Name: 세 가지 차원 문화 : 유방 세포의 악성 변형 대 일반 선포 건축을 연구하는 도구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 배우세요 3차원 배양 시스템을 이용하여 양성과 악성 유방 세포 표현형을 구분하는 방법을. 이 기술은 면역세포화학 분석과 공초점 현미경을 통해 조직 구조와 분자 변화를 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 NIH 보조금 R01 CA107469, R01 CA125577 및 CG KLEER, 미시간의 암 센터 지원 대학에 U01CA154224에 의해 지원되었다.

1. 재료의 준비 및 문화 미디어 <ol><li> 4 ° CO / N.에 (GFR) 리겔 감소 해동 성장 인자 </li><li> 37 ° C.에 필요한 세포주에 대한 완벽한 미디어를 따뜻하게 MCF10A-ATCC는 미디어를 지정; HME-햄 F-12 배지는 5 % 소 태아 혈청, 1 ㎍ / ㎖의 하이드로 코르티손, 5 ㎍ / ㎖의 인슐린, 10 ng의 / ㎖의 표피 성장 인자, 및 100 NG / ㎖ 콜레라 독소로 보충; 5 % FBS, 2 ㎍ / ㎖의 하이드로 코티손, 5 ㎍ / ml의 인슐린 보충 SUM149 햄의 F-12 미디어; 및 MDA-MB-231-10% FBS-DMEM </li><li> 얼음에 8 잘 챔버 슬라이드를 Precool. </li><li> 조직 문화 후드 및 용품을 준비합니다. </li></ol> 8 잘 회의소 슬라이드 2. 3 차원 문화 <ol><li> 코트 각 GFR 마트 리젤의 40 μL와 8 아니라 슬라이드의 잘. 슬라이드의 중앙에 리겔을 추가 한 다음 P200 피펫 팁을 사용하여 확산. 거품을 피하고으로 이어질 수있는 overspreading, 가능한 한 균일 확산을 시도메 니스 커스 (meniscus)를 형성. </li><li> 5 % CO 2에서 37 ° C에서 슬라이드를 품어. 리겔이 응고하는 동안, 세포를 Trypsinize 수집하고 4 분 동안 조직 문화 원심 분리기 150 XG에 스핀. </li><li> 세포를 계산하고 각각의 세포주의 완전한 미디어에 12,500 세포 / ml로 희석. 2 %에 GFR 마트 리겔을 추가하고 리겔 프리 코트 챔버 슬라이드의 각 웰에 400 μl를 추가합니다. </li><li> CO 2 배양기에서 슬라이드를 품어. 십오일 때까지 매 4 일째 신선한 전체 미디어 변경을 제공합니다. </li><li> GFR 마트 리겔에 세포 성장 동안 억제제의 연구는 3 일마다 억제제 보충 된 신선한 미디어 변화이어서 도금시 완전한 미디어 소분자 억제제를 추가 들어 : 약리학 억제제로 처리. </li><li> 정제 된 단백질과 치료 : <ol><li> 셀 플레이트 다음은 2.1-2.3 단계를 반복합니다. 문화가 혈청 starvati 다음 4 일 동안 성장 할 수 있도록 허용16 시간 동안에. </li><li> 5 일에, FBS는 혈청에 굶주린 세포에 용지를 보충 0.1 %에서 정제 된 단백질의 적절한 농도로 세포를 처리합니다. 이일 후 정제 된 단백질과 신선한 미디어 변화를 준다. </li><li> 10 일째에 완전한 HME 매체와 에어컨 미디어를 교체합니다. 문화가 다른 5 일 동안 성장 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 리겔에 성장 선포 구조의 면역 형광 염색 : <ol><li> 2 % 파라 포름 알데히드, 0.5 % 트리톤 X-100 및 1X PBS, pH 7.4의 100 mM의 글리신을 준비합니다. 0.1 % 소 혈청 알부민, 0.2 % 트리톤 X-100, 0.05 % 트윈 -20을 함유하는 1X PBS로 구성 면역 버퍼 (버퍼 IF)를 준비한다. </li><li> 주의 깊게 에어컨 미디어를 대기음하는 P200 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 20 분 동안 실온 (RT)에서 2 % 갓 준비 파라 포름 알데히드로 선포 구조를 수정. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 0.5 % 트리톤 X-100 세포를 투과 </li><li> 문화를 씻으의 세 100 mM의 글리신, 각각의 세척을위한 10 ~ 15 분 타임스. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 기본 블록 호출하면 버퍼의 10 % 염소 혈청과 세포를 차단합니다. </li><li> 20 ㎍ / ㎖의 염소 항 마우스 F (AB &#39;) 30 분 기본 블록 버퍼에있는 조각과 문화를 품다. 이 단계는 매트 리겔에서 면역 마우스 IgG의 종을 차단하는 것이 중요하다. </li><li> 두 번째 차단 솔루션 1 차 항체와 부화 4 ° C에서 (기본 블록 20 ㎍ / ㎖의 염소 항 마우스 F (ab &#39;) 2 단편) O / N </li><li> 15 분 부드러운 요동과 각 IF 버퍼로 3 회 씻는다. </li><li> 45 분 IF 버퍼에 형광 복합 이차 항체와 부화. </li><li> 10 분 동안 세척 배 부드러운 요동과 IF 버퍼 각. </li><li> 핵을 시각화하기 위해 DAPI를 포함하는 안티 - 페이드 시약과 슬라이드를 장착합니다. </li><li> 슬라이드는 실온에서 O / N을 건조하도록 허용합니다. </li><li> 이미지 수집 : 식민지 마일의 공 촛점 이미지 획득리겔의 상단에 성장 세포의 dsection. 자세한 내용은 Z의 적층하여 포상 구조의 전체 길이에 걸쳐 광 부분의 시리즈를 얻기. </li></ol></li></ol> 3. 면역 블롯 2 잘 회의소 슬라이드에서 3 차원 문화 <ol><li> 얼음이 잘 챔버 슬라이드를 Precool. 단계에 따라 2.1-2.4 리겔의 160 μL와 2 - 잘 챔버 슬라이드, 예를 들면 코트 시약을 확장 셀 / 리겔의 1.6 ml의 2 - 웰 슬라이드의 각 웰에 혼합을 추가합니다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 상업적으로 이용 가능한 3D 배양 세포 수확 키트를 사용하여 리겔에서 선포 구조를 수확. </li><li> 배에서 4 ° C.에 precool하는 세포 세척 및 세포 수확 버퍼를 희석 리겔의 세척 및 쫓아 내기 얼음에 수행되어야한다. </li><li> 셀 세척 버퍼를 사용하여 3 배 선포 구조를 씻으십시오. </li><li> 세포 수확 BU를​​ 사용하여 15 ㎖의 원심 분리기 튜브로 선포 세포를 수집ffer 4 ℃에서 로커에 30 분 인큐베이션 1 ㎖ 피펫 잘 현탁액을 섞는다. 이 작은 조각의 리겔을 중단하고 세포 수확 버퍼에있는 세포의 대부분을 해제합니다. </li><li> 문화 원심 분리기 200 XG에서 세포 펠렛. P200 피펫 팁과 펠렛 세포에서 하이드로 겔의 떠있는 레이어를 제거합니다. </li><li> 키트 구비 SDS 샘플 버퍼 용 해물을 재현 탁. RIPA 용해 완충액을 사용할 수도있다. </li></ol> 악성 대 양성 유방 표현형의 4. 정량 <ol><li> 단계 2.1-2.4 다음 각 처리 세트에 대한 삼중의 세포를 성장. </li><li> 5X 또는 슬라이드 시프터 및 컴퓨터에 연결된 위상차 현미경을 이용하여 10 배의 해상도를 각 웰로부터 포상 구조의 위상차 이미지를 가라. 한 프레임에서 다른 프레임으로 슬라이드를 이동하고, 따라서 챔버 슬라이드의 전체를 잘 커버하여 이미지를 가져 가라. </li><li> 포상 구조의 전체 개수를 세어한 라운드 플랫 선포 세포와 multiacinar 구조 나 조직을 부족 우연히 성장 구조의 수와 그것에서 나오는 분기 프로세스와 수. </li><li> 한 라운드 플랫 선포 구조에 대 악성 구조의 비율 및 열 그래프로 플롯을 계산합니다. 학생의 T-테스트에서 중요성을 계산합니다. </li></ol>

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<li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype%2C+gene+expression%2C+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8, 1-11 (2013).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

우리는 여기에서 재구성 기저막에 유방 상피 세포의 세 가지 차원의 문화와 악성 대 양성 유방 표현형을 구별하는이 시스템의 유용성을 설명했다. 이 시스템은 또한 다른 선의 조직 배양에서 다른 세포 유형에 이용 될 수 있고, 성공적으로 12-14 몇 가지 이름을 배양 전립선 상피 기관지 상피 및 갑상선 상피 세포에 사용 된 것으로보고되었다. 3D 배양의 중요성은 생리 학적으로 관련 모델이라는 사실에있다. 3D 문화가 악성 변환하는 동안 선의 건축의 중단에 이르게 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수있는 방법을 제공합니다. 또한 암 치료를위한 새로운 치료 표적을 선별에 도움이 될 수있는 작업 모델 시스템을 제공합니다. 2D 문화에 효과가 발견되는 많은 약물 종종 실험 및 임상 applictai에 거의 영향을 미치지기능 15. 이러한 3D 문화로 생체 내에서 화합물의 효과를 예측하는 중요한 임상 도구를 제공 할 수있다. <p class...

재구성 기저막에 유방 상피 세포의 3 차원 배양 (3D)는 복잡한 표현형 정상 유방과 유방암 2,3의 관련 신호를 연구하는 중요한 모델 시스템입니다. 유방의 기능 단위는 꽈리에있는 나뭇 가지의 작은 관으로 구성 터미널 덕트 소엽 단위 (TDLU)입니다. 선포 세포는 기저막 (5)에 의해 둘러싸여있다 두 세포층, 상피 및 근 상피 세포로 구성된 매우 조직 구조이다. 일반 선포 세포의 가장 두드러진 특징은 휴대 편광, 기본 기저막에 부착 전문 세포 - 세포 연락처입니다. 이 복잡​​한 조직은 침략 암에 중단됩니다. 세포는 단층으로 재배되는 널리 사용되는 2 차원의 문화, 선포 세포의 형성을 허용하지 않습니다. 따라서, 단층 배양 상피 세포 간의 복잡한 관계를 캡처하는 시스템을 제공 부족정상 유방과 유방암에서의 규제 완화. 유방 세포의 기능 monotypic 상피 문화는 여러 실험실 2,3에서 개발되었다. 3D 배양 Engelbreth-홀름 - 스웜 마우스 육종 세포 유래 가용화 엑기스이며 시판되고 리겔에 유방암 세포의 성장을 포함한다. 콜라겐 같은 다른 3D 하층은 I도 사용된다. 유방 세포는 세포가 매트 리겔이에 매립 배양 3D 임베디드 분석법에 의해 3 차원으로 배양 할 수있다. 또한, 세포는 또한 리겔의 적은 양을 필요로하고, 위상 콘트라스트 이미지에 의해 콜로니 형성의 시간 경과 감시를 용이하게하고 현장 영상 2에 이상적입니다로 비용 효과적인 3D 오버레이 분석,라고, 최고 분석에 3D로 배양 될 수있다 -3. 베스트 분석에 3D는 선포 표현형 및 유전자 발현 프로파일 (7) 사이의 상호 관계를 정의하는 데 사용되었다. 3D 문화 effectiv 할 수 있습니다엘리 침윤 암에서 정상과 양성 세포를 구별하는 데 사용됩니다. 정상 및 양성 유방 세포가 침윤 암 세포가 루멘없이 청소와 다산과 우연히 성장하는 반면 성장이 리겔의 중심에있는 잘 정의 된 루멘 편파 구조를 체포 형성한다. E6/E7은 인간의 유방 상피 세포와 섬유 낭종 성 변화와 36 세 환자에서 분리 된 자발적 불후의 세포주가 성공적으로 3D 3.8에 양성 유방 표현형을 탈환하는 데 사용되었습니다 및 지낸입니다 MCF10A 세포주를, 불후의 여러 분자 8,9의 종양 및 종양 억제 기능을 연구하기위한 모델 시스템. 이러한 양성 세포는 렌티 바이러스 / 레트로 바이러스의 도입으로 그 유전자 (들)을 조작 할 수 있도록 설계 할 수있다. 관심의 유전자 (들)은 종양 억제 경우 그 유전자가 양성 세포의 발암 유전자 과발현 경우, shRNA를 매개 최저는 반면 악성 변화로 이어질 것악성 표현형을 표시해야합니다. 두 경우 모두 3D로 형성된 선포 구조는 악성 변화를 캡처 할 수 있습니다. 3D로 도금 양성 단일 세포는 구형 구조를 증식 원형 형성하기 시작합니다. 일 5-8 셀이 구형 집합체 마트 리겔과 접촉하는 세포의 주변 편광 층 및 마트 리겔과 접촉이없는 적은 편광 세포의 내측 질량으로 분화한다. 다음 10-15 일에서 내부 세포 사멸이 명확한 루멘을 형성하여 죽기 시작합니다. 악성 세포는 우연히 자신의 극성을 잃고 성장할 것입니다. 고도의 악성 세포는 일반적으로 구조를 분기 형성한다. 표현형의 이러한 차이는 시간 경과 위상 콘트라스트 이미지에 의해 현장에서 관련 분자 마커로 면역 염색에 의해 캡처 할 수 있습니다. 가장 일반적으로 사용되는 마커는 증식 마커 포스 포 히스톤 3 apoptot와 ​​조합하여, 알파 -6 - 인테그린, 기저 극성 마커 아르IC 마커는 카스파 제 3을 절단. 후자 꽈리의 중심 정상적인 양성 유방 세포의 기능에 루멘을 형성가 있는지를 결정하는 것이 중요하다. 다른 극성과 세포 - 세포 접촉 마커 GM130, 라미닌, ERM, E-cadherin의 (가) 있습니다. 교대 유방암 세포주 관심 유전자를 조작하기 위하여 설계 될 수있다. 체포 더 성장이 경우 복귀 양성 표현형으로 사용할 수 암 표현형을 구별 할 독출. 3D 문화는 신중 악성 변형 10-11에 관련된 신호 전달 경로를 묘사하는 데 사용할 수 있습니다. 사용하여 위의 읽기 아웃, 약물 억제제, 차단 항체 나 재조합 단백질을 언급하는 것은 악성 변화를 선도하는 분자 신호에 정확하게 할 수 있습니다. 여러 실험실에서 지속적인 노력으로는 RNA를 분리하고 또한 면역 블롯 및 면역에 해물을 준비하는 차원에서 세포를 추출 할 수noprecipitation. 이러한 전략은 프로토콜 단계적 상세한 방법에 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>성장 인자 감소 Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td>반복 동결 해동을 피하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>Lab-Tek 유리 햄버 슬라이드 8-웰</td><td>Thermo Fisher Scientific 177402</td><td></td><td>얼음 위에서 미리 냉각&nbsp;</td></tr><tr><td>Lab-Tek 유리 챔버 슬라이드 2-웰&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177380</td><td>얼음 위에서 예열&nbsp;</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 F(ab&acute;)2 fragment</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-006-006</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent conjugated Alexa antibodies</td><td>Molecular Probes</td><td></td><td>분자 프로브 웹사이트를 참조하십시오.</td></tr><tr>DAPI <td>Molecular Probes</td><td>P36935</td><td></td>3D Culture Cell<td>로 금 퇴색 방지 시약을 연장하십시오</td></tr>.<tr><td> 수확 키트</td><td>Trevigen</td><td>3448-020-k</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Apha-6-integrin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MAB1378</td> IF Anti-GM130 BD <td>Biosciences에 대한 1:100 희석</td></tr><tr><td></td><td></td><td>610822</td><td>IF</td></tr><tr><td>Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-222</td><td>1:100 희석, IF</td></tr><tr><td>Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)</td><td>세포에 대한 1:100 희석 IF</td> Anti-E-cadherin BD Biosciences에 대한 신호 <td>9661s</td><td>1:50 희석</td></tr><tr><td></td><td></td><td>610181</td><td>IF에 대한 1:200 희석</td></tr></tbody></table>

세 가지 차원 문화 : 유방 세포의 악성 변형 대 일반 선포 건축을 연구하는 도구

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

침윤성 암은 전이에 인접 조직과 성향의 침입을 특징으로 악성 상피 종양의 그룹입니다. 암세포 및 그들의 미시 사이에서 신호의 상호 작용은 유방암의 성장 및 생물학적 행동 하나에 강력한 영향을 미친다. 그러나, 세포 외 기질 (extracellular matrix)에서이 신호의 대부분은 손실되거나 세포가 단층으로 두 가지 차원의 문화 (2D)에서 재배 할 때의 관련성은 understudied 아르됩니다. 최근, 재구성 기저막의 입체 (3D) 문화는 양성 및 악성 유방 세포의 조직 구조를 다시 요약 선택의 방법으로 떠오르고있다. 3D에서 자란 세포는 세포 외 기질에서 중요한 단서를 유지하고 생리학 관련 생체 시스템 2,3을 제공합니다. 참고로, 제 4에 비해 3D로 성장하면 세포가 다르게 행동 것을 제안 성장하는 증거가있다. 3D 문화효과적으로 3 개인 양성 유방 표현형에서 악성 표현형을 구별하는 수단으로하고 세포 및 분자 시그널링을 뒷받침 위해 사용될 수있다. 양성 상피 세포의 구별되는 특징 중 하나는 꼭대기 세포질은 루멘으로하고 기초 세포질이 기저막에 달려있다 그래서 그들은 편광되는 것입니다. 이 apico - 기초 극성은 세포의 해체와 우연히 주변의 기질에 침투 세관을 anastomosing 및 분기의 형성을 특징으로 침윤성 암에 손실됩니다. 양성 선 및 침윤 암 사이의 이러한 조직 병리학 적 차이는 3D 6,7에서 재현 할 수 있습니다. 다른 분자 및 세포 생물학 기술, 3 차원의 cultur와 함께 세포 증식, 극성 및 세포 사멸에 대한 검증 분자 마커의 발현을 차등 한 라운드 선포 구조의 정량과 같은 적절한 읽기 아웃을하거나 사용전자 나은 악성 변환시와 책임 신호를 서술의 세포 변화를 이해하는 중요한 도구를 제공 할 수 있습니다.

3D 배양 효과적으로 양성 유방에서 인간 유방 상피 세포의 악성 표현형을 구별 할 수있다. 리겔에 도금 단일 양성 세포는 쉽게 위상 콘트라스트 이미지를 사용하여 하나의 평면에 하나의 둥근 플랫 선포 세포로 이미지화 할 수있는 조직 구형 구조로 성장한다. 마트 리겔에 도금 한 악성 세포가 우연히 성장 매우 높은 굴절률을 표시 한 평면에서 이미지 어렵다. 도 1에 도시 된 바와 같이 고도로 전이성 유방암 세포주 SUM149 및 MDA-MB-231이 그들로부터 나오는 프로세스와 관형 구조 분파으로 성장하는 반면, 양성 HME 및 MCF10A 세포는 구형 찾고 선포 세포를 형성한다. 양성 표현형에서 이러한 편차로 사용할 수있는 악성 형질 전환을 확인하기 위하여 판독 및 종양 억제 또는 종양 촉진제로서 분자의 기능을 정의하기 위해 사용될 수있다. 도 2, 종양 억제 유전자의 CCN6 t의 녹다운 (KD)에 나타낸 바와 같이악성 변환을 조립 정비공. 아래 렌티 바이러스 매개 형...

재구성 기저막에 유방 상피 세포의 3 차원 배양 양성 유방의 생체 구조를 요점을 되풀이하고, 양성 유방 표현형에서 악성 표현형을 구별 할 수있는 유용한 방법입니다. 중요한 것은,이 시스템은 다른 조직에서 침습성 암 연구에 적용 할 수있다.

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 3차원 배양 시스템을 이용하여 양성 유방 표현형과 악성 유방 표현형을 구별하는 것입니다. 이를 위해 먼저 8웰 챔버 슬라이드 내의 성장 인자가 감소된 매트리젤(matrigel) 층 위에 대조군 및 실험군 세포를 3반복으로 플레이팅합니다. 두 번째 단계는 4일마다 2% GFR Matrigel이 포함된 신선한 완전 배지로 교체하여, 선와(acinus) 유사 콜로니가 10~15일 동안 성장하도록 하는 것입니다.다음으로, 3D로 배양된 aser 유사 콜로니의 위상차 이미지를 5배 배율로 획득합니다. 마지막 단계로, 관련 분자 마커를 사용하여 aser 유사 배양물을 면역세포화학 분석용으로 처리한 후, 중간 단면에서 C two 면역 염색된 aser 유사 콜로니의 공초점 이미지를 획득합니다. 최종적으로, 3D 배양으로 성장시킨 세포의 위상차 및 공초점 이미지를 사용하여 세포의 표현형 및 분자적 변화를 확인하며, 이를 통해 양성 유방 세포와 악성 세포를 구별합니다.2차원 배양, 침습 또는 이동 분석과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 양성 유방의 조직 구조와 악성 변성 과정 중의 조직 구조 소실을 재현할 수 있다는 점입니다. 따라서 이 기술은 양성 유방 세포와 악성 유방 세포를 효과적으로 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 세포 표현형에 영향을 미치는 신호 전달 경로의 결함 및 새로운 발암 경로 또는 종양 억제 경로를 규명하는 것과 같이 유방암 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.실험을 시작하려면 성장 인자 감소(growth factor reduced) 또는 GFR matrigel을 4°C에서 하룻밤 동안 해동하십시오. 다음으로, complete HME 배지를 37°C에서 가온하고 8-웰 챔버 슬라이드를 얼음 위에 올려 냉각시키십시오. 미리 냉각된 슬라이드의 각 웰 중앙에 GFR Matrigel 40 µL를 첨가하십시오.P 200 피펫 팁을 사용하여 겔을 가능한 한 균일하게 펴 바르되, 기포가 생기거나 너무 많이 퍼져서 메니스커스(meniscus)가 형성되지 않도록 주의하십시오. 그 후 슬라이드를 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양하여 Matrigel을 응고시킵니다. Matrigel이 응고되는 동안 HME 세포를 트립신 처리한 후, 15 mL 튜브에 수집하고 150 ×g에서 4분 동안 원심분리합니다. 세포 수를 측정하여 완전 배지에서 12,500 cells/mL 농도로 희석합니다. 세포 현탁액에 GFR Matrigel을 최종 농도 2%가 되도록 첨가하고, 사전 코팅된 챔버 슬라이드의 각 웰에 해당 용액을 400 µL씩 넣습니다.그 다음 슬라이드를 CO2 버퍼 잉큐베이터에 넣습니다. 15일 동안 4일마다 배지를 신선한 완전 배지로 교체합니다. 억제제 연구의 경우, 플레이팅 시점에 완전 배지에 저분자 억제제를 첨가하고, 이후 세포 성장을 시작하기 위해 3일마다 억제제가 보충된 신선한 배지로 교체하며 각 처리 세트당 3반복으로 진행합니다.슬라이드 시프터와 컴퓨터가 연결된 위상차 현미경을 사용하여, 각 웰의 aser 구조를 5배율 해상도로 위상차 이미징합니다. 챔버 슬라이드 웰의 전체 너비를 커버할 수 있도록 슬라이드를 한 프레임에서 다음 프레임으로 이동하며 이미지를 촬영합니다. aser 구조의 총 개수, 단일 원형 평면 asinine의 수, 그리고 조직성이 없는 다중 aser 구조 또는 무작위로 성장한 구조의 수를 측정합니다.발생하는 분기 과정을 통해, 단일 라운드 평면 ase-구조와 악성 구조의 비율을 계산하고 해당 정보를 막대 그래프로 도식화하십시오. 양측 꼬리 비짝 맞지 않은 student T-검정을 통해 유의성을 계산하십시오.함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 면역형광 염색을 위한 시약을 준비합니다. 다음으로, P 200 피펫을 사용하여 배양액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 신선하게 제조된 2%para formaldehyde를 사용하여 실온에서 20분 동안 ASIN 또는 구조물을 고정하고, 4°C에서 0.5%tritton X 100으로 10분 동안 세포를 투과화합니다.그 다음, 배양물을 100 millimeter glycine으로 10분에서 15분 동안 3회 세척합니다. 이어서, 실온에서 1시간 동안 primary block buffer로 세포를 블로킹합니다. 그런 다음, matrigel 내의 amino react mouse IgG 종을 블로킹하기 위해, second blocking solution이라고도 불리는 primary block buffer에 20 micrograms per milliliter의 goat anti mouse fab two fragment를 넣어 30분 동안 배양물을 반응시킵니다.블로킹 후, 세포를 2차 블로킹 용액에 희석한 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 면역형광 버퍼 또는 I 버퍼를 사용하여 세포를 3회 세척하며, 각 세척 시 완만한 흔들림(rocking) 상태로 10분에서 15분 동안 진행합니다. 그런 다음 if F 버퍼 내의 형광 결합 2차 항체와 함께 세포를 45분 동안 배양합니다.다음으로, if F 버퍼를 사용하여 부드럽게 흔들어주며 10분씩 세 번 세포를 세척합니다. 핵을 시각화하기 위해 항퇴색제(anti fade reagent)가 포함된 DPI로 슬라이드를 마운팅합니다. 슬라이드를 상온에서 하룻밤 동안 건조시킵니다.그 다음, matrigel 위에서 성장하는 세포의 콜로니 중앙 부분에서 공초점 이미지를 획득하고, z-stacking 공초점 이미지를 통해 asner 구조의 전체 길이에 걸친 일련의 광학 절편을 획득합니다. 5일 차에 DPI로 염색된 HME 대조군 세포와 C CN six 넉다운 세포를 관찰하면 넉다운 세포는 조직화가 결여되어 있음을 알 수 있습니다. 15일 차에 대조군 세포는 분화된 ASIN 구조와 뚜렷한 루멘을 형성하며 성장이 정지되는 반면, 넉다운 세포는 침습적인 분지 및 관형 표현형을 나타내며 대조군과 대조를 이룹니다. 면역형광 염색 결과 laminin v alpha six integrin 및 ECA herrin의 발현 소실이 나타나며, 이는 각각 기저막의 붕괴, 기저 극성 상실 및 세포 간 접촉의 소실을 의미합니다.악성 세포에서, 대조군 세포는 $\alpha$6 integrin의 기저 발현, GM130 및 ECA의 정단부 발현 주위에 온전한 층을 보여줍니다. 여기 세포 접합부에서, CCN6 넉다운 HME 세포의 악성 표현형은 정제된 재조합 인간 CCN6 단백질의 외인성 처리를 통해 역전되었습니다. 고전이성 유방암 세포주인 SUM149와 MDA-MB-231에 P38 MAP kinase 억제제인 SB203850 및 SB202190을 처리한 결과, 악성 행동이 감소하였습니다.이 영상을 시청한 후에는 유방 세포를 3D 배양으로 성장시키는 방법과, 양성 및 악성 유방 세포 표현형을 구분하는 판독 지표로서 Matrigel 상의 소포체 유사 성장(sino like growth)을 효과적으로 활용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

three-dimensional-cultures-tool-to-study-normal-acinar-architecture

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

양적 성장 인자 (TGF) - β - 유도 3 차원 콜라겐 젤의 침공을 변형 측정하는 분석이 설명되어 있습니다. 이 분석은 유방암 개발의 다른 단계를 나타내는 세포 라인의 MCF10A 시리즈의 활용합니다. 이 방법은 다른 세포 라인과 함께 사용하는 다른 가능성 activators 또는 침해의 억제제를 조사하기 위해 사용될 수 채택 수 있습니다.

TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

이 비디오는 세포-매트릭스 상호 작용을 연구하기 위한 폐암 세포의 3D 배양 기술에 대해 설명합니다. 이 프로토콜에서는 TUM622 폐암 세포의 3D 배양을 수행하여 in vitro에서 오가노이드를 형성할 수 있는 가능성을 탐구할 것입니다.

폐암종 세포의 3차원 배양: 세포-매트릭스 상호작용을 연구하는 방법

표준 배양 방법에 세포 생리 학적 환경 꺼내하고 접시의 플라스틱 표면에 성장합니다. 일차 인간 골수 세포의 거동을 연구하기 위해, 우리는 세포가 조직의 미세 환경을 네이티브 recapitulating 조건에서 재배되는 3-D 배양 시스템을 만들었다.

차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델

이 문서는 유방암 세포의 침입을 정량화하는 3 차원 (3D) 분석의 사용에 대한 자세한 방법을 제공합니다. 특히, 우리는 세포가 침입 할 때 발생하는 멤브레인 무결성의 손실을 검사하는 등의 분석을 설정하는 데 필요한 절차, 정량화 및 데이터 분석뿐만 아니라 방법에 대해 설명합니다.

3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

여기에서는 다세포 상호 작용 및 암세포 행동의 세포 외 기질 의존적 조절을 조사하는 데 유용한 3차원에서 공동 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 실험 모델에서는 인간 암 관련 섬유아세포가 내장된 콜라겐 겔에서 암세포를 배양합니다.

종양 기질 상호 작용에 대한 세 가지 차원의 공동 문화 모델

우리는 산소와 영양분을 전달하기 위해 관류 생물 반응기 시스템을 사용하여 배양할 수 있는 3D 유방암 대리모를 생성하는 방법을 시연합니다. 성장 후, 대리모는 관심 매개변수의 평가를 위해 고정되고 파라핀으로 처리됩니다. 이러한 매개 변수 중 하나 인 세포 밀도의 평가가 설명됩니다.

준비 및 분석<em&gt; 체외</em&gt; 3 차원 유방 암 서로 게이트

암세포를 콜라겐 겔에 삽입한 다음 무세포 피브린 겔에 끼워 넣어 위성 종양의 침습성과 형성을 모니터링할 수 있는 3D 배양 시스템을 생성합니다.

암 세포 침윤 및 위성 종양 형성을 탐색하는 문화 분석 세 가지 차원

여기, 우리는 기본 유 방 암 세포 뿐만 monocytes 그리고 콜라겐 저하, 면역 세포 모집, 셀 결과 함께 그들의 직접/간접적인 상호 작용 연구로 형태를 분석 하는 3 차원 문화 방법 설명 침공, 그리고 암 관련 된 염증의 승진.

(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

이 프로토콜은 인간 유방 세포의 변환을 평가하기 위해 실험적인 체외 도구를 제공합니다. 지하 막 매트릭스를 가진 3D 배양에서 세포 증식율, 앵커리지 독립적인 성장 능력 및 세포 혈통의 분포를 후속하는 상세한 단계가 설명되어 있습니다.

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

본 프로토콜은 혈소판 활성화 인자(PAF) 유도 형질전환을 연구하기 위해 변형된 형질전환되지 않은 유방 상피 세포주인 MCF10A의 3D '온탑 ' 배양의 설정을 설명합니다. 면역-형광은 형질전환을 평가하기 위해 사용되었으며 상세히 논의된다.

인지질 매개체는 3차원 배양에서 형질전환을 유도했습니다.

배우세요 3차원 배양 시스템을 이용하여 양성과 악성 유방 세포 표현형을 구분하는 방법을. 이 기술은 면역세포화학 분석과 공초점 현미경을 통해 조직 구조와 분자 변화를 연구하는 데 활용됩니다.

세 가지 차원 문화 : 유방 세포의 악성 변형 대 일반 선포 건축을 연구하는 도구

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