담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

다음 실험의 전반적인 목표는 온전한 담배 잎에서 발현된 두 단백질의 상호작용을 관찰하는 것입니다. 이를 위해 적절한 컨스트럭트를 설계하여, 관심 있는 두 유전자를 분할 형광 단백질에 융합시킨 후 이 컨스트럭트들을 아그로박테리아로 형질전환합니다. 두 번째 단계로 아그로박테리아 배양액을 혼합하여 담배 잎에 주입하면, 단백질이 발현되어 재구성된 형광 신호가 나타나게 됩니다.

단백질들이 서로 근접하게 되면, 다음으로 잎 전체 또는 분리된 원형질체를 현미경으로 분석합니다. 형광 현미경으로 검출된 형광 신호를 통해 단백질-단백질 상호작용을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 공동 면역침전법(co-immunoprecipitation)이나 효모 이중 hybrid법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 살아있는 식물 세포 내에서 단백질-단백질 상호작용을 직접 관찰할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 다양한 세포 구획 내 단백질 복합체 형성과 같이 식물 생물학 분야의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 담배 잎 형질전환에 사용할 아그로박테리아를 배양하십시오. 멸균된 50 milliliter 튜브에 적절한 항생제가 포함된 10 milliliters의 LB 배지를 넣고, 목적 플라스미드가 포함된 AG L one 글리세롤 스톡 배양액 50 microliters를 접종하십시오.

28 °C에서 최소 24시간 동안 190 RPM으로 흔들어 배양하여, 다음 날 배양액의 OD 600이 1.0에서 2.0 사이가 되도록 합니다. 박테리아를 3000 ×g에서 15분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거한 후, 펠렛을 갓 제조한 침투 배지에 현탁하고 현탁액의 OD 600이 1.0이 되도록 조정합니다.

담배 잎 침투를 위해 아그로박테리아 세포를 실온의 암조건에서 오버헤드 쉐이커로 2시간 동안 배양합니다. 3주 된 담배 식물에서 성숙한 잎 여러 장을 선택합니다. 동일한 부피로 혼합합니다.

관심 작제물을 운반하는 아그로박테리아를 각각 3 mL 준비합니다. 바늘이 없는 5 mL 주사기에 세포 현탁액 혼합물을 채워 담배 잎에 침투시킵니다. 잎의 뒷면 여러 곳에 주사기를 조심스럽게 누르고, 식물에 물을 준 뒤 2일 동안 덮개를 씌워 빛으로부터 보호하며 보관합니다.

침투시킨 잎에서 원형질체를 분리하려면, 먼저 잎을 페트리 접시에 넣고 새로 조제한 효소 용액을 첨가합니다. 새 면도날을 사용하여 잎을 약 0.5 square centimeter 크기로 자릅니다. 그다음, 효소 용액과 함께 잎 조각들을 진공 장치로 옮깁니다.

침투 플라스크. 잎에서 기포가 나올 때까지 약 20초 동안 진공 침투시킵니다. 진공을 매우 조심스럽게 해제합니다.

90분 후, 상온의 암조건에서 40 RPM으로 90분 동안 플라스크를 흔들어 줍니다. 90 RPM으로 1분 동안 흔들어 원형질체를 분리합니다. 거즈를 통해 용액을 15 milliliter 라운드 바텀 원심분리 튜브에 여과합니다.

원형질체 용액 위에 FPCN 버퍼 2 mL를 층이 지게 얹은 다음, 상온에서 느린 가속 및 감속 조건으로 70 ×g에서 10분 동안 원심분리하십시오. 손상되지 않은 원형질체는 효소 용액과 FPCN 사이의 계면에 축적됩니다. 입구가 넓은 1 mL 피펫 팁을 사용하여 손상되지 않은 원형질체를 새 원심분리 튜브로 옮기십시오. 이 절차를 성공적으로 수행하려면, 원형질체의 파열을 방지하기 위해 항상 입구가 넓은 화이트 팁을 사용하십시오.

튜브에 W five buffer를 채운 후, 가속 및 감속 속도를 낮게 설정하여 100 ×g에서 2분간 원심분리합니다. 원형질체를 침전시키기 위해 상층액을 조심스럽게 제거하고, 원형질체의 양에 따라 약 200 µL의 W five buffer로 펠렛을 재현탁합니다.

레이저 스캐닝 현미경 관찰을 위한 원형질체 시료를 준비하려면, 먼저 현미경 슬라이드 위에 약 2cm 간격으로 두 개의 작은 밀봉제 스트립을 배치합니다. 스트립 사이에 20 µL의 원형질체 용액을 떨어뜨리고 그 위에 커버 글라스를 조심스럽게 덮습니다. 밀봉제 스트립은 커버 글라스에 의해 원형질체가 눌리는 것을 방지합니다.

레이저 주사 현미경 관찰을 위한 잎 전체 시료를 준비하려면, 잎에서 1cm 크기의 조각을 잘라 잎의 뒷면이 위를 향하도록 현미경 슬라이드 글라스 위에 놓습니다. 물을 약 30 µL 첨가합니다. 그 위에 커버 글라스를 덮고 양쪽 가장자리를 접착 테이프로 단단히 고정합니다.

이미징은 배율 조절을 위해 MICCA type TCS SP five 공초점 레이저 주사 현미경으로 수행합니다. 이미징 매질로 글리세롤을 사용하여 63x 배율의 대물렌즈를 사용하고, 평가를 위해 Leica application suite advanced fluorescent 소프트웨어를 사용합니다. Argon 레이저를 30%로 설정하고 488 nanometers에서의 레이저 출력을 18% 강도로 설정합니다. 515 nanometers에서의 신호를 모니터링하기 위해 첫 번째 PMT 검출기의 방출 대역폭을 495에서 550 nanometers로 설정합니다.

엽록소 자가형광을 모니터링하려면, 두 번째 PMT 검출기의 방출 대역폭을 650에서 705 nanometers로 설정하십시오. M cherry 신호를 모니터링하려면, HENI 5 61 레이저를 사용하십시오.

레이저 강도를 18%로 설정하고, 세 번째 PMT 검출기의 방출 대역폭을 587에서 610 nanometers로 설정하십시오. 모든 PMT 검출기 채널의 이미지가 동일한 게인(gain) 설정으로 촬영되었는지 확인하십시오. 배경 신호를 배제하기 위해 게인은 800에서 900 사이여야 합니다.

너비와 높이가 1024 by 1024 픽셀이고 스캔 속도가 100 hertz인 형식으로 이미지를 획득합니다. Z stackings의 경우, 각 스택 사이의 최대 거리를 0.5 microns로 설정합니다. 본 연구에서는 BFC 방법을 사용하여 세포질 분자 샤페론 HSP 90과 막 도킹 단백질 TPR seven 및 64의 상호작용을 모니터링하였습니다.

이 모식도에서 보듯이, Venus는 소포체에 위치하는 TPR7 또는 엽록체 외막에 위치하는 TOC64의 세포질 부분에 결합되어 있습니다. HSP90은 N-말단이 SCFP와 융합되어 TOC64 및 TPR7의 TPR 도메인이 HSP90의 C-말단과 상호작용할 수 있게 합니다. TPR7-HSP90 단백질 복합체의 국소화를 확인하기 위한 음성 대조군으로서 SCFP만 세포질에서 발현됩니다. TPR7과 HSP90은 ER 마커와 함께 공동 형질전환되었습니다.

대조군으로서 온전한 잎에서 형광을 관찰하였습니다. SCFP 단독으로 TPR seven 및 ER 마커와 함께 발현되었습니다. 제시된 모든 이미지에서 스케일 바는 10 microns를 나타냅니다.

왼쪽 패널은 515 nanometers에서 모니터링한 재구성된 형광이 녹색으로 표시된 것입니다. ER 마커는 적색으로 나타납니다. 가운데 패널에는 두 신호의 중첩이 표시되어 있으며, 오른쪽 패널에도 함께 나타납니다.

HSP90와 함께 재구성된 TPR7 신호를 모니터링하였으며, 이는 ER 마커와 겹쳐 노란색으로 나타났습니다. 반면, TPR7과 음성 대조군인 CFP에 대한 신호는 관찰되지 않았습니다. 다음 예시에서는 대조군으로서 엽록체 단백질 tox64를 HSP90와 공동 발현시켰습니다.

Tox 64를 SCFP 단독으로 공동 발현시켰습니다. 이전과 마찬가지로, 515 nanometers에서 녹색의 재구성된 형광을 측정하였습니다. 중앙 패널은 480 nanometers에서 측정된 엽록소 자가형광을 보여줍니다.

두 신호의 빨간색 오버레이가 오른쪽 패널에 표시되어 있습니다. tox 64와 HSP 90을 공동 발현하는 세포에서는 형광 재구성이 관찰되었으나, tox 64와 SCFP만 공동 발현하는 세포에서는 관찰되지 않았습니다.

잎 전체의 현미경 사진으로는 tox 64와 HSP 90의 정확한 위치를 결정하기 어렵기 때문에, 형광 현미경 관찰을 위해 침투시킨 담배 잎에서 원형질체를 분리하였습니다. 이전과 마찬가지로, 재구성된 형광은 515 nanometers에서 측정하였고, 엽록소 자가형광은 480 nanometers에서 측정하였으며, 이 오버레이 이미지에서 보여지는 것과 같이 오버레이 이미지를 생성하였습니다. 이를 통해 tox 64와 HSP 90가 엽록체를 둘러싼 링 모양의 구조로 검출됨을 확인할 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 컨스트럭트를 설계하고 담배 잎을 형질전환하는 방법, 그리고 관심 있는 두 단백질 간의 상호작용을 나타내는 형광 신호를 시각화하는 최적의 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.