Name: 신생아 Pial 표면 에레 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: 배우세요 신생아 피아 표면 신경전구세포의 유전자 조작 방법을 전기천공법으로. 이 기술은 신경발달 및 세포 분화 연구에 필수적인 도구로 활용됩니다.

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저자는 삼목 시나이의 재생 의학 연구소와 겔랑 가족에서 사무엘 Oschin 종합 암 연구소 암 연구 포럼 수상의 지원뿐 아니라 자금을 인정하고 싶습니다. 설명이 프로젝트는 연구 자원, 그랜트 UL1RR033176를위한 국가 센터에 의해 투자 CTSI 코어 바우처의 형태로 지원하고, 번역 상 과학, 그랜트 UL1TR000124 선진화를위한 국가 센터에 지금 하였다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

이 절차는 삼목 시나이 IACUC의 요구 사항에 따라입니다. 조사자는 이전 절차에 기관 IACUC 준수를 확인해야합니다. 모든 도구와 시약은 사용하기 전에 소독해야한다. 1. 도구의 제조, 솔루션 및 DNA 혼합물 <ol><li> 마이크로 피펫 풀러에 100-mm 화재 광택 붕규산 유리 모세관 튜브를 삽입합니다. 약 17.5 mm의 피펫 팁을 형성하는 표준 가중치를 풀 수 있도록 열을 설정합니다. 약 100 μm의 직경의 구멍을 만들 수있는 팁의 시작 부분까지의 거리 약 8~9밀리미터에서 날카로운 수술 가위로 끝을 잘라. </li><li> 주식에게 1 % w / 건조 빠른 그린으로 (20 μm의 주사기 필터를 사용) 필터링 핵산 분해 효소가없는 물을 혼합하여 빠른 그린 솔루션 V를 확인합니다. </li><li> 트리스-EDTA (TE) 버퍼에 희석 고도로 집중되어 정제 된 독소가없는 플라스미드 DNA (예&gt; 3 ㎍ / μL)를 분리합니다. 플라스미드의 추가 원하는 양혼합물에 TE 버퍼에 희석 (w / 빠른 그린의 최종 농도 V 0.1 %를 만드는) 1 % 빠른 녹색 솔루션을 1:10의 비율을 추가합니다. 도입 유전자의 강력한 발현 플라스미드의 0.5 ~ 2.0 ㎍ / ㎕의 최종 농도를 사용합니다. </li></ol> 2. 동물 마취, 피펫 로딩 및 Pial 표면 플라스미드 주입 <ol><li> 5-8 분 (강아지 나이 / 무게에 따라 시간) 얼음에 배치 된 페트리 접시에 배치하여 1-2일 출생 후 마우스에서 저체온 마취를 유도한다. 저체온증이 발가락 곤란 및 / 또는 꼬리에서 반사 운동의 부족에 의해 확인되면, 마우스를 주입 할 준비가 된 것입니다. 통증 반사가 분명하면 얼음에 동물을 다시 넣습니다. 저체온증, 사출 및 일렉트로 절차를 따라 적절한 마취를 유지하는 시간, 그래서 주입 절차 및 일렉트로 합계보다 2 ~ 3 분을. </li><li> 마취하는 동안, 표준 피펫을 사용하여 조심스럽게 피펫 plasmi의 양을 원하는D 참조 파라핀 왁스 필름의 조각에 (0.5 μL)를 주입하는 혼합. 여기서, 플라스미드 믹스 0.5 μL의 총 부피가 주입된다. 다음, 마이크로 인젝터를 사용하여 조심스럽게 튜브 포함 플라스미드 혼합물로 조립 유리 모세관 피펫을 삽입합니다. 이 튜브의 가장자리에 닿지 않도록 확인하여 파손되는 팁을 방지하기 위해 추가 조치를 취. 천천히 이동 다이얼을 다시 전화를 걸어 피펫으로 솔루션을 대기음. 충분한 볼륨 피펫에로드되면, 0 고전력 증폭기의 중립 위치에 압력이 반환 될 때까지 앞으로 전화. </li><li> (2.2부터) 피펫 파라핀 왁스 필름 기준 주입 인근 팁을 배치, 심지어 pial 표면 / 수막 공간을 가득 채우는 적절한 압력을 확인하고 하나를 꺼내 마이크로 인젝터에서 풋 페달을 사용하여 주입을위한 300 ~ 450 고전력 증폭기의 압력을 사용하여 파라핀 왁스 필름에 볼륨. 배출 된 양이 이전에 피펫의 referenc에 달할 때까지 따라 압력을 조절전자 볼륨. </li><li> 팁 평형화되었고 마취 확인되면, 새끼 분사 될 준비가되었다. </li><li> 실험의 목표는 pial 표면 원종 (도 1a)로 아래쪽으로 DNA의 일렉트로 있도록 두개골 및 아래 pial 표면 위에 플라스미드 믹스를 주입하는 것이다. 피질 주사의 경우, 엄지 손가락과 덜 지배적 인 손의 검지 손가락을 사용하여 강아지를 누르십시오. 대뇌 피질 반구와 같은 뛰어난 colliculi 등의 표면 구조는 이러한 구조 (그림 1B)의 손쉬운 표적을 허용, P0과 P2 사이에 볼 수 있습니다. 피질의 지배적 인 손과 대상 원하는 영역 (등 즉, 모터, 체성 감각 등)를 사용하여, 대뇌 동맥에주의하면서 피부와 두개골을지나 피펫을 삽입합니다. (다만 두개골을 관통 한 후 더 저항의 부족에 의해 표시된다) 두개골을지나 끝의 더 침투를 방지해야합니다. </li><li> 혈장을 주입ID 솔루션은 마이크로 인젝터의 풋 페달을 사용하고 있는지 확인이 조직 (그림 2A)에 걸쳐 균등하게 분산합니다. 참고 : 경험적으로 인해 유체 압력에 혈종을 피하면서 플라스미드의 전달을 극대화 방법을 결정하는 것이 매우 중요합니다. 이것은 분사 기간, 각도, 볼륨, 및 혈관 장애를 피하기 위해 정확한 목표 부위를 조정함으로써 행해질 수있다. </li><li> 시도하고 파라핀 종이 또는 플라스틱 파라핀 필름에 이전에 만든 주사에서 테스트 방울의 팁을 배치하여 주사 사이에 건조에서 팁을 유지해야합니다. 이것은 팁, ​​그리고 모순 대금 볼륨의 막힘을 초래할 수 증류 및 결정화 DNA 용액의 팁 축적을 방지하기 위해 필요하다. </li></ol> 3. 일렉트로 <ol><li> 각 펄스 사이에 950 밀리 초 간격으로, 50 밀리 초를 지속, 다섯 펄스에 135-150 V에 Electroporator을 설정합니다. 전도도를 증가시키기 위해 및피부의 연소를 방지, 일렉트로 젤 3 mm 백금 tweezertrodes 커버. 마취를 보장하기 위해이 시점에서 발가락 곤란 꼬리 반사를 확인합니다. 응답하는 경우, 마취 몇 분 동안 얼음에 배치합니다. </li><li> 외피 (뛰어난 둔덕) 주사를, (- 심실 영역에 전기 천공에 사용되는 10-mm 전극 (7)에 비해서) 송아지의 생존을 증가시키는 3 mm 전극 (도 2B)를 사용한다. 전극 방향이 중간 선 (그림 2C)에 45 ~ 60 °의 각도로되도록 눈 아래의 반대편 지역 주변의 주입 영역과 적극적으로 청구 프로브를 통해 전극의 부정 청구 프로브를 놓습니다. </li><li> 곡률에 대한 회계 할 때 전류를 트리거 할 electroporator의 풋 페달을 사용하여 효과적으로 기본 pial 표면의 세포에 DNA를 대상으로, 강아지의 나이와 체중에 따라 3-5 펄스 자리에 tweezertrodes 개최반구의. 주 : 음극 펄스 또는 확대 전극 electroporation하여 면적을 증가하는데 사용될 수 사이에서 주입 영역을 석권 할 수있다. </li><li> 즉시 전기 충격 후, 조심스럽게 새끼에서 젤을 청소하고 약 5 분간 가열 램프 아래에 배치합니다. </li><li> 새끼 심하게 청색증에 의한 일렉트로 후 분에 자연 붉은 핑크 색상을 잃게됩니다. 자신의 새장에 반환하기 전에 자연적인 색깔 및 일반 운동의 개시의 복구를 위해 새끼를 관찰합니다. </li><li> 그녀가 다시 둥지에 새끼를 제공하고이를 정리 시작 여부를 관찰하여 어머니와 재 사회화를 확인합니다. 그녀는 공격적이되면 반드시 새끼 젤의 잔해를 가지고 새끼로 냄새를 전송하는 침구의 일부를 배양 실 수 있습니다. </li></ol> 4. 우수한 Colliculi를 대상으로하기위한 수정 대상 : <ol><li> 인제CT 우수한 피질과 같은 방식으로 둔덕 만이 대상 지역이 단지 후부 및 람다 측면과 대략 중간 선에 자리 잡고 있습니다 (그림 3a 및 3b). 성공적인 주사로, 플라스미드 믹스 자연스럽게 뛰어난 둔덕의 컨투어를 채운다. 주사가 성공적으로되었습니다되면, 동물은 전기 충격에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 일렉트로 : <ol><li> 매우 유사한 방식으로, 우수한 둔덕 주사를 위해, 우수한 둔덕의 표면 영역 (그림 3C)으로 DNA를 운전, 주입 영역과 눈, 코 또는 턱 주위에 적극적으로 청구 프로브를 통해 전극의 부정 청구 프로브를 배치 . 이 경우, 전극 방향은 정중선에 25 ~ 40 °의 각도로있다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

pial 표면 조상의 성공적인 일렉트로의 가장 중요한 측면은 다음과 같습니다 : 1) pial 표면에 플라스미드 믹스의 대상; 2) 주사 부위 혈종의 발생을 회피; 및 3) 중뇌 전기 천공과 연관된 사망률을 회피. 적절하게 pial 표면을 대상으로하는 pial 표면의 침투를 방지하기 위해 두개골의 측정 및주의 천공에 의해 달성된다. 부드럽게 조직 (즉, 빠른 그린이 피부와 결합 조직의 두개골 위에 지역화를) 마찰시 피부에 빠른 녹색 염료의 1) 변위 : 덮고있는 피부 또는 기본 뇌실, 뇌 실질 조직을 대상으로 부적절한가 입증 될 것 또는 2) 플라스미드 믹스 뇌실 및 / 또는 실질 들어갔을 나타내는 뇌에 빠른 녹색 염료의 소실. 플라스미드 믹스의 적절한 pial 표면 현지화 두개골 일에서 염료의 축적에 의해 입증됩니다상냥한 피부 변위에 의해 방해 할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고, 연습과 손재주이 성공적으로 타겟팅이 필요합니다. 혈종의 형성 가능성이 플라스미...

신경 줄기 및 전구 세포는 포유 동물 CNS 1, 2에 걸쳐 존재한다. 자신의 성격과 뇌와 척수의 심실 지역 주변 배아와 성인 새싹 영역의 속성을 광범위하게 지난 십 1-3에 설명되어있다. 많은 부분에서, 이는 같은 floxed 대립 유전자 또는 4를 추적 레트로 바이러스 계통의 신경계 특정 크레 재결합으로 더욱 정확한 유전 도구의 개발에있다. 그러나 한 전구 지역 - pial 표면 전구 최근에 어떤 세부 5-7에 설명 된 영역 - 가지고 기다리고 종합 시험. 뇌 pial 표면은 뇌의 표면 및 주변 수막 8 간의 인터페이스로 정의된다. 나중에 개발, neuroepithelial하고, 동안, 반경 폐해 최종 피트는이 표면 9, 10에 연결합니다. 전나무의 일부인간의 두뇌와 신경 세포의 유사 분열의 많은 성 신경 세포는이 지역 11에서 관찰된다. 나중에 배아 신경 동안, 대뇌 피질의 interneurons는 중간 영역과 subventricular 영역 12 ~ 14에서의 이주 경로에 추가하여 pial 지역을 통과하는 것으로 알려져있다. 이 기간 동안, 줄기 세포는이 영역에서 배양 될 수 있고 신경 및 gliogenesis 5의 활성 부위로 나타난다. 성인의 뇌에서,의 interneurons는 저산소 도전 7 다음 pial 표면 조상에서 태어난 될 수 있음을보고하고있다. 그러나, 배아 및 출생 후의 개발 기간 동안 genensis하는 자신에 대한이 지역의 기여로 인해 특히이 지역 6 조사의 어려움으로 일부 모호한 남아있다. 우수한 둔덕과 대뇌 피질에, 표면 (또는 피질 층 I)의 interneurons는 기본 흥분성 신경 세포 집단의 회로 출력을 조절하고, 따라서 signific를 기여할 수있다이러한 구조의 기능에 antly. 특히, 1 층의 interneurons는 대뇌 피질의 열 (15, 16)의 표면과 깊은 층에 자신의 광범위한 연결 주어진 대뇌 피질의 상위 계층에서 뉴런의 발화를 조절하는 주요 위치에 있습니다. 유사한 방식으로, 가로의 interneurons는 비교적 넓은 면적에 걸쳐 피질 및 망막 섬유 프로젝트에서 흥분성 입력을 수신하고 원격 시각적 자극 (17, 18)에 응답 신경원 인구의 억제를 중재하는 추측된다. 또한, 그들의 형태는 현상 카메라 시스템 (19)의 패터닝 표면파 활동 전위 역할을 매우 적합하다. 흥미롭게도, interneuron의 개발과 성숙은 출생 후 큰 정도 발생합니다. 또한,이 숙성 공정은 신경 활성에 의해 조절되는 것으로 밝혀졌다 따라서 회로 기능 (20, 21)의 평생 결과와 발달 가소성 기판이다. 특히, N오 발기인은 특히 transgenically이 세포를 표적으로 할 수있는 기술되어있다. 분할 전구 세포가 레트로 바이러스 7 대상이 될 수 있지만 바이러스의 생산 시간이 소요됩니다 세포 전달에 필요한 높은 역가를 산출하는 기술이 필요합니다. 이 신경 전구 세포 4, 22, 23의 신호 전달 경로의 신속하고 효율적인 유전자 심문을 허용으로 일렉트로는 신경 발달의 연구에서 르네상스를 주도하고있다. 전기 천공은 일방향 심실 4, 22, 23를 둘러싸고 증식 전구 세포로 DNA를 구동하는 헤드의 외부로의 전기 펄스의 전달 다음에 플라스미드 DNA의 주입하는 것을 포함한다. 일렉트로는 플라스미드 형질 전환 유전자 (24)의 식에 대한 세포주기의 M 단계를 통해 세포의 이동을 필요로 나타납니다. 구체적으로는 발견되었습니다 만이플라스미드의 일렉트로의 8 시간 이내 M 단계를 통과 세포는 심실 벽 (24)의 ~ 160 μm의 내의 모든 세포에 자신의 효과적인 전달에도 불구하고 도입 유전자를 표현하는 것입니다. 그것은 핵 permeabilization를 일으키는 화학 물질이 포스트 유사 분열 세포 (25)에 플라스미드의 발현을 유도 할 수있는이, 에피 솜 플라스미드의 핵 액세스를 허용 핵 봉투 고장의 필요성 때문이라고 추측된다. 원래 배아 22에 사용, 일렉트로는 훨씬 나중에 26, 27 출생 후의 뇌에 사용하기 위해 적응했다. 최근에, 우리는 pial 표면의 전구 세포 (6)의 유전자 조작에 사용하기 위해 전기 충격을 적응. 또한,이 방법을 사용하여 우리는 조상의 두 가지 계통이 지역 - interneuronal 및 성상 세포 6에 분명히 있다는 것을 보여 주었다. 이 프로토콜은 심문이 세포를 대상으로, 간단한 신속하고 강력한 방법의 자세한 사항이러한 세포의 조절 메커니즘 개발.

<table><tbody><tr><td>화재 광택 붕규산 튜빙</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>셔터 인스트루먼트 컴퍼니 컴퍼니</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>패스트 그린 FCF</td><td>시그마 알드리치, Inc.</td><td>F7528</td><td></td></tr><tr><td>XenoWorks 디지털 마이크로인젝터</td><td>Sutter Instruments Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 발전기</td><td><a 이름="RANGE! B6">하버드 장치, BTX 기기 사업부</A></td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>3mm 플래티넘 핀셋</td><td>하버드 기기, BTX 기기 Div</td><td>45-0487</td><td></td></tr><tr><td>SignaGel 전극 젤</td><td>Cardinal Health</td><td>70315-025</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA 버퍼, pH 8.0</td><td>통합 DNA Technologies, Inc.</td><td>11-01-02-05</td><td></td></tr><tr><td>적외선 열 램프</td><td>VWR</td><td>36547-009</td><td></td></tr><tr><td>고급 가위 날카로운</td><td>미세 과학 도구</td><td>14060-09</td><td></td></tr></tbody></table>

신생아 pial 표면 에레

Neonatal Pial Surface Electroporation

지난 몇 년 동안 pial 표면은 손상 후를 포함하여, 배아 산기 및 성인 신경과 gliogenesis 동안 중요성을 싹 틈새로 확인되었습니다. 그러나 유전이 전구 인구를 심문하고 그들의 계보를 추적하는 방법은 특이 또는 시간 바이러스의 생산을 소비의 부족으로 제한했다. 따라서,이 지역의 발전은이 지역의 연구 단지 소수의 상대적으로 느리다. 일렉트로은 배아의 신경 줄기 세포의 특성을 연구하기 년 넘게 사용하고, 최근에는 출생 후 뇌의되었습니다. 여기에 우리가 적응 일렉트로 방식에 따라 pial 표면 조상의 유전자 조작에 대한 효율적이고 신속하고 간단한 방법을 설명합니다. Pial 표면 일렉트로 따라서 이러한 세포 연구를위한 시간 절약과 경제적 인 접근 방식을 나타내는 이러한 조상의 손쉬운 유전자 표시 및 조작 할 수 있습니다.

세포 - 주로 조상 -이나 pial 표면 6 근처에있는 플라스미드 DNA의 발현에 Pial 표면 일렉트로 결과. 보다 구체적으로, 전극의 배향이 플라스미드 움직임과 후속 식의 방향을 지시하는 중요하다. 따라서, 이중 전극 구성에서, 플라스미드는 부정과 양극 사이에 거의 직선 벡터에 관한 것이다. 음극은 주사 부위 위에 배치되고 양극이 음극에 복부 롭다 따라서, 플라스미드 pial 표면으로 강제한다. 이것은 표면에 수직 인 전류 벡터를 생성하는 전극을 배향하는 것이 가장 이상적 일 것이라고 가정한다. 적절한 전극 방향과 더 작고 focally 타겟 전극의 사용으로, 생존율은 100 %입니다. 그러나, 중뇌 등 일부 지역에서, 치료는 심장을 중지 할 수 있습니다 현재 배달을하지 않도록주의해야한다, 따라서 caus전자 일렉트로 마우스 새끼의 생존 능력을 감소시켰다. 새로 한 트라이 전극 구성 또는 다른 수정은 심장 박동 28과 같은 중요한 기능에 관여 구조를 피함으로써 더 어려운 지역을 대상으...

pial 표면은 증가 주목을 받고 CNS에서 독특한 전구 영역입니다. 여기서, 세부 사항보기 개질 전기 천공 법을 사용하여이 시조 존의 급격한 유전자 조작 방법을 우리. 이 절차는 세포 계통 및 세포 분화에 관련된 신호 전달 경로의 세포 및 분자 연구에 사용할 수 있습니다와 딸 세포의 운명과 특성을 설명하기 위하여.

신생아 Pial 표면 에레

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

본 절차의 전반적인 목표는 껍질 표면(peel surface)의 신경 전구세포를 유전적으로 표지하고 조절하는 것입니다. 이는 먼저 플라스마 DNA 용액이 채워진 유리 피펫을 껍질 표면 영역에 삽입함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 껍질 표면 위에 위치한 뇌수막 공간(meningeal space)으로 DNA를 주입하는 것입니다.다음으로, 껍질 표면에 전류가 적절히 전달되도록 전극을 배치합니다. 마지막 단계는 전류를 가하여 껍질 표면의 전구세포 내로 DNA를 전기천공법으로 도입하는 것입니다. 궁극적으로, 이 방법은 다른 기술들과 결합하여 껍질 표면, 신경 전구세포의 증식, 이동 및 분화의 자연사와 분자적 결정 요인을 밝히는 데 활용될 수 있습니다.바이러스 형질전환과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 전기천공법이 더 안전하고 유연하며, 바이러스 입자 생성이나 패키징 과정이 필요하지 않다는 점입니다. 이 방법은 표면 전구세포가 조직의 조직 발생 및 신경 회로 기능에 어떻게 기여하는지와 같은 신경 줄기세포 및 전구세포 분야의 핵심 질문들에 대한 해답을 제시할 수 있습니다. 우선, 피펫 풀러(pipette puller)를 사용하여 유리 모세관으로 피펫을 제작하고, 제작이 완료되면 날카로운 가위로 끝부분을 자릅니다.다음으로, 여과된 nuclease free water를 사용하여 1% fast green 스톡 용액을 준비합니다. endotoxin free plasma DNA를 EDTA buffer로 희석한 후, 이를 1% fast green 용액과 적절한 비율로 혼합합니다. 표준 피펫을 사용하여 주입할 플라스미드 혼합물의 원하는 양을 참조용 파라핀 왁스 필름 위에 놓습니다.다음으로, 마이크로 인젝터를 사용하여 조립된 유리 피펫을 플라스미드 혼합물이 들어 있는 튜브에 조심스럽게 삽입합니다. 파손을 방지하기 위해 피펫 팁이 튜브 가장자리에 닿지 않도록 주의하십시오. 트랜스퍼 다이얼을 천천히 뒤로 돌려 용액을 피펫 안으로 흡입합니다.충분한 부피가 로드되면, 압력이 0 Hectopascals의 중립 위치로 돌아올 때까지 다이얼을 앞으로 돌립니다. 다음으로, 팁을 기준 주입구 옆에 배치하고 마이크로 인젝터의 풋 페달을 사용하여 한 부피를 배출합니다.압력을 조절하여 양이 이전에 피펫팅한 기준 부피와 동일하게 맞춥니다. 주입 부피를 교정한 후, 플라스미드 주입을 위해 동물을 회수합니다. 마취 깊이가 확인되면, 비우세손의 엄지와 검지로 새끼 쥐를 잡습니다.주로 사용하는 손을 이용하여 목표 부위를 조준하며, 대뇌 피질 반구와 상구와 같은 기타 표면 구조가 명확하게 보여야 합니다. 정확한 위치를 확인하면 피펫을 피부와 두개골 너머로 삽입합니다. 이때 뇌동맥을 건드리지 않도록 주의하십시오.껍질 표면을 타겟팅하려면 피펫의 전진을 즉시 중단하십시오. 피펫 팁이 정확한 위치에서 두개골을 관통하는 즉시, 마이크로 인젝터의 풋 페달을 사용하여 플라스미드 용액을 주입하십시오. 주입 후에는 피펫을 조심스럽게 제거하십시오. 주입 사이사이에 팁이 마르거나 막히는 것을 방지하기 위해, 파라핀 필름 위에 놓인 테스트 액적에 팁을 담가두십시오. 전도성을 높이고 피부 화상을 방지하기 위해 모든 새끼 쥐에게 주입이 완료될 때까지 이 단계들을 반복하십시오.3mm 백금 핀셋 TROs를 전기천공 겔로 덮습니다. 다음으로, 피질 내 주입을 위한 전기 설정을 조정합니다. 음전하 프로브를 주입 부위 위에 배치하고, 양전하 프로브를 눈 아래의 반대측 영역 주변에 배치합니다.전극의 방향은 정중선 대비 45~60도 각도가 되어야 합니다. 풋 페달을 사용하여 전류를 발생시키고, 핀셋 TRO를 3~5회 펄스 동안 제자리에 유지하십시오. 새끼 쥐의 연령과 체중에 따라, 펄스는 DNA가 하부 표피 표면 세포로 전달되도록 조절해야 합니다.음극을 주입 부위 위로 훑으며 이동시킬 수 있습니다. 펄스 사이의 간격 동안 또는 더 큰 전극을 사용하여 전기천공 직후 전기 처리 면적을 넓힐 수 있으며, 새끼 쥐의 몸에서 젤을 조심스럽게 닦아낸 후 약 5분 동안 가열 램프 아래에 둡니다. 새끼 쥐들은 청색증으로 인해 전기천공 후 몇 분 동안 자연스러운 붉은 분홍색을 급격히 잃게 됩니다.새끼 쥐를 케이지로 돌려보내거나 superior colliculus에 주입하기 전에, 원래의 색이 돌아오고 정상적인 움직임이 시작되는지 관찰하십시오. 방금 시연한 단계와 동일하게, Lambda의 바로 후방 및 외측이자 대략 중앙선에 위치한 표적 영역을 찾으십시오. 주입이 성공적이면, 플라스미드 혼합물이 superior colliculus의 윤곽을 따라 자연스럽게 채워집니다.상측 뇌궁(superior colliculus) 주입 후 전기천공법을 시행할 때, 전극의 음전하 프로브를 주입 부위 위에 배치하고 양전하 프로브를 눈, 코 또는 턱 주변에 배치합니다. 이 경우, 전극의 방향은 정중선에 대해 25~40도 각도로 설정합니다. 이 이미지는 녹색의 membrane tagged clover와 tag bfp를 발현하는 형광 리포터 플라스미드를 전기천공한 후의 배외측 피질(dorsal lateral cortex)을 보여줍니다.빨간색 가색으로 표시된 두 개의 핵 단백질입니다. 전기천공법 시행 후 약 2개월이 지난 이 피질 중간뉴런에서 광범위한 가지돌기가 발견됩니다. EGFP 양성 세포는 BRDU 양성으로 나타나며, 이는 전기천공법 절차 동안 이들이 증식하고 있었음을 나타냅니다.이 기술을 시도할 때는 하부의 피층 또는 혈관 구조의 손상을 방지하기 위해 껍질 표면을 정확하게 타겟팅하는 데 집중하는 것이 중요합니다.

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기에서 망막 신경절 murine 세포 (RGCs)의 유전자 발현을 조작 두 가지 기법을...

마우스 망막 신경절 세포의 유전자 발현에 대한 utero 및 전직 생체내의 Electroporation에

이득 또는 기능 연구의 손실 중 하나를 수행하기위한 목적으로 murine 망막 세포에 플라스미드 DNA의 결합을위한...

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

utero의 electroporation에서 개발 중추 신경계 (CNS)에서 공간과 temporally 제어 방식으로 신속한 유전자 전달 수 있습니다. 여기서 우리는 telencephalon, diencephalon 및 망막을 포함한 여러 배아 CNS의 도메인으로 표현 구조를 제공하는 데 사용할 수있는 utero의 electroporation 프로토콜에 매우 적응을 설명합니다.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

Craniofacial 연골은 다른 조직들과 긴밀한 접촉을 개발하고 살아있는 동물의 조작 어렵습니다. 우리는 초기 배아 효과를 우회하면서 craniofacial 골격의 성장하는 동안 분자 도구를 제공하는 electroporation을 사용하고 있습니다. 이러한 접근 방식은 우리가 효율적으로 후보 분자를 테스트하실 수...

Craniofacial Mesenchyme의 Electroporation

이 비디오는 자궁 내 전기천공법을 사용하여 쥐 배아의 소뇌 신경 세포에 플라스미드 DNA를 전달하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 정상적인 뇌 발달에서 유전자의 생체 내 기능과 종양 진행 중 뉴런 세포의 유전자 발현 변화를 이해하는 데 유용합니다.

자궁 전기천공법 기반 유전자 전달: 쥐 배아의 배아 소뇌 세포에 플라스미드 DNA를 주입하는 기술

우리는 신생아 subventricular 영역 electroporation라고 최소한 침입 기술을 보여줍니다. 기술은 신생아 새끼의 측면 심실에 플라스미드 DNA를 주입하고 전달하는 전기 전류를 적용 구성되어 있으며, 유전자 신경 줄기 세포를...

신생아 Subventricular 지대 Electroporation

이 절차는 자궁 내 전기천공법을 통해 발달 중인 마우스 전뇌의 인터뉴런을 표적으로 삼는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 피질의 표재층으로 향하는 중간뉴런 아형에서 선택적 유전자 발현을 달성하는 데 특히 효율적이었습니다.

두피의 interneurons의 하위 유형 선택적 일렉트로

이 논문은 단일 세포 수준과 형광 표지 된 뉴런의 흥분성 뉴런의 연결 구조를 설명하는 자궁 전기 (IUE)에서 사용하는 프로토콜을 제공한다. 조직학은 수지상 및 축삭 돌기를 특성화하는 데 사용됩니다. 급성 슬라이스 전체 셀 기록 흥분성을 조사하기 위해 사용된다.

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

자궁 전기기화의 이중은 공간적으로 그리고 일시적으로 분리되는 세포 집단을 표적으로 할 수 있습니다. 이 기술은 정상 조건에서 형광 단백질을 사용하여 그 세포 인구 사이 상호 작용을 구상하는 데 유용하지만 기능적 실험 후 관심의 유전자를 어지니로 조정합니다.

자궁에서 두 배의 자궁 전기화는 시간적으로 그리고 공간적으로 분리된 세포 인구를 표적으로 합니다

다공성 기판 전기천공법(PSEP)은 높은 세포 생존율과 일관되고 높은 처리량 전달을 결합합니다. 경상피 전기 임피던스(TEEI) 측정의 도입은 PSEP의 중간 프로세스에 대한 통찰력을 제공하고 무표지 전달을 가능하게 합니다. 이 기사에서는 PSEP 전달 실험과 TEEI 측정 분석을 동시에 수행하는 방법에 대해 설명합니다.

Transepithelial Electrical Impedance Monitoring을 사용한 다공성 기판 기반 전기천공법

배우세요 신생아 피아 표면 신경전구세포의 유전자 조작 방법을 전기천공법으로. 이 기술은 신경발달 및 세포 분화 연구에 필수적인 도구로 활용됩니다.

신생아 Pial 표면 에레

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