세 가지 차원 문화 : 유방 세포의 악성 변형 대 일반 선포 건축을 연구하는 도구

이 절차의 전반적인 목표는 양성 유방 표현형과 악성 유방 표현형을 구별하는 수단으로 3차원 배양 시스템을 활용하는 것입니다. 이것은 먼저 8개의 웰 챔버 슬라이드에서 성장 인자 감소 마트리겔 층에 대조군 및 실험 세포를 삼중으로 도금하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 4일마다 2%GFR 마트리겔로 신선하고 완전한 배지 변화를 주어 아시닌과 같은 콜로니가 10-15일 동안 자랄 수 있도록 하는 것입니다.

다음으로, 3D로 성장한 군체와 같은 aser의 위상차 이미지는 5x 해상도에서 획득됩니다. 마지막 단계는 관련 분자 마커를 사용하여 면역 세포 화학 분석을 위해 aser like culture를 처리한 다음 C에서 중간 부분의 콜로니와 같은 두 개의 immuno stain aser에 대한 컨포칼 이미지를 획득하는 것입니다. 궁극적으로, 3D 배양에서 성장한 세포의 위상차 및 컨포칼 이미지는 세포 표현형 및 분자 변화를 식별하여 양성 유방 세포와 악성 세포를 구별하는 데 사용됩니다.

2차원 배양, 침입 또는 이동 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 양성 유방의 조직 구조와 악성 변형 중 조직 상실을 다시 요약할 수 있다는 것입니다. 따라서 이 기술은 양성 유방 세포와 악성 유방 세포를 구별하는 데 효과적으로 사용될 수 있습니다. 이 방법은 세포 표현형에 대한 신호 전달 경로의 결함과 같은 유방암 분야의 주요 질문에 답하고 새로운 발암성 및/또는 종양 억제 경로를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

실험을 시작하려면 성장 인자 감소 또는 GFR 마트리겔을 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 해동합니다. 다음으로, 전체 HME 매체를 섭씨 37도에서 예열하고 얼음 위에 8웰 챔버 슬라이드를 놓아 냉각합니다. 40마이크로리터의 GFR Matrigel을 사전 냉각된 슬라이드의 각 웰 중앙에 추가합니다.

P 200 피펫 팁을 사용하여 겔을 최대한 고르게 펴 바르되, 거품이 생기거나 과도하게 펴지는 것을 피하면 반월상 연골 모양이 생깁니다. 그런 다음 matri 젤이 트립신 눈, HME 세포를 응고시키는 동안 37 섭씨 온도와 5%CO2에 활주를 배양해서 matri 젤을 고형화하고, 그 후에 15 milliliter 관에서 그(것)들을 모으고 4 분 동안 150 시간 중력에 세포를 회전시키고, 세포를 세고 12, 밀리리터 당 500의 세포에 묽게 하십시오. 완전한 배지에서 GFR 마트리겔을 2%의 최종 농도로 세포 현탁액에 첨가하고 사전 코딩된 챔버 슬라이드의 각 웰에 400마이크로리터의 용액을 추가합니다.

그런 다음 슬라이드를 CO2 완충 인큐베이터에 넣습니다. 15일 동안 4일마다 미디어를 완전한 새 미디어로 교체하십시오. 억제제 연구의 경우, 도금 시 완전한 배지에 소분자 억제제를 추가한 다음, 3일마다 억제제로 보충된 새로운 배지 교체를 통해 각 치료 세트에 대해 세포 성장 및 삼중화를 시작합니다.

슬라이드 시프터와 컴퓨터에 부착된 위상차 현미경을 사용하여 각 웰의 aser 구조에 대한 위상차 이미지를 5배 해상도로 촬영합니다. 슬라이드를 한 프레임에서 다른 프레임으로 이동하여 챔버 슬라이드의 전체 웰을 넓게 덮어 이미지를 촬영합니다. aser 구조의 총 수, 단일 원형 평면 asinine의 수, 다중 aser 구조 또는 조직이없는 무계획적으로 성장하는 구조의 수를 계산합니다.

그리고 발산 분기 과정을 통해 단일 원형 평면 aser 구조와 악성 구조의 비율을 계산하고 정보를 플롯합니다. 세로 막대형 그래프로. 쌍을 이루지 않은 쌍을 이루지 않은 학생 T 검정으로 유의성을 계산합니다.

함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 면역형광 염색을 위한 시약을 준비합니다. 다음으로, P 200 피펫을 사용하여 컨디셔닝된 매체를 조심스럽게 흡입합니다. 그런 다음 ASIN 또는 구조를 갓 준비한 2% 파라 포름알데히드로 고정 후 실온에서 20분 동안 고정하고 섭씨 4도에서 10분 동안 0.5% 트리튼 X 100으로 세포를 투과시킵니다.

그런 다음 100mm 글리신으로 배양물을 3회 세척할 때마다 10-15분 동안 세척합니다. 다음으로, 실온에서 1시간 동안 기본 블록 버퍼의 셀을 차단합니다. 그런 다음 1 차 블록 완충액에서 염소 안티 마우스 팹 2 단편의 밀리리터 당 20 마이크로 그램으로 배양물을 배양하고, 30 분 동안 두 번째 차단 용액이라고도하며 matrigel에서 아미노 반응 마우스 IgG 종을 차단합니다.

차단 후 2차 차단 용액에 1차 항체가 포함된 세포를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 면역형광 완충액으로 세포를 세 번 세척하거나 세척할 때마다 10-15분 동안 부드럽게 흔들어 완충제를 세척합니다. 그런 다음 형광 접합 2차 항체로 세포를 if F 완충액에서 45분 동안 배양합니다.

다음으로, if F 버퍼와 부드러운 흔들림으로 각각 10분 동안 세포를 세 번 세척합니다. 핵을 시각화하기 위해 퇴색 방지 시약이 포함된 DPI로 슬라이드를 장착합니다. 슬라이드를 실온에서 밤새 건조시키십시오.

그런 다음 마트리겔 상부에서 자라는 세포의 집락 중간 부분과 아스너 구조의 전체 길이에 걸쳐 일련의 광학 절편을 획득하여 DPI 염색된 HME 제어 및 C CN 6개의 녹다운 세포의 공초점 이미지를 5일째에 획득하면 넉다운 세포가 조직화되어 있지 않음을 보여줍니다. 15일째에 대조 세포는 분화된 ASIN 또는 구조와 녹다운 세포에서 갈라지는 잘 정의된 내강으로 성장이 정지되며, 이는 침습적 분지 및 세뇨관 표현형을 나타냅니다. 면역형광 염색은 laminin v alpha six integrin 및 ECA herrin의 발현 상실을 보여주며, 이는 각각 기저막의 파괴, 기저 극성 손실 및 세포 세포 접촉의 손실을 나타냅니다.

악성 세포에서 대조 세포는 GM one 30 및 eca의 alpha six integrin 정점 발현의 asinine 기저 발현 주위에 온전한 층을 표시합니다. 여기 세포 세포 접합부에서, CCN 6 녹다운 HME 세포의 악성 표현형은 정제 된 재조합 인간 CCN 6 단백질 2 전이성 유방 세포주, 일부 1 49 및 M-D-A-M-B 2 31의 외인성 처리로 역전되었다. P38 맵 키나아제 억제제, SB 2 0 3 8 50 및 SB 2 0 2 1 90으로 치료하여 악성 행동을 감소시켰습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 3D 배양에서 유방 세포를 성장시키는 방법과 양성 유방 세포 표현형과 악성 유방 세포 표현형을 구별하기 위한 판독값으로 matrigel의 sino like growth를 효과적으로 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.