Name: 3 차원 조직학 볼륨 및 마우스 유방 땀샘을 연구에의 응용의 재구성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 배우세요 마우스 유방 땀샘의 3차원 조직학 볼륨 재구성 방법을 통해 세포 거시구조 변화를 분석하는 기술입니다. 이 이미지 정합 기법은 야생형과 Igfbp7 결손형 마우스 간의 구조적 차이를 밝히는 데 활용됩니다.

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저자는 조직학 서비스에 대해 Sunnybrook Research Institute의 Biomarker Imaging Research Laboratory(BIRL)에 감사를 표합니다. 이 작업에 대한 지원은 Terry Fox Foundation, Canadian Breast Cancer Foundation-the Prairie-NWT 및 CIHR 보조금 #MOP-97996에서 제공했습니다.

1. 표본 <ol><li> 사흘 수유의 발병을 게시 야생형 CDH1에서 수술 유방 동맥뿐만 아니라 IGFBP7 널 마우스를 절제. </li><li> 기본 유선 형태를 회복하는 데 도움이 유리 슬라이드에 분비를 확산. </li></ol> 2. 고정 및 조직 처리 <ol><li> 4 O C.에서 중립 버퍼 4 % PFA O / N에있는 유방 동맥 수정 </li><li> 이전 조직 처리에 70 % 에탄올에 분비를 저장합니다. </li><li> 작은 조직 처리 카세트에 분비를 전송합니다. </li><li> 자동 조직 프로세서를 사용하여 조직을 처리 <ol><li> 45 분 자일 렌의 1 시간과 2 시간 동안 100 % 에탄올, 45 분 동안 95 %의 에탄올에 45 분, 2 회 3 회 70 % 에탄올 에탄올, 자일 렌 화장실을 증가하는 조직을 탈수. </li><li> 인가 압력이 진공에서 1 시간마다 파라핀 3 회에 조직을 침투. </li></ol></li><li> 블록을 형성하기 위해 파라핀의 조직을 포함, 절편. </li></ol> 3. 조직학 및 Blockface 영상 <ol><li> 과량의 파라핀이 제거 될 때까지 회전 마이크로톰을 사용하여 파라핀 블록을 트림. </li><li> 카세트에 수직 파라핀 블록의 적어도 두 모서리 1 ㎜의 구멍을 드릴 수직 밀링 기계를 사용한다. </li><li> 회전하는 마이크로톰의 조직 블록을 설치합니다. </li><li> 마이크로톰 앞에 blockface 이미징 시스템 (19)을 설정합니다. </li><li> 이전 절편을 광학 blockface 이미지를 캡처합니다. </li><li> 마이크로톰에 5 μm의 두께로 네 부분의 리본을 잘라. <ol><li> 차가운 물을 욕조에 리본을 전송합니다. </li><li> 리본의 제 2 및 제 4 섹션을 분리하고 현미경 슬라이드에 그들을 마운트합니다. 제 2 및 제 4 섹션을 선택하면 부분 사이에 5 μm의 간격을 제공합니다. </li><li> 는 현미경 슬라이드에 다시 장착 한 후, 그것을 unwrinkle에 따뜻한 물을 욕조 (48 오 C)의 각 섹션을 확장합니다. 참고 : C우팅,, 설치 섹션 같은 눈물, 배, 수축, 팽창 등의 부분에 약간의 왜곡을 일으킬 unwrinkling. 이러한 아티팩트는 조직학 섹션의 등록을 복잡. </li><li> 자동 염색기를 사용하여 H &amp; E와 섹션을 얼룩. </li><li> 자동 coverslipper를 사용하여 슬라이드를 커버 슬립. </li><li> 또한 해상도로 디지털 조직학 슬라이드 스캐너를 사용하여 슬라이드를 디지털화. 이 프로토콜에 대한 배율은 20 배이며, 해상도는 0.47 μm의 수 있습니다. </li><li> blockface 이미지, 18 μm의 해상도에 조직학 이미지를 다운 샘플링. </li></ol></li></ol> 4. 이미지 등록 <ol><li> 이미지 분할 포인트 선택 <ol><li> blockface의 이미지는 등록 구멍의 화소 값을 측정하고 세그먼트 파라핀 블록의 모서리에있는 등록의 홀에 고정 된 임계 값으로서 평균값을 사용한다. </li><li> 몇 가지 추가 부품도에 의해 분할 될 수 있기 때문에고정 된 임계 값을 사용하여, 원형도 및 정공을 찾아 여분 오브젝트를 폐기 세그먼트 객체의 영역을 사용한다. 이렇게 작은 코드를 작성하고 분할 된 개체에 대한 (4π X 면적) / (주변) 2의 비율을 찾을 수 있습니다. 둥근 물체에 대한이 비율은 1입니다. </li><li> 각 유선 들어, 참조로 한 blockface 콘텐츠를 선택하고 등록 구멍 및 경계표 기반 등록 기술의 중심을 이용하여 기준에 blockface 이미지의 나머지를 정렬. </li><li> 정렬 blockface의 이미지에 대해서는, 수동 세그먼트 또는 배경에서 조직을 추출합니다. 프로토콜의 나머지 부분에 대한 마스크의 대부분 상당한 크기의 개체를 사용합니다. </li><li> H &amp; E에 대한 부분은 자동 분할 아래의 단계를 따릅니다. <ol><li> 배경에서 세그먼트 이미지에 오쓰 임계 기술 (20)를 사용하고 조직학 이미지의 바이너리 마스크를 만들 수 있습니다. </li><li> 식별 및 시간을 사용하여 각 마스크에 가장 상당한 개체를 선택표시된 개체의 istogram. </li><li> 조직학 및 blockface 마스크 모두에서 폭이 1 픽셀 경계 지점의 압축을 풉니 다. </li><li> 조각 별 선형의 시퀀스에 의해 경계 지점을 나타내는, 사슬 코드 알고리즘 (21)을 사용하여 적합하다. </li></ol></li></ol></li><li> 초기 강성 등록 <ol><li> 초기 강성은 조직학의 경계 지점 및 해당 blockface 이미지 사이의 변환을 찾기 위해, 푸리에 기술자에게 알고리즘 (22)를 사용합니다. 이 초기 변환은 변환, 회전 및 배율 요소가 포함되어 있습니다. </li><li> 초기는 이전 단계에서 수득되는 변환 각각 조직학 콘텐츠 변환. </li></ol></li><li> 엄밀한 등록 제련 <ol><li> 롤링 볼 필터 (23)를 사용하여 조직 학적 윤곽에서 곡률의 가장자리 부분을 제거합니다. </li><li> 무작위로 균일 한 분포를 사용하여 나머지 조직 학적 경계 지점에서 500 포인트를 선택합니다. </li><li> 변환푸리에 설명에서 얻은 초기 변화와 조직 학적 임의의 경계 지점. </li><li> blockface 경계 지점의 전체 집합을 선택하고 blockface 경계 지점, 대상 및 조직학 임의의 경계 지점의 강성 변화를 찾기 위해 반복 가장 가까운 포인트 (ICP) 알고리즘 (24)를 사용합니다. </li><li> 정렬 조직학 이전 단계에서 얻은 이미지와 정렬 조직학 이미지의 스택 조직학 볼륨을 생성하고 변환 할 수 있습니다. </li><li> 조직학 볼륨의 시각적 이미지를 만드는 3D 시각화 소프트웨어를 사용합니다. </li></ol></li><li> 배의 배율로 이미지의 스택보기 <ol><li> 배율 5 배 원래 조직학 이미지를 다운 샘플링. </li><li> 조직학 이미지 중 하나에 관심 영역을 자릅니다. </li><li> 등록이 단계에서 강성 변환의 조합을 사용하여 다른 5X 조직학 이미지에 해당 영역의 위치를​​ 계산한다. </li><li> REGI 자르기다른 모든 조직 학적 이미지에 같은 크기의 영역으로 그 기능. </li><li> 마지막으로 수동으로 영역 사이의 정렬을 구체화합니다. 두 개의 이미지를 오버레이 및 회전과 다른 하나 이상의 이미지 중 하나의 번역에 대한 값을 선택할 수 있도록 한 다음 정렬이 허용됩니다 변환 된 이미지를 저장하는 프로그램을 작성하라. </li><li> 3D 시각화 소프트웨어를 사용하여 정렬 배 조직학 영역의 스택을 볼 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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이 연구에서, 우리는 조직을 왜곡 할 수있는 조직 내에서 내부 무작위로 선택된 랜드 마크 또는 이식 기준 마커를 필요로하지 않는 직렬 2D 조직학 이미지에서 3D 조직학 볼륨을 재구성하기 이미지 등록 워크 플로우를 개발했습니다. 기재된 방법에 의해, 광 blockface 이미지 자체는 종래 구획에 참조 화상으로서 사용된다. 우리는 blockface 이미지 정렬을 돕기 위해 및 카메라 앞에서 파라핀 블록의 2 차원 횡 이동을 정정하기 파라핀 블록에서 드릴 된 외부 구멍을 사용한다. 불완전한 직렬 섹션 블록에서 발생할 때에도 차원 조직학 이미지는, 레지스트레이션 오차의 전파를 방지하고 정확한 조직학 볼륨을 재구성 대응 blockface 2D 이미지로 정렬된다. 조직의 종류와 조직학 얼룩의 플로 독립적 만들기 위하여는, 경계점은 등록을 수행하는 데 사용된다. 이 점베이스D의 접근 방식은 매우 큰 디지털 병리 이미지에 대처하기 위해 더 적은 계산을 요구하기 때문에 더 할 수 있는지 (강도 기반의 접근 방식을 통해) 장점이 있습니다. ...

IGFBP7 (단백질 7 바인딩 성장 인자와 같은 인슐린)는 IGF-결합 단백질 가족의 일원이며, IGF1 수용체 4를 결합하기 위해 표시되었습니다. 이종 이식 종양 모델에서 IGFBP7의 재 도입이 크게 세포 사멸과 세포 노화 (7)의 유도를 통해 6 성장 종양을 억제하면서 IGFBP7의 하향 조정은, 유방암 5의 나쁜 예후와 상관 관계가있는 것으로 알려져있다. IGFPB7의 효과를 연구하기 위해, IGFBP7 null이 마우스는 5 (게시되지 않은 데이터)를 만들었습니다. 이 마우스가 종양을 개발하지 않는 동안, 난소, 근육과 간 조직 학적 변화뿐만 아니라 유선 발달 패턴 (게시되지 않은 데이터)의 결함을 보여줍니다. 널 마우스는 작은 쓰레기 크기가 여러 큰 새끼 (게시되지 않은 데이터)를 유지 할 수없는 등 결함이 표현형을 먼저 표시했다. 3D 조직학 볼륨 유용 INFORMAT을 제공하는 잠재력을 가지고부피 의료 영상의 병리 소견의 양적 비교 분석과 평가를 위해 이온. 입체 촛점, 이광자 현미경 지역 범위 (14)에서 동맥의 고해상도 세포 형태 학적 정보를 제공 할 수 있지만, 볼과 깊이의 제한된 필드를 갖는다. 조직학 볼륨 재구성이 훨씬 더 큰 공간 범위를 통해 자세한 정보를 제공합니다. 약간의 왜곡이 같은 수축, 팽창, 눈물, 그리고 주름 등의 조직 학적 섹션의 준비 기간 동안 예상되는 전통적인 접근 방법을 사용. 이러한 왜곡은 어려운 3D 볼륨을 재구성하는 3 차원 스택으로 직렬 조직학 이미지를 등록 할 수 있습니다. 결함 연속 섹션 수를 그대로 섹션 사이의 유사성을 증가함에 따라 감소하고 결과적 등록 프로세스는 더욱 복잡하게된다. 다른 방법은 조직 학적 섹션을 등록하고 연속 조직학 VO를 생성하는 것이 제안되어있다륨. 일부 기술은 강도의 변화 (8)에 따라, 그리고 다른 사람은 섹션 9의 모양을 기반으로합니다. 일부 시편 해부 구조는 랜드 기반 등록 방법 12,13와 함께 마크 (10, 11)로서 사용될 수있다. 그러나 이러한 내부 구조는 전체 볼륨에 걸쳐 더 신뢰할 수있는 해부학 적 구조를 식별 할 수있는 표본에 대해 감지하지 않을 수 있습니다. 일부 그룹은 짝 등록 방법을 사용하고 연속 조직학 이미지보기 윤곽 또는 해부학 적 구조를 16 ~ 18을 사용하여 다른 하나를 등록했습니다. 참조 이미지의 사용없이 서로 직렬 조직학 섹션 등록은 레지스트레이션 오차를 전파하고 조직학 볼륨의 실제 형상을 변경할 수있다. 쌍대 등록 방법은 이미지의 스택에 걸쳐 조직학 섹션 및 내부 구조물의 형상의 일관성에 의존한다; 그 때문에, 시료의 치밀 샘플링을 요구하는임상 검체에 대한 예를 들어, 수도 항상 가능한 것은 아니다. 이 파이프 라인에서 우리는 조직 학적 볼륨 재구성 19 참조 이미지의 집합으로 blockface 이미지를 사용합니다. Blockface 이미지는 마이크로톰에 장착 한 후 파라핀 조직 블록으로 촬영되며 각 섹션은 절단하기 전에. 따라서, 각각의 시리얼 섹션 컷 손상 시리얼 섹션 8,11,15의 등록을 방해하지 않습니다. 우리는 다른 그룹에서 다른 방식 blockface 이미지를 캡처. 광학 블록 얼​​굴 이미지는 광학 정기적으로 렌즈를 사용할 때 일반적으로 발생 배럴 및 관점 왜곡을 제거하거나 최소화하기 위해 텔레 센 트릭 렌즈에 의해 얻을 수있다. 이 레귤러 렌즈를 사용 blockface 촬상을 수행 게시 된 다른 방법을 통해 제안 된 방법의 장점 중 하나이다. 이미지는 담배 마는 간의 콘트라스트 개선을위한 블록의 표면의 반사를 사용하여 약간 비스듬한 각도에서 찍은UE와 파라핀 표면과 파라핀 표면 아래 깊이에서 조직의 그림자를 제거하는 방법. 사진 필터는 블록 표면 및 콘트라스트 19 균형 조직으로부터 나오는 광을 편광하기 위해 사용된다. 회전하는 마이크로톰에 블록의 변위를 교정하려면 2-3 구멍 blockface 이미지를 쉽게 감지 할 수있는 블록의 모서리에 드릴 수 있습니다. 이 구멍의 무게 중심은 blockface 이미지를 정렬하는 랜드 마크 기반의 엄격한 등록과 함께 사용된다.

<table><tbody><tr><td>16% PFA</td><td>VWR International</td><td>15710</td><td>16% 파라포름알데히드 용액</td></tr><tr><td>소형 조직 처리 카세트</td><td>VWR International</td><td>CA95029-956</td><td></td></tr><tr><td>Leica ASP300 자동 조직 처리기</td><td>Leica</td><td>14047643515</td><td></td></tr><tr><td>100% 에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25307B</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR International&nbsp;</td><td>CA95057-822</td><td></td></tr><tr><td>파라핀&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>39501006</td><td>Paraplast 조직 임베딩 매체</td></tr><tr><td>Leica EG 1160 임베딩 센터</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica 로터리 마이크로톰</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>밀링 머신</td><td>Argo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>VWR International&nbsp;</td><td>CA48312-015</td><td></td></tr><tr><td>H& E stain</td><td>VWR International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자동 염색기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>커버슬립&nbsp;</td><td>VWR 국제공항&nbsp;</td><td>48404-452</td><td></td></tr><tr><td>MEDITE RCM 7000 유리 커버슬리퍼</td><td>MEDITE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SCN400 슬라이드 스캐너</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks Inc</td><td>MATLAB 2007b</td><td>개발 소프트웨어</td></tr><tr><td>MeVisLab</td><td>MeVis Medical Solutions AG</td><td>MeVisLab 2.1</td><td>3D 시각화 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

3 차원 조직학 볼륨 및 마우스 유방 땀샘을 연구에의 응용의 재구성

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

조직학 볼륨 재구성 된 3D 형상 및 셀 이루어진 macrostructures의 수준에서 장기의 부피 변화의 연구를 용이하게한다. 또한 부피 의료 영상 및 치료에 새로운 기술과 알고리즘을 조사하고 유효성을 검사 할 수 있습니다. 다른 장기 1,2,3의 3D 고해상도지도 책 만들기 조직학 볼륨 재건의 또 다른 응용 프로그램입니다. 이 조직 구조 및 다양한 세포 기능 간의 공간 관계를 조사하기위한 자원을 제공한다. 우리는 광 blockface 이미지 세트를 사용 조직학 대량 재건을위한 이미지 등록 방식을 제시한다. 재구성 된 조직학 볼륨없이 전파되는 후 처리 등록 오류로 처리 된 시편의 신뢰할 수있는 모양을 나타냅니다. 두 개의 마우스 유방 땀샘의 hematoxylin 및 eosin (H &amp; E) 염색 부분은 ED에서 추출 된 경계 지점을 사용하여 해당 blockface 이미지에 등록 된조직학 및 blockface 이미지에서 시편의 GES. 등록의 정확성은 육안으로 평가 하였다. 유 방 땀 샘의 macrostructures의 정렬은 시각적으로 높은 해상도로 평가되었다. 이 연구는 유선의 절제에서 3D 조직학 볼륨 재구성을 통해 이르기까지,이 이미지 등록 파이프 라인의 여러 단계를 묘사한다. 2D 조직학 이미지 섹션 쌍 간의 구조적 차이점을 계시하면서, 3 차원 조직학 부피는 모양과 젖샘의 체적의 차이를 시각화 할 수있는 능력을 제공한다.

전통적인 기법 현미경 함정 미세한 수준에서 기관의 이해는 한번에 하나의 시야에 한정된다는 점이다. 심지어 전체 슬라이드 섹션을 제공 &quot;전체 개시&quot;슬라이드, 입체 정보를 제공하지 못한다. 전체 슬라이드, 동적 인 스캐닝 기술, 전체가 부분을 볼 수있는 우리의 능력이 증가의 발전 그러나 구조를 추정하는 것은 3D 조직학 볼륨 재구성이 필요합니다. 더 IGFBP7 널 마우스의 결핍을 특징, 유 방 땀 샘의 3D 재구성이 비유의 3 일 포스트 개시를 절제 땀샘에서 수행 하였다. 그림 1은 3 차원의 조직 학적 재구성을위한 제안 된 기법의 파이프 라인을 보여줍니다. blockface 이미지가 제 파라핀 블록의 모서리에있는 구멍으로 정렬된다. 2A-B는 야생형 및 IGFBP7 널 mamm의 blockface 볼륨을 보여준다진 샘이었다. 조직학 이미지는 다음 조직학 볼륨을 복구하기...

우리는 세포로 구성된 거시 구조 수준에서 기관의 변화에 대한 연구를 용이하게하는 3 차원 (3D) 조직학 볼륨 재구성을위한 이미지 등록 접근 방식을 제시합니다. 이 접근법을 사용하여 야생형과 Igfbp7-null 유선의 3차원 변화를 연구했습니다.

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

다음 영상의 전반적인 목적은 유선 세포의 거시 구조 변화를 연구하기 위한 3차원 조직학적 이미지 등록 방식 및 볼륨 재구성 방법을 제시하는 것입니다. 이를 위해 야생형 및 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 7(IGF BP seven) 결핍 마우스에서 수유 시작 3일 후 유선을 적출합니다. 그 후 적출된 유선은 처리 과정을 거쳐 절편 제작을 위해 파라핀 블록에 매립됩니다.다음으로 조직 블록 단면의 광학 이미지를 촬영하고 조직 블록을 절편화합니다. 절편들의 이미지를 촬영한 후 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 각 절편을 해당 블록 단면 이미지와 정렬함으로써 유선 조직의 조직학적 볼륨을 재구성합니다. 결과 데이터는 돌연변이형과 야생형 유선의 크기 차이를 명확히 보여줍니다.3차원 공초점 이중 현미경과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 훨씬 더 넓은 공간 범위에 대한 정보를 제공한다는 것입니다. 이 방법은 다양한 장기의 3D 고해상도 분석을 생성하는 것뿐만 아니라, 체적 의료 영상 및 치료 분야의 새로운 기술과 알고리즘을 조사하고 검증하는 데에도 사용될 수 있습니다. 이렇게 재구성된 조직학적 체적은 등록 오류의 전파 없이 시료 처리 과정을 신뢰성 있게 나타냅니다.저희는 IGF P seven null 마우스의 한 배 배수 크기가 더 작고 여러 번의 대규모 산란을 유지하지 못한다는 점에 주목하여 이 방법의 아이디어를 처음 얻었으며, 이에 따라 이들의 유선 구조를 조사하기로 결정했습니다. 조직을 파라핀에 임베딩한 후, 회전식 마이크로톰을 사용하여 과잉 파라핀이 제거될 때까지 블록을 다듬습니다. 다음으로, 수직 밀링 머신을 사용하여 파라핀 블록의 최소 두 모서리에 카세트 마운트와 수직이 되도록 1 mm 구멍을 뚫고, 조직 블록을 회전식 마이크로톰에 장착합니다.다음으로 마이크로톰 앞에 블록 표면 이미징 시스템을 설정하려면, 조직 블록 표면에서 약간 비스듬한 각도로 텔레 렌즈가 장착된 카메라를 배치하십시오. 카메라는 마이크로톰 앞의 컴퓨터에 연결되어 있어야 합니다. 그런 다음 카메라가 블록에서 반사되는 빛을 포착할 수 있도록 블록 앞에 광원을 배치하십시오.블록 표면의 조직이 주변 파라핀과 쉽게 구별될 때까지 카메라 각도를 조절합니다. 광학 블록 면 이미지 한 장을 캡처합니다. 그런 다음 마이크로톰을 사용하여 5 µm 두께의 절편 4개로 구성된 리본을 절단합니다.리본을 냉수조로 옮겨 리본의 각 섹션을 분리한 후, 두 번째와 네 번째 섹션을 냉수에서 떠서 슬라이드 위에 올립니다. 이를 온수조로 옮겨 주름을 폅니다. 두 번째와 네 번째 섹션을 선택하면 섹션 사이에 5 µm의 간격이 생깁니다.주름이 펴지면, 스쿠핑(scooping) 방식으로 절편을 현미경 슬라이드에 다시 부착합니다. 이전과 마찬가지로 절편의 절단, 부착 및 주름 제거 과정에서 찢어짐, 접힘, 수축, 팽창과 같은 일부 왜곡이 발생할 수 있음에 유의하십시오. 이러한 아티팩트는 조직학적 절편의 레지스트레이션(registration)을 어렵게 만듭니다.자동 염색기를 사용하여 절편을 h 및 d로 염색합니다. 그다음 자동 커버슬립 장치를 사용하여 슬라이드에 커버슬립을 덮습니다. 디지털 조직 슬라이드 스캐너를 사용하여 원하는 해상도로 슬라이드를 디지털화합니다. 본 프로토콜에서 배율은 20x이며 해상도는 0.47 microns입니다.비디오의 이 섹션에서는 이미지 정합 과정에 대해 설명합니다. 이 과정은 본 실험실에서 개발한 맞춤형 소프트웨어와 MATLAB C++ 및 ITK를 결합하여 수행됩니다. 우선 조직학 이미지를 블록 면(block face) 이미지의 해상도로 다운샘플링하는 것으로 시작합니다. 이렇게 하면 조직학 이미지의 크기가 0.026 배로 축소됩니다.다음으로, 이미지 분할 및 지점 선택을 위해 MATLAB에서 블록 단면 이미지 몇 장을 열고 데이터 커서 도구를 사용하여 정렬 구멍의 픽셀 값을 측정합니다. 정렬 구멍을 분할하기 위해 평균 픽셀 값을 고정 임계값으로 사용하십시오. 불필요한 분할 영역을 제거하려면 분할된 객체의 원형도와 면적을 이용하여 구멍만 남기고 나머지 분할 영역은 제거하십시오.다음으로, 각 유선에 대해 하나의 블록 단면 이미지를 기준 이미지로 선택합니다. 나머지 블록 단면 이미지의 등록 홀 중심을 기준 이미지의 등록 홀 중심에 맞춥니다. 그런 다음 등록 홀을 통해 얻은 변환 행렬을 사용하여 블록 단면 이미지들을 정렬하고, 정렬된 블록 단면 이미지에서 h 및 d 섹션의 조직을 배경으로부터 수동으로 분할하거나 추출합니다.OSU 임계값 설정 기법을 사용하여 배경으로부터 이미지를 분할하고 조직학 이미지의 이진 마스크를 생성합니다. 다음으로, 레이블링된 객체의 히스토그램을 이용하여 각 마스크에서 가장 크기가 큰 객체를 식별하고 선택합니다. 조직학 마스크와 블록 면 마스크 모두에서 1픽셀 너비의 경계 지점을 추출합니다.다음으로, 푸리에 기술자(Fourier descriptors) 알고리즘을 사용하여 조직학 경계점과 그에 대응하는 블록 단면 이미지 사이의 초기 강체 변환(rigid transform)을 찾습니다. 이 초기 변환에는 평행 이동, 회전 및 배율 인자가 포함됩니다. 이전 단계에서 얻은 초기 변환을 사용하여 각 조직학 이미지를 변환합니다.강체 등록(rigid registration)을 정밀하게 수행하기 위해, 롤링 볼 필터(rolling ball filter)를 사용하여 조직학적 윤곽선에서 곡률이 높은 가장자리 섹션을 제거합니다. 그다음, 균일 분포를 사용하여 남은 조직학적 경계점 중에서 500개의 점을 무작위로 선택합니다. 푸리에 기술자(Fourier descriptors)로부터 얻은 초기 변환을 사용하여 조직학적 경계점을 변환합니다.블록 표면 경계점들을 사용하고 반복 최근접점(iterative closest points) 알고리즘을 이용하여 블록 표면 경계점과 조직학적 분석 결과 사이의 강체 변환(rigid transformation)을 구합니다. 무작위 경계점들을 설정합니다. 그 후, 이전 단계에서 얻은 조직학 이미지를 변환하여 3D 시각화 소프트웨어 내에 조직학적 볼륨의 시각적 이미지를 생성합니다.Me vis lab에서 modules, file miscellaneous를 선택하고 add the composed 3D from 2D files 모듈을 추가하십시오. 그런 다음 메뉴에서 image를 선택하고 image property convert 모듈을 추가하십시오. 마지막으로 modules visualization 3D viewers에서 view 3D 모듈을 추가하십시오.'compose 3D from 2D files'를 더블 클릭하여 이미지를 불러온 후 'create 3D'를 클릭하십시오. 'image property convert'를 더블 클릭하여 복셀 크기를 조정하고, 복셀 크기를 0.018 0.018 0.01로 설정하십시오. 'view 3D'를 더블 클릭하여 볼륨을 확인하십시오.마지막으로, 동봉된 문서의 단계에 따라 5배 배율로 이미지 스택을 관찰하십시오. IGFBP7 결핍 상태를 더 정확하게 규명하기 위해, 본 문서에 기술된 바와 같이 유방샘의 3D 재구성을 수행하였습니다. 이 그림들은 야생형 및 null 유방샘의 재구성된 조직학적 볼륨을 보여줍니다.오른쪽의 돌연변이 샘이 왼쪽의 야생형보다 더 짧고 좁지만, 깊이는 야생형 샘이 1.06 millimeters, null 샘이 1.02 millimeters로 거의 동일하다는 점에 유의하십시오. 또한, 왼쪽의 야생형 샘은 분홍색 에오신 염색으로 표시된 기질 조직이 거의 없는 반면, 오른쪽의 null 샘은 주로 기질 조직으로 구성된 것으로 보인다는 점에 주목하십시오. 여기서 핵이 있는 세포를 식별하는 헤마토실린 염색 결과, 야생형 샘은 주로 선 구조를 포함하고 있는 반면 null 샘은 그 밀도를 유지하고 있음을 보여줍니다.이를 추가로 조사하기 위해 림프절 부위의 고해상도 이미지를 정렬하였습니다. 우유로 채워졌을 큰 구조물들이 관찰됩니다. 반면, IGFBP7 null 샘에는 잘 발달된 구조물이 거의 없습니다.또한, 이러한 구조들은 섬유아세포와 유사한 세포들로 밀집되어 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 연속 절편 스캔 데이터를 재구성하여 장기의 3D 재구성을 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 좋습니다. 이제 이 절차를 수행할 때, 슬라이드와 스캔의 수가 매우 많으므로 이들을 일관되게 명명하는 것이 중요하며, 순차적인 정리가 이 절차를 성공적으로 수행하는 핵심이라는 점을 기억하시기 바랍니다.혈관이 어떻게 종양에 침투하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해, 특정 세포 및 질병 마커에 대한 면역조직화학염색과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

reconstruction-3-dimensional-histology-volume-its-application-to

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 방법은 생쥐에서 유선 개발 및 기능을 해부하다하고 평가하는 방법에 대해 설명합니다. 우유 방출은 옥시토신 기반 myoepithelial 세포 수축 분석을 사용하여 평가하는 동안 Excised 내유 분비가 전체 마운트를 사용하여 개발의 정도에 대한 평가입니다.

마우스 모델에서 유선 개발 및 기능 평가

MRI 스캔(인간), 3D 이미징 소프트웨어 및 면역조직학적 분석을 사용하여 뇌의 외측심실의 변화를 문서화합니다. 그런 다음 노화 또는 질병으로 인해 인간 뇌에서 발생하는 외심실 부피 변화의 종단 3D 매핑과 뇌실 주위 세포 변화의 특성화를 마우스에서 모델링합니다.

인간과 마우스의 뇌실 주위 조직의 측면 심실 및 조직 학적 특성의 3D 모델링

설치류의 유선 선생 발달은 일반적으로 기술적 평가를 사용하거나 기본적인 신체적 속성을 측정하여 평가되었습니다. 분지 밀도는 객관적으로 정량화하기 어려운 유방 발달의 지표입니다. 이 프로토콜은 유선의 분기 특성의 정량 평가를위한 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다.

Sholl 분석법을 이용한 유방 내 유선 마운트의 분지 밀도 정량화

우리는 성공적으로 슬라이드를 전체 마운트로 고정시킨 유방 조직을 조직 병리학 적 평가를 위해 성공적으로 제거, 가공, 절단 및 착색하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 생식 및 발달 테스트 지침 연구에서 유선 전체 마운트의 수집 및 평가를 촉진 할 수 있습니다.

병변 식별을위한 유선 절개 전체 장착

여기, 우리는 전체, 그대로 마우스의 격리에 대 한 프로토콜 세포 외 기질 (ECM) 식과 ductal 형태를 조사 하는 유 방 땀 샘을 제시. 마우스 #4 복 부 동맥은 8 10 주 오래 된 여성 미 쥐, 중립 버퍼링 된 포 르 말린에 고정, 단면화 및 immunohistochemistry ECM 단백질에 대 한 사용 하 여 스테인드에서 추출 되었다.

세포 외 기질 식 및 선 형태 분석을 그대로, 전체 마우스 유 방 땀 샘의 절연

우리는 2개의 유방 상피 선, HC11 및 EpH4의 분화 유도를 위한 기술을 기술합니다. 둘 다 우유 단백질을 생성하기 위하여 태아 송아지 송아지 혈청, 인슐린 및 prolactin를 요구하는 동안, EpH4 세포는 3 차원 문화에서 유방구로 완전히 분화할 수 있습니다. 이러한 상보적인 모델은 분화 및 신생물의 신호 환전 연구에 유용하다.

마우스 유방 상피 HC11 및 EpH4 세포의 분화

이 프로토콜은 교체 가능한 뚜껑 (R.MIW)이있는 새로운 유방 이미징 창을 설명합니다. R.MIW의 이식 후 생체 내 현미경 검사는 다른 발달 단계에서 세포 해상도로 건강하고 병든 유선의 종방향 및 다일 이미징을 허용합니다.

교체 가능한 뚜껑이있는 유방 이미징 창을 사용하는 종방향 생체 내 현미경 검사

여기에 설명된 생체내 영상화 방법은 대사 보조인자 NAD(P)H로부터의 콜라겐 초고조파 생성 및 내인성 형광을 이용하여 표지되지 않은 종양 미세환경을 종양, 기질 및 혈관 구획으로 비침습적으로 분절하여 4D 생체내 영상의 심층 분석을 한다.

유방 종양 미세환경의 생체 내 이미징을 위한 라벨 없는 세분화 접근법

생체 내 이미징 및 유방암 예방을 위한 마우스 유방 덕트 트리에 대한 에탄올 계 성 절제용용 시약의 내분사 주입 방법이 설명되어 있다. 젖꼭지 개구부에 직접 주사하면 최소한의 부수적 인 조직 손상으로 유방 상피 세포를 대상으로 할 수 있습니다.

마우스 모델에서 유방암의 예방 및 지역 치료를 위한 에탄올 기반 담약 솔루션의 내배송 및 X선 시각화

본 프로토콜은 레이저 스캐닝 컨포칼 및 다광자 현미경에 의한 수유 마우스 유선의 생체 내 이미징을 위한 손쉬운 기술을 설명합니다.

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland(유선의 생체 내 세포내 현미경)

배우세요 마우스 유방 땀샘의 3차원 조직학 볼륨 재구성 방법을 통해 세포 거시구조 변화를 분석하는 기술입니다. 이 이미지 정합 기법은 야생형과 Igfbp7 결손형 마우스 간의 구조적 차이를 밝히는 데 활용됩니다.

3 차원 조직학 볼륨 및 마우스 유방 땀샘을 연구에의 응용의 재구성

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