G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조를 감지하기 위해 라벨이없는 광 바이오 센서의 사용

다음 실험의 전반적인 목적은 레이블 프리 공명 파장 구배 광학 바이오센서를 활용하여 칼륨 채널에 의한 G-단백질 결합 수용체의 조절을 검출하는 것입니다. 이를 위해 HEK 2 93 세포와 쥐의 나트륨 활성 칼륨 채널 slack B를 안정적으로 발현하는 HEK 2 93 세포를 384-웰 광학 바이오센서 플레이트에 분주하고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로, 세포막 근처의 질량에 대한 기선 측정을 수행하고 내인성 G-단백질 결합 수용체(GPCR)의 효능제를 첨가합니다. 마지막 단계로, GPCR 활성화로 인한 신호 변화를 측정하고, 이에 대한 칼륨 채널의 조절 정도를 산출합니다.

궁극적으로, 이 방법은 G-단백질 결합 수용체와 칼륨 채널 사이의 신호 전달 메커니즘을 정량적으로 측정함으로써 신경과학 및 세포 신호 전달 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 공동 면역침전법(CO)이나 침전 분석법과 같이 채널과 단백질 간의 상호작용을 관찰하기 위해 현재 존재하는 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은 살아있는 세포를 사용하여 분석을 수행할 수 있다는 점입니다. 또한 상호작용하는 단백질의 구조를 변화시킬 수 있는 외인성 표지자의 사용이 필요하지 않습니다.

마지막으로, 살아있는 세포 내에서 실제 상호작용을 실시간으로 추적할 수 있습니다. 이 방법은 GPCR과 칼륨 채널 사이의 신호 전달에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 리간드로 유도된 세포 접착 및 퍼짐, 독성, 증식, 이동의 변화로 인한 세포 반응과 혈장 막과 광학 바이오센서 사이의 근접성 변화를 연구하는 데에도 사용될 수 있습니다.

이 기술은 채널 단백질에 대한 약물제의 효과를 테스트하기 위한 고속 처리 방법으로 사용될 수 있기 때문에, 많은 채널병증(channelopathies)과 같이 이온 채널 또는 수용체 이상으로 인해 발생하는 질병의 새로운 치료 접근법을 발견하는 데 활용될 가능성이 있습니다. 단백질 상호작용과 관련하여, 저희는 살아있는 세포 내에서 채널 단백질 상호작용을 관찰할 수 있는 분석법 개발이 필요하다는 것을 깨달았을 때 처음으로 이 방법을 사용한다는 아이디어를 얻었습니다.

384-웰 광학 바이오센서 플레이트 코팅을 시작하려면, 웰당 20 µL의 멸균 조직 배양 등급 용수를 사용하여 이산화티타늄 플레이트를 15분 동안 수화합니다. 그다음 16채널 피펫을 사용하여 웰당 50 µL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 플레이트를 1회 세척합니다.

다음으로, 세포외 기질(ECM)을 형성하기 위해 준비된 fibronectin 작동 용액 20 µL를 각 웰에 넣고 상온에서 2시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 웰당 50 µL의 PBS로 플레이트를 한 번 세척합니다. 그 다음, 준비된 ovalbumin 작동 용액 40 µL를 각 웰에 추가합니다.

오발부민(ovalbumin) 결합 후 플레이트를 블로킹하기 위해 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 웰당 50 µL의 PBS로 플레이트를 세 번 세척합니다. ECM이 코팅된 플레이트는 4 °C에서 최대 48시간 동안 보관할 수 있습니다.

본문 프로토콜에 설명된 대로 배양한 미절제 HEK 2 93 세포와 slack B를 안정적으로 발현하는 HEK 2 93 세포 모두에서 성장 배지를 제거합니다. 그 다음 트립신을 첨가하여 플레이트에서 세포를 떼어냅니다. 1000 ×g에서 1분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다.

트립신 배지를 제거하고 성장 배지로 세포를 재현탁합니다. 혈구계수기(hemocytometer) 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 측정하고, 배양 중 증발에 의한 영향을 최소화하기 위해 세포를 희석하여 웰당 원하는 세포 수를 맞춥니다. 본 실험에서는 성장 배지 50 µL 부피에 웰당 1000 cells가 되도록 합니다.

희석된 세포 50 µL를 각 웰에 피펫팅하여 바이오센서에 플레이팅한 후, 부착된 세포를 37 °C, 5% CO2 조건의 성장 배지에서 하룻밤 동안 배양합니다. 공명 파장 구배(RWG) 광학 바이오센서 분석을 준비하기 위해, 배양이 끝난 후 세포에서 성장 배지를 제거합니다.

Hank's balanced salt solution으로 세포를 한 번 세척한 다음, 각 웰에 해당 용액 25 µL를 첨가합니다. 바이오센서 플레이트를 바인드 스캐너에 올리고 세포가 상온에서 1~2시간 동안 평형 상태에 도달하도록 둡니다. 그동안, 분석 중에 바이오센서 플레이트에 첨가할 대상 리간드가 담길 별도의 화합물 플레이트를 준비합니다.

이 분석법들을 위해, 화합물이 포함된 용액 25 µL를 바이오센서 플레이트의 각 웰에 첨가하여 총 부피를 50 µL로 맞추었습니다. RWG 광학 바이오센서 분석을 수행하려면, 384-웰 플레이트의 절반에 해당하는 A 1부터 P 12까지의 웰을 스캐너 시스템으로 베이스라인 측정하십시오. Bind scan 소프트웨어를 사용하여 각 웰의 중앙 1.5 mm 영역에 대해 픽셀당 3.75 µm의 최대 해상도를 적용하며, 이 베이스라인 스캔에는 약 30분이 소요됩니다.

그런 다음 A 1부터 P 12까지의 각 웰에 화합물 용액 25 µL를 추가합니다. 다음으로 A 13부터 P 24까지의 웰에 대해 기저치 측정을 수행합니다. 이들 웰의 기저치를 측정한 후, A 13부터 P 24까지의 각 웰에 화합물 용액 25 µL를 추가합니다.

마지막 단계로, A1부터 P12까지의 웰에 대해 화합물 처리 후 측정값을 측정하고, A13부터 P24까지의 웰에 대해 동일하게 반복합니다. 분석 데이터를 분석하려면, 윈도우에서 기준선 측정값에 대한 bind assay 데이터를 열고 그리드 에디터 버튼을 클릭하여 셀 선택을 활성화합니다. 소프트웨어가 사용자가 정의한 관심 지표를 계산하며, 플러그인 내의 cell finder와 baseline 또는 function set 파라미터를 열어 바이오센서의 배경과 셀을 구별할 수 있도록 설정합니다.

기준 측정치(baseline measurement)에 대한 셀 파인더(cell finder) 데이터가 포함된 셀 맵 파일을 내보내십시오. 화합물 첨가 후 데이터에 대해서도 이 단계를 반복하십시오. 그런 다음 기준선 또는 플러그인을 열고 기준 측정치에서 셀 맵을 가져오십시오.

소프트웨어가 배경 데이터와 화합물 처리 후 데이터 사이의 피크 파장 값(PWV) 변화량을 계산합니다. 세포의 평균 PWV 이동 값을 출력하려면 delta cell mean을 선택하십시오. 이후 데이터를 Microsoft Excel로 내보내어 추가 분석을 수행할 수 있습니다.

Slack b가 안정적으로 형질전환된 HEK 2 93 세포와 대조군인 미절제 HEK 2 93 세포를 384웰 ECM 코팅 RWG 바이오센서 플레이트에 웰당 1000개씩 분주하였으며, 화합물 첨가 전과 첨가 30분 후에 bind scan을 통해 질량의 밀도 구배 맵을 생성하였다.

빨간색으로 표시된 소프트웨어 영역은 세포로 식별된 픽셀을 나타내며, 노란색 선은 회색 플레이트 배경과 구별되는 개별 세포를 나타냅니다. GPCR 작용제 투여에 따른 PWV의 변화를 결정하기 위해 bind view 소프트웨어를 사용하여 기저 PWV에서 화합물 투여 후 PWV를 뺐습니다. 이는 색상 그라데이션으로 표시되며, 빨간색은 피크 파장 값의 양의 변화를, 파란색은 변화 없음을 나타냅니다.

carbahol에 대한 내인성 M1 무스카린 수용체를 미전환 대조군 HEK 2 93 세포와 slack B를 안정적으로 발현하는 HEK 2 93 세포 모두에 적용한 결과, 대조군 세포와 비교하여 피크 파장 값이 양의 방향으로 증가하는 것으로 나타났습니다. slack B가 형질전환된 세포에서 피크 파장 값의 증가 폭이 더 컸습니다. 내인성 GPCR 프로테아제 활성 수용체 1에 대해 작용제 활성을 나타내는 S-F-L-L-R NH 두, tri fluoro acetate salt 및 C-말단 트롬빈 수용체 활성화 펩타이드 펜타펩타이드 또한 미전환 세포와 slack B 형질전환 세포에서 서로 다른 반응을 보였습니다.

이러한 결과는 Slack B 채널의 존재가 HEK 세포 내 내인성 G PCR 활성화 시 발생하는 PWV의 변화를 유의하게 증가시킨다는 것을 보여주며, 채널 단백질 상호작용을 연구하기 위해 이 분석법을 사용하는 것이 가능하다는 것을 입증합니다. 이 비디오를 시청한 후, 여러분은 무표지 광학 바이오센서 분석법을 개발하고 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면, 본 절차를 수행하는 동안 세포와 시약을 세심하게 준비했을 경우 이틀에 걸쳐 수행할 수 있습니다.

분주할 세포 수, 리간드 배양 시간 등과 같은 분석 파라미터는 세포주마다 최적화해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차를 수행한 후에는 R 및 AI와 같은 다른 방법을 사용하여 신호의 변화를 관찰하는 데 어떤 특정 단백질이 필요한지 결정할 수 있습니다. 인간 세포 배양 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 생물안전 작업대(biosafety hood) 내에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.