담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다.

다음 실험의 전반적인 목표는 손상되지 않은 담뱃잎에서 발현되는 두 단백질의 상호 작용을 모니터링하는 것입니다. 이는 적절한 구조를 설계하고, 관심 있는 두 유전자를 융합하여 형광 단백질을 분리하고, 이러한 구조를 농업 박테리아로 변형시킴으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로 농업 박테리아 배양을 혼합하여 담뱃잎에 주입하면 단백질의 발현과 재구성된 형광 신호가 발생합니다.

단백질이 가까이 다가오면 다음으로 전체 잎 또는 분리된 원형질체를 현미경으로 분석합니다. 형광 현미경 검사법으로 감지된 방출된 형광 신호를 기반으로 단백질 단백질의 상호 작용을 보여주는 결과를 얻었습니다. cor immunoprecipitation 또는 yeast to hybrid와 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 살아있는 식물 세포에서 단백질 단백질 상호 작용을 직접 모니터링할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 다양한 세포 구획에서 단백질 복합체의 형성과 같은 식물 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 담뱃잎의 변형에 사용할 농업 박테리아를 성장시킵니다. 적절한 항생제를 함유한 LB 배지 10ml를 멸균된 50ml 튜브에 관심 플라스미드를 함유한 AG L 1개의 글리세롤 스톡 배양액을 50마이크로리터로 접종합니다.

섭씨 28도에서 최소 24시간 동안 배양하고 다음 날 배양액이 1.0에서 2.0 사이의 OD 600에 도달할 때까지 190RPM으로 흔듭니다. 박테리아를 3000배 G로 15분 동안 원심분리합니다. 상등액 소생제를 버린 후 펠릿을 갓 만든 침투 매체에 현탁액을 현탁시키고 현탁액을 1.0의 OD 600으로 조정합니다.

담뱃잎의 침투를 위해 실온의 어둠 속에서 2시간 동안 오버헤드 셰이커에 어그로 박테리아 세포를 배양합니다. 3주 된 담배 식물에서 오래된 잎 몇 개를 선택하십시오. 같은 부피를 섞습니다.

관심 구조를 운반하는 농업 박테리아 각각당 3 밀리리터. 바늘이 없는 5ml 주사기에 세포 현탁액 혼합물을 채워 세포 현탁액이 담뱃잎에 침투하도록 합니다. 잎 바닥면의 주사기를 여러 곳에서 조심스럽게 누르고 식물에 물을 주고 이틀 동안 덮개를 씌우고 빛으로부터 보호하십시오.

침투한 잎에서 원형질체를 분리하려면 먼저 잎을 페트리 접시에 넣고 갓 준비한 효소 용액을 추가합니다. 새 면도날을 사용하여 잎을 약 0.5제곱센티미터 크기로 자릅니다. 다음으로, 효소 용액이 담긴 잎 조각을 진공 상태로 옮깁니다.

침투 플라스크. 잎에서 기포가 나올 때까지 약 20초 동안 진공 침투합니다. 진공 청소기를 매우 조심스럽게 해제하십시오.

플라스크를 90분 후 실온의 어둠 속에서 40RPM으로 90분 동안 흔듭니다. 90RPM으로 1분 동안 흔들어 원형질을 방출합니다. 거즈를 통해 용액을 15ml 원형 바닥 원심분리기 튜브에 여과합니다.

프로톱플라스트 용액에 2ml의 FPCN 버퍼와 원심분리기를 70배 G에서 10분 동안 오버레이하고 실온에서 느린 가속 및 감속을 수행합니다. 원형(intact) 원형질체는 넓은 오리피스(1ml) 피펫 팁을 사용하여 효소 용액과 FPCN 사이의 계면에 축적되어 온전한 원형체를 새로운 원심분리기 튜브로 전달합니다. 이 절차의 성공을 위해 항상 흰색 오리피스 팁을 사용하여 손상되지 않은 원형질체의 파열을 방지하십시오.

느린 가속 및 감속으로 100배 G에서 2분 동안 W 5 버퍼 원심분리기로 튜브를 채웁니다. 프로토플라스트를 펠릿화하려면 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 약 200 마이크로 리터의 W 5 버퍼에서 프로토 플라스트의 양에 따라 다릅니다.

레이저 스캐닝 현미경 검사를 위한 프로토플라스트 샘플을 준비하기 위해 첫 번째 페이스, 현미경 슬라이드에서 약 2cm 떨어진 두 개의 작은 실란트 스트립. 스트립 사이에 20마이크로리터의 프로토플라스트 용액을 놓고 그 위에 커버 유리를 조심스럽게 놓습니다. 실란트 스트립은 프로토플라스트가 커버 유리에 의해 찌그러지는 것을 방지합니다.

레이저 스캐닝 현미경 검사를 위해 전체 잎 샘플을 준비하려면 잎에서 1cm 조각을 잘라 잎의 바닥면이 위를 향하도록 하여 현미경 슬라이드에 놓습니다. 약 30마이크로리터의 물을 넣으십시오. 그 위에 커버 유리를 놓고 양쪽에 접착 테이프로 단단히 고정합니다.

이미징은 확대를 위해 MICCA 유형 TCS SP five의 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 수행됩니다. 글리세롤을 이미징 매체로 사용하는 63배 크기의 대물 렌즈를 사용하고, 평가를 위해 Leica 애플리케이션 제품군 고급 형광 소프트웨어를 사용하십시오. 아르곤 레이저를 30%로 설정하고 488나노미터의 레이저 출력을 18%의 강도로 설정합니다.515나노미터에서 신호를 모니터링하려면 첫 번째 PMT 검출기 방출 대역폭을 495에서 550나노미터로 설정합니다.

엽록소 자가형광을 모니터링합니다. 두 번째 PMT 검출기 방출 대역폭을 650에서 705나노미터로 설정합니다. M 체리 신호를 모니터링하려면 HENI 5 61 레이저를 사용하십시오.

레이저 강도를 18%로 설정하고 세 번째 PMT 검출기 방출 대역폭을 587에서 610나노미터로 설정합니다. 모든 PMT 검출기 채널의 사진이 동일한 게인 설정으로 촬영되었는지 확인하십시오. 게인은 배경 신호를 제외하기 위해 800에서 900 사이여야 합니다.

1024 x 1024 픽셀의 이 형식, 너비 및 높이와 100헤르츠의 스캔 속도로 이미지를 획득합니다. Z 스택의 경우 각 스택 사이에 최대 0.5미크론의 거리를 사용합니다. 이 연구에서는 BFC 방법을 사용하여 세포질 분자 샤페론 HSP 90과 막 도킹 단백질 TPR 7 및 to 64의 상호 작용을 모니터링했습니다.

이 설계도에서 볼 수 있듯이 금성은 소포체에 있는 TPR 7 또는 엽록체 외피에 있는 64의 세포질 부분에 결합되어 있습니다. Hs.P 90은 SCFP에 말단 융합되어 토크 64 및 TPR 7의 TPR 도메인의 상호 작용을 가능하게하며, HSP 90 C, Terminus와 함께 SCFP 단독은 TPR 7 HS P 90 단백질 복합체의 국소화를 확인하기 위해 음성 대조군으로 사이토졸에서 발현됩니다. TPR 7 및 HS P 90은 ER 마커와 함께 공동 형질전환되었습니다.

형광은 대조군으로 손상되지 않은 잎에서 모니터링되었습니다. SCFP 단독은 TPR 7 및 ER 마커와 함께 발현되었습니다. 표시된 모든 이미지에서 축척 막대는 10미크론을 나타냅니다.

왼쪽의 패널은 515나노미터에서 모니터링된 녹색의 재구성 형광을 보여줍니다. ER 마커가 빨간색으로 나타납니다. 중간 패널에서 두 신호의 오버레이가 오른쪽 패널에 표시됩니다.

HS P 90과 함께 TPR 7에 대한 재구성된 신호는 노란색으로 나타나는 ER 마커와 겹쳐서 모니터링되었습니다. 대조적으로, TPR 7에 대한 신호 없음 및 CFP로서의 음성 대조군은 모니터링되었습니다. 다음 예에서, 엽록체 단백질 tox 64는 대조군으로서 HS P 90과 동시 발현되었습니다.

Tox 64는 SCFP 단독과 함께 발현되었습니다. 이전과 마찬가지로 녹색으로 재구성된 형광은 515나노미터에서 모니터링되었습니다. 중간 패널은 480나노미터에서 모니터링된 엽록소 자가형광을 보여줍니다.

두 신호의 빨간색 오버레이가 오른쪽 패널에 표시됩니다. 재구성된 형광은 tox 64 및 HSP 90을 발현하는 coex 세포에서 관찰되었지만, 세포에서는 관찰되지 않았습니다. tox 64와 SCFP만을 단독으로 표현하는 코엑스.

tox 64 및 HSP 90의 정확한 국소화는 전체 잎의 현미경 사진으로 결정하기 어렵기 때문입니다. 원형질체는 형광 현미경 검사를 위해 침투된 담배 잎에서 분리되었습니다. 이전과 마찬가지로 재구성 형광은 515 나노미터에서 모니터링하고, 엽록소 자가형광은 480 나노미터에서 모니터링한 후 이 오버레이 이미지와 같이 오버레이 이미지를 생성하고, 64와 HSP 90은 엽록체 Off를 둘러싼 고리 모양의 구조로 검출할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 구조를 설계하고, 담뱃잎을 변형하고, 관심 있는 두 단백질의 상호 작용을 보여주는 형광 신호를 가장 잘 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.