Name: 담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 학습하세요 담배 잎에서 이분자 형광 보완법을 이용한 단백질-단백질 상호작용 시각화 방법을. 살아있는 식물 세포에서 실시간으로 단백질 상호작용을 관찰할 수 있는 강력한 기술입니다.

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우리는 원고의 비판적 읽기에 도움이 토론과 크리스 캐리에 대한 위르겐 Soll에 감사를드립니다. 이 프로젝트는 DFG 및 드퐁 데르 chemischen 인더스트리 (부여 번호 SFB 1035 SS에 프로젝트 A04 및 RS 187 개의 22 / 수행)에 의해 투자되었다.

1. BiFC의 변환은 아그로 박테리아에 구축 <ol><li> BiFC 구조의 클로닝 <ol><li> 측면에서는 attB - 사이트를 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 적절한 템플릿에서 관심의 유전자를 증폭. 교정 중합 효소를 사용하여 PCR을 수행합니다. 설계된 프라이머 조합 어닐링 단계의 길이와 단편 크기에 따른 연신 공정의 길이를 적응시킨다. 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 PCR 생성물을 확인 PCR 클린 - 업 키트를 사용하여 정제. </li><li> 얻어진 단편 BP 반응과 BP의 재조합 효소를 사용하여 입력 벡터를 수행합니다. 항목 벡터의 150 NG와 attB-PCR 제품의 15-150 NG를 혼합, BP의 재조합 효소의 2 μl를 추가하고 8 μL의 총 부피에 TE 버퍼와 입력합니다. 실온에서 1 시간 동안 반응을 품어 37 ℃에서 10 분 동안 2 μL 테 K를 추가하여 반응을 중지 </li><li> 관할 E.으로 전체 반응을 변환 대장균 DH5α, 세포와 벡터에 DNA 단편의 해당 위치에 식민지 PCR에 의해 얻어진 식민지 화면. 양의 플라스미드 DNA 서열은 돌연변이의 부재를 확인하기 위해 수행된다. </li><li> LR의 재조합 효소를 사용하여 해당 대상 벡터와 LR 재결합을 위해 얻어진 항목 복제를 사용합니다. 대상 벡터의 150 NG와 입력 벡터의 50 ~ 150 NG를 혼합, 1 μL의 LR의 재조합 효소를 추가하고 5 μL의 총 부피에 TE 버퍼와 입력합니다. 실온에서 1 시간 동안 반응을 품어 37 ℃에서 10 분 동안 1 μL 테 K를 추가하여 반응을 중지 </li><li> 벡터에 DNA 단편의 해당 위치에 식민지 PCR에 의해 식민지를 획득 능력 대장균 DH5α 세포와 화면에 전체 반응을 변환 할 수 있습니다. DNA의 염기 서열이 단계에서 필요하지 않습니다. </li><li> 높은 순도를 보장하기 위해 플라스미드 미니 키트 플라스미드 DNA를 분리. </li></ol></li><li> 화학적 능력 아그로 박테리아 (준비변형 AGL1, 리팜피신 및 실린 저항) <ol><li> 행진 중 주식 문화에서 아그로 박테리아 및 28 ℃에서 24 시간 동안 성장 </li><li> 하나의 식민지로 5 ㎖ LB 배지에 접종하고 28 ℃에서 하룻밤 배양 </li><li> 접종 50 2 하룻밤 문화 ㎖의 OD 1.0 600 28 ° C에서 약 4 시간 동안 성장과 ml의 LB 배지. </li><li> 4 ° C에서 15 분 동안 3,000 XG에서 세포를 원심 분리기와 얼음처럼 차가운 염화칼슘 (10 ㎜) 멸균 된 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁. 이 단계 후 얼음에 세포를 보관하십시오. </li><li> -80 ° C에서 액체 질소와 저장소에 즉시 동결 세포의 분취 량 (100 μL)를 준비 </li></ol></li><li> 화학적 능력 아그로 박테리아의 변환 <ol><li> 얼음에 유능한 AGL1 세포의 하나 나누어지는 해동. 세포에 플라스미드 DNA의 1-2 μg을 추가합니다. 얼음에 5 분, 37 ℃에서 액체 질소와 5 분에서 5 분 알을 품다 세포와의 600 μL LB 매체를 추가28 ℃에서 4 시간 동안 650 rpm에서 메르 루사 </li><li> 8,000 XG에서 1 분 동안 세포를 원심 분리기 및 뜨는 폐기하십시오. 적절한 항생제를 포함하는 LB 플레이트 상에, 나머지 LB 배지 플레이트 50 μL에 펠렛을 재현 탁. 플레이트를 밀봉하고 28 ℃에서 2 일 동안 배양 식민지 PCR에 의한 플라스미드의 존재를위한 스크린 식민지. </li><li> 적절한 항생제를 포함하는 5 ㎖ LB 배지에서 하나의 긍정적 인 식민지의 예방과 밤 동안 28 ° C에서 알을 품다. 500 ㎕의 50 % 살균 글리세롤 하룻밤 문화의 500 μl를 혼합하여 -80 ℃에서 동결 </li><li> 담배 잎의 일시적인 변화를위한 글리세롤 주식에서 직접 적절한 항생제를 포함하는 LB 배지에서 아그로 박테리아를 접종한다. </li></ol></li></ol> 2. 담배 잎의 과도 변환 <ol><li> 아그로 박테리아 성장 <ol><li> 다음 주식 솔루션을 준비 : 아세토 시린 곤 (150 MM은 70에서 용해-20 ° C에서 분주 % 정도의 EtOH), 저장 MES / KOH (0.1 M)의 pH 5.7, 4 ° C (이상 보관시 세균의 증식을 방지하기 위해 0.2 μm의 필터를 통해 살균 필터)에서 저장, MgCl2를 (1 M) 주식, 실온에서 저장. </li><li> 멸균 50 ML 튜브에 대한 관심의 플라스미드를 포함하는 AGL1 글리세롤 주식 문화의 50 μL와 적절한 항생제를 포함하는 10 ㎖의 LB 배지에 접종하고 적어도 24 시간이 1.0 사이의 OD 600까지 190 rpm으로 흔들어 28 ° C에서 알을 품다 -2.0가 도달한다. </li><li> 원심 분리기 박테리아 15 분 3,000 XG에. 갓 침투 매체에서 펠렛 [MgCl2를 (10 ㎜), MES / KOH (10 ㎜)의 pH 5.7, 아세토 시린 곤 (150 μM)]을 재현 탁하고 OD 1.0 600 서스펜션을 조정합니다. </li><li> 어둠 속에서 2 시간 동안 오버 헤드 통에 아그로 박테리아 세포를 품어. 세포는 침투를 위해 사용될 수있다. </li></ol></li><li> 담배 잎의 침투 <ol><li> 세 가지를 사용주 이전 담배 (는 담배 benthamiana) 식물. 침투에 대한 몇 가지 오래된 잎을 선택합니다. </li><li> 관심의 구조 (3 ml의 각을) 들고 아그로 박테리아의 동일한 볼륨을 섞는다. 침투를위한 바늘없이 5 ML의 주사기를 가져 가라. 여러 위치에서 잎의 밑면에 주사기를 눌러 잎담배에 신중 세포 현탁액을 침투. </li><li> 식물을 물과 이틀 동안 어둠 속에서 그들을두고. </li></ol></li></ol> 3. 원형질체 준비 담배 잎의 원형질체 준비는 쿠프 등. 16에서 적응 약간 수정되었습니다. <ol><li> 버퍼 준비 <ol><li> F-PCN 매체를 준비 매크로 염 [3 (1012 ㎍ / ㎖) KNO, 염화칼슘 2 • 2H 2 O (440 ㎍ / ㎖), 망초 • 7H 2 O (370 ㎍ / ㎖), KH 2 PO 4 ( 170 ㎍ / ㎖), NH 4-숙시 네이트 [(20 ㎜, 2 M 주식 졸을 준비의 ution (숙시 네이트 (236 ㎍ / ㎖)과 NH 4 망할 CIA (106 ㎍ / ㎖)을, 용해 pH를 5.8로 조정), 마이크로 염은 [EDTA-FE (III), 나 소금 (40 ㎍ / ㎖의) × KJ (825 ㎍ / ㎖), H 3 BO 3 (3 ㎍ / ㎖) MnSO 4 • H 2 O (10 ㎍ / ml)에 ZnSO 4 • 7H 2 O (2 ㎍ / ㎖) 나 2 무 4 • 7H 2 O (0.25 ㎍ / ㎖), CuSO 4 • 5 H 2 O (0.025 ㎍ / ㎖)의 CoCl2 2 • 6H 2 O (0.025 ㎍ / ㎖)], MES (390 ㎍ / ㎖), 포도당 (약 80 μg / ㎖) 삼투압이 550 mOsm, pH가 5.8 (KOH). -20 ° C에서 분주에 보관 </li><li> F-PIN 매체를 준비 F-PCN으로 대신 포도당을 사용 자당 (약 110 ㎍ / ㎖), 삼투압이 550 mOsm, pH가 5.8 (KOH)의 모든 성분. -20 ° C에서 분주에 보관 </li><li> W5 매체를 준비 : 150 밀리미터의 NaCl, 125 mM의 염화칼슘, 5 밀리미터의 KCl, 2 MM의 MES, 삼투압 550-580 mOsm, pH가 5.7 (KOH)을. 4 °에서 보관; C (이상 보관 중에 박테리아의 성장을 방지하기 위해 0.2 ㎛의 필터를 통해 필터 멸균). </li><li> 원형질체 분리 (0.1 g 셀룰라아제, 10 ㎖ F-PIN에 0.03 g의 macerozym) 신선한 효소 솔루션을 준비합니다. 10 분, 실온으로 냉각을 위해 55 ° C에서 솔루션을 품어. 10 ㎖ 용액에 10 % BSA 100 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> 원형질체의 분리 <ol><li> 페트리 접시에 하나의 침투 잎을 배치하고 신선한 효소 솔루션을 추가합니다. 약 0.5 cm 2 크기의 조각으로 잎을 잘라 새로운 면도칼을 사용합니다. 진공 침투 플라스크에 효소 용액으로 잎 조각을 전송하고 기포가 (매우 신중하게 릴리스 진공) 잎에서 나올 때까지 진공은 약 20 초 동안 침투. </li><li> 어둠 속에서 40 rpm으로 90 분 동안 플라스크를 흔들어. </li><li> 90 rpm에서 1 분간 흔들어 원형질체를 놓습니다. 15 ㎖의 원심 분리 관 (둥근 바닥)에 거즈 (100 μM)를 통해 솔루션을 필터링합니다. </li&gt; <li> 70 XG RT에서 (느린 가속 및 감속)에서 10 분 동안 2 ㎖ F-PCN 버퍼와 원심 분리 원형질체 용액 오버레이. </li><li> 본래 원형질체는 효소액 및 F-PCN의 계면에 축적된다. 신선한 원심 분리 관에 그대로 원형질체를 전송하고 W5 버퍼에 채우기 위해 넓은 구멍 1 ㎖ 피펫 팁을 가져 가라. 원형질체 펠렛 100 XG (느린 가속과 감속)에서 2 분 동안 원심 분리기. </li><li> 원형질체의 양에 따라 약 200 μL 5,000 버퍼에 피펫에 resuspend 펠렛을 사용하여 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. </li><li> 항상 그대로 원형질체의 파열을 방지하기 위해 다양한 오리피스 팁을 사용합니다. </li></ol></li></ol> 4. 레이저 스캐닝 현미경 <ol><li> 샘플 준비 <ol><li> 현미경 슬라이드 정도 밀봉 두 개의 작은 스트립 (2cm 간격)을 붙여 넣습니다. 스트립 사이의 원형질 용액 20 μl를 놓고 조심스럽게 덮개 유리를 배치상단에. 밀봉 스트립은 원형질체는 커버 유리에 의해 숙청하지 있는지 확인하십시오. </li><li> 총 잎 샘플은 잎에서 1cm 조각을 잘라 위쪽으로 향하게 잎의 바닥면과 현미경 슬라이드에 배치하십시오. 약 30 μL의 H 2 O를 추가 상단에 커버 유리를 배치하고 양쪽에 접착 테이프로 단단히 고정합니다. </li></ol></li><li> 공 촛점 이미징 및 현미경 설정 <ol><li> TCS SP5 : 이미지는 라이카, 형식에서 공 초점 레이저 주사 현미경으로 수행됩니다. 확대를 위해 영상 매체로 글리세롤 63X의 크기와 대물 렌즈 (HCX PL APO CS)를 사용합니다. 개구 수를 1.3로 설정합니다. 평가를위한 라이카 응용 프로그램 제품군 / 고급 형광 소프트웨어를 (추가 데이터 S1 참조)를 사용합니다. </li><li> 515 nm에서 재구성 BiFC 신호를 모니터링 및 495-550 개의 PMT 검출기 방출 대역폭을 설정하는 18 %의 강도로 488 nm에서 30 % 아르곤 레이저 및 레이저 파워를 설정한다. </lI&gt; <li> 엽록소 형광도를 모니터링하려면 650-705 두 번째 PMT 검출기 방출 대역폭을 설정합니다. </li><li> mCherry 신호 헬륨 네온 레이저 (561)를 사용하여 모니터링하기 위해, 레이저의 강도 561-18% 및 587-610 제 PMT 검출기의 방사 대역폭을 설정한다. </li><li> 모든 PMT 검출기 채널의 사진은 동일한 게인 설정 (게인 배경 신호를 제외하는 800 ~ 900 사이 여야합니다)로 촬영되어 있는지 확인합니다. </li><li> 100 Hz의 스캔 속도와 1024 × 1024 픽셀의 형식 너비 / 높이에서 사진을 촬영합니다. </li><li> Z-스태킹 각 스택에서 0.5 ㎛의 최대 거리를 사용하십시오. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Citovsky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li>
<li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).</li>
<li>Weinthal, D., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+in+plant+cells+by+bimolecular+fluorescence+complementation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay.</a> Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).</li>
<li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li>
<li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Lee, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+a+cDNA+library+for+protein-protein+interactions+directly+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta.</a> Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).</li>
<li>McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+ABCG+transporters%2C+which+are+required+for+export+of+diverse+cuticular+lipids%2C+dimerize+in+different+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations.</a> Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).</li>
<li>Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+studies+between+the+chloroplast+signal+recognition+particle+subunit+cpSRP43+and+the+full-length+translocase+Alb3+reveal+a+membrane-embedded+binding+region+in+Alb3+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).</li>
<li>Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+GATEWAY+vectors+for+high+throughput+analyses+of+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).</li>
<li>Qbadou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+chaperone+Hsp90+delivers+precursor+proteins+to+the+chloroplast+import+receptor+Toc64%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64.</a> EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).</li>
<li>Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtTPR7+is+a+chaperone+docking+protein+of+the+Sec+translocon+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis.</a> J. Cell Sci. , (2012).</li>
<li>Schweiger, R., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtTPR7+as+part+of+the+Arabidopsis+Sec+post-translocon%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Behav%22%5BJournal%5D)">AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon.</a> Plant Signal Behav. 8, (2013).</li>
<li>Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51, 1126-1136 (2007).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+as+a+probe+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).</li>
<li>Koop, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199, 193-201 (1996).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

BiFC 실험 계획에 여러 지점이 고려되어야한다. 관심의 단백질에 대한 구조적 정보가 필요하지 않지만, 토폴로지는 막 단백질에 걸친 작업을 할 때 알고 있어야합니다. 형광 단백질은 동일한 세포 내 구획에서 상주하거나 상호 작용을 허용하는 멤브레인의 동일 측면에 직면한다. N-말단 서열을 타겟팅 필요 단백질을 분석 할 때 당연히, 단지 C-말단 태그가 고려 될 수있다. 그 태그는 GFP-태그 된 단백질을 발현함으로써, 예를 들면, 미리 세포 내 현지화를 테스트하는 것이 바람직하다 또한 단백질의 적절한 표적 또는 막 삽입을 방해하는 것이 가능하기 때문이다. 또한, 음성 대조군은 항상 포함되어야한다. 이 예에서 우리는 세포질에 SCFP C를 표현하는 구조를 생성합니다. 그러나, 상호 작용하는 것으로 예상되지 않은 단백질은 음성 대조군으로 사용할 수있다. 적절한 표현 (을)를 확인하려면F 형광가 보이지 특히, 침투 나뭇잎이나 원형질체의 단백질 추출물을 SDS-PAGE 및 단백질 발현을 실시 할 수있는 구조는, 각각...

단백질 복합체의 형성을 공부하고 생체 내에서 식물 세포에서의 현지화는 셀룰러 네트워크를 조사하는 것이 필수적입니다, 신호 및 신진 대사 과정. BiFC 직접 살아있는 식물 세포 1-5 내에서의 자연 환경에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 시각화 할 수 있습니다. BiFC에서 재구성 형광 단백질에 형광 단백질 리드의 두 비 형광 N-및 C-말단 조각의 보완에 접근. 많은 다른 형광 단백질의 단편은 녹색 형광 단백질 (GFP) 화학적 세 가지 잔기 (6)에 의해 형성되어있는 발색단 예 : 단백질 상호 작용을 검출하기 위해 사용되어왔다. 형광 단백질은 관심의 두 단백질에 융합 될 수있는 두 개의 비 형광 조각 될 수있는 루프 또는 ß-가닥 내 반감 될 수있다. 분석은 어떤 세포 내 compartme에 상호 작용을 검출하는데 사용될 수있다유전자 융합 단백질을 표현하기 위해 수정 될 수있는 기적으로 성장하는 유기체 또는 세포 NT. 이 단백질은 세포 내에서 근접에 오면, 형광 재구성되고 외인성 또는 형광 염료 (3)의 추가없이 현미경에 의해 모니터링 될 수있다. 단백질은 쉽게 담배 생성 구문 남긴다의 아그로 박테 리움 - 매개 형질 전환을 이용하여 표현 될 수 있기 때문에, 담배 (는 담배 benthamiana)는, 식물성 단백질의 상호 작용을 시각화하기 편리한 모델 생물로 입증되었다. 아그로 박테리아는 식물 세포로 그 유전자의 전달을 매개하는 효소를 코딩하는 소위의 Ti 플라스미드 (종양 유도)를 사용한다. BiFC는 가용성뿐만 아니라 모든 세포 구획 내에서 막 단백질 잘 적용하고 성공적으로 생체 내에서 단백질 상호 작용을 식별 할뿐만 아니라 상호 작용 사이트를 분석하기 위해 지난 몇 년 동안 사용되었습니다7-9 단백질 내. 도입 된 유전자의 발현시에, 형광 단백질의 상호 작용은 소포체 (ER), 세포막 또는 엽록체 같은 큰 셀룰러 구조 위해 적당한, 나뭇잎에 직접 시각화 될 수있다. 그러나,보다 세련된 구조에서 지역화을 모니터링, 예를 들어, 엽록체 봉투, 그것은 변형 담배 잎에서 분리 된 원형질체에서 형광을 시각화하는 것이 바람직하다. C-말단 또는 N-말단 형광 태그 식물 10 BiFC 접근을 위해 사용되어야하는 하나를 함유 BiFC 벡터들의 집합. 이하 설명 프로토콜은 tetratricopeptide 반복 도킹 단백질 Toc64 및 AtTPR7는 엽록체 외부 봉투와 각각 소포체, 11-13에 거주를 포함 (TPR) 도메인과 세포질 열 충격 단백질 90 (HSP90)의 상호 작용을 연구하는 데 사용되었다. 이를 위해, HSP90은 캐럿에 융합시켰다SCFP (SCFP C)의 erminal 부분. 태그는 N-말단 TPR 도메인 형 클램프 HSP90의 C-말단 MEEVD 결합 모티프의 접근성을 보장하기 위해 보호자에 융합했다. 병행 금성 (비너스 N)의 N-말단 부분은 도킹 단백질 각각 Toc64 및 AtTPR7을 함유 TPR 도메인의 세포질 도메인에 융합시켰다. 음성 대조군으로 우리는 세포질에 존재하고, 따라서 적절한 컨트롤입니다 전적으로 SCFP C의 수용성 C-말단 부분을 복제. 연구 단백질의 형광 태그는 근접시켜 형광 신호의 재구성을 할 수 있도록 동일한 세포 구획을 직시해야합니다. 다른 형광 태그에 융합 마커 단백질이 상호 작용의 세포 내 현지화를 보여 cotransformed 할 수있는 재구성 된 형광 신호의 지역화를 결정합니다. mCherrry에 융합 ER 마커 단백질에 동시에 형질 전환AtTPR7 14에 위치한 ER 경우. 엽록소의 형광도는 Toc64의 경우에는 엽록체 마커로 봉사했다. 이것에 의해뿐만 아니라 세포질 HSP90의 보호자와 각각 Toc64 및 AtTPR7,,의 생체 상호 작용은 담배 잎에 직접 모니터링 할 수 있습니다뿐만 아니라 상호 작용의 세포 내 현지화를 조사 할 수 있습니다. BiFC 잘 단백질 - 단백질 상호 작용을 공부하는 다른 방법에 대한 보완 방법으로 적합합니다. coimmunoprecipitation에 또는 시험 관내 풀다운 실험에 비교하여, 예를 들면, 특정의 항체는 관심의 단백질에 해당 될 필요없고, 단백질은 특히 막 단백질에 대한 도전 일 수있는 재조합 적으로 시험 관내에서 발현 될 필요가 없다. 단백질 융합 형광 태그 (15)의 상호 작용에 의해 포착되기 때문에 더욱, 또한 과도 상호 작용은 BiFC을 사용하여 모니터링 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>3&#039;,5&#039;-Dimethoxy-4&#039;-hydroxyacetophenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td>Acetosyringone</td></tr><tr><td>Cellulase, Onozuka-R10</td><td>Serva</td><td>16419</td><td>from Trichoderma viridae</td></tr><tr><td>Macerozyme R-10&nbsp;</td><td>Rhizopus sp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11789-(020)</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11791-(020)</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-up Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609-250</td><td></td></tr><tr><td>의 Serva 28302pDEST-GWVYNE</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Gateway-cloning</td></tr><tr><td>pDEST-VYNE(R)GW</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Gateway-cloning</td></tr><tr><td>pDEST-SCYCE(R)GW</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Gateway-cloning</td></tr></tbody></table>

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

많은 단백질은 다른 단백질과 상호 작용을 일시적으로 또는 생물학적 기능을 수행하기 위해 다중 단백질 복합체에 통합되어 있습니다. 이분자 형광 보완 (BiFC)는 식물 세포에서 이러한 상호 작용을 모니터링 할 수있는 생체 내 방법입니다. 제시된 프로토콜 추궁 후보 단백질이 형광 단백질의 상보 반쪽에 융합되고, 각 구조물은 아그로 박테 리움 - 매개 형질 전환을 통해 식물 세포 내로 도입된다. 이어서, 단백질은 일시적으로 담배 잎에서 발현되고 복원 된 형광 신호는 그대로 셀의 공 초점 레이저 주사 현미경으로 검출 할 수있다. 이것은 상호 작용 자체뿐만 아니라 시각화를 허용하지만, 또한 단백질 복합체의 세포 내 지역화는 결정될 수있다. 이를 위해, 형광 태그를 함유하는 표지 유전자는 이와 같은 t 셀룰러 구조를 시각화 BiFC 구조와 함께 공 발현 될 수있다그는 세망, 미토콘드리아, 골지체 또는 원형질막을 세포질. 형광 신호를 직접 표피 잎 세포 또는 쉽게 변형 담배 잎으로부터 단리 할 수​​있다 단일 원형질체에서 모니터링 할 수있다. BiFC 이상적으로 살아있는 세포 내에서 자연 환경에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하기에 적합합니다. 그러나, 식 강한 프로모터에 의해 구동되어야하고 상호 작용 파트너 인해 상호 작용 메카니즘을 방해 할 수있는 비교적 큰 형광 태그의 융합으로 변성되어 있음을 고려하여야한다. 그럼에도 불구하고, BiFC는 coimmunoprecipitation 같은 단백질 - 단백질 상호 작용, 생체 풀다운 분석 또는 효모 두 하이브리드 실험을 조사하고 다른 일반적으로 적용되는 방법에 대한 훌륭한 보완적인 접근 방식입니다.

이 예에서는 막 도킹 단백질 AtTPR7 및 Toc64와 세포질 분자 샤페론 HSP90의 상호 작용을 모니터링하는 BiFC 방법을 사용했다. AtTPR7는 초 translocon의 일부이며 아마도 ER 막에 번역 후 전위에 대한 분비 preproteins을 제공 세포질 보호자와 상호 작용합니다. 마찬가지로, 엽록체 외부 봉투에 Toc64는 HSP90 관련 엽록체 preproteins를 수신하여 번역 후 수입의 역할을합니다. 두 단백질 HSP90의 C-말단 MEEVD 모티브와의 상호 작용을 매개 세포질 노출 TPR 도메인을 포함한다. 단백질은 형광 태그가 세포질 도메인에 연결되어 있으며, 따라서 단백질의 타겟팅 및 막 삽입을 방해하지 않는 것을 보장 금성 N에 도킹 단백질을 함유 TPR 도메인 융합 적합한 대상 벡터로 특정 콤비 네이즈에 의해 클로닝 하였다. HSP90, SCFP C의 경우 </suC-말단 MEEVD 주제에 방해가되지 않는...

생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다.

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

다음 실험의 전반적인 목표는 온전한 담배 잎에서 발현된 두 단백질의 상호작용을 관찰하는 것입니다. 이를 위해 적절한 컨스트럭트를 설계하여, 관심 있는 두 유전자를 분할 형광 단백질에 융합시킨 후 이 컨스트럭트들을 아그로박테리아로 형질전환합니다. 두 번째 단계로 아그로박테리아 배양액을 혼합하여 담배 잎에 주입하면, 단백질이 발현되어 재구성된 형광 신호가 나타나게 됩니다.단백질들이 서로 근접하게 되면, 다음으로 잎 전체 또는 분리된 원형질체를 현미경으로 분석합니다. 형광 현미경으로 검출된 형광 신호를 통해 단백질-단백질 상호작용을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 공동 면역침전법(co-immunoprecipitation)이나 효모 이중 hybrid법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 살아있는 식물 세포 내에서 단백질-단백질 상호작용을 직접 관찰할 수 있다는 점입니다.이 방법은 다양한 세포 구획 내 단백질 복합체 형성과 같이 식물 생물학 분야의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 담배 잎 형질전환에 사용할 아그로박테리아를 배양하십시오. 멸균된 50 milliliter 튜브에 적절한 항생제가 포함된 10 milliliters의 LB 배지를 넣고, 목적 플라스미드가 포함된 AG L one 글리세롤 스톡 배양액 50 microliters를 접종하십시오.28 °C에서 최소 24시간 동안 190 RPM으로 흔들어 배양하여, 다음 날 배양액의 OD 600이 1.0에서 2.0 사이가 되도록 합니다. 박테리아를 3000 ×g에서 15분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거한 후, 펠렛을 갓 제조한 침투 배지에 현탁하고 현탁액의 OD 600이 1.0이 되도록 조정합니다.담배 잎 침투를 위해 아그로박테리아 세포를 실온의 암조건에서 오버헤드 쉐이커로 2시간 동안 배양합니다. 3주 된 담배 식물에서 성숙한 잎 여러 장을 선택합니다. 동일한 부피로 혼합합니다.관심 작제물을 운반하는 아그로박테리아를 각각 3 mL 준비합니다. 바늘이 없는 5 mL 주사기에 세포 현탁액 혼합물을 채워 담배 잎에 침투시킵니다. 잎의 뒷면 여러 곳에 주사기를 조심스럽게 누르고, 식물에 물을 준 뒤 2일 동안 덮개를 씌워 빛으로부터 보호하며 보관합니다.침투시킨 잎에서 원형질체를 분리하려면, 먼저 잎을 페트리 접시에 넣고 새로 조제한 효소 용액을 첨가합니다. 새 면도날을 사용하여 잎을 약 0.5 square centimeter 크기로 자릅니다. 그다음, 효소 용액과 함께 잎 조각들을 진공 장치로 옮깁니다.침투 플라스크. 잎에서 기포가 나올 때까지 약 20초 동안 진공 침투시킵니다. 진공을 매우 조심스럽게 해제합니다.90분 후, 상온의 암조건에서 40 RPM으로 90분 동안 플라스크를 흔들어 줍니다. 90 RPM으로 1분 동안 흔들어 원형질체를 분리합니다. 거즈를 통해 용액을 15 milliliter 라운드 바텀 원심분리 튜브에 여과합니다.원형질체 용액 위에 FPCN 버퍼 2 mL를 층이 지게 얹은 다음, 상온에서 느린 가속 및 감속 조건으로 70 ×g에서 10분 동안 원심분리하십시오. 손상되지 않은 원형질체는 효소 용액과 FPCN 사이의 계면에 축적됩니다. 입구가 넓은 1 mL 피펫 팁을 사용하여 손상되지 않은 원형질체를 새 원심분리 튜브로 옮기십시오. 이 절차를 성공적으로 수행하려면, 원형질체의 파열을 방지하기 위해 항상 입구가 넓은 화이트 팁을 사용하십시오.튜브에 W five buffer를 채운 후, 가속 및 감속 속도를 낮게 설정하여 100 ×g에서 2분간 원심분리합니다. 원형질체를 침전시키기 위해 상층액을 조심스럽게 제거하고, 원형질체의 양에 따라 약 200 µL의 W five buffer로 펠렛을 재현탁합니다.레이저 스캐닝 현미경 관찰을 위한 원형질체 시료를 준비하려면, 먼저 현미경 슬라이드 위에 약 2cm 간격으로 두 개의 작은 밀봉제 스트립을 배치합니다. 스트립 사이에 20 µL의 원형질체 용액을 떨어뜨리고 그 위에 커버 글라스를 조심스럽게 덮습니다. 밀봉제 스트립은 커버 글라스에 의해 원형질체가 눌리는 것을 방지합니다.레이저 주사 현미경 관찰을 위한 잎 전체 시료를 준비하려면, 잎에서 1cm 크기의 조각을 잘라 잎의 뒷면이 위를 향하도록 현미경 슬라이드 글라스 위에 놓습니다. 물을 약 30 µL 첨가합니다. 그 위에 커버 글라스를 덮고 양쪽 가장자리를 접착 테이프로 단단히 고정합니다.이미징은 배율 조절을 위해 MICCA type TCS SP five 공초점 레이저 주사 현미경으로 수행합니다. 이미징 매질로 글리세롤을 사용하여 63x 배율의 대물렌즈를 사용하고, 평가를 위해 Leica application suite advanced fluorescent 소프트웨어를 사용합니다. Argon 레이저를 30%로 설정하고 488 nanometers에서의 레이저 출력을 18% 강도로 설정합니다. 515 nanometers에서의 신호를 모니터링하기 위해 첫 번째 PMT 검출기의 방출 대역폭을 495에서 550 nanometers로 설정합니다.엽록소 자가형광을 모니터링하려면, 두 번째 PMT 검출기의 방출 대역폭을 650에서 705 nanometers로 설정하십시오. M cherry 신호를 모니터링하려면, HENI 5 61 레이저를 사용하십시오.레이저 강도를 18%로 설정하고, 세 번째 PMT 검출기의 방출 대역폭을 587에서 610 nanometers로 설정하십시오. 모든 PMT 검출기 채널의 이미지가 동일한 게인(gain) 설정으로 촬영되었는지 확인하십시오. 배경 신호를 배제하기 위해 게인은 800에서 900 사이여야 합니다.너비와 높이가 1024 by 1024 픽셀이고 스캔 속도가 100 hertz인 형식으로 이미지를 획득합니다. Z stackings의 경우, 각 스택 사이의 최대 거리를 0.5 microns로 설정합니다. 본 연구에서는 BFC 방법을 사용하여 세포질 분자 샤페론 HSP 90과 막 도킹 단백질 TPR seven 및 64의 상호작용을 모니터링하였습니다.이 모식도에서 보듯이, Venus는 소포체에 위치하는 TPR7 또는 엽록체 외막에 위치하는 TOC64의 세포질 부분에 결합되어 있습니다. HSP90은 N-말단이 SCFP와 융합되어 TOC64 및 TPR7의 TPR 도메인이 HSP90의 C-말단과 상호작용할 수 있게 합니다. TPR7-HSP90 단백질 복합체의 국소화를 확인하기 위한 음성 대조군으로서 SCFP만 세포질에서 발현됩니다. TPR7과 HSP90은 ER 마커와 함께 공동 형질전환되었습니다.대조군으로서 온전한 잎에서 형광을 관찰하였습니다. SCFP 단독으로 TPR seven 및 ER 마커와 함께 발현되었습니다. 제시된 모든 이미지에서 스케일 바는 10 microns를 나타냅니다.왼쪽 패널은 515 nanometers에서 모니터링한 재구성된 형광이 녹색으로 표시된 것입니다. ER 마커는 적색으로 나타납니다. 가운데 패널에는 두 신호의 중첩이 표시되어 있으며, 오른쪽 패널에도 함께 나타납니다.HSP90와 함께 재구성된 TPR7 신호를 모니터링하였으며, 이는 ER 마커와 겹쳐 노란색으로 나타났습니다. 반면, TPR7과 음성 대조군인 CFP에 대한 신호는 관찰되지 않았습니다. 다음 예시에서는 대조군으로서 엽록체 단백질 tox64를 HSP90와 공동 발현시켰습니다.Tox 64를 SCFP 단독으로 공동 발현시켰습니다. 이전과 마찬가지로, 515 nanometers에서 녹색의 재구성된 형광을 측정하였습니다. 중앙 패널은 480 nanometers에서 측정된 엽록소 자가형광을 보여줍니다.두 신호의 빨간색 오버레이가 오른쪽 패널에 표시되어 있습니다. tox 64와 HSP 90을 공동 발현하는 세포에서는 형광 재구성이 관찰되었으나, tox 64와 SCFP만 공동 발현하는 세포에서는 관찰되지 않았습니다.잎 전체의 현미경 사진으로는 tox 64와 HSP 90의 정확한 위치를 결정하기 어렵기 때문에, 형광 현미경 관찰을 위해 침투시킨 담배 잎에서 원형질체를 분리하였습니다. 이전과 마찬가지로, 재구성된 형광은 515 nanometers에서 측정하였고, 엽록소 자가형광은 480 nanometers에서 측정하였으며, 이 오버레이 이미지에서 보여지는 것과 같이 오버레이 이미지를 생성하였습니다. 이를 통해 tox 64와 HSP 90가 엽록체를 둘러싼 링 모양의 구조로 검출됨을 확인할 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면, 컨스트럭트를 설계하고 담배 잎을 형질전환하는 방법, 그리고 관심 있는 두 단백질 간의 상호작용을 나타내는 형광 신호를 시각화하는 최적의 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

protein-protein-interactions-visualized-bimolecular-fluorescence

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서는 제대로 BioRad는 양파 표피 세포에 플라스미드 DNA을 소개하는 진 건 헬리 우스 및 Bimolecular 형광 Complementation의 원칙 (BiFC)를 기반으로 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 테스트를 사용하는 방법을...

헬리 우스 진 건을 사용하여 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이

단백질의 subcellular 지방화는 세포 신호의 spatio - 시간적 규정을 결정 중요합니다. 여기, 우리는 세포에있는 단백질의 공간적 상호 작용을 모니터링을위한 간단한 방법으로 bimolecular 형광 complementation (BiFC)를 설명합니다.

Bimolecular 형광 Complementation

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단백질 막 중첩 분석 : 가용성식이 및 불용성 단백질 간의 상호 작용을 테스트하는 프로토콜 체외에서</em

우리는 공장에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

세포 이하 수준에서 신호 이벤트는 발달 및 환경 단서에 의해 동적으로 조절됩니다. 여기에서는 담배 일시적 발현 시스템을 사용하여 동적 단백질-단백질 상호 작용을 모니터링하고 식물 세포에서 신호 전달의 공간적 조직을 공개하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

이 원고 luciferase 활동의 측정에 기반 하는 단백질 단백질 상호 작용을 결정 하기 위한 간단 하 고 신속한 실험 절차를 설명 합니다.

Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

공동 기존 방법의 어려움을 극복 하기 위해 공장에서 여러 공상 형광 성 융해 단백질을 표현 하기 위한 새로운 방법을 개발 했습니다. 그것은 단백질 공동 식 달성 하기 위해 카세트를 표현 하는 여러 기능적으로 독립적인 단백질을 포함 하는 단일 식 플라스 미드를 사용 하 여 활용 합니다.

식물에는 효율적인 방법으로 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식

여기서 설명된 것은 니코티아나 벤타미아나 잎 조직에서 NLR 면역 수용체의 TIR 도메인의 상호작용 파트너의 식별을 위한 근접 라벨링 방법이다. 또한 니코티아나 및 다른 식물 종에서 이 기술을 사용하여 관심 있는 다른 단백질 간의 상호 작용을 식별하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다.

단백질-단백질 상호 작용 네트워크의 질라 식별을 위한 터보ID 기반 근접 라벨링

여기서 우리는 BiFC 기반 FRET-FLIM 분석법에 의한 형광 태그 단백질을 사용하여 3개의 단백질 파트너 간의 삼차 복합 형성을 시각화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 생체 내에서단백질 단백질 상호 작용 복합체를 연구하는 데 유용합니다.

BIFC-FRET-FLIM 분석체에 의한 MADS 박스 전사 계수의 두 단백제와 칼슘 센서 단백질 간의 삼자 상호 작용 결정

여기에서는 AT4G18020(APRR2)-AirID 단백질을 모델로 사용하여 오이(Cucumis sativus L.)에서 근접 라벨링(PL) 실험을 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 벡터의 구성, 아그로인 침투를 통한 구성물의 변형, 비오틴 침투, 단백질 추출 및 친화성 정제 기술을 통한 비오틴 표지 단백질의 정제를 설명합니다.

식물의 단백질-단백질 상호작용을 위한 AirID 기반 근접 라벨링

이 프로토콜은 바이러스-플라스모데스마타 상호 작용 또는 플라스모데스마 수송 중 플라스모데스마타를 표적으로 하는 단백질의 컨포칼 현미경 기반 분석을 위한 최적의 플라스모데스마 마커 선택에 대해 설명합니다.

Nicotiana benthamiana에서 Plasmodesmata에 대한 단백질 분류의 컨포칼 현미경 분석

학습하세요 담배 잎에서 이분자 형광 보완법을 이용한 단백질-단백질 상호작용 시각화 방법을. 살아있는 식물 세포에서 실시간으로 단백질 상호작용을 관찰할 수 있는 강력한 기술입니다.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

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