Name: G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조를 감지하기 위해 라벨이없는 광 바이오 센서의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-10T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 배우세요 라벨 없는 광학 바이오센서를 활용하여 G-단백질 결합 수용체에 의한 칼륨 채널 변조를 HEK 293 세포에서 실시간으로 정량 측정하는 방법을. 이 기술은 신경과학 및 세포 신호 전달 연구에 활용됩니다.

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저자는 안정적으로 쥐 한산한-B 단백질을 발현하는 HEK293 세포의 관대 한 기부에 대한 예일 대학에서 박사 프레드 Sigworth의 실험실에서 박사 양양 얀에게 감사의 말씀을 전합니다. 또한 저자는 비디오 소개에 표시 여유의 극저온 전자 현미경 상 동성 모델의 박사 Sigworth에게 감사의 말씀을 전합니다.이 연구는 LKK에 NIH 보조금 DH067517 및 NS073943에 의해 지원되었다

1. 세포 배양 (플레밍과 Kaczmarek 18에서 적응) <ol><li> 2보다 큰 미만 10 구절이 분석에서 사용하기 전에 적절한 미디어 문화 세포. 안정적으로 쥐 한산한-B 단백질을 발현하는 형질 감염되지 않은 HEK-293 세포와 HEK-293 세포는 Leibovitz의 L-15 중간 10 %의 열 불 활성화 된 소 태아 혈청과 항생제로 보충 절반 둘 베코의 수정 된 이글 매체와 반에서 재배된다. 500 ㎍ / ㎖의 네티 (G418)를 안정적으로 여유 채널의 발현을 선택 한산한-B를 표현하는 HEK-293 세포에 첨가된다. 0.25 % 트립신-EDTA 용액으로 요리에서 분리하여 70-90%의 합류 통로 세포. </li></ol> 2. 피브로넥틴 및 오발 부민과 티오 2 384도 광 바이오 센서 플레이트의 세포 외 기질 (ECM) 코팅 <ol><li> 피브로넥틴 ECM 혼합물 및 알부민 블로킹 용액의 조제 <ol><li> fibronect의 작업 솔루션을 준비합니다20.0 ㎖의 PBS에서 파이브로 넥틴의 5 μg / ML의 최종 농도와 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에서. 1.0 ㎎ / ㎖의 주식 농도에서 200 배 희석 20.0 ㎖의 PBS 100 μl를 추가합니다. 피브로넥틴의 작업 솔루션을 준비 후 분주 및 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 멸균 열 불 활성화 알부민의 5 % 주식 솔루션을 준비합니다. 5 % 용액과 무균 조직 배양 등급 물에 알부민을 희석하여 60 ℃에서 30 분 동안 열 불 활성화 실온 및 살균 필터 솔루션 용액을 냉각. 4 ° C에서 5 % 알부민 용액과 상점을 나누어지는 </li><li> PBS로 5 % 스톡 용액을 희석하여 알부민의 2 % 작동 용액을 준비한다. 예, 30.0 ML의 최종 볼륨 PBS의 18.0 ml의 5 % 알부민 원액의 12.0 ML을 추가합니다. </li></ol></li><li> 384도 광 바이오 센서 플레이트 코팅 <ol><li> 20.0 μL / 잘와 티오 2 판을 수화물15 분 동안의 무균 조직 배양 등급 물. 다음 단계는 16 - 채널 피펫으로 수행되어야한다. </li><li> 물론 당 50.0 ㎕의 PBS와 플레이트 1X을 씻으십시오. </li><li> 각 웰에 피브로넥틴 작업 솔루션의 20.0 μl를 추가하고 ECM을 만들 실온에서 2 시간 동안 배양한다. </li><li> 물론 당 50.0 ㎕의 PBS와 플레이트 1X을 씻으십시오. </li><li> 물론 각 알부민 작업 솔루션의 40.0 μl를 추가하고 판을 차단하는 4 ° C에서 밤새 품어. </li><li> 물론 당 50.0 ㎕의 PBS와 판 3 배를 씻으십시오. ECM 코팅 된 플레이트는 최대 48 시간 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 3. 384도 광 바이오 센서 접시에 세포의 파종 <ol><li> 세포에서 성장 미디어를 제거하고 접시에서 세포를 이동시키다 트립신을 추가합니다. 세포를 수집하고 1 분 1,000 XG에 원심 분리기. 성장 미디어 트립신 미디어에 resuspend 세포를 제거합니다. </li><li> 혈구 나 자동화를 사용하여셀 카운터, 세포 농도를 결정한다. </li><li> 배양 중에 증발의 영향을 최소화하기 위해, 웰 당 성장 배지 50.0 μL가 사용될 것이다. 세포를 성장 배지 중에서 50.0 μL의 부피 웰 당 세포의 원하는 수를 달성하기 위해 희석되어야한다. 이 실험을 위해, 1,000 세포 / 웰 바이오 센서에 도금했다. </li><li> 시드 세포가 공기 / 5 % CO 2에서 37 ° C에서 성장 배지에서 하룻밤 배양 할 수 있습니다. </li></ol> 4. RWG 광 바이오 센서 분석을위한 바이오 센서 및 복합 플레이트의 제조 <ol><li> 인큐베이터에서 접시를 제거하고 세포 성장 매체를 제거합니다. 세포 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS)와 1x는 씻으십시오. 각 웰에 HBSS의 25.0 μl를 추가합니다. </li><li> BIND 스캐너에 바이오 센서 플레이트를 놓고 세포가 1 ~ 2 시간 동안 실온으로 평형을 할 수 있습니다. </li><li> 그 리간드가 광고됩니다되는 별도의 복합 플레이트를 준비분석 기간 동안 바이오 센서 판에 공격 한. 이러한 분석은 솔루션 함유 화합물의 25.0 μL은 50.0 μL의 총 볼륨의 바이오 센서 플레이트에 각 웰에 첨가 하였다. 따라서, 용액 중의 화합물 2X 원하는 최종 농도로 제조 하였다. </li></ol> 5. RWG 광 바이오 센서 분석을 수행 <ol><li> 잘 BIND 스캔 소프트웨어를 사용하여 각의 중심 1.5 mm에 4,125 μm의 / 픽셀의 최대 해상도를 사용하여 우물 A1-P12 (SBS 384 - 웰 플레이트의 절반)의 스캐너 시스템과 기준 측정을 가져 가라. 이 기준 검사는 약 30 분 소요됩니다. </li><li> 우물 A1-P12에 대한 각 웰에 복합 솔루션의 25.0 μl를 추가합니다. </li><li> 웰스 A13-P24의 기준 측정을 가져 가라. </li><li> 웰스 A13-P24에 대한 각 웰에 복합 솔루션의 25.0 μl를 추가합니다. </li><li> 우물 A1-P12에 대한 게시물 화합물 첨가 측정을하고, 우물 A13-P24에 대해 반복합니다. </li></ol> 6.BIND보기와 분석 데이터의 (분석) <ol><li> Windows의 기본 측정을​​ 위해 BIND 분석 데이터를 열고, 셀 선택을 가능하게하는 &quot;그리드 편집기&quot;버튼을 클릭합니다. 이 소프트웨어는 사용자가 정의한 그 통계를 계산합니다. </li><li> &quot;셀 찾기&quot;와 &quot;Baseliner&quot;기능을 포함하는 &quot;플러그 - 인&quot;을 엽니 다. &quot;셀 찾기&quot;에서 매개 변수를 설정 세포는 바이오 센서의 배경과 구별되도록. </li><li> 기준 측정을위한 &quot;셀 찾기&quot;데이터가 포함 된 셀의 맵 파일을 내 보냅니다. </li><li> 반복 포스트 화합물뿐만 아니라 데이터에 대한 6.1-6.2 단계를 반복합니다. </li><li> &quot;Baseliner&quot;플러그를 열고 기준 측정에서 세포 맵을 가져옵니다. 이 소프트웨어는 배경과 포스트 화합물 데이터 사이의 PWV의 변화를 계산합니다. </li><li> 세포에 대한 PWV의 평균 변화의 출력은 &quot;Δ 셀 평균&quot;을 선택합니다. 데이터는 마이크로 소프트 EXC로 내보낼 수 있습니다추가 분석을 위해 엘. </li></ol>

<ol><li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHille%2C+B+%22Ion+Channels+of+Excitable+Membranes%22">Ion Channels of Excitable Membranes</a>. , Sinauer Associates. (1992).</li>
<li>Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-conducting+functions+of+voltage-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Non-conducting functions of voltage-gated ion channels.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).</li>
<li>Levitan, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+protein+complexes+associated+with+neuronal+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels.</a> Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).</li>
<li>Shamah, S. M., Cunningham, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+cell-based+assays+using+photonic+crystal+optical+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors.</a> Analyst. 136, 1090-1102 (2011).</li>
<li>Cunningham, B. T., Laing, L. M. icroplate-based <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((label-free+detection+of+biomolecular+interactions%3A+applications+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics.</a> Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).</li>
<li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev%22%5BJournal%5D)">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).</li>
<li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).</li>
<li>Cunningham, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+assays+on+the+BIND+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Label-free assays on the BIND system.</a> J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).</li>
<li>Hessel, A. aO., A, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Theory+of+Wood%27s+Anomalies+on+Optical+Gratings%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Optics%22%5BJournal%5D)">A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings.</a> Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).</li>
<li>Cunningham, B. T., Laing, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+application+of+label-free+detection+assays+in+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advantages and application of label-free detection assays in drug screening.</a> Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).</li>
<li>Lee, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+optical+biosensor%3A+a+tool+for+G+protein-coupled+receptors+pharmacology+profiling+and+inverse+agonists+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Recept.+Signal+Transduct.+Res%22%5BJournal%5D)">Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).</li>
<li>Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+K%2B+channels%2C+Na%2B+is+the+new+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">For K+ channels, Na+ is the new Ca2.</a> Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).</li>
<li>Santi, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+regulation+of+Slick+and+Slack+K%2B+channels+by+neuromodulators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators.</a> J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).</li>
<li>Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slack+and+Slick+K%28Na%29+channels+regulate+the+accuracy+of+timing+of+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons.</a> J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).</li>
<li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+mental+retardation+protein+controls+gating+of+the+sodium-activated+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel.</a> 13, 819-821 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuronal+excitability+by+interaction+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+slack+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels.</a> J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).</li>
<li>Barcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+gain-of-function+KCNT1+channel+mutations+cause+malignant+migrating+partial+seizures+of+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy.</a> Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).</li>
<li>Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+optical+biosensors+to+detect+modulation+of+Slack+potassium+channels+by+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Recept.+Signal+Transduct.+Res%22%5BJournal%5D)">Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).</li>
<li>Nelson, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+diacylglycerol+degradation+to+M1+muscarinic+receptors+by+beta-arrestins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins.</a> Science. 315, 663-666 (2007).</li>
<li>Zhang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Gribbon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+real-life+high-throughput+screening+data%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Evaluating real-life high-throughput screening data.</a> J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).</li>
</ol>

스티븐 M. Shamah는 X - BODY 생명 과학의 직원입니다.

Z 프라임 (Z &#39;) 요소는 높은 처리량 스크리닝 검사 (20)의 품질을 정량화하는 일반적인 통계 방법이며,이 분석에서 GPCR 작용제의 심사 SBS 호환 384 잘 분석에서 발생했기 때문에, 훌륭한을 제공합니다 이 분석 (21)의 안정성과 유효성의 측정. 1 애리조나 &#39;값이 존재하지 않는 표준 편차와 데이터 포인트의 무한한 번호를 이론적으로 최적의 분석을 나타냅니다. 0.5 이하의 소폭 정보를 분석 간주과 0.5 사이의 알파벳 &#39;값은 높은 처리량 검사 목적을위한 훌륭한 분석 간주됩니다. 이 데이터 집합에 대한 긍정적 인 컨트롤로 SFLLR carbachol을 활용하여 계산 Z &#39;값이 분석은 높은 견고하고 얻어진 결과가 높은 중요 나타내는은 각각 0.79 0.81합니다. 384도 광 바이오 센서 플레이트, 세포 파종 및 화합물 첨가의 세포 외 기질 코팅이 실험에서 16 채널 Finnpipette (5-50 μ...

생리 학적으로 중요한 상황에서 살아있는 세포를 검사하는 표적 세포의 생물학적 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. 그러나, 채널과 같은 coimmunoprecipitation 분석법 규제 세포질 단백질 사이의 상호 작용을 조사 분석법은 일반적으로 살아있는 세포의 상호 작용의 시간 경과에 약간의 정보를 제공한다. 현재 셀 기반 분석의 대부분은 그 찬란 태그 단백질의 전위와 같은 특정 세포 이벤트를 측정합니다. 이러한 분석은 잠재적으로 단백질의 동작을 변경하고 대상의 생리 학적 관련성을 줄일 수있다 또한 단백질의 변형을 요구한다. 시스템의 조작을 필요로 세포 활동의 연속 측정을 제공하고 그들의 가장 생리 학적으로 관련 국가 4 세포의 연구를 허용하지 않는 비 침습적 인 세포 기반 분석. 광 바이오 센서를 생산하도록 설계센서 표면에 결합되는 광의 특성에 측정 가능한 변화. 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및 공진 파장 격자 (RWG) 기법을 포함 소멸 파를 이용하는 광 바이오 센서는, 주로, 센서 표면에 고정 생물학적 수용체에 결합하는 분자의 친화도 및 반응 속도를 검출하기 위해 사용되어왔다. 최근 시판 RWG 바이오 센서는 높은 공간 해상도 (최대 3.75 μM / 픽셀) 5에서 센서 표면에 부착 한 세포의 바닥 부 내의 질량 상대적인 변화의 검출을 허용하도록 개발되었다. 이러한 바이오 센서는 세포 부착 및 퍼짐, 독성, 증식 및 G-단백질 결합 수용체 (GPCR에) 포함하여 세포 표면 수용체의 다양한 의해 유도 신호 전달 경로와 같은 자극으로부터 발생 살아있는 세포의 세포막 근처 질량의 변화를 감지 할 수있는 6 . RWG 바이오 센서는 상대적으로 찬 검출바이오 센서 (7)의 150 nm의 사이에서 질량 상대적인 변화의 함수로서 굴절률의 GE. 세포를 바이오 센서에 도금되는 경우, 굴절률의 변화는 바이오 센서에 부착 세포의 변화로 인한 세포의 세포막 근처 질량의 변화를 반영. 이 프로토콜은 RWG 바이오 센서를 사용하여 채널의 단백질 상호 작용의 검출에 대해 설명합니다. RWG 데이터 수집 시스템의 몇 가지 요소로 구성됩니다. X-BODY 생명 과학 BIND 스캐너가이 실험에 사용 되었기 때문에, 우리는 플레이트 리더, 관련 바이오 센서, BIND 스캔 수집 소프트웨어, BIND보기 분석 소프트웨어 8로 구성이 특정 시스템의 구성 요소를 참조해야한다. 광자 결정 바이오 센서는, 광학 바이오 센서를 이하에서 언급 할의주기적인 배열로 구성되어 특정의 빛의 전파를 방지한다 2 또는 3 차원의 유전체 재료파장 및 방향. 광자 결정 구조는 나무의 변종이라는 현상을 기반으로합니다. 처음으로 1902 년에 발견 목재, 이러한 변이는 특히 회절 차수의 세기의 급격한 변동이 소정의 좁은 주파수 대역에서 발생하는 광 회절 격자에 의해 반사되는 빛의 스펙트럼에서 관찰 된 효과이다. 1962 년 Hessel의 및 Oliner 유한 기간의 격자가 서 공명 파장 9를 생성하는 나무의 이상 현상의 새로운 이론을 제시했다. 여기에 설명 된 광 바이오 센서에서 나무의 이상이 흰색 빛으로 자극하는 경우가 파장 만 매우 좁은 밴드 (대표적으로는 850-855 nm의) 반영 RWG 바이오 센서를 생산하는 데 사용됩니다. 개별 바이오 센서는 높은 굴절률 유전체 이산화 티탄 (티오이)의 얇은 층으로 코팅되어 주기적 표면 구조를 가진 저 굴절률 플라스틱 재료로 구성되어있다. 때 biosens또는 광자 결정의 광 격자가 BIND 스캐너에서 분광 광도계로 측정되는 빛의 파장의 좁은 범위를 반영하는 광범위한 파장의 광원으로 조명된다. 반사 된 파장 (피크 파장 값 또는 PWV)의 피크 강도는 그 신호로부터 계산된다. 바이오 센서 표면의 근접성 내의 질량의 증가 또는 감소 (~ 150 nm 정도)의 결과로서 굴절율의 변화에​​ 따라 빛 시프트 PWV. 광 바이오 센서는 생명 과학을위한 표준 협회 (SBS) 이러한 실험에 사용 된 분석을위한 384 - 웰 마이크로 플레이트에 통합됩니다. RWV 바이오 센서는 셀 10 생활에 외인성 신호의 추가에 변화를 감지하는 데 사용됩니다. 세포를 직접 RWG 바이오 센서의 표면 상에 배양하고 굴절 로컬 인덱스의 변화는 특정 자극 치료시 모니터링된다. 바이오 센서의 질량의 변화의 방향이 될 수있다로컬 바이오 센서 근처의 질량 증가로 굴절 결과의 인덱스의 증가는 PWV의 증가로서 측정되기 때문에, 결정. 반대로 질량 감소는 PWV의 감소를 생성한다. 검출 PWV의 변화는 세포 접착의 변화, 단백질 모집 / 해제, 엔도 시토 시스 및 재활용, 세포 외 유출, 세포 사멸 및 세포 골격의 재 배열 등 다양한 세포 사건에서 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 분석은 칼륨 채널 및 다른 세포질 또는 세포 골격 성분 간의 채널 단백질 상호 작용의 변화를 검출 할 수있다. 이벤트는, 그러나, 바이오 센서 근처 ~ 150 nm의 검출 영역 내에서 발생하고, 세포막 근처 연결된 셀의 경우한다. 세포 반응의 취득은 BIND 스캔 소프트웨어와 함께 수행되며 SBS 플레이트의 웰 (384)의 각각의 이미지 표현이 생성된다. 이 시스템은 하나의 셀에있는 이벤트의 검출을 허용 최대 3.75 μM / 화소의 해상도를 가지며,(예 : HEK293 또는 CHO 세포와 같은) 세포 라인 이상 생리학 관련 기본 세포로도 사용할 수 있습니다. BIND View 소프트웨어와 이미지 분석은 개별 세포의 인구 모두에서 세포 반응의 검출을 할 수 있습니다. 바이오 센서는 마이크로 플레이트 384 - 웰 표준 SBS에 통합됨에 따라, 시스템은 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 용이하게 적응할 수있다. 공진 파장 격자 광 바이오 센서 (11)는 이전의 GPCR의 활성화 다음 세포의 세포막 근처 질량의 변화를 감지하기 위해 사용되어왔다. 우리 연구소는 두 나트륨 활성화 (K NA) 칼륨 채널, 슬랙-B와 슬릭 (12)를 복제했다. 둘 다 B 흔들림 매끄러운 채널의 활성이 매우 강력한 단백질 키나제 C (PKC)의 활성화 (13)의 직접적인 영향을받을 것으로 나타났다. 이러한 M1 무스 카린 수용체와 mGluR1 대사성 글루타메이트 R 등 Gα Q의 단백질 결합 수용체의 활성화eceptor, 유력 PKC 활성화를 통해 채널의 활동을 조절한다. 이러한 K 나 채널은 지속적인 신경 자극 동안 적응 올릴 액션 타이밍의 정확도는 14 전위 조절. 여유 채널 FMRP, 허약 한 X 정신 지체 단백질 (15, 16)를 포함하여 세포질 신호 분자의 다양한 상호 작용하는 것으로 알려져있다. 유년기 (MMPSI), 심한 발달 지연 (17) 결과 간질의 조기 발병 형태의 다수의 마이그레이션 부분 발작의 여유 결과 돌연변이.

<table><tbody><tr><td>DMEM, High Glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G-418 Sulfate</td><td>American Bioanalytical AB05057</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>인간 혈장에서 추출한 피브로넥틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>닭 달걀 흰자위의 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5378</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Carbamoylcholine chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4382</td><td></td></tr><tr><td>SFLLR-NH2 트리플루오로아세테이트 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>S8701</td><td></td></tr><tr><td>핀피펫(5-50 &마이크로; l)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>4662090</td><td></td></tr><tr><td>BIND 스캐너 시스템</td><td>X-BODY Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>384웰 TiO2 코팅 플레이트</td><td>X-BODY Biosciences</td><td>TiO-96-CM</td><td></td></tr></tbody></table>

g-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조를 감지하기 위해 라벨이없는 광 바이오 센서의 사용

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

이온 채널을 선택적으로 이온이 플라즈마 막 (1)을 통해 흐르게함으로써 뉴런 및 다른 흥분성 세포 유형의 전기적 특성을 제어한다. 신경 세포의 흥분성을 조절하기 위해, 이온 채널의 생물 리 학적 특성은 종종 이종 체 채널 착물 2,3을 형성하는 채널 자체에 바인딩 신호 단백질 및 분자에 의해 수정된다. 살아있는 세포에서의 상호 작용의 시간 경과에 적은 정보를 제공하면서 채널 및 규정 단백질 사이의 상호 작용을 조사 전통적인 분석은 잠재적으로 단백질의 동작을 변경하고 대상의 생리 학적 관련성을 줄일 수 외인성 라벨을 필요로한다. 이러한 X-BODY 생명 과학 BIND 스캐너 시스템과 광 바이오 센서는, 공명의 변화를 감지하는, 새로운 라벨이없는 기술, 공진 파장 격자 (RWG) 광 바이오 센서를 사용하는 바이오 센서 주변의 빛을 반영합니다. 이 분석은 허용 상대 검출세포 접착의 리간드 유도 변화 확산 독성, 증식 및 세포막 근처 단백질 - 단백질 상호 작용의 변화로 인해 발생하는 바이오 센서의 표면에 부착 한 생세포의 바닥 부 내에 질량 변화. RWG 광 바이오 센서는 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에), 수용체 티로신 키나아제, 및 다른 세포 표면 수용체의 활성화 다음 세포의 세포막 근처 질량의 변화를 감지하기 위해 사용되어왔다. 이온 채널 단백질 상호 작용의 리간드에 의한 변화는이 분석을 사용하여 공부하실 수 있습니다. 이 논문에서, 우리는 한산한-B 나트륨 활성화 칼륨 GPCR에 의해 (K 나) 채널의 변조를 감지하는 데 사용되는 실험 절차를 설명합니다.

한산한-B 안정적 HEK-293 세포를 형질 전환 및 제어 형질 감염되지 않은 HEK-293 세포는 물론 384도, ECM 코팅 RWG 바이오 센서 접시에 1,000 세포 /에 씨앗을 품고 있었다. 바이오 센서의 중앙 1.5 mm 2의 이미지는 4,125 μm의 / 픽셀의 해상도 (그림 1)을 기록했다. 질량 밀도 구배지도는 사전 생성 및 BIND 스캔 소프트웨어와 함께 30 분 후 화합물 첨가 하였다. BIND보기 소프트웨어는베이스 라인 PWV에서 PWV 포스트 화합물의 추가 감산하여 GPCR 작용제 추가시 PWV의 변화를 결정하기 위해 이용되었다. 내인성 M1 무스 카린 수용체 작용제 carbamoylcholine 클로라이드 (카바 콜)가 19 안정적 HEK-293 세포는 PWV의 긍정적 증가 (도 2A)였다 발현 형질 감염되지 않은 제어 HEK-293 및 래트 슬랙-B 모...

광학적 바이오 센서 기술은 살아있는 세포에서 세포막 근처 질량의 변화를 감지 한 개별 세포와 세포 집단 모두에서 세포 반응을 수행 할 수있다. 이 프로토콜은 이러한 접근법을 사용하여 그대로 세포에서 G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조의 검출에 대해서 설명한다.

G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조를 감지하기 위해 라벨이없는 광 바이오 센서의 사용

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

다음 실험의 전반적인 목적은 레이블 프리 공명 파장 구배 광학 바이오센서를 활용하여 칼륨 채널에 의한 G-단백질 결합 수용체의 조절을 검출하는 것입니다. 이를 위해 HEK 2 93 세포와 쥐의 나트륨 활성 칼륨 채널 slack B를 안정적으로 발현하는 HEK 2 93 세포를 384-웰 광학 바이오센서 플레이트에 분주하고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로, 세포막 근처의 질량에 대한 기선 측정을 수행하고 내인성 G-단백질 결합 수용체(GPCR)의 효능제를 첨가합니다. 마지막 단계로, GPCR 활성화로 인한 신호 변화를 측정하고, 이에 대한 칼륨 채널의 조절 정도를 산출합니다.궁극적으로, 이 방법은 G-단백질 결합 수용체와 칼륨 채널 사이의 신호 전달 메커니즘을 정량적으로 측정함으로써 신경과학 및 세포 신호 전달 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 공동 면역침전법(CO)이나 침전 분석법과 같이 채널과 단백질 간의 상호작용을 관찰하기 위해 현재 존재하는 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은 살아있는 세포를 사용하여 분석을 수행할 수 있다는 점입니다. 또한 상호작용하는 단백질의 구조를 변화시킬 수 있는 외인성 표지자의 사용이 필요하지 않습니다.마지막으로, 살아있는 세포 내에서 실제 상호작용을 실시간으로 추적할 수 있습니다. 이 방법은 GPCR과 칼륨 채널 사이의 신호 전달에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 리간드로 유도된 세포 접착 및 퍼짐, 독성, 증식, 이동의 변화로 인한 세포 반응과 혈장 막과 광학 바이오센서 사이의 근접성 변화를 연구하는 데에도 사용될 수 있습니다.이 기술은 채널 단백질에 대한 약물제의 효과를 테스트하기 위한 고속 처리 방법으로 사용될 수 있기 때문에, 많은 채널병증(channelopathies)과 같이 이온 채널 또는 수용체 이상으로 인해 발생하는 질병의 새로운 치료 접근법을 발견하는 데 활용될 가능성이 있습니다. 단백질 상호작용과 관련하여, 저희는 살아있는 세포 내에서 채널 단백질 상호작용을 관찰할 수 있는 분석법 개발이 필요하다는 것을 깨달았을 때 처음으로 이 방법을 사용한다는 아이디어를 얻었습니다.384-웰 광학 바이오센서 플레이트 코팅을 시작하려면, 웰당 20 µL의 멸균 조직 배양 등급 용수를 사용하여 이산화티타늄 플레이트를 15분 동안 수화합니다. 그다음 16채널 피펫을 사용하여 웰당 50 µL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 플레이트를 1회 세척합니다.다음으로, 세포외 기질(ECM)을 형성하기 위해 준비된 fibronectin 작동 용액 20 µL를 각 웰에 넣고 상온에서 2시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 웰당 50 µL의 PBS로 플레이트를 한 번 세척합니다. 그 다음, 준비된 ovalbumin 작동 용액 40 µL를 각 웰에 추가합니다.오발부민(ovalbumin) 결합 후 플레이트를 블로킹하기 위해 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 웰당 50 µL의 PBS로 플레이트를 세 번 세척합니다. ECM이 코팅된 플레이트는 4 °C에서 최대 48시간 동안 보관할 수 있습니다.본문 프로토콜에 설명된 대로 배양한 미절제 HEK 2 93 세포와 slack B를 안정적으로 발현하는 HEK 2 93 세포 모두에서 성장 배지를 제거합니다. 그 다음 트립신을 첨가하여 플레이트에서 세포를 떼어냅니다. 1000 ×g에서 1분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다.트립신 배지를 제거하고 성장 배지로 세포를 재현탁합니다. 혈구계수기(hemocytometer) 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 측정하고, 배양 중 증발에 의한 영향을 최소화하기 위해 세포를 희석하여 웰당 원하는 세포 수를 맞춥니다. 본 실험에서는 성장 배지 50 µL 부피에 웰당 1000 cells가 되도록 합니다.희석된 세포 50 µL를 각 웰에 피펫팅하여 바이오센서에 플레이팅한 후, 부착된 세포를 37 °C, 5% CO2 조건의 성장 배지에서 하룻밤 동안 배양합니다. 공명 파장 구배(RWG) 광학 바이오센서 분석을 준비하기 위해, 배양이 끝난 후 세포에서 성장 배지를 제거합니다.Hank's balanced salt solution으로 세포를 한 번 세척한 다음, 각 웰에 해당 용액 25 µL를 첨가합니다. 바이오센서 플레이트를 바인드 스캐너에 올리고 세포가 상온에서 1~2시간 동안 평형 상태에 도달하도록 둡니다. 그동안, 분석 중에 바이오센서 플레이트에 첨가할 대상 리간드가 담길 별도의 화합물 플레이트를 준비합니다.이 분석법들을 위해, 화합물이 포함된 용액 25 µL를 바이오센서 플레이트의 각 웰에 첨가하여 총 부피를 50 µL로 맞추었습니다. RWG 광학 바이오센서 분석을 수행하려면, 384-웰 플레이트의 절반에 해당하는 A 1부터 P 12까지의 웰을 스캐너 시스템으로 베이스라인 측정하십시오. Bind scan 소프트웨어를 사용하여 각 웰의 중앙 1.5 mm 영역에 대해 픽셀당 3.75 µm의 최대 해상도를 적용하며, 이 베이스라인 스캔에는 약 30분이 소요됩니다.그런 다음 A 1부터 P 12까지의 각 웰에 화합물 용액 25 µL를 추가합니다. 다음으로 A 13부터 P 24까지의 웰에 대해 기저치 측정을 수행합니다. 이들 웰의 기저치를 측정한 후, A 13부터 P 24까지의 각 웰에 화합물 용액 25 µL를 추가합니다.마지막 단계로, A1부터 P12까지의 웰에 대해 화합물 처리 후 측정값을 측정하고, A13부터 P24까지의 웰에 대해 동일하게 반복합니다. 분석 데이터를 분석하려면, 윈도우에서 기준선 측정값에 대한 bind assay 데이터를 열고 그리드 에디터 버튼을 클릭하여 셀 선택을 활성화합니다. 소프트웨어가 사용자가 정의한 관심 지표를 계산하며, 플러그인 내의 cell finder와 baseline 또는 function set 파라미터를 열어 바이오센서의 배경과 셀을 구별할 수 있도록 설정합니다.기준 측정치(baseline measurement)에 대한 셀 파인더(cell finder) 데이터가 포함된 셀 맵 파일을 내보내십시오. 화합물 첨가 후 데이터에 대해서도 이 단계를 반복하십시오. 그런 다음 기준선 또는 플러그인을 열고 기준 측정치에서 셀 맵을 가져오십시오.소프트웨어가 배경 데이터와 화합물 처리 후 데이터 사이의 피크 파장 값(PWV) 변화량을 계산합니다. 세포의 평균 PWV 이동 값을 출력하려면 delta cell mean을 선택하십시오. 이후 데이터를 Microsoft Excel로 내보내어 추가 분석을 수행할 수 있습니다.Slack b가 안정적으로 형질전환된 HEK 2 93 세포와 대조군인 미절제 HEK 2 93 세포를 384웰 ECM 코팅 RWG 바이오센서 플레이트에 웰당 1000개씩 분주하였으며, 화합물 첨가 전과 첨가 30분 후에 bind scan을 통해 질량의 밀도 구배 맵을 생성하였다.빨간색으로 표시된 소프트웨어 영역은 세포로 식별된 픽셀을 나타내며, 노란색 선은 회색 플레이트 배경과 구별되는 개별 세포를 나타냅니다. GPCR 작용제 투여에 따른 PWV의 변화를 결정하기 위해 bind view 소프트웨어를 사용하여 기저 PWV에서 화합물 투여 후 PWV를 뺐습니다. 이는 색상 그라데이션으로 표시되며, 빨간색은 피크 파장 값의 양의 변화를, 파란색은 변화 없음을 나타냅니다.carbahol에 대한 내인성 M1 무스카린 수용체를 미전환 대조군 HEK 2 93 세포와 slack B를 안정적으로 발현하는 HEK 2 93 세포 모두에 적용한 결과, 대조군 세포와 비교하여 피크 파장 값이 양의 방향으로 증가하는 것으로 나타났습니다. slack B가 형질전환된 세포에서 피크 파장 값의 증가 폭이 더 컸습니다. 내인성 GPCR 프로테아제 활성 수용체 1에 대해 작용제 활성을 나타내는 S-F-L-L-R NH 두, tri fluoro acetate salt 및 C-말단 트롬빈 수용체 활성화 펩타이드 펜타펩타이드 또한 미전환 세포와 slack B 형질전환 세포에서 서로 다른 반응을 보였습니다.이러한 결과는 Slack B 채널의 존재가 HEK 세포 내 내인성 G PCR 활성화 시 발생하는 PWV의 변화를 유의하게 증가시킨다는 것을 보여주며, 채널 단백질 상호작용을 연구하기 위해 이 분석법을 사용하는 것이 가능하다는 것을 입증합니다. 이 비디오를 시청한 후, 여러분은 무표지 광학 바이오센서 분석법을 개발하고 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면, 본 절차를 수행하는 동안 세포와 시약을 세심하게 준비했을 경우 이틀에 걸쳐 수행할 수 있습니다.분주할 세포 수, 리간드 배양 시간 등과 같은 분석 파라미터는 세포주마다 최적화해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차를 수행한 후에는 R 및 AI와 같은 다른 방법을 사용하여 신호의 변화를 관찰하는 데 어떤 특정 단백질이 필요한지 결정할 수 있습니다. 인간 세포 배양 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 생물안전 작업대(biosafety hood) 내에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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연구

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G 단백질 문이 안쪽 정류기 K와 상호 작용하는 약물을 식별을위한 실시간 검사...

GIRK 채널의 변조기를 식별을위한 형광 검사 분석

출처: Josiah, S. S., et al. 웨스턴 블로팅을 이용한 Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2의 기능 및 활성에 관한 연구.  J. Vis. 특급. (2022). 이 동영상은 세포 용해물에서 인산화된 염화칼륨 공동수송체 2(KCC2) 단백질을 검출하고 정량화하는 단계를 보여줍니다. 이 과정에는 인산화된 KCC2를 분리하기 위한 면역침전과 분리된 단백질을 정량화하기 위한 화학발광이 포함됩니다.

Western Blotting을 통한 Phosphorylated Neuronal Potassium-Chloride Cotransporter 2 검출

간 셀룰러 통신은 내부와 세포 외부의 각종 생리 활성 조절에 중요​​하다. 이 논문은 단일 세포 분비물의 시공간적 특성을 측정하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이를 달성하기 위해, 종합 접근법 생균 이미징 감지 라벨없는 nanoplasmonic을 통합하는 데 사용된다.

단일 세포 분비물의 공간 - 시간 영상의 레이블이없는 기술

속됨 부정맥은 종종 하나 이상의 이온 채널의 표면에 전달 변경 돌연변이에 의해 야기된다. 여기서는 TSA-201 세포에서 발현 된 재조합 이온 채널의 상대적 총 세포 표면 단백질 발현의 정량 분석을 제공하기 위해 유세포 적응.

유동 세포 계측법을 사용하여 재조합 이온 채널의 상대 셀 표면 및 전체 식의 결정

설명된 세포 분석 결과 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)의 식별을 위해 설계 되었습니다-상호 작용 하거나 에이전트는 억제 자극, 경쟁적으로 또는 allosterically, 세포내 캘리포니아2 + 릴리스 CXCR4 활성화에 의해 시작.

운동 형광 기반 Ca2 + 동원 분석 결과 G 단백질 결합 된 수용 체 주 작동 근, 길 항 근, 그리고 Allosteric 변조기를 식별 하

여기에 프로토콜 작은 분자 지질 ligand phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (핍2)을 정제 hEAG1 이온 채널 단백질의 상호 작용을 설명합니다. 측정 씨 소설 작은 분자 이온 채널 ligand 심사에 대 한 잠재적인 방법이 될 수 보여 줍니다.

바이오-레이어 간섭계 분석 결과 의해 작은 분자와 이온 채널 단백질의 상호 작용 활동을 캡처

이 프로토콜은 라벨이 없는 임피던스 측정을 사용하여 단일 마이크로 전극에서 성장한 단일 세포 층으로부터 작용제 유발 GPCR 활성화에 대한 전체 용량 응답 관계를 실시간으로 기록하는 것을 보여줍니다. 새로운 도징 방식은 시간 해결 의 손실없이 처리량을 크게 증가시킵니다.

라벨없는 임피던스 기반 GPCR 분석에서 처리량 증가를위한 단계별 투약 프로토콜

이 프로토콜은 세포 환경에서 실시간으로 수용체에 대한 아데닌 뉴클레오티드 결합을 측정하는 방법을 제시합니다. 결합은 트리니트로페닐 뉴클레오티드 유도체와 비표준 형광 아미노산으로 표지된 단백질 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)로 측정됩니다.

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

이 작업에서는 재조합 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에서 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 384웰 플레이트에 대한 고처리량 세포 내 칼슘 형광 분석에 대해 설명합니다. 표적, 소열 진드기, Rhipicephalus microplus 의 키닌 수용체는 CHO-K1 세포에서 발현됩니다. 이 분석은 하나의 "이중 첨가" 분석에서 동일한 세포를 사용하여 작용제와 길항제를 식별합니다.

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

이 프로토콜은 G 단백질 결합 수용체 리간드 자극 시 살아있는 HEK293 세포에서 G 단백질 활성화를 실시간으로 측정하기 위한 BRET 기반 바이오센서의 사용을 설명합니다. 여기서, β2-아드레날린성 수용체와 칸나비노이드 1형 수용체는 여러 G 단백질 아형과 다양한 GPCR에 걸쳐 센서의 효율성을 입증하는 예로 사용됩니다.

살아있는 세포에서 G 단백질 결합 수용체 활성을 측정하기 위한 BRET 기반 G 단백질 바이오센서

배우세요 라벨 없는 광학 바이오센서를 활용하여 G-단백질 결합 수용체에 의한 칼륨 채널 변조를 HEK 293 세포에서 실시간으로 정량 측정하는 방법을. 이 기술은 신경과학 및 세포 신호 전달 연구에 활용됩니다.

G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조를 감지하기 위해 라벨이없는 광 바이오 센서의 사용

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