터 상단 부분을 연결합니다. </li><li> 사용하기 전에 층류 후드에서 적어도 2 시간 동안 변경됨 프린터 살균 UV. </li><li> 손보고 또는 다른 절단 도구를 사용하여 HP의 51626a 잉크 카트리지의 뚜껑을 잘라. </li><li> 잉크를 비우고 연골의 아래쪽 아니라 저수지를 포함 필터를 제거합니다. </li><li> 철저하게 수돗물을 실행하여 카트리지를 씻어. </li><li> 초음파 처리는 10 분 동안 탈 이온화 (DI) 물에 카트리지 잔여 잉크를 제거합니다. </li><li> 반드시 모든 잉크가 제거 된 확인하기 위해 카트리지를 검사합니다. 멸균 DI 물 다음에 소독 용 70 % 에탄올로 철저하게 카트리지를, 린스 또는 스프레이. </li><li> 동시 광중합 능력을 제공하는 인쇄 플랫폼 위에 장파장 자외선 램프를 설치했다. </li><li> UV 광을 이용하여 인쇄 플랫폼에 UV 강도를 측정미터. 인쇄 제목의 강도가 4-8 mW의 / ㎠ (프린터 플랫폼 램프에서 약 25 CM) 그래서 UV 램프와 프린터 플랫폼 사이의 거리를 조정합니다. </li></ol> 2. Bioink 준비 <ol><li> 단층의 연골 세포의 확장 <ol><li> Dulbeccos의 세포 확장을위한 각 T175 조직 배양 플라스크에 넣고 판 5 백만 인간의 연골 세포는 10 %의 혈청 및 1X 페니실린 - 스트렙토 마이신-글루타민 (PSG)으로 보충 이글스 중간 (DMEM)을 수정. 5 % CO 2를 포함하는 가습 공기와 37 ° C에서 배양 세포. 플라스크는 85 %의 합류 때까지 3 일마다 배지를 변경합니다. 같은 구절에서 세포를 사용합니다. </li></ol></li><li> 10 % W / V의 최종 농도로 PBS에 PEGDA을 녹여 0.05 % W / V의 최종 농도에 광개시제 I-2959에 추가 솔루션을 살균 필터. </li><li> 5 × 10 6 세포의 준비 PEGDA 용액에서 배양 된 연골 세포를 일시 중지 /ML. </li></ol> 3. 연골 조직의 인쇄 <ol><li> 프린터와 노트북을 켭니다. </li><li> Microsoft Word 또는 어도비 포토샵을 사용하여 직경 4 mm의 고체 원의 인쇄 패턴을 만듭니다. <ol><li> 패턴의 위치를​​ 조정하고 플라스틱 금형에 정확하게 인쇄 할 수 있는지 확인하십시오. </li><li> 지지체의 원하는 두께에 도달하기 위해 필요한 인쇄 매수를 계산한다. 높이 4mm의 경우, (220) 인쇄가 원하는 발판을 만들어야합니다. </li></ol></li><li> 잉크 카트리지에 bioink를 넣습니다. 인쇄 중에 직접 UV의 노출로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 카트리지를 커버. </li><li> 프린터로 인쇄 명령을 보냅니다. 프린터가 인쇄를 시작할 때 용지 센서를 당깁니다. 전체 인쇄 과정은 직경 4 ㎜, 높이 4 mm의 발판 미만 4 분 소요됩니다. </li><li> 전송은 24 웰 플레이트에 neocartilage을 인쇄하고 각 웰에 1.5 ml의 문화 매체를 추가 할 수 있습니다. </li></ol><ol><li> 어둠 속에서 15 분 동안 실온에서 LIVE / DEAD 생존 / 세포 독성 작업 솔루션에서 인쇄 neocartilage을 품어. </li><li> 반 세포 함유 하이드로 겔을 절단하고 절단 영역의 형광 이미지를 가지고. </li><li> 다섯 무작위로 촬영 한 이미지에 눈이 먼 관찰자 (녹색)과 죽음 (적색) 세포 라이브 계산합니다. 살아있는 및 죽은 세포의 총 수에 의해 생균 수를 분할함으로써 세포 생존도를 계산한다. </li></ol>

<ol><li>Cui, X., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microvasculature+fabrication+using+thermal+inkjet+printing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology.</a> Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).</li>
<li>Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., D'Lima, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+human+cartilage+repair+using+three-dimensional+bioprinting+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Direct human cartilage repair using three-dimensional bioprinting technology.</a> Tissue Eng Part A. 18, 1304-1312 (2012).</li>
<li>Cui, X., Breitenkamp, K., Lotz, M., D'Lima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+action+of+fibroblast+growth+factor-2+and+transforming+growth+factor-beta1+enhances+bioprinted+human+neocartilage+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Synergistic action of fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 enhances bioprinted human neocartilage formation.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 2357-2368 (2012).</li>
<li>Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., Colwell, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+human+cartilage+repair+using+thermal+inkjet+printing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Direct human cartilage repair using thermal inkjet printing technology.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19, (2011).</li>
<li>Cui, X., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+deposition+of+human+microvascular+endothelial+cells+and+biomaterials+for+human+microvasculature+fabrication+using+inkjet+printing%5BTitle%5D)+AND+%22NIP24%2Fdigital+Fabrication+2008%3A+24th+International+Conference+on+Digital+Printing+Technologies%2C+Technical+Program+and+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Simultaneous deposition of human microvascular endothelial cells and biomaterials for human microvasculature fabrication using inkjet printing.</a> NIP24/digital Fabrication 2008: 24th International Conference on Digital Printing Technologies, Technical Program and Proceedings. 24, 480-483 (2008).</li>
<li>Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+damage+evaluation+of+thermal+inkjet+printed+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).</li>
<li>Cui, X., Hasegawa, A., Lotz, M., D'Lima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+three-dimensional+co-culture+of+mesenchymal+stem+cells+with+meniscus+cells+promotes+meniscal+phenotype+without+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with meniscus cells promotes meniscal phenotype without hypertrophy.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 2369-2380 (2012).</li>
<li>Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+myotube+formation+using+bioprinting+technology+for+biosensor+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications.</a> Biotechnol. Lett. 35, 315-321 (2013).</li>
<li>Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+inkjet+printing+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat+Drug+Deliv+Formul%22%5BJournal%5D)">Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).</li>
<li>Bryant, S. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+properties+influence+ECM+production+by+chondrocytes+photoencapsulated+in+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Hydrogel properties influence ECM production by chondrocytes photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 59, 63-72 (2002).</li>
<li>Elisseeff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoencapsulation+of+chondrocytes+in+poly%28ethylene+oxide%29-based+semi-interpenetrating+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Photoencapsulation of chondrocytes in poly(ethylene oxide)-based semi-interpenetrating networks.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 51, 164-171 (2000).</li>
<li>Buskirk, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+A+High-Resolution+Thermal+Inkjet+Printhead%5BTitle%5D)+AND+%22Hewlett-Packard+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of A High-Resolution Thermal Inkjet Printhead.</a> Hewlett-Packard Journal. 39, 55-61 (1988).</li>
<li>Harmon, J. P., Widder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+the+Printhead+Into+the+HP+Deskjet+Printer%5BTitle%5D)+AND+%22Hewlett-Packard+Journal%22%5BJournal%5D)">Integrating the Printhead Into the HP Deskjet Printer.</a> Hewlett-Packard Journal. 39, 62-66 (1988).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+model+for+cartilage+tissue+engineering+to+regenerate+the+zonal+organization+of+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Experimental model for cartilage tissue engineering to regenerate the zonal organization of articular cartilage.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 11, 653-664 (2003).</li>
<li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+zonal+organization+into+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage.</a> Tissue Engineering. 13, 405-414 (2007).</li>
<li>Cohen, D. L., Lipton, J. I., Bonassar, L. J., Lipson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additive+manufacturing+for+in+situ+repair+of+osteochondral+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Additive manufacturing for in situ repair of osteochondral defects.</a> Biofabrication. 2, (2010).</li>
</ol>

저자는이 연구에 재정적 인 관심이 없다.

동시 광중합 용량이 3D bioprinting 시스템은 셀룰러 알지네이트 하이드로 겔 (16)을 압출 주사기를 사용하여 골 연골 결함 시츄 프린팅 소재의 최상의 이전에보고 된 방법보다 상당히 큰 인쇄 해상도를 제공한다. 높은 인쇄 해상도는 해부학 연골 띠 조직을 복원하는 연골 조직 공학에 특히 중요합니다. 계층 별 조립시 동시 광중합는 3D 건설을위한 세포 및 생체 재료 비계의 정확한 침착을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 각 인쇄 층과 미세 또한 인해 박리 저하의 가능성을 최소화 띠 층 사이의 부드러운 전환의 결과. 정확하게 bioprinting 파라미터 및 bioink의 성분을 조절함으로써, 우리는 연골 병변의 다양한 치료에 필요한 복잡한 3D 구조를 제조 할 수있을 것이다. 영신로rgistic 성장 인자의 자극, bioprinted neocartilage 최고의 연골 세포의 표현형 및 대부분의 세포 증식 3 있었다....

열 잉크젯 프린팅에 근거 Bioprinting은 조직 공학과 재생 의학 분야에서 가장 유망한 지원 기술의 하나이다. 디지털 제어 및 높은 처리량 프린트 헤드와 세포 골격 및 성장 인자는 정확히 3 차원 (3D) 위치를 빠르게 원하는 이차원 (2D)로 증착 될 수있다. 많은 성공적인 응용 프로그램은 조직 공학 및 재생 의학 1-9에서이 기술을 사용하여 달성되었습니다. 본 논문에서는 bioprinting 플랫폼은 수정 된 휴렛 팩커드 (HP) 데스크젯 500 열 잉크젯 프린터와 동시에 광중합 시스템과 함께 설립되었다. 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG)에서 제형 화 합성 하이드로 겔은 연골 세포 생존을 유지하고 연골 ECM 생산 10,11 홍보의 용량을 보여 주었다. 또한, photocrosslinkable PEG 동시 고분자 재료에 이상적 낮은 점도, 물에 매우 용해3D의 bioprinting 동안 rization. 본 논문에서는 폴리 (에틸렌) 글리콜 디 아크릴 레이트 (PEGDA, MW 3,400)에 현탁 인간의 연골 세포는 정확하게 3D 해상도 1,400 dpi로와 neocartilage 계층별로 레이어를 구성하는 인쇄되었다. 3 차원 지지체에 증착 된 세포 균질 분포는 우수한 기계적 특성 및 향상된 ECM 생산하여 연골 조직을 생성하는 관찰되었다. 대조적으로, 수동 조립에 의한 배양 2,3 불균일 연골 형성되었다 느린 비계 중합, 대신 그들의 초기 증착 위치의 겔의 바닥에 축적 된 세포.

<table><tbody><tr><td>HP Deskjet 500 열전사 잉크젯 프린터</td><td>Hewlett-Packard</td><td>C2106a</td><td>제품 생산 중단 인터넷 공급 업체에서 리퍼브 제품을 구입했습니다.</td></tr><tr><td>HP 검정 잉크 카트리지</td><td>Hewlett-Packard</td><td>51626a</td><td></td></tr><tr><td>자외선 램프</td><td>UVP</td><td>B-100AP</td><td></td></tr><tr><td>자외선 측정기</td><td>일반 도구</td><td>UV513AB</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>Mediatech</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신-글루타민(PSG)</td><td>인비트로겐</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>아쿠아타제 세포 해리 시약</td><td>인비트로젠</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>인비트로젠</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>라이브/데드 생존력/세포독성 키트</td><td>인비트로젠</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(PEGDA)</td><td>글리코산 바이오시스템즈</td><td>GS700</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba 특수 화학 물질</td><td>I-2959</td><td></td></tr><tr><td>인간 관절 연골 세포</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr></tbody></table>

입체 잉크젯 인쇄 기술을 사용하여 인간의 연골 조직 제작

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

열 잉크젯 프린팅을 기반으로 Bioprinting는 조직 공학 및 재생 의학 분야에서 가장 매력적인 지원 기술 중 하나입니다. 디지털 제어 세포 골격 및 성장 인자는 정확히 3 차원 (3D) 위치 빠르게 원하는 이차원 (2D)로 증착 될 수로. 따라서,이 기술은 그 나라의 해부학 적 구조를 흉내 낸 조직을 조작 할 수있는 이상적인 방법입니다. 네이티브 존 조직, 세포 외 매트릭스 조성물 (ECM), 그리고 기계적 성질과 연골을 설계하기 위해, 우리는 3D 연골 조직 공학을위한 가능한 동시 광중합와 상용 잉크젯 프린터를 사용 bioprinting 플랫폼을 개발했다. 폴리 (에틸렌 글리콜) 디 아크릴 레이트 (PEGDA)에 현탁 인간의 연골 세포는 계층 별 어셈블리를 통해 3D neocartilage 건설에 인쇄되었다. 인쇄 균체 surro 지원 그들의 본래 증착 위치에 고정했다동시에 광중합에 발판을 unding. 인쇄 조직의 기계적 성질은 네이티브 연골 유사 하였다. 이상 자외선 노출을 필요로 기존의 조직 제조에 비해, 동시에 광중합 인쇄 된 세포의 생존 능력이 유의하게 높았다. 인쇄 neocartilage 우수한 글리코 사 미노 글리 칸 (GAG)과 유전자 발현과 일치했다 콜라겐 타입 II의 생산을 보여 주었다. 따라서이 플랫폼은 해부학 적 조직 공학에 대한 정확한 세포의 분포와 배치에 이상적입니다.

수정 된 열 잉크젯 프린터는 높은 처리량 및 우수한 세포 생존 능력의 세포와 비계 증착 할 수 있었다. 동시에 광중합 및 감광 바이오 물질과 결합,이 기술은 처음에 퇴적 위치로 세포와 다른 인쇄 물질을 고정 할 수 있습니다. 개질 열 잉크젯 프린터의 속성에 따라, 2D 인쇄 해상도는 130 (PL)의 하나의 잉크 방울 체적 300 dpi로 하였다. 3.6 kHz에서 발사 주파수 (12, 13)과 각각의 프린트 헤드 (50) 점화 노즐이 있습니다. 따라서 4 개 mm 직경 4mm의 높이, 볼륨 및 계층 별 건설 기간 동안 각 인쇄 층의 두께의 대표적인 구조에 대해 각각 0.23 μL 18 μm의되었습니다. 전체 프린팅 공정은 연골 조직 (도 1)를 구성하는 4 개 이하 분 걸렸다. 도 2a는 인화의 짝수 셀 분포를 나타내고테드 인해 셀 증착 동안 주변의 발판을 동시에 광중합에 3D 지지체에 연골 세...

이 문서에 설명 된 방법은 동시 UV 중합과 bioprinter에 상용 잉크젯 프린터로 변환하는 방법을 보여줍니다. 프린터는 세포 및 생체 재료와 3 차원 조직 구조를 구축 할 수있다. 여기에 설명이 연구는 3D neocartilage을 건설했다.

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

본 절차의 전반적인 목표는 동시 광중합 기능이 탑재된 수정된 열 잉크젯 프린터를 사용하여 3D 조직 프린팅의 가능성을 테스트하기 위한 3차원 인간 연골 조직을 구축하는 것입니다. 이는 먼저 시판되는 Hewlett Packard desk jet 500 열 잉크젯 프린터와 단색 잉크 카트리지를 바이오 프린터로 수정함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 단순한 3D 프린팅 스테이지와 장파장 UV 램프를 결합하여 제조 과정 중 분사된 바이오 잉크의 즉각적인 중합을 유도하는 것입니다.다음으로, 확장된 인간 관절 연골세포를 10% polyethylene glycol 용액에 mL당 500만 개의 세포 농도로 부유시켜 바이오 잉크를 준비합니다. 마지막 단계는 광중합을 동시에 진행하며 연골 조직을 층별로 출력하는 것입니다. 최종적으로 공초점 현미경 관찰 및 조직학적 분석을 수행합니다.염색은 3D 하이드로젤 내에 프린팅된 연골세포의 균일한 분포와 배양 과정 중 균질한 신생 연골의 우수한 연골 세포외 기질 생성 능력을 보여주기 위해 사용됩니다. 수동 제작 후 중합하거나 제작을 위한 스캔 후 세포를 안착시키는 기존 방식과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 프린팅된 세포가 정밀하게 목표 위치로 전달되어 매트릭스 내의 위치를 유지한다는 점입니다. 이는 중력으로 인해 세포가 스캐폴드의 바닥으로 가라앉는 대신 균질한 연골을 형성하게 합니다.본 영상에서 시연하는 프린터 개조는 Hewlett Packard desk jet 500 열전사 잉크젯 프린터와 5 1 6 2 6 a 블랙 잉크 카트리지를 기반으로 합니다. 먼저 프린터의 상단 플라스틱 커버를 제거하고, 커버에서 제어 패널을 조심스럽게 분리하십시오. 프린터 상단부와 하단부 사이의 케이블 연결 3곳을 분리합니다.그런 다음 베이스에서 프린터 상단 부분을 분리합니다. 다음으로, 프린트헤드 세척 시스템을 구성하는 작은 플라스틱 및 고무 액세서리들을 프린터 상단 부분에서 제거합니다. 스프링이 달린 용지 트레이의 베이스를 제거합니다.플라스틱 용지 공급 바를 덮고 있는 금속 플레이트 역시 제거해야 합니다. 또한, 플라스틱 용지 공급 바를 중앙 공급 휠 위치에서 절단하고 두 개의 용지 공급 휠을 제거해야 합니다. 본 영상에서는 이러한 구성 요소들이 이미 제거된 상태입니다.캔 에어와 에탄올 와이프를 사용하여 먼지와 이물질을 제거한 후, UV 사용 전에 프린터 상단부를 베이스에 부착하십시오. 수정된 프린터를 층류 후드(laminar flow hood) 내에서 최소 2시간 동안 멸균하십시오. 잉크 카트리지를 수정하려면 먼저 캡을 잘라내십시오.핸드 톱을 사용하여 카트리지의 하단 웰 저장조를 덮고 있는 필터를 제거하고 내부의 잉크를 비웁니다. 수돗물로 카트리지를 충분히 헹구어 잔류 잉크 울트라를 제거합니다. 탈이온수에서 카트리지를 10분 동안 초음파 세척합니다.카트리지를 확인하여 잉크가 모두 제거되었는지 확인하십시오. 멸균을 위해 카트리지 전체에 70% ethanol을 충분히 뿌린 후, 멸균된 탈이온수로 헹굽니다. 마지막으로, 동시에 광중합이 가능하도록 프린팅 플랫폼 위에 장파장 UV 램프를 설치하십시오.UV 광도계를 사용하여 프린팅 플랫폼의 UV 강도를 측정합니다. 출력 대상물의 강도가 4~8 mW/cm² 사이가 되도록 UV 램프와 프린터 플랫폼 사이의 거리를 조정합니다. 램프와 프린터 플랫폼 사이의 거리는 약 25 cm가 되어야 합니다.바이오 잉크를 제조하기 위해 인간 연골세포를 단층 배양 플레이트에서 증식시킵니다. 세포 증식을 위해 각 T 175 조직 배양 플라스크에 5 million 개의 인간 연골세포를 접종합니다. 10% calf serum과 one x penicillin streptomycin glutamine이 첨가된 DMEM에서 5% carbon dioxide가 포함된 가습 공기가 있는 37 degrees Celsius 조건으로 세포를 배양합니다. 세포 밀도가 85%confluent가 될 때까지 3일마다 배양액을 교체합니다.동일한 계대 수의 세포를 사용하십시오. 폴리에틸렌 글리콜 DL 또는 peda 용액을 준비하십시오. peda를 PBS에 녹여 최종 농도가 10%weight per volume가 되게 하십시오.최종 농도가 0.05% w/v가 되도록 광개시제 I 2 9 5 9를 첨가한 후 필터 멸균합니다. 배양된 인간 연골세포의 밀도가 85%에 도달하면 세포 농도를 계산하여 세포를 수집합니다.1mL당 500만 개의 세포 농도로 바이오 잉크를 제조하는 데 필요한 부피의 세포 현탁액을 원심분리용 원뿔 튜브에 옮겨 1200 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포를 펠렛화하기 위해 상층액을 흡입하여 제거하고, 준비된 Pega 용액에 세포를 현탁하여 바이오 잉크를 형성합니다. 이 절차를 시작하려면 프린터와 노트북의 전원을 켜고, Microsoft Word를 사용하여 직경 4mm의 실선 원형 출력 패턴을 생성합니다.플라스틱 몰드를 프린터에 넣습니다. 패턴의 위치를 조정하여 플라스틱 몰드 내에 정확하게 출력되는지 확인합니다. 스캐폴드의 원하는 두께에 도달하는 데 필요한 출력 횟수를 계산합니다.4 mm 높이의 원하는 스캐폴드를 제작하려면 220회의 프린팅이 필요합니다. 바이오 잉크를 잉크 카트리지에 충전하십시오. 직접적인 UV 노출로부터 보호하기 위해 카트리지를 알루미늄 호일로 덮으십시오.인쇄 중에 프린터로 인쇄 명령을 보냅니다. 프린터가 인쇄를 시작하면, 인쇄를 계속 진행하기 위해 용지 센서를 당겨줍니다. 프린터를 통과하는 용지가 없는 경우, 직경 4 mm 및 높이 4 mm의 스캐폴드를 제작하는 데 전체 인쇄 과정은 4분 미만이 소요되어야 합니다.프린팅된 신카틸리지(neo cartilage)를 24웰 플레이트로 옮기고 각 웰에 1.5 milliliters의 배양액을 추가합니다. 세포 생존율을 평가하기 위해, 프린팅된 신카틸리지를 실시간 세포 생존/사멸(live dead viability) 세포독성 작업 용액에 넣고 상온의 암소에서 15분 동안 배양한 후, 세포가 함유된 하이드로젤을 절반으로 자릅니다. 절단 부위의 형광 이미지를 획득한 후, 눈가림법을 적용한 관찰자가 무작위로 추출한 5장의 이미지에서 생존 세포와 사멸 세포의 수를 측정하여 세포 생존율을 계산합니다.개조된 열 잉크젯 프린터의 특성을 기반으로 제작된 직경 4 mm, 높이 4 mm의 대표적인 인공 연골 조직 출력물이 이 사진에 제시되어 있습니다. 이 크기의 구조물을 층별로 적층하여 제작할 때, 각 출력층의 부피와 두께는 각각 0.23 µL와 18 µm였습니다. 인공 연골 조직을 제작하는 전체 출력 과정은 4분 미만이 소요되었습니다.이 이미지들은 녹색과 주황색 형광 염료로 라벨링된 연골세포를 보여줍니다. 패널 A는 3D 스캐폴드 내에 출력된 연골세포가 균일하게 분포되어 있음을 보여줍니다. 세포 증착 과정에서 주변 스캐폴드의 광중합이 동시에 이루어졌기 때문에, 출력 및 광중합 과정은 90%의 세포 생존율과 함께 4분 만에 완료되었습니다. 이와 대조적으로 패널 B는 동시 광중합이 이루어지지 않았을 때, 세포가 처음에 증착된 위치에 머무는 대신 중력으로 인해 하단 수평 인터페이스로 가라앉았음을 보여줍니다.젤화까지 10분간의 UV 노출이 소요되었으며, A와 동일한 크기의 구조물에서 63%의 세포 생존율이 나타났습니다. PEG 하이드로젤 내에 프린팅된 연골세포의 Saffron O 염색 결과, 배양 기간 동안 프로테오글리칸 생성이 점진적으로 증가하는 것이 관찰되었으며, 이는 3D 내 프린팅된 연골세포의 동계 표현형 유지와 균질한 신생 연골 형성을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 수정된 열 잉크젯 프린터를 사용하여 3D 스캐폴드 내에 세포가 균일하게 분포된 3차원 연골 조직을 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

human-cartilage-tissue-fabrication-using-three-dimensional-inkjet

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

3 차원 (3D) 미세 복합 빔은 3 차원 다공성 미세 유체 네트워크로 나노 복합 재료의 감독 및 지역화 침투를 통해 제조된다. 이 제조 방법의 유연성은 기능적 3D 강화 나노 복합체 거시적 다양한 제품을 달성하기 위해 서로 다른 열경화성 재료와 nanofillers의 이용을 가능하게한다.

미세 유체 침투를 통해 세 가지 차원 미세 구조 나노 복합 재료의 제조

Cartesian bioprinter는 정밀하고 재현 가능한 형상으로 다중 재료 증착을 허용하는 동시에 환경 요인을 제어할 수 있도록 설계 및 제작되었습니다. 3차원 바이오프린터를 사용하면 복잡하고 실행 가능한 구조를 인쇄하고 쉽게 복제할 수 있습니다.

세 디스펜서 데카르트 프린터 사용 Bioprinted 세포를 구축의 생존

연골과 피부 아날로그 bioprinted nanocellulose-alginate 근거한 bioink를 사용 하 여 했다. bioinks 번 수동 혼합 장치를 통해 인쇄 하기 전에 cellularized 했다. 구문 균일 하 게 cellularized, 높은 생존 능력, 그리고 차별화의 유리한 마커 전시를 시연 했다.

연골과 피부 조직 아날로그 소설 수동 Bioink Precellularization에 대 한 단위 기술 혼합을 이용 하 여 Bioprinting

이 프로토콜의 구조 조직 구조 엔지니어링 3D 인쇄를 decellularized 행렬 (DM)를 포함 하는 임베디드 polylactic 산 (PLA) 스피어와 polycaprolactone (PCL) 필 라 멘 트의 생산을 설명 합니다.

3D 인쇄에 대 한 새로운 과정 Decellularized 행렬

이 프로토콜의 3 개의 중요 한 단계는 i) 개발 올바른 구성 및 일관성 ii) 3D로 다양 한 장비의 인쇄 셀 루 로스 히드로 잉크의 기 공 구조 좋은 모양 충실도 및 치수와 iii)의 데모는 연골 재생에 대 한 시뮬레이션 된 신체 조건에서 기계적 속성.

3D 인쇄 다공성 셀 루 로스 나노 하이드로 겔 건설 기계

여기에 제시된 젤라틴 메타크릴로일의 3D 바이오프린팅을 위한 방법이다.

젤라틴 메타크릴 하이드로겔 기반 바이오잉크의 3D 바이오프린팅 프로토콜

이 프로토콜은 결정성 나노셀룰로오스(CNC)/아가로즈 복합 하이드로겔 생체재료 잉크를 마우스 골수 유래 마스트 세포와 함께 세포 표면 수용체의 세포 생존성 및 표현성 발현, 키트(CD117) 및 고친화도 이에 수용체(FcθRI)의 생체 적합성을 신속하게 평가하는 방법을 강조한다.

골수 유래 마스트 세포 배양을 위한 결정성 나노셀룰로오스 내장 아가로즈 생물재료 잉크의 제조

엔지니어링 플랩은 통합된 기능적 혈관 네트워크가 필요합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 계층 적 혈관 네트워크와 쥐 대퇴 동맥에 대한 직접적인 미세 외과 적 해부학을 포함하는 3D 인쇄 된 조직 플랩을 제작하는 방법을 제시합니다.

3D 프린팅 기술을 이용한 혈관 플랩 제작

이 프로토콜은 젤라틴 기반 과립 지지체에 인산 칼슘 잉크를 증착하여 뼈와 같은 구조를 제조하는 3D 프린팅 기술을 설명합니다. 인쇄된 뼈 유사체는 다상 구축물을 위한 살아있는 세포 매트릭스 내에서 인쇄물의 직접 수확 또는 가교를 위한 유연성과 함께 자유 형태로 증착됩니다.

뼈 유사체 생성을 위한 세포 함유 현탁액의 세라믹 전방향 바이오프린팅

하이드로겔 형성 중 전단 처리는 전단력이 제거된 후 전단이 얇지만 빠르게 재구성되는 마이크로겔 현탁액의 생성을 초래합니다. 이러한 물질은 바이오프린팅 복합체, 세포 함유 구조의 지지 매트릭스로 사용되었습니다. 여기서는지지 베드 및 호환 가능한 바이오 잉크를 제조하는 데 사용되는 방법을 설명합니다.

부유 된 3D 바이오 프린팅을위한 겔화 동안 전단 처리에 의해 형성된 Agarose 유체 겔

배우세요 입체 잉크젯 바이오프린팅 기술을 사용하여 인간 연골 조직을 제작하는 방법을. 수정된 열전사 프린터와 동시 UV 중합을 활용하여 균일한 세포 분포를 가진 3D 네오카티라지를 구축합니다.

입체 잉크젯 인쇄 기술을 사용하여 인간의 연골 조직 제작

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