3 차원 조직학 볼륨 및 마우스 유방 땀샘을 연구에의 응용의 재구성

다음 영상의 전반적인 목적은 유선 세포의 거시 구조 변화를 연구하기 위한 3차원 조직학적 이미지 등록 방식 및 볼륨 재구성 방법을 제시하는 것입니다. 이를 위해 야생형 및 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 7(IGF BP seven) 결핍 마우스에서 수유 시작 3일 후 유선을 적출합니다. 그 후 적출된 유선은 처리 과정을 거쳐 절편 제작을 위해 파라핀 블록에 매립됩니다.

다음으로 조직 블록 단면의 광학 이미지를 촬영하고 조직 블록을 절편화합니다. 절편들의 이미지를 촬영한 후 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 각 절편을 해당 블록 단면 이미지와 정렬함으로써 유선 조직의 조직학적 볼륨을 재구성합니다. 결과 데이터는 돌연변이형과 야생형 유선의 크기 차이를 명확히 보여줍니다.

3차원 공초점 이중 현미경과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 훨씬 더 넓은 공간 범위에 대한 정보를 제공한다는 것입니다. 이 방법은 다양한 장기의 3D 고해상도 분석을 생성하는 것뿐만 아니라, 체적 의료 영상 및 치료 분야의 새로운 기술과 알고리즘을 조사하고 검증하는 데에도 사용될 수 있습니다. 이렇게 재구성된 조직학적 체적은 등록 오류의 전파 없이 시료 처리 과정을 신뢰성 있게 나타냅니다.

저희는 IGF P seven null 마우스의 한 배 배수 크기가 더 작고 여러 번의 대규모 산란을 유지하지 못한다는 점에 주목하여 이 방법의 아이디어를 처음 얻었으며, 이에 따라 이들의 유선 구조를 조사하기로 결정했습니다. 조직을 파라핀에 임베딩한 후, 회전식 마이크로톰을 사용하여 과잉 파라핀이 제거될 때까지 블록을 다듬습니다. 다음으로, 수직 밀링 머신을 사용하여 파라핀 블록의 최소 두 모서리에 카세트 마운트와 수직이 되도록 1 mm 구멍을 뚫고, 조직 블록을 회전식 마이크로톰에 장착합니다.

다음으로 마이크로톰 앞에 블록 표면 이미징 시스템을 설정하려면, 조직 블록 표면에서 약간 비스듬한 각도로 텔레 렌즈가 장착된 카메라를 배치하십시오. 카메라는 마이크로톰 앞의 컴퓨터에 연결되어 있어야 합니다. 그런 다음 카메라가 블록에서 반사되는 빛을 포착할 수 있도록 블록 앞에 광원을 배치하십시오.

블록 표면의 조직이 주변 파라핀과 쉽게 구별될 때까지 카메라 각도를 조절합니다. 광학 블록 면 이미지 한 장을 캡처합니다. 그런 다음 마이크로톰을 사용하여 5 µm 두께의 절편 4개로 구성된 리본을 절단합니다.

리본을 냉수조로 옮겨 리본의 각 섹션을 분리한 후, 두 번째와 네 번째 섹션을 냉수에서 떠서 슬라이드 위에 올립니다. 이를 온수조로 옮겨 주름을 폅니다. 두 번째와 네 번째 섹션을 선택하면 섹션 사이에 5 µm의 간격이 생깁니다.

주름이 펴지면, 스쿠핑(scooping) 방식으로 절편을 현미경 슬라이드에 다시 부착합니다. 이전과 마찬가지로 절편의 절단, 부착 및 주름 제거 과정에서 찢어짐, 접힘, 수축, 팽창과 같은 일부 왜곡이 발생할 수 있음에 유의하십시오. 이러한 아티팩트는 조직학적 절편의 레지스트레이션(registration)을 어렵게 만듭니다.

자동 염색기를 사용하여 절편을 h 및 d로 염색합니다. 그다음 자동 커버슬립 장치를 사용하여 슬라이드에 커버슬립을 덮습니다. 디지털 조직 슬라이드 스캐너를 사용하여 원하는 해상도로 슬라이드를 디지털화합니다. 본 프로토콜에서 배율은 20x이며 해상도는 0.47 microns입니다.

비디오의 이 섹션에서는 이미지 정합 과정에 대해 설명합니다. 이 과정은 본 실험실에서 개발한 맞춤형 소프트웨어와 MATLAB C++ 및 ITK를 결합하여 수행됩니다. 우선 조직학 이미지를 블록 면(block face) 이미지의 해상도로 다운샘플링하는 것으로 시작합니다. 이렇게 하면 조직학 이미지의 크기가 0.026 배로 축소됩니다.

다음으로, 이미지 분할 및 지점 선택을 위해 MATLAB에서 블록 단면 이미지 몇 장을 열고 데이터 커서 도구를 사용하여 정렬 구멍의 픽셀 값을 측정합니다. 정렬 구멍을 분할하기 위해 평균 픽셀 값을 고정 임계값으로 사용하십시오. 불필요한 분할 영역을 제거하려면 분할된 객체의 원형도와 면적을 이용하여 구멍만 남기고 나머지 분할 영역은 제거하십시오.

다음으로, 각 유선에 대해 하나의 블록 단면 이미지를 기준 이미지로 선택합니다. 나머지 블록 단면 이미지의 등록 홀 중심을 기준 이미지의 등록 홀 중심에 맞춥니다. 그런 다음 등록 홀을 통해 얻은 변환 행렬을 사용하여 블록 단면 이미지들을 정렬하고, 정렬된 블록 단면 이미지에서 h 및 d 섹션의 조직을 배경으로부터 수동으로 분할하거나 추출합니다.

OSU 임계값 설정 기법을 사용하여 배경으로부터 이미지를 분할하고 조직학 이미지의 이진 마스크를 생성합니다. 다음으로, 레이블링된 객체의 히스토그램을 이용하여 각 마스크에서 가장 크기가 큰 객체를 식별하고 선택합니다. 조직학 마스크와 블록 면 마스크 모두에서 1픽셀 너비의 경계 지점을 추출합니다.

다음으로, 푸리에 기술자(Fourier descriptors) 알고리즘을 사용하여 조직학 경계점과 그에 대응하는 블록 단면 이미지 사이의 초기 강체 변환(rigid transform)을 찾습니다. 이 초기 변환에는 평행 이동, 회전 및 배율 인자가 포함됩니다. 이전 단계에서 얻은 초기 변환을 사용하여 각 조직학 이미지를 변환합니다.

강체 등록(rigid registration)을 정밀하게 수행하기 위해, 롤링 볼 필터(rolling ball filter)를 사용하여 조직학적 윤곽선에서 곡률이 높은 가장자리 섹션을 제거합니다. 그다음, 균일 분포를 사용하여 남은 조직학적 경계점 중에서 500개의 점을 무작위로 선택합니다. 푸리에 기술자(Fourier descriptors)로부터 얻은 초기 변환을 사용하여 조직학적 경계점을 변환합니다.

블록 표면 경계점들을 사용하고 반복 최근접점(iterative closest points) 알고리즘을 이용하여 블록 표면 경계점과 조직학적 분석 결과 사이의 강체 변환(rigid transformation)을 구합니다. 무작위 경계점들을 설정합니다. 그 후, 이전 단계에서 얻은 조직학 이미지를 변환하여 3D 시각화 소프트웨어 내에 조직학적 볼륨의 시각적 이미지를 생성합니다.

Me vis lab에서 modules, file miscellaneous를 선택하고 add the composed 3D from 2D files 모듈을 추가하십시오. 그런 다음 메뉴에서 image를 선택하고 image property convert 모듈을 추가하십시오. 마지막으로 modules visualization 3D viewers에서 view 3D 모듈을 추가하십시오.

'compose 3D from 2D files'를 더블 클릭하여 이미지를 불러온 후 'create 3D'를 클릭하십시오. 'image property convert'를 더블 클릭하여 복셀 크기를 조정하고, 복셀 크기를 0.018 0.018 0.01로 설정하십시오. 'view 3D'를 더블 클릭하여 볼륨을 확인하십시오.

마지막으로, 동봉된 문서의 단계에 따라 5배 배율로 이미지 스택을 관찰하십시오. IGFBP7 결핍 상태를 더 정확하게 규명하기 위해, 본 문서에 기술된 바와 같이 유방샘의 3D 재구성을 수행하였습니다. 이 그림들은 야생형 및 null 유방샘의 재구성된 조직학적 볼륨을 보여줍니다.

오른쪽의 돌연변이 샘이 왼쪽의 야생형보다 더 짧고 좁지만, 깊이는 야생형 샘이 1.06 millimeters, null 샘이 1.02 millimeters로 거의 동일하다는 점에 유의하십시오. 또한, 왼쪽의 야생형 샘은 분홍색 에오신 염색으로 표시된 기질 조직이 거의 없는 반면, 오른쪽의 null 샘은 주로 기질 조직으로 구성된 것으로 보인다는 점에 주목하십시오. 여기서 핵이 있는 세포를 식별하는 헤마토실린 염색 결과, 야생형 샘은 주로 선 구조를 포함하고 있는 반면 null 샘은 그 밀도를 유지하고 있음을 보여줍니다.

이를 추가로 조사하기 위해 림프절 부위의 고해상도 이미지를 정렬하였습니다. 우유로 채워졌을 큰 구조물들이 관찰됩니다. 반면, IGFBP7 null 샘에는 잘 발달된 구조물이 거의 없습니다.

또한, 이러한 구조들은 섬유아세포와 유사한 세포들로 밀집되어 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 연속 절편 스캔 데이터를 재구성하여 장기의 3D 재구성을 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 좋습니다. 이제 이 절차를 수행할 때, 슬라이드와 스캔의 수가 매우 많으므로 이들을 일관되게 명명하는 것이 중요하며, 순차적인 정리가 이 절차를 성공적으로 수행하는 핵심이라는 점을 기억하시기 바랍니다.

혈관이 어떻게 종양에 침투하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 특정 세포 및 질병 마커에 대한 면역조직화학염색과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.