신생아 Pial 표면 에레

이 절차의 전반적인 목표는 박리 표면 신경 전구세포를 유전적으로 라벨링하고 조작하는 것입니다. 이는 먼저 혈장 DNA 용액으로 채워진 유리 피펫을 박리 표면 영역에 삽입하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 DNA를 수막 공간으로 주입하여 껍질 표면 위에 놓는 것입니다.

다음으로, 전극은 박리 표면에 전류를 적절하게 전달하도록 배향됩니다. 마지막 단계는 DNA가 전류의 인가에 의해 박리 표면 전구체로 전기천공되는 것입니다. 궁극적으로 이 방법은 다른 기술과 결합하여 박리 표면, 신경 전구 세포 증식, 이동 및/또는 분화의 자연사 및 분자 결정 요인을 보여줄 수 있습니다.

바이러스 형질도입과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 전기천공법이 더 안전하고 유연하며 바이러스 입자를 생성하거나 패키징할 필요가 없다는 것입니다. 이 방법은 신경 줄기 및 전구 세포 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다., 예를 들어 이러한 껍질 표면 전구 세포가 조직, 히스토 제네시스 및 신경 회로 기능에 기여하는 것은 무엇입니까? 시작하려면 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관 튜브에서 피펫을 만들고 날카로운 가위로 팁을 자릅니다.

다음으로, 여과된 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 1% 빠른 녹색 원료 용액을 준비합니다. 내독소가 없는 혈장 DNA 관심 EDTA 완충액을 희석한 후 1% 빠른 녹색 용액에 적절한 비율로 결합합니다. 표준 피펫을 사용하여 원하는 양의 플라스미드 혼합물을 참조용으로 파라핀 왁스 필름 조각에 주입합니다.

다음으로, 마이크로 인젝터를 사용하여 조립된 유리 피펫을 플라스미드 혼합물이 들어 있는 튜브에 조심스럽게 삽입합니다. 파손을 방지하기 위해 팁을 튜브 가장자리에 만지지 마십시오. 트랜스퍼 다이얼을 천천히 뒤로 돌려 용액을 파이펫에 흡입합니다.

충분한 볼륨이 로드되면 압력이 중립 위치인 0으로 돌아올 때까지 앞으로 다이얼합니다. 헥터 파스칼스. 다음으로, 기준 주입 옆에 팁을 놓고 마이크로 주입기에서 풋 페달을 사용하여 하나의 볼륨을 배출합니다.

양이 이전에 피펫으로 만든 기준 부피와 같아질 때까지 압력을 조정합니다. 주입량을 보정한 후 플라스미드 주입을 위해 동물을 회수합니다. 마취 깊이가 확인되면 덜 지배적인 손의 엄지와 검지를 사용하여 강아지를 잡습니다.

주로 사용하는 손을 사용하여 원하는 부위를 대상으로 하며, 피질 반구 및 상구(superior colliculi)와 같은 다른 표재성 구조를 쉽게 볼 수 있어야 합니다. 올바른 위치가 확인되면 피펫을 피부와 두개골을 지나 삽입합니다. 대뇌 동맥을 피하도록 주의하십시오.

껍질 표면을 즉시 목표로 삼으려면 피펫 전진을 중단하십시오 피펫 팁이 올바른 위치에 있는 상태에서 두개골이 관통되자마자 마이크로 인젝터의 풋 페달을 사용하여 플라스미드 용액을 주입합니다 주입 후 조심스럽게 피펫을 제거합니다. 팁이 파라핀 필름에 있는 테스트 방울에 넣어 주입 사이에 건조되거나 막히는 것을 방지하십시오. 전도도를 높이고 피부가 타는 것을 방지하기 위해 모든 새끼가 주입될 때까지 이 단계를 반복합니다.

3mm 백금 핀셋 TRO를 전기천공법 젤로 덮습니다. 다음으로, 피질에 주입하기 위한 전기 설정을 조정합니다. 음전하를 띤 프로브를 주입된 부위 위에 놓고 양전하를 띤 프로브를 눈 아래의 반대쪽 영역 주위에 놓습니다.

전극 방향은 정중선에 대해 45-60도 각도여야 합니다. 풋 페달을 사용하여 전류를 트리거하고 핀셋 TRO를 3-5개의 펄스 동안 제자리에 유지합니다. 새끼의 나이와 체중에 따라 펄스는 DNA를 아래에 있는 껍질 표면 세포로 표적으로 삼아야 합니다.

음극은 주입 영역 위로 스윕될 수 있습니다. 그 사이에 펄스 또는 더 큰 전극을 사용하여 전기 천공 직후 전기 면적을 늘릴 수 있으며, 강아지의 젤을 조심스럽게 닦아내고 약 5분 동안 열 램프 아래에 놓습니다. 새끼는 청색증으로 인해 전기천공법 후 몇 분 안에 자연적인 붉은빛을 띤 새끼손가락을 급격히 잃게 됩니다.

새끼를 우리로 되돌리거나 상결장에 주사하기 전에 자연스러운 색이 회복되고 정상적인 움직임이 시작되는지 관찰하십시오. 대상 영역을 Lambda의 바로 뒤쪽과 측면, 그리고 대략 정중선에 배치하고 방금 설명한 것과 동일한 단계를 따랐습니다. 성공적인 주입으로 플라스미드 혼합물은 자연적으로 상대장의 윤곽을 채웁니다.

우수한 대장 주사 후 전기 작동을 할 때 전극의 음전하를 띤 프로브를 주입된 부위에 놓고 양전하를 띤 프로브를 눈, 또는 턱 주위에 놓습니다. 이 경우 전극 방향은 정중선에 대해 25-40도 각도입니다. 이 이미지는 형광 리포터 플라스미드의 전기천공 후 등쪽 측면 피질을 보여주며, 녹색으로 태그가 지정된 클로버를 발현하고 bfp를 태그합니다.

여기에 빨간색 의사 색상으로 표시된 두 개의 핵 단백질. 광범위한 수상돌기는 전기천공법 후 약 2개월 후에 이 피질 간 뉴런에서 발견됩니다. EGFP 양성 세포는 BRDU 양성으로 전기천공법 절차 중에 증식하고 있음을 나타냅니다.

이 기술을 시도할 때는 기저에 있는 피질 및/또는 혈관 구조의 파괴를 방지하기 위해 껍질 표면을 적절하게 조준하는 데 초점을 맞추는 것이 중요합니다.